JPH02503633A - トキソプラスマ症のための診断上の遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トキソプラスマ症のための診断上の遺伝子発明の背景 発明の分野 本発明は、遺伝子工学の分野及びより詳しくは、ワクチン開発のために及びハイ ブリダイゼーション及び免疫学的アッセイによりトキソプラスマ感染の検出のた めに有用なポリヌクレオチド配列及びポリペプチドの同定及び調製に関する。

背景の説明 トキソブラスマ症は、原生動物の寄生虫トキソプースマゴンジイ（ｎμｆμｌＬ Ｌ神旦）により引き起こされる。この病気は、発育中の胎児に元来関係し、ここ でそれは、水頭症、精神１弱又は失明として現われる重大な神経系問題を引き起 こす、健康な成人においては、この病気は、典型的には軽く、もしあったとして も、はとんどの症状を伴わない。

最近、トキソブラスマ症の患者の数が、たとえば移植後治療、腫瘍性疾患又は後 天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に起因する免疫欠損している人々における上昇 の結果として劇的に上昇して来た。そのような免疫欠損患者においては、寄生虫 が、脳炎、すなわち実質的に致命的な形の疾病を引き起こすことができる。

トキソプラスマスを診断するための現段階での手段は、費用がかかり、手間がか かり、感応に限界があり、そして患者への実質的な危険を伴う、血清学的技法を 含む従来の方法は、ＡＩＤＳ患者における重い免疫機能障害のために及びその疾 病の再発性質のためにほとんど信軌できない、妊娠中に、トキソブラスマスにつ いて初めて試験される′妊婦においては、現在か過去かの感染を区別することが 臨界である（現在は、ある期間にわたってＩｇＧ及びＩｇＭ力価を比較すること 軒よって行なわれる）。

現存する１つの問題は、ワクチンの調整及び免疫学的ア・ンセイにおける標準液 としての使用の両者のために十分な量の適切な抗原を得ることである。抗原を供 給するための現在の技法は、マウスにおける原生動物の増殖及び新しいマウスの 連続した再感染を必要とする。ワクチン又は免疫学的標準として使用され得る遺 伝子的に構築されたポリペプチド抗原の有効性は、現在の抗原源に関する多くの 問題を緩和するであろう。

さらに、トキソプラスマ感染の阻止のための処理方法は、現在制限されている。

トキソプラスマスの制御のために利用できる市販のワクチンは存在しない。その 疾病の処置は一般的に、ピリメタミン及びスルファジアジンにより開始され、そ して維持される。しかしながら、薬物処理による毒性が重要であり、その結果、 予防薬療法は推薦されない（但し、嚢胞が実際に検出される場合を除り）。

従って、低レベルのトキソプラスマ感染を確実に検出する診断アッセイ及びワク チンの産生のために有用な物質の開発についての必要性が存在する。

発明の要約 本発明は、ニーゴンジイの細胞表面抗原をコードする遺伝子物質を供給する。そ の遺伝子物質は、ワクチン又は診断試薬として使用するためにポリペプチド又は タンパク質を産生ずるために使用され得、又はトキソプラスマ感染の直接的な検 出のために核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとして使用さ れ得る。特定の遺伝子物質及び分析技法は、次の詳細な説明及び次の例に開示さ れる。

図面の簡単な説明 第１図は、親水性疫対本発明のｐ３０遺伝子配列記よりコードされるポリペプチ ドをプロットするグラフである。

特定の態様の説明 本発明者は、原生動物の寄生虫上玉ヱプ立スヱゴンジイの特定のタンパク質をコ ードする遺伝子物質を初めて同定し、そして得た。その特異的抗原はｐ３０及び Ｂ１抗原である。Ｐ３０抗原は主要表面抗原であり〔Ｋａｓｐｅｒｌ　ｅ　、、 　Ｊ、Ｉ＋＋ｍ、　（１９８３）１３０　：２４０７〜２４１２を参照のこと〕 、そしてワクチン又は診断用標準液の製造のために使用され得る（後者は、ニー ゴンジイを検出するためのイムノアッセイに使用するためのものである）。

Ｂ１抗原の機能及び位置は知られていないが、しかしその多発性ゲノム性質は、 ＤＮＡハイブリダイゼーシッンアンセイのための特に有用な標的にそれをする。

従って、特定された遺伝子物質の同定及び単離は、種々の生化学的成分、たとえ ば抗原、診断用核酸プローブ及びそのプローブを産生ずるためのシステムの産生 を可能にし、そしてこれらは、種々の有用な生物学的用途に使用される。

ペプチドにおけるアミノ酸とそのペプチドをコードするＤＮＡ配列との間に既知 の一定の関係が存在するので、天然のニーゴンジイタンパク質（又は、後で論議 される変性されたペプチドのいづれか）をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子のＤ ＮＡ配列は、特定のアミノ酸配列を示す場合、容易に理解されるであろうし、そ してそのような典型的なヌクレオチド及びアミノ酸の配列が第１表に示されてい る。

鎖のヌクレオチド配列及び対応するペプチドの配列。その数字は、配列の５′末 端で始まるＤＮＡ配列を言及する。そのＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ配列に対応する であろう（但し、ｍＲＮＡにｌ靭ｙ死 正ｌ東１死（続き） まＪ釘り死（続き） 上ｌｌ已死（続き） ＧＡＣＡＡＡ　ＧＧＡ　ＡＡＣＡＣＡ　ＣＴＴ　ＣＧＴ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＴＧ Ｔ　ＧＣＣＣＣＡ　ＴＴＡ上ｌ四碍死（続き） ＣＧＣ 旦」」１剋 ヱ」」１列（続き） 旦ＩＪＵ死（続き） ヱ」」亡死（続き） −ＬＷＳＲＲＩＳＳＲＧＶＰＧ 旦」」ζ死（続き） ＲＷＳＥＰＰＫＩＧＥＮＲＷＣ ＨＶＦＣＱＴＳＬＣＡＥＡＬＰ ＰＳＫＬＱＱＬＬ−ＲＶＲＬＨ ＲＰＮＣＮＮＣＳＳＶＦＶＳＩ ν　　ＱＴＡＴＴＡＬＡＣＳＳＰＦ 旦」」１死（続き） 旦」］亡１（続き） ＬＲＲＹＫＬＬＮＧＰＧＥＴ１ 上」」１死（続き） 遺伝子のＤＮＡ配列は十分に同定されたので、合成化学により完全にＤＮＡ遺伝 子を産生ずることは可能であり、この後、遺伝子は、組換えＤＮＡ技法の既知技 術を用いていづれか多くの利用できるＤＮＡベクター中に挿入され得る。従って 、本発明は、本特許出願の提出の時期、公衆が自由に入手できる試薬、プラスミ ド及び微生物を用いて実施され得る。

