JPH082798B2 - 抗体を利用した新しいタイプの鎮痛薬 - Google Patents
抗体を利用した新しいタイプの鎮痛薬Info
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- JPH082798B2 JPH082798B2 JP3352481A JP35248191A JPH082798B2 JP H082798 B2 JPH082798 B2 JP H082798B2 JP 3352481 A JP3352481 A JP 3352481A JP 35248191 A JP35248191 A JP 35248191A JP H082798 B2 JPH082798 B2 JP H082798B2
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は抗体を利用した新しいタ
イプの鎮痛薬に関する。
イプの鎮痛薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】主観的には不愉快な感覚であるが生命の
保全または維持に重要な痛覚は組織を損傷あるいは破壊
する化学的な発痛物質が放出されることにより生ずる。
発痛物質のうちで体内に存在するものを内因性発痛物質
といい、痛覚発現機構に関わるものと考えられる。
保全または維持に重要な痛覚は組織を損傷あるいは破壊
する化学的な発痛物質が放出されることにより生ずる。
発痛物質のうちで体内に存在するものを内因性発痛物質
といい、痛覚発現機構に関わるものと考えられる。
【０００３】内因性発痛物質にはＫ+イオン、アセチル
コリン、セロトニン、ヒスタミン、ブラキジニンを代表
とするプラズマキニン類、オキシトニン、アンジオテン
シン、ＡＴＰなどが知られている。組織が傷害されて若
干の細胞が死滅すると蛋白分解酵素が放出され、それが
血漿蛋白を分解してブラジキンをはじめとする数々のポ
リペプチドを産生する。これらが侵害受容繊維の末端に
働きかけて痛覚を生じると考えられる。ブラジキニンは
発痛作用と共に血管拡張や血管透過性作用も持っている
ので局所に疼痛と共に発赤、腫張などの炎症症状を出現
させる。
コリン、セロトニン、ヒスタミン、ブラキジニンを代表
とするプラズマキニン類、オキシトニン、アンジオテン
シン、ＡＴＰなどが知られている。組織が傷害されて若
干の細胞が死滅すると蛋白分解酵素が放出され、それが
血漿蛋白を分解してブラジキンをはじめとする数々のポ
リペプチドを産生する。これらが侵害受容繊維の末端に
働きかけて痛覚を生じると考えられる。ブラジキニンは
発痛作用と共に血管拡張や血管透過性作用も持っている
ので局所に疼痛と共に発赤、腫張などの炎症症状を出現
させる。
【０００４】さらに痛覚情報伝達物質として、皮膚への
圧刺激による機械的侵害情報はサブスタンスＰ、熱刺激
による侵害情報はソマトスタチンによってそれぞれ伝達
されるといわれている。
圧刺激による機械的侵害情報はサブスタンスＰ、熱刺激
による侵害情報はソマトスタチンによってそれぞれ伝達
されるといわれている。
【０００５】一方、鎮痛薬の現状は、耐え難い激痛を伴
う末期ガン患者などに対しては、現在でも麻薬性鎮痛薬
モルヒネが主に使用されている。このモルヒネについて
は、従来の注射による投与法から経口投与法による安全
な長期投与法が開発され、耐性や依存性の問題がある程
度克服され、副作用も最小限に抑えられた。しかし、そ
れらの問題が完全に解決されたわけではない。また、モ
ルヒネよりも強力な効果を有し、さらにその欠点である
耐性及び依存性の問題を解決するために、モルヒネの化
学構造物の一部を改造したりして数多くの麻薬性鎮痛薬
が合成されたが、モルヒネに比べて総合的に優れたもの
は見いだされていない。
う末期ガン患者などに対しては、現在でも麻薬性鎮痛薬
モルヒネが主に使用されている。このモルヒネについて
は、従来の注射による投与法から経口投与法による安全
な長期投与法が開発され、耐性や依存性の問題がある程
度克服され、副作用も最小限に抑えられた。しかし、そ
れらの問題が完全に解決されたわけではない。また、モ
ルヒネよりも強力な効果を有し、さらにその欠点である
耐性及び依存性の問題を解決するために、モルヒネの化
学構造物の一部を改造したりして数多くの麻薬性鎮痛薬
が合成されたが、モルヒネに比べて総合的に優れたもの
は見いだされていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】鎮痛薬は麻薬性鎮痛薬
と解熱性鎮痛薬に大別される。前者はモルヒネを代表と
するアヘンアルカロイド及びその類似合成化合物であ
る。モルヒネは強い鎮痛作用を示し、癌性疼痛や外科的
手術時の疼痛など激しい痛みに対して有用である。しか
しながら、モルヒネは多幸感（陶酔）を起こすだけでな
く、連用により主に中枢神経抑制作用（鎮痛、鎮静、鎮
咳、呼吸抑制など）に対して耐性を生ずる。さらに精神
的及び身体的依存を形成し、投薬を中止すると、激しい