たとえば、１００塩基よりも長いヌクレオチド配列は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８０Ａ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒにより 、その商業上の広告により明らかなように容易に合成され得る（たとえば、Ｇｅ ｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅｗｓ、　１１月／１２月、１９８４ ．３ページ）。そのようなオリゴヌクレオチドは、中でも、オーバーラツプする 相補的配列（たとえば１〜１００のコード鎖、０〜５０及び５１〜１５０の相補 的鎖、１０１〜２００のコード鎖、等）を調製する技法を用いて容易にスプライ スされ得、続いてハイブリダイズされ、そして鎖を連結され得る。

さらに、自動化された装置（本明細書に開示されるいづれかのペプチドの直接的 な合成を容易に入手可能にする）もまた利用できる。上記のＧｅｎｅｔｉｃ　Ｅ ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅｗｓの同じ号において、９９％を越える結合効力を 有する市販の自動化されたペプチド合成機が広告されている（３４ページ）。そ のよう−な装置は、直接的な合成又は他の既知の技法を用いて結合され得る一連 のフラグメントの合成のいづれかにより、本発明のペプチドへの容易な接近を提 供する。

第１表に示される特定のポリペプチド配列の他に、これらの配列に基づくペプチ ドフラグメント及びその小さな変化を表わすフラグメントは、種々のペプチドの 生物学的活性を有する。たとえば、ｐ３０抗原自体に対して特異的な免疫グロブ リンにより認識され得るｐ３０ペプチド配列のフラグメントは、容易に調製され 、そしてスクリーンされ得る。ペプチド合成機は、短かなペプチドフラグメント （たとえば１００個以下のアミノ酸）を調製するために使用され得又は遺伝子工 学の技法は、長いフラグメントを調製するために使用され得る。適切なポリペプ チドフラグメントを同定するであろう単純なスクリーニング方法は、Ｐ３０抗原 に対するモノクローナル抗体を調製し、アフィニティカラムにその抗体を結合し 、そしてその結合される抗体により保持されるペプチドフラグメントを捕獲する ことから成る。ポリクローナル抗血清は、所望により、モノクローナル抗体の代 わりに使用され得る。この技法の適合性は、実験的に示された。ｐ３０配列のサ ブ配列がクローン化され、そしてβ−ガラクトシダーゼ融合生成物（ｐ　３０． ５として同定される）として発現されて来た。ｐ３０．５タンパク賞配列をコー ドするポリヌクレオチド配列は、第１図において、ヌクレオチドの数５８２で始 まり、そしてヌクレオチド９９６で終結する。そのｐ　３０．５ポリペプチドは 、ポリクローナル抗−ｐ３０血清と反応する。

大きなタンパク質から免疫学的に活性的な適切なフラグメントを調製し、そして 選択するための能力は、当業界において良く知られており、そして多くの出版物 （特許も含む）に記載されている。たとえば、アメリカ特許第４，６２９，７８ ３号（ウィルスタンパク質の免疫学的に活性的なフラグメントの調製法を記載す る）を参照のこと。

融合されたポリペプチドの形での本発明のポリペプチドの調製法は、１つの通常 の変法である。そのようなペプチドは、典型的には、宿主に発現されることが知 られている遺伝子のプロモーター領域を用いて、そして本発明のアミノ酸配列の すべて又は主要部分をコードするヌクレオチドを宿主タンパク質のための遺伝子 配列中に挿入することによって調製される。そのような融合タンパク質の例は、 上記のβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を包含する。

免疫学的に活性的なペプチドフラグメントを調製するためのもう１つの技法は、 長さく又は、いづれかの介在する長さ、たとえば１０　、１５又はこの範囲にお ける２、３、又は５の倍数）５〜１００個のアミノ酸の一連のアミノ酸を合成し 、そして抗血清（又はモノクローナル抗体）を用いて免疫学的活性についてスク リーンすることである。そのフラグメントは、交差反応性を最適にするためにペ プチドの完全な長さで選択される（たとえば長さ２０個のアミノ酸の一連のペプ チド及びＡＡ、−ＡＡｚｏ、　ＡＡＳ−ＡＡＺＳ、ＡＡＩｇｌ−ＡＡ３０、等を 含んで成る）、その選択されたフラグメントは、本明細書に記載されるようにし て使用するための多量のペプチドを製造するために使用される、特に有用な対応 するヌクレオチド配列に対応するであろう。

さらに、前に言及されたペプチド及びＤＮＡ分子の少々の変更はまた、当業者に より正しく評価されるであろうように、より詳細に示されるこれらのペプチド及 びＤＮＡ分子に等しいように企画される。たとえば、イソロイシン又はバリンに よるロイシン、グルタメートによるアスバーテート、セリンによるトレオニンの 単独の置換、又は構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の類似する置換（す なわち、保存性置換）は、特に、その置換が生物学的活性の結合部位又は他の部 位でアミノ酸を包含しない場合、その得られた分子の生物学的活性に主な効果を 付与しないであろうことを予測することは適切である。変化が機能するペプチド にもたらされるかどうかは、免疫原性の特異性による免疫化又は診断試験におけ る機能についての直接的な分析により容易に決定され得る。この方法の例は、後 で詳細に記載される。１個以上の置換が起こったペプチドは、同じ方法で容易に 試験され得る。好ましいペプチドは、２０個のアミノ酸の連続する群において、 １２個よりも多くない、より好ましくは５個よりも多くないアミノ酸で異なる。

アミノ酸の標準保存群は、−文字のアミノ酸コードを用いて括弧で示される：非 極性（Ａ、Ｖ、Ｌ、１．Ｐ。

Ｍ）；芳香性（Ｆ、Ｔ、Ｗ）；非帯電極性（Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｃ。

Ｎ、Ｑ）ｉ酸性（Ｄ、’Ｅ）；塩基性（Ｋ　、　Ｒ、Ｈ）。芳香族群は、時々、 広定義の非極性（Ｆ、Ｗ）又は非帯電極性（Ｔ）群に属するように思われる。

そのようなペプチドをコードする他のＤＮＡ分子は、第２表におけるコドンの表 から容易に決定され得、そしてさらに、第１表のＤＮＡ配列に等しいように企画 されている。事実、ペプチドにおけるＤＮＡコドンとアミノ酸との間に一定の関 係が存在するので、ペプチドにおける置換又は他の変更の本出願における論議は 、対応するＤＮＡ配列又はＤＮＡ分子、組換えベクター、又は前記配列が位置す る形質転換された微生物に同じように通用されえる（そして逆もまた同様である ）。

手引き：個々の３文字のトリプレ・ントは、左で５′端及び右で３′端を有する ＤＮＡのトリヌクレオチドを表わす。それらの文字は、ヌクレオチド配列を形成 するプリン又はピリミジン塩基を表わす。

Ｘ＝Ｔ又はＣ（ＹがＡ又はＧである場合）Ｘ＝Ｃ（、ＹがＣ又はＴである場合） Ｙ＝Ａ　、　Ｇ　、　Ｃ１又はＴ（ＸがＣである場合）Ｙ＝Ａ又はＧ（χがＴで ある場合） ｗ＝ｃ又はＡ（ＺがＣ又はＴである場合）Ｗ＝Ｃ（ＺがＣ又はＴである場合） Ｚ＝Ａ、Ｇ、Ｃ２又はＴ（ＷがＧである場合）Ｚ＝Ａ又はＧ　（ＷがＡである場 合） ＱＲ＝ＴＣ（ＳがＡ、Ｇ、Ｃ１又はＴである場合）ＱＲ＝ＡＣ（ＳがＴ又はＣで ある場合）Ｓ＝Ａ、Ｇ、Ｃ１又はＴ　（ＱＲがＴＣである場合）Ｓ＝Ｔ又はＣ（ ＱＲがＡＧである場合）第１表に示された特定のヌクレオチドの他に、本発明の ＤＮＡ　（又は対応するＲＮＡ）分子は、特別に列挙されたヌクレオチドの前又 は後に追加のヌクレオチドを有すること力（できる。たとえば、ポリＡは、３′ −末端に付加され得、短い（たとえば２０個よりも少ないヌクレオチド）配列は 、制限エンドヌクレアーゼ部位に対応する末端配列を付与するためにいづれかの 末端に付加され得、停止コドンはペプチドは翻訳を終結するためにペプチド配列 に従えることができる。さらに、遺伝子の上流にプロモーター領域又は他の制御 領域を含むＤＮＡ分子が生成され得る。本発明の配列を含むすべてのＤＮＡ分子 は、少なくとも１つの目的のために有用であろう。なぜならば、すべては、オリ ゴヌクレオチドプローブを生成するために及び生物学源からＤＮＡの単離又は検 出に有用であるように最小に断片化され得るからである。

本発明のペプチドは、まず初めに、直接的な合成又はクローン化された遺伝子又 はそのフラグメントを用いることによって均質調製物として調製され得る。ｐ３ ０ペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーにより前もって富化されたが 、しかしその得られる物質は、他のすべてのトキソプラスマ物質を有さなかった 。“均質”とは、ペプチド又はＤＮＡ配列を言及する場合、考慮される組成物に 存在する実質的にすべての分子の一次分子構造（すなわち、アミノ酸又はヌクレ オチドの配列）が同一であることを意味する。前記文章に使用されるような“実 質的には”とは、少なくとも９５重量％、より好ましくは少なくとも９９重量％ 、及び最っとも好ましくは少なくとも９９．８重量％を意味する。均質ペプチド 又はＤＮＡ配列の完全な分子に起因するフラグメントの存在（５重量％以下、好 ましくは１重量％以下及びより好ましくは０．２重量％以下で存在する場合）は 、均質性の決定に考慮され得ない。

なぜならば、用語“均質”とは、類似する分子量のいくつかの分子（但し、それ らの−次分子構造で異なる）が存在する混合物に反対するものとして、単一の定 義された構造を有する完全な分子（及びそのフラグメント）の存在に関するから である。本明細書に使用される用語“単離された”とは、他のペプチドから分離 される純粋なペプチド、ＤＮＡ又はＲＮＡ１複数のＤＮＡ又は複数のＲＮＡを言 及し、そして単に溶媒、緩衝液、又はその同じ生化学的溶液に通常存在するイオ ン又は他の成分の存在下で見出される。“単離された”とは、それらの本来の状 態での天然の物質又は、成分に分離されているが（たとえばアシルアミドゲルに おいて）、シかし純粋な物質又は溶液のいづれかとして得られなかった、天然の 物質のいづれをも包含しない、用語“純粋”とは、好ましくは、上記“実質的に は”と同じ数字的な限定を有する。句“〜により置換される”又は″置換”とは 、指摘される“置換”アミノ酸が異なった式に存在すべきことが指摘されている アミノ酸と同じ位置に存在する場合（たとえば、ロイシンがバリンの代わりにｐ ３０のアミノ酸３で存在する場合）、存在するペプチドに起こるべきいづれかの 作用を必ずしも言及しない。