禁断症状が現れる。このようにモルヒネは多くの好まし
くない副作用を有するので、欠点の少ない種々の誘導体
が半合成あるいは合成されてきた。一方後者は比較的鎮
痛作用が弱く、解熱作用をもつアスピリンやインドメタ
シンを代表とする薬物である。
と解熱性鎮痛薬に大別される。前者はモルヒネを代表と
するアヘンアルカロイド及びその類似合成化合物であ
る。モルヒネは強い鎮痛作用を示し、癌性疼痛や外科的
手術時の疼痛など激しい痛みに対して有用である。しか
しながら、モルヒネは多幸感（陶酔）を起こすだけでな
く、連用により主に中枢神経抑制作用（鎮痛、鎮静、鎮
咳、呼吸抑制など）に対して耐性を生ずる。さらに精神
的及び身体的依存を形成し、投薬を中止すると、激しい
禁断症状が現れる。このようにモルヒネは多くの好まし
くない副作用を有するので、欠点の少ない種々の誘導体
が半合成あるいは合成されてきた。一方後者は比較的鎮
痛作用が弱く、解熱作用をもつアスピリンやインドメタ
シンを代表とする薬物である。
【０００７】アスピリンは解熱、鎮痛薬としてかぜ症侯
群、神経痛、歯痛などに広く用いられているほか、慢性
関節リウマチ、リウマチ熱に対しては現在でも第一選択
薬である。しかしアスピリンは市販薬として簡単に入手
し易いため、安易に使用され、その結果副作用が高率に
発生している。副作用としてよく知られたものには胃腸
障害、腎障害、肝障害、プロトロンビン減少に基づく出
血傾向、中毒などである。また、インドメタシンは副腎
皮質ステロイド剤に匹敵する抗炎症作用とすぐれた解
熱、鎮痛作用とを合わせ持つ非ステロイド性抗炎症剤で
ある。副作用としては、他の非ステロイド性抗炎症剤と
同様、中枢神経系（頭痛、めまいなど）と消化器系（胃
腸障害、食欲不振など）の副作用が知られている。これ
らの副作用を軽減する目的で、徐放化や軟膏などの新し
い剤形が開発されており、現在でも種々の製剤的修飾が
試みられている。
群、神経痛、歯痛などに広く用いられているほか、慢性
関節リウマチ、リウマチ熱に対しては現在でも第一選択
薬である。しかしアスピリンは市販薬として簡単に入手
し易いため、安易に使用され、その結果副作用が高率に
発生している。副作用としてよく知られたものには胃腸
障害、腎障害、肝障害、プロトロンビン減少に基づく出
血傾向、中毒などである。また、インドメタシンは副腎
皮質ステロイド剤に匹敵する抗炎症作用とすぐれた解
熱、鎮痛作用とを合わせ持つ非ステロイド性抗炎症剤で
ある。副作用としては、他の非ステロイド性抗炎症剤と
同様、中枢神経系（頭痛、めまいなど）と消化器系（胃
腸障害、食欲不振など）の副作用が知られている。これ
らの副作用を軽減する目的で、徐放化や軟膏などの新し
い剤形が開発されており、現在でも種々の製剤的修飾が
試みられている。
【０００８】そこで本発明者等は上述の問題をできるか
ぎり、解決する方法を鋭意努力した結果、内因性発痛物
質及び痛覚情報伝達物質に対する抗体を作製し、その抗
体、及び物理的、化学的処理をしたフラグメント、そし
て抗体やそのフラグメントと既存の抗炎症性解熱鎮痛薬
の併用を利用することにより、全く新しいタイプの鎮痛
薬を開発することができた。
ぎり、解決する方法を鋭意努力した結果、内因性発痛物
質及び痛覚情報伝達物質に対する抗体を作製し、その抗
体、及び物理的、化学的処理をしたフラグメント、そし
て抗体やそのフラグメントと既存の抗炎症性解熱鎮痛薬
の併用を利用することにより、全く新しいタイプの鎮痛
薬を開発することができた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は内因
性発痛物質及び痛覚情報伝達物質に対して作製した抗
体、またはその抗体を物理的あるいは化学的に処理した
抗体、及びそれらの抗体と抗炎症性解熱鎮痛薬との併用
を利用した鎮痛薬に係るものである。
性発痛物質及び痛覚情報伝達物質に対して作製した抗
体、またはその抗体を物理的あるいは化学的に処理した
抗体、及びそれらの抗体と抗炎症性解熱鎮痛薬との併用
を利用した鎮痛薬に係るものである。
【００１０】
【作用】本発明において利用されうる抗体の作製の方法
は抗血清すなわちポリクローナル抗体とモノクローナル
抗体によって異なる。一般的に前者については、抗原で
ある内因性発痛物質または痛覚情報伝達物質を適当な動
物に適当量、数回皮下または筋肉内に投与して一定期間
経過後、充分抗体価が上昇した後、宿主より採血し、そ
の採血した血液の冷アルコール処理を行うＣｏｈｎ法
（Ｅ．Ｊ．Ｃｏｈｎｅｔ ａｌ， Ｊ．Ａｍｅｒ・Ｃｈ
ｅｍ・ Ｓｏｃ・、６８、４５９（１９４６））または
塩析−透析カラムクロマトグラフィー法を組み合わせた
方法により、免疫グロブリンを分離精製して得ることが
できる。
は抗血清すなわちポリクローナル抗体とモノクローナル
抗体によって異なる。一般的に前者については、抗原で
ある内因性発痛物質または痛覚情報伝達物質を適当な動
物に適当量、数回皮下または筋肉内に投与して一定期間
経過後、充分抗体価が上昇した後、宿主より採血し、そ