本明細書に記載されるペプチドのいづれかの塩は、そのようなペプチドが種々の ｐｎの水溶液中に存在する（又はその水溶液から単離されて存在する）場合、天 然に存在するであろう。指摘された生物学的活性を有するペプチドのすべての塩 は、本発明の範囲内にあると思われる０例として、カルボン酸残基のアルカリ、 アルカリ土類及び他の金属塩、アミノ残基の酸付加塩（たとえばＨＣｆ）及び同 じ分子内でのカルボン酸とアミノ残基との反応により形成された両性イオンを挙 げることができる。

本発明は、第１表及び第２表に列挙された可能性あるコドン選択に基づく組合せ を選択することによって製造され得るポリヌクレオチドのそれぞれの及びあらゆ る可能性ある変更を特に包含し、そしてすべてのそのような変更は、特別に開示 されるものとして考えられる。

遺伝子及び対応するタンパク質は、上記の完全な合成技法により調製され得るけ れども、本発明の好ましい態様においては、遺伝子情報は天然源から得られ、そ して本明細書に記載されているようにして同定される。遺伝子物質は、多くの存 在する技法のいづれかを用いて、遺伝子ライブラリィ−の形で最初に得られる。

次にゲノムＤＮＡをランダムに剪断し、そしてこの剪断された物質を発現ベクタ ー中に挿入する。十分な組換え体が生成される場合、対象の抗原に対応する融合 タンパク質を発現する少なくとも１つの組換え体をその集団中に有する良好な可 能性が存在する。実際、ニーゴンジイのゲノムサイズ（約７　Ｘ１０’ｂｐ）の ためには、少なくとも５×１０６個の独立した組換え体が必要とされる。これは 、少なくとも１つの挿入体が１０個の塩基対領域内に存在するその末端の１つで 存在するであろう組換え体により表わされる完全なゲノムを付与する。６回のそ のような挿入のうちたった１回が正しい配向及び読み枠に整合して存在する場合 、機能的な組換え体は、あらゆる６０個の塩基対に相当する融合体を有するよう なライブラリィ−に存在するにちがいない。

そのようなライブラリィ−は、本発明者の実験室において生成され、そして怒染 されたマウスからの血清によりスクリーンされた。血清と反応性の決定基を発現 する組換え体の中に、平均頻度以上で見出される組換え体が存在した。この組換 え体、すなわち任意に名づけられたＢ１は、次の通り促特徴づけられた。

Ｂ１遺伝子は２．２キロ塩基（ｋｂ）の長さであり、そして頭から尾（ｈｅａｄ −ｔｏ−ｔａｉｌ）の態様で約３５回、並んでくり返えされた。遺伝子の完全な 配列に基づいて、広範な読み取り枠は存在しない。これは、短いポリペプチド生 成物のみがコードされるか、又はこの遺伝子にイントロンが存在するかを示唆す る。

次の配列で示されるように、ヌクレオチド４１１で始まり、そしてヌクレオチド １３８４で終結するＢ゛′１のｃＤＮＡが単離された二次の配列で示されるよう に、ヌクレオチド４５６で始まり、そしてヌクレオチド８４３で終結するような １つのイントロンがゲノム配列に同定された： 従って、ｃＤＮＡクローンの５′−末端で始まり（フレーム３）、新規エキソン の始まりでフレーム１に転換しくこれによってＯＲＦを維持し）、そしてヌクレ オチド】０２０で終結する読み取り枠が存在する。

遺伝子ライブラリィ−を調製するための第二の方法は、寄生体の全ｍＲＮＡ集団 の相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）のコピーを製造し、そしてこれらを、発現ベクタ ーにおける組換え分子としてクローン化することである。本発明者により実施さ れた他の研究は、イントロンが他のエエゴンジイ遺伝子のコード領域内に存在し たことを指摘した。イントロンは剪断されたゲノムＤＮＡの使用を妨げないけれ ども、それらは、スクリーンされるべき組換え体の数を高め、そしてさらに、分 析を実質的に複雑にする。この結果に基づけば、ニーゴンジイ遺伝子を得るため にｃＤＮＡライブラリィ−を使用することは、好ましい。

ｐ３０に対するポリクローナル抗血清を使用して、ｐ３０遺伝子を定めるために ｃＤＮＡライブラリィ−をスクリーンすることができる。この方法で初めに同定 された組換え体は、種々の異なった遺伝子を含むことが見出され、これは、抗− ｐ３０血清との少なくともいくらかの偶然の交差反応が生じたことを意味する。

正しいｐ３０遺伝子は、初期スクリーンにおいて得られる融合タンパク質の個々 に対する抗血清を調製することによって得られる。次に、これらの血清は、ニー ゴンジイの分解物に対してウェスターンプロット分析で使用される。

ｐ３０遺伝子の融合生成物からの抗血清のみが、ｐ３０に対する反応性を卓越的 且つ独占的に示すであろう。

上記方法で得られたクローンは、完全に配列決定された。

この配列を用いて、他のｃＤＮＡクローンを単離した。さらに、これらの配列を 用いて、第１表に示されるような遺伝子の完全なタンパク質−コード配列を予測 することができる。その予測されるアミノ酸配列の疎水性分析は、第１図に示さ れる。

−次翻訳生成物は、３６．２１０ＫＤの予測されるＭｒを有する。それはまた、 表面抗原について予測した通りに、そのＮ−末端で可能性ある疎水性シグナルペ プチドを有する。それは、Ｐ３０タンパク質が糖タンパク質であるかも知れない ことを指摘しているこれまでの研究者の研究と一致する１つの予測されるＮ−グ リコジル化部位（残５２６７）を有する。最後に、それは、いづれか荷電された 残基を後に持たない疎水性Ｃ−末端を有する。これは、明らかに、トリバノソー マにおける本来、報告されている工程の診断に役立ち、そしてそれによって、疎 水性ポリペプチドセグメントが糖脂質アンカーにより置換される。そのような工 程は、現在、ユニ之主ヱ三ヱ（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ　）及びプ立ス±乏’７　 Ｌ　（ＰｌａｓＩＩｌｏｄｉｕｍ）の主要表面抗原のために生じることが知られ ている。