の採血した血液の冷アルコール処理を行うＣｏｈｎ法
（Ｅ．Ｊ．Ｃｏｈｎｅｔ ａｌ， Ｊ．Ａｍｅｒ・Ｃｈ
ｅｍ・ Ｓｏｃ・、６８、４５９（１９４６））または
塩析−透析カラムクロマトグラフィー法を組み合わせた
方法により、免疫グロブリンを分離精製して得ることが
できる。
【００１１】一方、後者については、マウス（Ｋｏｈｌ
ｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６，４
９５，１９７５）、ヒト由来のミエローマを用いる細胞
融合法（Ｏｌｓｓｅｎ， Ｌ． ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ７２，５
４２９， １９８０）やヘテロハイブリドーマ法（Ｎｏ
ｗｉｎｓｋｉ， Ｒ． ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ
２１０， ５３７，１９８０；Ｔｅｎｇ， Ｎ．Ｎ．
Ｈ． ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉｃ． ＵＳＡ ８０， ７３０８， １９
８３）、ＥＢウィルスによりＢ細胞を刺激する法（Ｓｔ
ｅｉｎｉｔｚ， Ｍ． ｅｔａｌ Ｎａｔｕｒｅ ２６
９， ４２０， １９７７）またはそれらの組み合わせ
法や最近では遺伝子工学的技術が使用できるようになっ
てきた。どの方法を用いるかは利用する対象の動物が何
であるかによって異なってくるので、適宜良い方法を選
択することが大切である。有効性を確認する鎮痛作用の
検定方法は使用する動物種、刺激の種類により異なって
くるが、熱刺激に対してはハフナー法やランダムセリッ
ト法、熱刺激に対しては熱板法、テール・フリック法、
化学的刺激に対しては酢酸法、ブラジキニン動注法、ホ
ルマリンテスト法、などが推奨される。それぞれの方法
には長所、短所があるので目的に応じた方法を動物と組
み合わせて使用すると良好な結果が得られる。
ｅｒ Ｇ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６，４
９５，１９７５）、ヒト由来のミエローマを用いる細胞
融合法（Ｏｌｓｓｅｎ， Ｌ． ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ７２，５
４２９， １９８０）やヘテロハイブリドーマ法（Ｎｏ
ｗｉｎｓｋｉ， Ｒ． ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ
２１０， ５３７，１９８０；Ｔｅｎｇ， Ｎ．Ｎ．
Ｈ． ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉｃ． ＵＳＡ ８０， ７３０８， １９
８３）、ＥＢウィルスによりＢ細胞を刺激する法（Ｓｔ
ｅｉｎｉｔｚ， Ｍ． ｅｔａｌ Ｎａｔｕｒｅ ２６
９， ４２０， １９７７）またはそれらの組み合わせ
法や最近では遺伝子工学的技術が使用できるようになっ
てきた。どの方法を用いるかは利用する対象の動物が何
であるかによって異なってくるので、適宜良い方法を選
択することが大切である。有効性を確認する鎮痛作用の
検定方法は使用する動物種、刺激の種類により異なって
くるが、熱刺激に対してはハフナー法やランダムセリッ
ト法、熱刺激に対しては熱板法、テール・フリック法、
化学的刺激に対しては酢酸法、ブラジキニン動注法、ホ
ルマリンテスト法、などが推奨される。それぞれの方法
には長所、短所があるので目的に応じた方法を動物と組
み合わせて使用すると良好な結果が得られる。
【００１２】
【実施例】以下本発明の実施例および試験例を示して更
に詳述する。
に詳述する。
【００１３】実施例１ 内因性発痛物質ブラジキニンに対するラット抗血清の作
製 化学的に合成されたブラジキニン（ＢＫ，ペプチド研
製）１００ｇ／ｍｌと同量のフロイントの完全アジュバ
ンドを充分に混合し、日本白色系ウサギ（５〜６周齢）
の背部数カ所に０．２〜０．４ｍｌずつ投与した。２週
間後、再度上記のような操作を行った。このような操作
を数回行い十分に抗体力価が上昇したところで、ウサギ
の頸動脈より全採血を行い、血液約１１０ｍｌを得た。
得られた血液を室温に放置し、血餅が形成された後、遠
心分離により（室温、３５００ｒｐｍ，３０分）抗血清
を５０ｍｌ得ることができた。この５０ｍｌの血清にリ
ン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）５０ｍｌを加え、次にあ
らかじめ調製しておいた飽和硫安１００ｍｌを攪拌しな
がら徐々に加え室温に１時間放置した。遠心分離を行い
（７０００ｒｐｍ，２０分、室温）得られた沈殿をＰＢ
Ｓに溶解し、全量を５０ｍｌとした。攪拌しながら飽和
硫安を２０％飽和になるように加え、遠心分離により沈
殿を除き、上清を得、それに飽和硫安を最終濃度が３０
〜３３％になるように加え、遠心分離して沈殿を得た。
次にできるだけ少量のＰＢＳに溶解し、透析法で硫安を
除いて、最終的に４０ｍｌ（ｍｇ／ｍｌ）の生成した抗
血清を得た。（Ｐ−１）
製 化学的に合成されたブラジキニン（ＢＫ，ペプチド研
製）１００ｇ／ｍｌと同量のフロイントの完全アジュバ
ンドを充分に混合し、日本白色系ウサギ（５〜６周齢）
の背部数カ所に０．２〜０．４ｍｌずつ投与した。２週
間後、再度上記のような操作を行った。このような操作
を数回行い十分に抗体力価が上昇したところで、ウサギ
の頸動脈より全採血を行い、血液約１１０ｍｌを得た。
得られた血液を室温に放置し、血餅が形成された後、遠
心分離により（室温、３５００ｒｐｍ，３０分）抗血清
を５０ｍｌ得ることができた。この５０ｍｌの血清にリ
ン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）５０ｍｌを加え、次にあ
らかじめ調製しておいた飽和硫安１００ｍｌを攪拌しな
がら徐々に加え室温に１時間放置した。遠心分離を行い
（７０００ｒｐｍ，２０分、室温）得られた沈殿をＰＢ
Ｓに溶解し、全量を５０ｍｌとした。攪拌しながら飽和
硫安を２０％飽和になるように加え、遠心分離により沈
殿を除き、上清を得、それに飽和硫安を最終濃度が３０
〜３３％になるように加え、遠心分離して沈殿を得た。
次にできるだけ少量のＰＢＳに溶解し、透析法で硫安を
除いて、最終的に４０ｍｌ（ｍｇ／ｍｌ）の生成した抗
血清を得た。（Ｐ−１）
【００１４】実施例２ ブラジキニンに対するマウスモノクローナル抗体の作製 ブラジキニン（ペプチド研究所製）１ｍｇとヒトαグロ
ブリン（ユ・エス・バイオケミカル社）４．８ｍｇを
０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解
し、それに０．０２Ｍグルタルアルデヒド水溶液０．５
ｍｌを滴下した。室温で５時間緩やかに攪拌し、ＰＢＳ
で透析して抗原を調製した。動物はＢＡＬＢ／ｃ５週齢
の雌性マウス（日本ＳＬＣ社船橋農場製）を用いた。
１、２回目の免疫では上記で調製した抗原と完全フロイ
ントアジュバンド（ＤＩＦＣＯ社製）を混合し、マウス
１頭当たり１００μｇを腹空内に投与した。３回目は抗
原５０μｇを尾静脈内に投与した。細胞融合３日前に抗
原５０μｇを尾静脈内に投与し、ケーラー・ミルスタイ
ンの方法に従ってマウスモノクローナル抗体を作製し
た。（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５）（Ｐ
−２）
ブリン（ユ・エス・バイオケミカル社）４．８ｍｇを
０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解
し、それに０．０２Ｍグルタルアルデヒド水溶液０．５
ｍｌを滴下した。室温で５時間緩やかに攪拌し、ＰＢＳ
で透析して抗原を調製した。動物はＢＡＬＢ／ｃ５週齢
の雌性マウス（日本ＳＬＣ社船橋農場製）を用いた。
１、２回目の免疫では上記で調製した抗原と完全フロイ
ントアジュバンド（ＤＩＦＣＯ社製）を混合し、マウス
１頭当たり１００μｇを腹空内に投与した。３回目は抗
原５０μｇを尾静脈内に投与した。細胞融合３日前に抗
原５０μｇを尾静脈内に投与し、ケーラー・ミルスタイ
ンの方法に従ってマウスモノクローナル抗体を作製し
た。（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５）（Ｐ
−２）
【００１５】実施例３ サブスタンスＰに対するマウスモノクローナル抗体の作
製 サブスタンスＰ（ペプチド研究所製）１ｍｇとヒトαグ
ロブリン（ユ・エス・バイオケミカル社製）４．８ｍｇ
を０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶
解し、それに０．０２Ｍグルタルアルデヒド水溶液０．
５ｍｌを滴下した。その後、実施例２とまったく同様に
してサブスタンスＰに対するマウスモノクローナル抗体
を作製した。（Ｐ−３）
製 サブスタンスＰ（ペプチド研究所製）１ｍｇとヒトαグ
ロブリン（ユ・エス・バイオケミカル社製）４．８ｍｇ
を０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶
解し、それに０．０２Ｍグルタルアルデヒド水溶液０．
５ｍｌを滴下した。その後、実施例２とまったく同様に
してサブスタンスＰに対するマウスモノクローナル抗体
を作製した。（Ｐ−３）
【００１６】実施例４ サブスタンスＰに対するウサギ抗血清から酵素パパイン
処理によるＦａｂフラグメントの作製 実施例１と同様の操作で作製したサブスタンスＰに対す
る抗血清１５０ｍｇを００１Ｍシステインと０．０２Ｍ
ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ７．０）
１５０ｍｌに溶解し、１．５ｍｇのパパイン（シグマ
社、ｐ３１２５）を加え、３７℃で１６時間反応させ
た。酵素処理物を、透析外液として蒸留水及び０．０１
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で充分透析後、