ｐ３０抗原をコードする遺伝子は、単細胞微生物を操作し、そして増殖する標準 技法を用いての完全な又は変性されたペプチドの産生のために使用され得る。ワ クチン開発及び／又は診断用試薬のための候補体である抗原は、感染された患者 からの血清により認識されるものを含むであろう。さらに、いづれかの遺伝子配 列が、ハイブリダイゼーションアッセイにおいてプローブとして使用され得る。

上記に示された技法は、遺伝子工学に関係する当業者の知識及び前で言及された 概要と共に使用される場合、所望する遺伝子の単離及び十分な情報が遺伝子の位 置を定めるために提供されている組換えＤＮＡベクターにおけるその使用を容易 に可能にするであろうけれども、同じ結果を導びく他の方法もまた知られており 、そして本発明の組換えＤＮＡベクターの調製に使用され得る。

ニーゴンジイタンパク質の発現は、形質転換された宿主における遺伝子の複数コ ピーを含むことによって、宿主中で複製することが知られているベクターを選択 することによって、挿入された外因性ＤＮＡ　（たとえばｐＬＩｃ８　；　ｐｔ ａｃ１２　；ｐｌＮ−Ｉ［１−ｏｍｐＡｌ　、　２、又は３　；ｐＯＴｓ、ｐＡ ｓｌ　；又はｐＫＫ２２３−３）から多量のタンパク質を産生ずることによって 又はペプチドの発現を高める他のいづれかの既知手段によって増強され得る。

すべての場合、エーユ之２−イータンパク質は、そのＤＮＡ配列がベクター中に 機能的に挿入される場合、発現されるであろう。“機能的に挿入された”とは当 業者により十分に理解されるように、正しい読み枠及び配向を意味する。所望に より、ハイブリッドタンパク質としての産生（たぶん、その後、切断が行なわれ る）が使用されるけれども、典型的には、遺伝子はプロモーターから下流に挿入 され、そしてその後に停止コドンを従がえるであろう。

本発明に従って、糾換えＤＮＡ分子及び形質転換された単細胞生物を調製するた めに使用され得る上記−船方法の他に、他の既知の技法及びその変法が本発明の 実施に使用され得る。

特に、遺伝子工学に関係する技法は、最近、暴発的な成長及び開発を受けて来た 。多くの最近のアメリカ特許は、プラスミド、遺伝的構築微生物及び本発明の実 施に使用され得る遺伝子工学を行なうための方法を開示する。たとえば、アメリ カ特許第４，２７３．８７５号は、プラスミド及びそれを単離する方法を開示す る。アメリカ特許第４，３０４，８６３号は、ハイブリッドプラスミドが構成さ れ、そして細菌宿主を形質転換するために使用される、遺伝子工学により細菌を 産生ずるための方法を開示する。アメリカ特許第４．４１９．４５０号は、組換 えＤＮＡ研究においてクローニングビークルとして有用なプラスミドを開示する 。アメリカ特許第４，３６２，８６７号は、組換えｃＤＮＡの構成方法及びクロ ーニング工程において有用である、前記方法によって産生されるハイブリッドヌ クレオチドを開示する。アメリカ特許第４，４０３，０３６号は、組換えＤＮＡ ）ランスファーベクターを開示する。アメリカ特許第４，３５６，２７０号は、 組換えＤＮＡクローニングビークルを開示し、そしてこれは、遺伝子工学の分野 に制限された経験を有する人々のために特に有用な開示である。なぜならば、そ れは、遺伝子工学に使用される多くの用語及びその中に使用される基本方法の多 くを定義するからである。アメリカ特許第４．３３６．３３６号は、融合遺伝子 及びそれの製造方法を開示する。アメリカ特許第４．３４９，６２９号は、プラ スミドベクター及びその産生法及び使用法を開示する。アメリカ特許第４，３３ ２，９０１号は、組換えＤＮＡに有用なりローニングベクターを開示する。これ らの特許のいくつかは、本発明の範囲内に存在しない特定の遺伝子生成物の産生 法を言及するけれども、それらの中に記載される方法は、遺伝子工学に関係する 当業者により、本明細書に記載される発明の実施に容易に変性され得る。

本発明の包含は、本発明のニーゴンジイタンパク質及び遺伝子物質の非制限供給 が、診断、免疫化、治療及び研究において使用するための試薬としてこれらの物 質を使用するハイブリダイゼーションアッセイの開発又はいづれか他のタイプの アッセイに使用するために利用できるようになるであろうことにおいて有意であ る。ハイブリダイゼーションアッセイに遺伝子物質を使用する方法は、アメリカ 特許出願第０８０．４７９号（１９８７年７月３１日に提出され、そして通例通 りに譲渡された）に開示され、そしてこれは引用により本明細書に組込まれる。

他の発現ベクターに単離されているニーゴンジイｃＤＮＡのトランスファーは、 旦、２２Ｌ（Ｅ、　ｃｏ旦）におけるＴ。

ゴンジイポリペプチドの発現又は他の宿主におけるそのポリペプチドの発現を改 良する構造体を産生ずるであろう。

本明細書に開示される主要且つ異なったヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレ オチドプローブを用いてニーゴンジイタンパク質を発現するこれらの及び関連す る生物体からの遺伝子の単離が特に言及される。そのようなプローブは、完全な 配列よりも相当に短かいが、しかし少なくとも１０、好ましくは少なくとも１４ 個の長さのヌクレオチドであるべきである。

長さ２０〜５００、特に３０〜２００のヌクレオチドからの中間のオリゴヌクレ オチドが、特に特異的且つ急速に作用するプローブを供給する。遺伝子の完全な 長さまでの長いオリゴヌクレオチドもまた有用である。