ＣＭ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ワットマン社製 ＤＥ５
０）を充填したカラム（φ２．４×２５ｃｍ）にかけて
分画を行った。分画に際しては０．１−０．９Ｍ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５．５）の直線的グラジエントシ
ステムを用いた。溶出のプロファイルを図２に示す（Ｆ
ａｂフラグメントはＩＩ及びＩＩＩ画分に含まれる）。
得られた溶出液（ＩＩ及びＩＩＩ画分）を０．０２Ｎ酢
酸液に入れた後、リン酸緩衝液（ｐＨ６〜７）を外液と
し透析を繰り返して、結晶化させた。収量は４０ｍｇで
あった。（Ｐ−４）
処理によるＦａｂフラグメントの作製 実施例１と同様の操作で作製したサブスタンスＰに対す
る抗血清１５０ｍｇを００１Ｍシステインと０．０２Ｍ
ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ７．０）
１５０ｍｌに溶解し、１．５ｍｇのパパイン（シグマ
社、ｐ３１２５）を加え、３７℃で１６時間反応させ
た。酵素処理物を、透析外液として蒸留水及び０．０１
Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で充分透析後、
ＣＭ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（ワットマン社製 ＤＥ５
０）を充填したカラム（φ２．４×２５ｃｍ）にかけて
分画を行った。分画に際しては０．１−０．９Ｍ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ５．５）の直線的グラジエントシ
ステムを用いた。溶出のプロファイルを図２に示す（Ｆ
ａｂフラグメントはＩＩ及びＩＩＩ画分に含まれる）。
得られた溶出液（ＩＩ及びＩＩＩ画分）を０．０２Ｎ酢
酸液に入れた後、リン酸緩衝液（ｐＨ６〜７）を外液と
し透析を繰り返して、結晶化させた。収量は４０ｍｇで
あった。（Ｐ−４）
【００１７】実施例５ ブラジキニンに対するマウスモノクローナル抗体（Ｉｇ
Ｇ1）の化学的処理に対するフラグメントの作製 Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎらの方法にしたがって処理、精製
を行った。（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ａ
ｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｓｕｐｐｌ
１， １７４（１９６１））。実施例２で作製したブ
ラジキニンに対するマウスモノクローナル抗体を０．５
５ｍｏｌ／Ｌの濃度になるようにＴｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝
液（ｐＨ８．２）に溶解した溶液に２−メルカプトエタ
ノールを最終濃度０．７５ｍｏｌ／Ｌになるように加
え、室温で６０分間放置する。次に氷で冷却しながら、
０．７５ｍｏｌ／Ｌ濃度のよう化アセトアマイドを等量
加える。次にｐＨ８．０に調整するためにトリメチルア
ミンを静かに加える。１時間後、反応液を１００倍量の
冷生理食塩水で一晩透析を行う。処理された抗体１５０
ｍｇを１Ｎ酢酸で一晩透析後、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７
５を充填したカラム（φ３×７０ｃｍ）を用い、同様の
緩衝液で溶出、Ｈ及びＬチェンのフラグメント画分を分
画、精製した。（図３）（Ａピーク：Ｈチェン画分１１
２．２ｍｇ，Ｂピーク：Ｌチェン画分２７．８ｍｇ）
（Ｐ−５）
Ｇ1）の化学的処理に対するフラグメントの作製 Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎらの方法にしたがって処理、精製
を行った。（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ， Ａ
ｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｓｕｐｐｌ
１， １７４（１９６１））。実施例２で作製したブ
ラジキニンに対するマウスモノクローナル抗体を０．５
５ｍｏｌ／Ｌの濃度になるようにＴｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝
液（ｐＨ８．２）に溶解した溶液に２−メルカプトエタ
ノールを最終濃度０．７５ｍｏｌ／Ｌになるように加
え、室温で６０分間放置する。次に氷で冷却しながら、
０．７５ｍｏｌ／Ｌ濃度のよう化アセトアマイドを等量
加える。次にｐＨ８．０に調整するためにトリメチルア
ミンを静かに加える。１時間後、反応液を１００倍量の
冷生理食塩水で一晩透析を行う。処理された抗体１５０
ｍｇを１Ｎ酢酸で一晩透析後、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７
５を充填したカラム（φ３×７０ｃｍ）を用い、同様の
緩衝液で溶出、Ｈ及びＬチェンのフラグメント画分を分
画、精製した。（図３）（Ａピーク：Ｈチェン画分１１
２．２ｍｇ，Ｂピーク：Ｌチェン画分２７．８ｍｇ）
（Ｐ−５）
【００１８】試験例１ 鎮痛効果試験（１）（ホルマリンテスト法） 実施例１〜５で作製した抗体または酵素や化学的処理し
た抗体フラグメントを用いた鎮痛効果試験を行った。 1)実験動物 ４週齢の雄性ｄｄＹ系マウス（２５〜３５ｇ、日本ＳＬ
Ｃ社）を購入後すぐに約２４℃の動物室にいれ、１週間
予備飼育し実験に使用した。実験開始まで餌及び水を自
由に摂取させた。１群６匹として実験に供した。 2)使用薬物 ホルマリン（特級 和光純薬社製）は生理食塩液で０．
５％に希釈、アミノピリン（小野薬品社製）は２ｍｇ／
ｍｌに生理食塩液で調製して試用した。（ポジティブコ
ントロール） 3)実験方法 マウスを用いてホルマリンテストを行うことは、ラット
や猫に比べ取扱が簡単で多数処理が可能であるという有
利点があるので、柴田（柴田等、日薬理誌８７、４０
５、１９８６；Ｓｈｉｂａｔａ． Ｍ． ｅｔ ａｌ
Ｐａｉｎ ３８，３４７，１９８９）らの方法を参考に
して、急性痛（Ｆ相）と持続痛（Ｓ相）の疼痛強度の判
定の定量的な評価方法を検定した。マウスは、実験開始
１５分前に観察を容易にするため、ケージの裏面と底面
に鏡を置いた透明なプラスチックケージ製の観察装置に
入れ環境に慣らした（図１）。希釈ホルマリン液（０．
５％ホルムアルデヒド生理食塩液溶液、以下ホルマリン
と略す）を左側後肢足頸部皮下に２０μｌ注射し誘発さ
れる仮性疼痛反応、すなわちｌｉｃｋｉｎｇ，ｂｉｔｉ
ｎｇ行動の持続時間を、ストップウォッチで秒単位で計
測し、５分ごとの総計を記録した・鎮痛活性の評価につ
いては、Ｆ相の反応が出ているホルマリン投与後０〜５
分の５分間と、Ｓ相の反応が出ている、ホルマリン投与
後１０〜３０分の２０分間のｌｉｃｋｉｎｇ，ｂｉｔｉ
ｎｇ行動の持続時間を比較した。ネガティブコントロー
ルは発痛にまったく関係ない物質に対するモノクローナ
ル抗体を用いた。 4)実験結果 結果を表１に示す。各群ともＦ相は２５％〜３８％の抑
制効果を、Ｓ相は３１％〜４３％の抑制効果を示した。
た抗体フラグメントを用いた鎮痛効果試験を行った。 1)実験動物 ４週齢の雄性ｄｄＹ系マウス（２５〜３５ｇ、日本ＳＬ
Ｃ社）を購入後すぐに約２４℃の動物室にいれ、１週間
予備飼育し実験に使用した。実験開始まで餌及び水を自
由に摂取させた。１群６匹として実験に供した。 2)使用薬物 ホルマリン（特級 和光純薬社製）は生理食塩液で０．
５％に希釈、アミノピリン（小野薬品社製）は２ｍｇ／
ｍｌに生理食塩液で調製して試用した。（ポジティブコ
ントロール） 3)実験方法 マウスを用いてホルマリンテストを行うことは、ラット
や猫に比べ取扱が簡単で多数処理が可能であるという有
利点があるので、柴田（柴田等、日薬理誌８７、４０
５、１９８６；Ｓｈｉｂａｔａ． Ｍ． ｅｔ ａｌ
Ｐａｉｎ ３８，３４７，１９８９）らの方法を参考に
して、急性痛（Ｆ相）と持続痛（Ｓ相）の疼痛強度の判
定の定量的な評価方法を検定した。マウスは、実験開始
１５分前に観察を容易にするため、ケージの裏面と底面
に鏡を置いた透明なプラスチックケージ製の観察装置に
入れ環境に慣らした（図１）。希釈ホルマリン液（０．
５％ホルムアルデヒド生理食塩液溶液、以下ホルマリン
と略す）を左側後肢足頸部皮下に２０μｌ注射し誘発さ
れる仮性疼痛反応、すなわちｌｉｃｋｉｎｇ，ｂｉｔｉ
ｎｇ行動の持続時間を、ストップウォッチで秒単位で計
測し、５分ごとの総計を記録した・鎮痛活性の評価につ
いては、Ｆ相の反応が出ているホルマリン投与後０〜５
分の５分間と、Ｓ相の反応が出ている、ホルマリン投与
後１０〜３０分の２０分間のｌｉｃｋｉｎｇ，ｂｉｔｉ
ｎｇ行動の持続時間を比較した。ネガティブコントロー
ルは発痛にまったく関係ない物質に対するモノクローナ
ル抗体を用いた。 4)実験結果 結果を表１に示す。各群ともＦ相は２５％〜３８％の抑
制効果を、Ｓ相は３１％〜４３％の抑制効果を示した。
【００１９】
【表１】
【００２０】試験例２ 鎮痛効果試験（２）（酢酸ライジング法） １群１０匹のマウス（日本ＳＬＣ社製、体重２５〜２８
ｇ）にそれぞれ、０．７％酢酸を０．１ｍｌ／１０ｇ体
重ずつ腹腔内に投与後、誘発されるライジング回数を５
分間ごとに計測してその推移を見た。観察時間は最も多
くｗｒｉｔｈｉｎｇが出現する投与後５〜１５分の１０
分間とした。その他の実験条件は試験例１と同様に行っ
た。結果を表２に示した。仮性疼痛反応に対する抑制率
は４４〜６６％で良好な結果であった。
ｇ）にそれぞれ、０．７％酢酸を０．１ｍｌ／１０ｇ体
重ずつ腹腔内に投与後、誘発されるライジング回数を５
分間ごとに計測してその推移を見た。観察時間は最も多
くｗｒｉｔｈｉｎｇが出現する投与後５〜１５分の１０