使用法においては、プローブは典型的には、検出可能な方法（たとえば３Ｚｐ、 ３Ｈ、ビオチン又はアビジンによる）によりラベルされ、そして遺伝子が探究さ れている生物体の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮ　Ａと共にインキュベートされる。ハイ ブリダイゼーションは、−末鎖及び二本鎖（ハイブリダイズされた）ＤＮＡ　（ 又はＤＮＡ／ＲＮＡ）が分離された（典型的にはニトロセルロース紙を用いて） 後、ラベルによって検出される。オリゴヌクレオチドと共に使用するために適切 なハイブリダイゼーション技法は良く知られている。Ｂ１遺伝子は、常に複数コ ピーで存在するように、特に所望するハイブリダイゼーションの標的である。

プローブは、容易な同定を可能にする検出可能なラベルと共に通常使用されるけ れども、ラベルされていないオリゴヌクレオチドもまた、ラベルされたプローブ の前駆体として及び二本鎖ＤＮＡ　（又はＤＮＡ／ＲＮＡ）の直接的な検出法を 提供する方法、たとえばニトロセルロース上での吸収法に使用するためにも有用 である。従って、用語“オリゴヌクレオチドプローブは、ラベルされた及びラベ ルされていない画形を言及する。

次の例は、本発明をより理解するために例示的に与えられているが、しかし本発 明を限定するものではない。

例 第１表に示される配列を有する遺伝子物質を、下記のようにして単離した。

材料及び方法 Ａ、寄生体材料 本明細書に記載されるほとんどの研究は、上土ル仁１ｉ」仁！研究者の間で最っ とも日常に使用される株である一ト±◇仁Ａｊ−スヱゴンジイのＲＨ株を使用す る（Ｐｆｅｆｆｅｒｋｏｒｎ　ｌｅ、＋Ｅｘ　、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、　（１９ ７６）３９　：　３６５＋〜３７６）　、実験室における連続した継代のその長 い歴史によれば、それは動物中においてひじように毒性であり、そして多量の材 料を得るために理想的にする培養物中で急速に増殖する。しかしながら、それは 、ネコにおいて、完全な仝殖循環を行なう能力を失った。従って、つい最近、完 全な生物学的機能を保持するが、しかしよりゆっくりと増殖する“Ｃ”及び“Ｐ ”株の単離体がまた使用された（Ｐｆｅｆｆｅｒｋｏｒｎ　ｆｊ　？　、、　Ｊ 、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、　（１９７７）６３　：　１５８〜１５９及びＷａｒｅ ）７　ｅ　＋ｌ　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　（１９８７）５５　：　７７ ８〜７８３）。

寄生体は一般的に、培養されたヒト包皮線維芽細胞（ＯＦＦ）の単層において且 ビトロで増殖された。典型的には、ＲＨ株を用いて感染された培養物を、４８〜 ７２時間ごとに、約１：５０の希釈度で感染されていない単層に接種することに よって維持した。これは、感染された培養物の３個のＴ１７５フラスコから約１ ０ｑ個の寄生体を産生ずる。寄生体を、）Ｉｏｓｈｉｎｏ−Ｓｈｉｍｉｚｕ星ｅ 　、、　Ｊ、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ　（１９８０）６６　：　９Ｂ９〜９９１に記 載のようにして、注射器を通してのトリプシン化された細胞の通過及びカラムク ロマトグラフィーによる）ＩＦＦ残骸の除去により生じる細胞溶解物として収穫 された。

Ｂ、゛　−−イブーｉイー ニーゴンジイのための３種の遺伝子ライブラリィ−を、本発明者の実験室で構成 した。他にことわらないかぎり、すべてのライブラリィ−は、メチル化された挿 入体にＥｃｏＲＩリンカ−を付加し、そしてベクターのＥｃｏＲ１部位中にクロ ーニングすることによって構成されたλｇｔｌ１組換え体を含む、これらは次の ものである： １、　λＲ）Ｉｇｌ、すなわちＲＨ株からの針で剪断されたゲノムＤＮＡのライ ブラリィ−１ ２、ＣＲＩ（ｇｌ、すなわちコスミドベクターｃ２χＢ　（Ｂａ　ｔｅｓ　ｆｌ 　ｅ　、　＋釦匹（１９８３）江：１３７〜１４６）のシ徂ＨＩ部位中に挿入さ れた一部５ａｕ３Ａにより消化されたＲＨゲノムＤＮＡのライブラリィ−２及び ３、　λＲＨｃ２、すなわち本発明者の実験室で調製されたＲＨ株タキツォイト ａ＋ＲＮＡのｃＤＮＡライブラリィ−。

ライブラリィ−は、Ｈｕｙｎｈ星＋？、＋　ｌｎ　Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ（ｅｄ ）　：　ＤＮＡＣＩｏｎｉｎｇ＋　０ｘｆｏｒｄ　：　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ（１ ９８５）４９〜７８ページに記載されるようにして構成され、そして操作された 。

ニゴンジイのＲＨ株の２種のポリペプチド抗原に対するモノクローナル抗体を使 用した。それらの特異性と一緒に、これらは次のものである： ａ、７Ｂ８　：　ｐ３０に対する約３０ＫＤの主要表面抗原［ＫａｓｐｅｒｆＬ 煮、　、　Ｊ、　１ｍｍ、　（１９８３）　１３０　：　２４０７〜２４１２） 。

λ　ポリクロ−ル　−トキソプラスマ 本発明者により生ぜしめられた抗血清の他に、共同研究者は次の抗血清を供給し た： ａ、ＨＣｌ・・・・・・）ＩｃＩＯ：エエゴンジイにより先天的に感染された幼 児からのヒト血清、 ｂ、ＨＡ：感染された成人からのヒト血清、ｃ、Ｒｐ３０：精製されたｐ３０に 対するウサギ抗血清ＣｍｃＡｂ　７Ｂ８への免疫吸収により調製された）、及び ｄ、ＲＴＬＩ及ヒＲＴＬ２　：エーゴンジイＲＨ株タキツォイトの溶解物に対す るウサギ抗血清。

ｃＤＮＡライブラリィ−１λＲＨｃ２をスクリーンするためにｐ３゜（Ｒｐ３０ ）に対するポリクローナル抗血清を用いた。いくつかの組換え体を初めのスクリ ーンで同定し、そしてこれらのうち３種を、陽性シグナルの強度及び再生度に基 づいての追加の試験のために選択した。これらの３種の組換え体を、挿入体を単 離し、そして他のものに対するハイブリダイゼーションプローブとしてそれぞれ を用いることによって及び消化されたゲノムＤＮＡのサザンプロット分析により 比較した。これから、それらの３種の組換え体は異なった遺伝子を表わすことが 明らかになり、そしてこれは、少なくとも２種の組換え体が抗−Ｐ３０血清と偶 然の交差反応によることをも包含した。配列及びサザンプロット分析は、それら の明確なコード機能を確認した。正しいｐ３０遺伝子であることを確認するため に、ウサギ抗血清が、アクリルアミドゲルからの適切なバンドを切除し、そして これをウサギ中に注入することによって、個々の融合タンパク質に調製された。

次に、これらの血清を、ニーゴンジイの溶解物に対するウェスターンプロット分 析に使用した。１つのクローン、すなわちλＴｃ３０．５に対する抗血清のみが 、ｐ３０に対する反応性を示した。この血清はまた、溶解物における他の物質に 対する反応性も示した。

これは、同時移動物質よりもむしろＰ３Ｏであったことが、精製されたＰ３Ｏと 抗血清との反応性から明らかである。他の２種のクローンは、明らかに別々の遺 伝子であり、そして多分、単に偶然交差反応したに過ぎない。

λＴｃ３０．５クローンを完全に配列決定し、そしてすでに配列決定されている 他のｃＤＮＡクローンを単離するために使用した。

これらから、ｐ３０コード領域のための完全な配列が由来された（第１表を参照 のこと）、第１図は、予測されるアミノ酸配列の疎水性分析を示す、第一次翻訳 生成物は、正確なアミノ末端は直接的なタンパク質配列決定なしには決定され得 ないけれども、予測される３６．２１０ＫＤのＭｒを有する。それはまた、表面 抗原のために予測されるように、そのＮ−末端で可能性ある疎水性シグナルペプ チドを有する。それは、Ｐ３Ｏが糖タンパク質であることを指摘する従来の結果 と一致する１つの予測されるＮ−グリコジル化部位（残基２６７）を有する。

最後に、それは、いづれの荷電された残基をも後に有さない疎水性Ｃ−末端を有 する。これは、明らかに、トクパノソーマにおける本来、報告されている工程の 診断に役立ち、そしてそれによって、疎水性ポリペプチドセグメントが糖脂質ア ンカーにより置換される。そのような工程は、現在、リーシュマニア及び７”” ２％ニア９Ａの主要表面抗原のために生じることが知られている。

予測されたアミノ酸配列を用いて、臭化シアンフラグメントの大きさを予測する ことができる。そのデータは、２種の大フラグメントを示し、そしてその１つは チロシンを有する。

＋！ＪによりラベルされたＰ２Ｏを用いて、臭化シアンは、いくつかの小さなフ ラグメントと共に、予測された大きさく１１ＫＤ）の単一の大フラグメント（ポ リアクリルアミドゲル電気泳動により）を生成せしめる。さらに、そのポリペプ チド配列は、電荷−シフト免疫電気泳動によりＰ３Ｏについてこれまで指摘され たように、一般的にタンパク質についての実質的な疎水性を予測する。これらの 結果はさらに、組換え体がＰ３Ｏをコードすることを確認する。

推定上のｐ３０遺伝子は、−倍体ゲツム当たり１つのコピーで存在し、そして１ ．５ｋｂのｍＲＮＡをコードする。ノザン分析のシグナル強度（そのバンドは０ ．２５時間で容易に明確になる）及びｃＤＮＡライブラリィ−におけるこの遺伝 子のためのｃＤＮＡＯ数（１０，０００個の組換えファージ当たり少なくとも２ ０個のプラーク）に基づけば、それは、合計の細胞タンパク質の約３％で存在す るタンパク質に予測されるように多くの情報である。

Ｂ１反復道伝王旦土 ニーゴンジイの溶解物に対して生ぜしめられたマウス抗血清は、ポリクローナル 抗血清の利用の前、可能性ある抗原をコードする遺伝子を同定する手段として、 剪断されたゲノムライブラリィ−１λＲＨｇｌをスクリーンするために使用され た。いくつかの組換え体が同定され、このほとんどは、ニーゴンジイゲノムに２ ．２ｋｂの並列反復体として存在する同じ遺伝子（ここでは、Ｂ１として任意に 言及される）を表わした。

部分的なｃＤＮＡクローン（ポリＡ末端を含む）は、λＲＨｃ２ライブラリィー から同定され、そして配列決定された。完全な読み取り枠の一部が同定され（少 なくとも１つのイントロンがゲノム及びｃＤＮＡ配列を比較することからこれま で明らかである）；転写の配向及び転写単位のおおよその末端点が示される。く り返しての試みにもかかわらず、抗血清に対する反応性〔そのような反応性は、 ファージリフト上で容易に再現できるが、しかし誘発された溶原体（ｌｙｓｏｇ ｅｎ）のウェスターンプロットにおいては決して観察されなかった〕を担当する 組換えファージの生成物を同定することはできなかった。この反応性の欠乏が、 ４７Ｙｆでの抗原の同定を妨げた。なぜならば、細菌性生成物が精製のために同 定され得す、そして“抗体選択”が不成功であった（たぶん、血清中の抗−Ｂ１ 抗体の不十分な結合活性及び／又は力価のためである）からである、有意には、 遺伝子は、分析される他のすべての４種のニーゴンジイ株（ＡＩＤＳ患者からの 最近の単離物を含む）のゲノム中に維持される（ＥｃｏＲＩ消化物のサザンプロ ット分析により評価される場合）。

この遺伝子の反復性質は、ハイブリダイゼーションアッセイ、たとえば１９８７ 年７月３１日に提出された先願節０８０．４７９号に記載されるアッセイによる 直接的な診断のための標的としてのその利用性を増強する。

本明細書に言及されるすべての出版物及び特許出願は、本発明が関与する当業者 のレベルの表示である。すべての出版物及び特許出願を、引用により本明細書に 組込む。

本発明は、十分に説明されたけれども、請求の範囲内で修飾及び変更を行なうこ とができる。

国際調査報告 ｔ＋＋＋＋ｖｕ喝鴫−ムーー１−一・　　Ｐ：τ／ＬＩＳξミ　リ、旧８４−− −−−−１１−−−刺―阿−−１−Ａｅｅ１ｇ＋＋＋ｉｅ＋＋１１＋＊、Ｐ口τ ／ＬＩＥ９９／ＱＱε：：ｐＪ−ＰＣＴ／υ５８９１０ＯＢＥ１４ Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｅｒ＋ｎｓ＋　ｐ　７且、　ｔｏｘｏｐｌａｓ＋＋＋ｏｓｉｓ 、　５ｅｑｕｅｎ−ｃｅｓ、　ｇ＠ｎｅｓ、　ｃｌｏｎｉｎｇ、　ｖａｃｃｉｎ ｅｓ、　ａｎｔｉｇｅｎｓ。

ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、　１ｎｖｅｒｔｏｒ’ｓ　ｎａ＋ｏ ｅ。

５ｅｑｕｅｎｃｅ　　Ｄａｔａｂａｓｅｓ　　５ｅａｒｃｈｅ＋ｈ　　ＧＤ：Ｅ Ｂ八へＸ、　　ＥＭＢＬ。

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であって、トキソプラズマゴンジイのｐ３０又はＢ１ ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成るＤＮＡ又はＲＮＡ分子。
2. ２．前記分子が、下記ｐ３０配列： 【配列があります】又は； 下記Ｂ１配列： 〔配列中、 Ａはデオキシアデニルであり； Ｇはデオキシグアニルであり； Ｃはデオキシシトシルであり； Ｔはデオキシチミジルであり； ＪはＡ又はＧであり； ＫはＴ又はＣであり； ＬはＡ，Ｔ，Ｃ又はＧであり； ＭはＡ，Ｃ又はＴであり； 続くＹがＡ又はＧである場合、ＸはＴ又はＣであり、そして続くＹがＣ又はＴで ある場合、Ｃであり；前のＸがＣである場合、ＹはＡ，Ｇ，Ｃ又はＴであり、そ して前のＸがＴである場合、Ａ又はＧであり；続くＺがＧ又はＡである場合、Ｗ はＣ又はＡであり、そして続くＺがＣ又はＴである場合、Ｃであり；前のＷがＣ である場合、ＺはＡ，Ｇ，Ｃ又はＴであり、そして前のＷがＡである場合、Ａ又 はＧであり；続くＳがＡ，Ｇ，Ｃ又はＴである場合、ＱＲはＴＣであり、そして 続くＳがＴ又はＣである場合、ＡＧであり；前のＱＲがＴＣである場合、ＳはＡ ，Ｇ，Ｃ又はＴであり、そして前のＱＲがＡＧである場合、Ｔ又はＣであり；下 側の数字は、ヌクレオチド配列が遺伝子コードに対応するためのペプチド配列中 のアミノ酸位置（該アミノ酸位置はアミノ末端から数えられる）を示し；そして 上側の数字は、５′末端から測定されるヌクレオチド位置を示す〕から選択され る配列を含んで成る請求の範囲第１項記載の分子。
3. ３．前記分子が、下記ｐ３０配列： 【配列があります】 を有する請求の範囲第２項記載の分子。
4. ４．前記分子がＲＮＡであり、そして前記ｐ３０配列に対応する配列又はｐ３０ 配列に補足的な配列を有する請求の範囲第３項記載の分子。
5. ５．前記分子が前記Ｂ１配列を有する請求の範囲第２項記載の分子。
6. ６．前記分子がＲＮＡであり、そして前記Ｂ１配列に対応する配列又はＢ１配列 に補足的な配列を有する請求の範囲第５項記載の分子。
7. ７．前記配列の先にプロモーター配列が存在する請求の範囲第１項記載の分子。
8. ８．前記配列の少なくとも１つのコピーが機能的な組換えＤＮＡベクターに存在 する請求の範囲第７項記載の分子。
9. ９．前記配列が、β−ガル融合生成物をコードする配列の一部として存在する請 求の範囲第７項記載の分子。
10. １０．遺伝子工学的に構成された微生物であって、請求の範囲第８項記載のベク ターを含んで成る微生物。
11. １１．前記微生物がＥ．コリ株である請求の範囲第１０項記載の微生物。
12. １２．単離されたオリゴヌクレオチドであって、請求の範囲第２項記載のヌクレ オチド配列から選択された少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含んで成 るオリゴヌクレオチド。
13. １３．前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡである請求の範囲第１２項記載のオリゴ ヌクレオチド。
14. １４．前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡである請求の範囲第１２項記載のオリゴ ヌクレオチド。
15. １５．前記オリゴヌクレオチドが放射性ラベルされる請求の範囲第１２項記載の オリゴヌクレオチド。
16. １６．前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含 んで成る請求の範囲第１２項記載のオリゴヌクレオチド。
17. １７．請求の範囲第１項記載のヌクレオチド配列によりコードされる遺伝子工学 的に構成されたペプチド。
18. １８．前記ペプチドがグリコシル化されていない請求の範囲第１７項記載のペプ チド。
19. １９．請求の範囲第１２項記載のヌクレオチド配列によりコードされる遺伝子工 学的に構成されたペプチドであって、トキソプラズマゴンジイの抗原と免疫学的 に交差反応するペプチド。