分間とした。その他の実験条件は試験例１と同様に行っ
た。結果を表２に示した。仮性疼痛反応に対する抑制率
は４４〜６６％で良好な結果であった。
【００２１】
【表２】
【００２２】試験例３ 鎮痛効果試験（３）（カオリンライジング法） 試験例１で用いたサンプルと既存薬剤インドメタシンま
たはアスピリンとの併用による鎮痛効果試験をカオリン
誘発ライジング試験方法を用いて行った。 1)実験動物 試験例１と同様に行った。 2)使用薬物 カオリン（和光純薬）は０．２％Ｔｗｅｅｎ８０（和光
純薬社製）添加の生理食塩水で５ｍｇ／ｍｌの濃度に懸
濁して使用した。アスピリンは市販の製剤（ヴェノピリ
ン、ミドリ十字社製）を使用した。製剤に使用されてい
る５０％ポリエチレングリコールはＰＥＧ２００（和光
純薬社製）を使用した。これらの薬物は試験開始１５分
前皮下投与して実験を行った。 3)薬物の調製、及び実験方法 抗体及びそのフラグメントは１ｍｇ／ｍｌの濃度になる
ように生理食塩液で調製した。試験開始２４分前に上述
で調製した薬物を１匹当たり０．１ｍｇ／１０ｇ体重ず
つ投与した後、2)で調製したカオリンを投与し、ｌｉｃ
ｋｉｎｇやｂｉｔｉｎｇ行動の持続時間をストップウォ
ッチで秒単位で計測し、５分ごとの総計を記録した。 4)実験結果 結果を表３、４に示した。既存薬剤アスピリンまたはイ
ンドメタシンの仮性疼痛反応に対する抑制率は両者とも
約７０〜８０％で既存する薬剤単独よりも高い値を示し
た。
たはアスピリンとの併用による鎮痛効果試験をカオリン
誘発ライジング試験方法を用いて行った。 1)実験動物 試験例１と同様に行った。 2)使用薬物 カオリン（和光純薬）は０．２％Ｔｗｅｅｎ８０（和光
純薬社製）添加の生理食塩水で５ｍｇ／ｍｌの濃度に懸
濁して使用した。アスピリンは市販の製剤（ヴェノピリ
ン、ミドリ十字社製）を使用した。製剤に使用されてい
る５０％ポリエチレングリコールはＰＥＧ２００（和光
純薬社製）を使用した。これらの薬物は試験開始１５分
前皮下投与して実験を行った。 3)薬物の調製、及び実験方法 抗体及びそのフラグメントは１ｍｇ／ｍｌの濃度になる
ように生理食塩液で調製した。試験開始２４分前に上述
で調製した薬物を１匹当たり０．１ｍｇ／１０ｇ体重ず
つ投与した後、2)で調製したカオリンを投与し、ｌｉｃ
ｋｉｎｇやｂｉｔｉｎｇ行動の持続時間をストップウォ
ッチで秒単位で計測し、５分ごとの総計を記録した。 4)実験結果 結果を表３、４に示した。既存薬剤アスピリンまたはイ
ンドメタシンの仮性疼痛反応に対する抑制率は両者とも
約７０〜８０％で既存する薬剤単独よりも高い値を示し
た。
【００２３】
【表３】
【００２４】
【表４】
【００２５】試験例４ 毒性試験（１） 体重１７〜２０ｇの４週齢ｄｄｙ雌性マウスの１群１０
匹を用い、実施例２で調製したブラジキニンに対するマ
ウスモノクローナル抗体を腹腔内に投与し、１週間後の
動物の死亡数よりＬＤ50値を算出した。本物質のＬＤ50
値は１００ｍｇ以上であった。
匹を用い、実施例２で調製したブラジキニンに対するマ
ウスモノクローナル抗体を腹腔内に投与し、１週間後の
動物の死亡数よりＬＤ50値を算出した。本物質のＬＤ50
値は１００ｍｇ以上であった。
【００２６】試験例５ 毒性試験（２） 体重１７〜２０ｇの４週齢ｄｄｙ雌性マウスの１群１０
匹を用い、実施例１〜５までの各薬剤を腹腔内に投与
し、１週間、毎日、体重減少、毛の逆立ち、死亡等を観
察することにより毒性試験を行った。結果は表５に示し
た。Ｐ−１、Ｐ−４の１０ｍｇ／頭投与群で毛の逆立ち
がわずかに認められたが、それ以外の薬剤の投与群では
まったく副作用は認められなかった。本薬剤の安全性は
かなり高いと考えられる。
匹を用い、実施例１〜５までの各薬剤を腹腔内に投与
し、１週間、毎日、体重減少、毛の逆立ち、死亡等を観
察することにより毒性試験を行った。結果は表５に示し
た。Ｐ−１、Ｐ−４の１０ｍｇ／頭投与群で毛の逆立ち
がわずかに認められたが、それ以外の薬剤の投与群では
まったく副作用は認められなかった。本薬剤の安全性は
かなり高いと考えられる。
【００２７】
【表５】
【００２８】
【発明の効果】既存薬剤と同等或いは既存薬剤より高い
鎮痛効果を示す場合があり、しかも毒性が低く副作用を
生じない。
鎮痛効果を示す場合があり、しかも毒性が低く副作用を
生じない。
【図１】ホルマリン誘発後肢ｌｉｃｋｉｎｇの観察法及
び装置を示す斜視図である。
び装置を示す斜視図である。
【図２】サブスタンスＰに対する抗血清のパパイン処理
物のＣＭ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅによる溶出パターンを示
すグラフである。
物のＣＭ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅによる溶出パターンを示
すグラフである。
【図３】ブラジキニンに対するマウスモノクローナル抗
体の化学的処理物のＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５による溶
出パターンを示すグラフである。
体の化学的処理物のＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５による溶
出パターンを示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 31/557 31/60 38/00 38/04 (72)発明者 福井 邦顕 福島県郡山市安積町笹川字平の上１番地の １ 日本全薬工業株式会社内
Claims (16)
- 【請求項１】 内因性発痛物質及び痛覚情報伝達物質に
対する抗体を作製し、該抗体を鎮痛薬として用いること
を特徴とする鎮痛薬。 - 【請求項２】 内因性発痛物質及び痛覚情報伝達物質に
対する抗体を作製し、該抗体と抗炎症性解熱鎮痛薬の併
用を利用することを特徴とする鎮痛薬。 - 【請求項３】 抗体を有機溶媒、酵素処理、ＰＨ、また
は物理的あるいは化学的処理したフラグメントを利用す
る請求項１又は２に記載の鎮痛薬。 - 【請求項４】 抗体としてモノクローナル抗体を利用す
る請求項１又は２又は３に記載の鎮痛薬。 - 【請求項５】 抗体としてポリクローナル抗体を利用す
る請求項１又は２又は３に記載の鎮痛薬。 - 【請求項６】 内因性発痛物質としてブラジキニンを利
用する請求項１又は２又は３に記載の鎮痛薬。 - 【請求項７】 痛覚情報伝達物質としてサブスタンスＰ
を利用する請求項１又は２又は３に記載の鎮痛薬。 - 【請求項８】 抗炎症性解熱鎮痛薬としてアスピリンを
用いる請求項２に記載の鎮痛薬。 - 【請求項９】 抗炎症性解熱鎮痛薬としてインドメタシ
ンを用いる請求項２に記載の鎮痛薬。 - 【請求項１０】 抗体の有機溶媒処理としてアルコール
を用いて処理したものを利用する請求項３に記載の鎮痛
薬。 - 【請求項１１】 抗体の有機溶媒処理としてβ−プロピ
オラクトンを用いる請求項３に記載の鎮痛薬。 - 【請求項１２】 抗体の有機溶媒処理としてポリエチレ
ングリコールを用いる請求項３に記載の鎮痛薬。 - 【請求項１３】 抗体の酵素処理としてペプシンを用い
る請求項３に記載の鎮痛薬。 - 【請求項１４】 抗体の酵素処理としてプラスミンを用
いる請求項３に記載の鎮痛薬。 - 【請求項１５】 抗体の酸処理としてＰＨ４を用いる請
求項３に記載の鎮痛薬。 - 【請求項１６】 抗体の化学処理としてスルホン化処理
を用いる請求項３に記載の鎮痛薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3352481A JPH082798B2 (ja) | 1991-12-13 | 1991-12-13 | 抗体を利用した新しいタイプの鎮痛薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3352481A JPH082798B2 (ja) | 1991-12-13 | 1991-12-13 | 抗体を利用した新しいタイプの鎮痛薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05163159A JPH05163159A (ja) | 1993-06-29 |
| JPH082798B2 true JPH082798B2 (ja) | 1996-01-17 |
Family
ID=18424368
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3352481A Expired - Fee Related JPH082798B2 (ja) | 1991-12-13 | 1991-12-13 | 抗体を利用した新しいタイプの鎮痛薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH082798B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2399601A (en) * | 1999-12-21 | 2001-07-03 | Takeda Chemical Industries Ltd. | Novel tachykinin-like polypeptides and use thereof |
| EP1740957B1 (en) * | 2004-04-20 | 2014-03-12 | SphingoTec GmbH | Use of precursors of tachykinins and/or their fragments in medical diagnostic |
-
1991
- 1991-12-13 JP JP3352481A patent/JPH082798B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05163159A (ja) | 1993-06-29 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |