JPH0249591A - 植物ウィルスｒｎａベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上皇肌■公国 本発明は、植物ウィルスＲＮＡベクター、該ＲＮＡベク
ター製造用転写ベクターおよびこれらを用いた有用タン
パクの製造法並びに植物細胞への外来遺伝子の導入方法
に関する。

従来肢歪 トバモウィルス（ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）　は、タバ
コ、トマト、ササゲ、キュウリ等の植物から分離される
棒状ＲＮＡウィルスであり、タバコ、トマト等を宿主と
するタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ）及びキュウリ等
を宿主とするキュウリ縁座モザイクウィルス（ＣＧＭＭ
Ｖ）等がこれに属する。ＴＭＶは、タバコから単離され
た普通系、トマト、ササゲから単離されたトマト系やザ
サゲ系等の数種類があることが知られている。すでに、
トマト系ＴＭＶ−Ｌ株やその弱毒株ＴＭＶ−Ｌ、、Ａ株
等の数種類のトハモウィルスの塩基配列が決定され、そ
の遺伝子構造が解明されている（例えばＮｉｓｈｉＮ１
５ｈｉ　ｅｔ　ａｌ　：　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒ
ｅｓ、　１３．５５８５　（１９８５）　；開田：細胞
工学Ｖｏｌ　４．　Ｎｏ、１１　＋’、９７９−９９０
　（１９８５）　）。

即ち、トハモウィルスのゲノムにはウィルス複製に関与
している２種のタンパク、３０にタンパクおよびコート
タンパクの４種類のタンパクがコードされていることが
知られており、ＴＭＶについて言えば、ウィルス複製に
関与している１３０にタンパクおよびそのリードスルー
クンバクである１８０にタンパク、ウィルスの細胞間移
転に必要な３０にタンパクおよびコートタンパクの４種
類の遺伝子から成り立っていることが知られている。

また、ＴＭＶ−Ｌ株およびＴＭＶ−Ｌ＋＋Ａ株ＲＮＡの
完全長ｃＤＮＡを作成し、これをアールキスト（Ａｈｌ
ｑＧｉｓｔ）らの開発した転写ベクターｐＰＭ１ヘクロ
ーニングし、これを線状化した後、大腸菌のＲＮＡポリ
メラーゼでインビトロ転写反応を行い感染性ＴＭＶ−Ｒ
Ｎ　Ａを再生することに成功している。

本発明者らは、既にトハモウィルスのコートタンパク遺
伝子領域を所望の外来遺伝子で置換した配列のＲＮＡを
転写産物とする転写ベクターを開発し、これにより所望
の外来遺伝子を植物細胞で発現させることができる植物
ＲＮＡベクターの製造に成功している（特開昭６３−１
４６９３）。

さらに本発明者らは、トパモウィルスの３０Ｋ　９ンパ
クおよびコートタンパクをコードする領域を所望の外来
遺伝子で置換することにより植物細胞間移転能を持たな
い植物ＲＮＡベクターを製造することに成功した（特願
昭６２−２８０５３０）。

本発明者らは、トバモウィルスＲＮＡを植物細胞におけ
る有用タンパク生産に用いる植物ベクターに利用する目
的で更に研究を進め、本発明を完成した。

光亙坐ｌ景 本発明者らは、トハモウィルスＲＮＡを利用した植物Ｒ
ＮＡベクターについて更に研究を進め、トバモウィルス
ＲＮＡのコータンパク遺伝子の下流に外来遺伝子を接続
することにより、コートタンパクと外来タンパクの融合
タンパクを生産可能トスる植物ＲＮＡベクターを製造す
ることに成功した。また、この植物ＲＮＡベクターを転
写産物とするＲＮＡベクターの製造用転写ベクターの製
造に成功し、本発明を完成した。

本発明の植物ＲＮＡベクターは、外来タンパクをコート
タンパクのカルボキシ末端にメチオニン残基等の接続領
域を介して接続した所謂、融合タンパクとして止産可能
七するもので、融合タンパクは大量発現し、細胞内で安
定に蓄積される。

船釣に、分子量の小さなタンパクの生産は、困難とされ
ているが、コートタンパクとの融合タンパクにすること
で、効率よく生産することが可能となった。接続部を適
当な手段を用いて切断することにより、容易に外来タン
パクを分離・回収することができる。

光皿Ω盗底 本発明は、トバモウィルスＲＮＡのコートタンパク遺伝
子下流に、メチオニン残基等の接続領域を介して外来遺
伝子を接続し、コートタンパクと外来タンパクの融合タ
ンパクを生産可能とする植物ＲＮＡベクター、トバモウ
ィルスＲＮＡのコートタンパク遺伝子の下流に外来遺伝
子を接続し、コートタンパクと外来タンパクの融合タン
パクを生産可能とするトバモウィルスＲＮＡを転写産物
とする転写ベクターおよびこれらの製造法並びに植物細
胞への外来遺伝子の導入方法を提供する。

溌１！υＵ杓萌１呵 本発明のＲＮＡベクターは、トバモウィルスのコートタ
ンパク遺伝子の下流に外来遺伝子を接続し、コートタン
パクが外来タンパクと結合した融合タンパクとして産生
ずるよう構築されたものである。

このＲＮＡベクターの製造は、以下の工程により実施す
ることができる。

１）ウィルスＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを合成２）ウィル
スＲＮＡの完全長ｃＤＮＡのコートタンパクをコードす
る領域に、外来遺伝子が接続した組換えｃＤＮＡを含み
これに対応する配列のＲＮＡを転写産物とする転写ベク
ターを構築３）上記の転写ベクターを線状化 ４）線状化された転写ベクターを常法に従ってＲＮＡポ
リメラーゼによる転写反応を行い、目的の組換えＲＮＡ
ベクターを製造する。この際、ｍ７ＧｐｐｐＧの存在下
にＲＮＡポリメラーゼにより転写反応を行い、ＲＮＡの
５゛末端をキャンプ構造でブロックした場合には、植物
細胞への組換えｒｌＮＡの感染性が顕著に増大するが、
ＲＮＡの５゛末端をキャップ構造でブロックすることは
必須ではない。また、ＲＮＡの３゛末端については、３
゛末端を越えて多くのヌクレオチドが接続してないこと
が望ましく、転写ベクターによるｃＤＮＡからのＲＮＡ
の転写に際し、ＲＮＡの３°末端で正確に転写が終了す
ることが望ましい。この為に、鋳型となるｃＤＮＡ３’
末端の間近かに適当な制限酵素（例えば、旧ｕｌ）によ
る切断部位を組込み、転写の前に、そこでｃＤＮＡを切
断することにより転写を停止させるとか望ましい。

本発明において、ベクターとして使用するトハモウィル
スとしては、トマト系、普通系、ササゲ系等のＴＭＶお
よびＣＧＭＭＶを用いることができる。

野生型および植物に対し病徴を生じない感染性を示す自
然変異株あるいは組換え技術により変異を生じさせ弱毒
化したものを用いることが可能である。

ウィルスＲＮＡの完全長のｃＤＮＡは逆転写酵素でＲＮ
Ａを逆転写する公知の方法で容易に作成することができ
る。例えば、ＴＭＶ−Ｌ株のゲノムＲＮＡ　（１〜６２
１５番目）のｃＤＮＡおよび３゛末端１．６ＫｂのｃＤ
ＮＡ、並びにその弱毒株ＴＭＶ−Ｌ＋　＋Ａ株の完全長
ｃＤＮＡをクローニングしたプラスミドｐＬＴ−Ｄ２７
、ｐ＋、−１−１３およびｐＬ＋　＋Ａ−Ａ２５などが
公知であり、それぞれ０ｈｎｏ　ｅｔ　ａｌ　：　Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９６＋１９］５　１９２３（１９８
４）、Ｔａｋａｍａｔｓｕ　　ｅｔ　ａｌ、　　：　　
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１１．３６７６
−３７７８　（１９８３）、およびＮｉｓｈｉＮ１５ｈ
ｉ　　ｅｔ　　ａｌ　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ
　　Ｒｅｓ＋　　１３＋５５８５５５９０　（１９８５
）に記載の方法で製造できる。

本発明のＲＮＡベクターの製造に鋳型として用いられる
ＤＮＡは、ウィルスＲＮＡの完全長ｃＤＮＡのコートタ
ンパクの遺伝子領域に外来遺伝子を接続したＤＮＡを転
写ベクターに組み込むことにより製造されるが、この組
換え転写ベクタ上自体の構築は、遺伝子組換えで用いら
れる常法を用いることにより行うことができる。

特に、複製開始領域、選択マーカー、プロモーター、ト
ハモウィルスＲＮＡの完全長ｃＤＮＡおよびこの部分に
続く外来遺伝子を含むトハモウィルスＲＮＡのｃＤＮＡ
から成り、該プロモーター転写開始ヌクレオチドが該ｃ
ＤＮＡの最初のヌクレオチドであるように接続されてい
る転写ベクターを用いることにより容易に行うことがで
きる。

この転写ベクターの外来遺伝子挿入部分に所望の遺伝子
を通常の遺伝子組換え技術を用い挿入することにより目
的とする転写ベクターを構築することができる。

コートタンパク遺伝子と外来遺伝子の接続は、融合タン
パクをコートタンパクと外来タンパクに切断、分離でき
るように、そのような機能を有する塩基配列をコートタ
ンパク遺伝子と外来遺伝子の間に介在させて接続する。

接続領域の塩基の種類に応じて、適当な処理を行うこと
により、接続領域を切断し、目的の外来タンパクを分離
する。

接続領域および切断方法は、上記の目的に添うものであ
れば、特に制限されない。例えば、メチオニン残基をコ
ードする塩基を介して接続した場合は、シアノジエンブ
ロマイド処理により切断し、目的の外来タンパクを分離
できる。又、特定のアミノ酸残基を接続領域に用い、そ
れに対するタンパク分解酵素の特異的な切断作用を利用
することも可能である。例えば、アルギニン、リジン残
基をコードする塩基を介して接続し、トリプシン処理を
行う方法、チロシン、トリプトファン、フェニールアラ
ニン残基をコードする塩基を介して接続し、キモトリプ
シン処理を行う方法等も有効である。さらに、目的の外
来タンパク内部に切断が入らないようにするため、より
特異的には（イソロイシン）−（グルタミン酸）−（グ
リシン）−（アルギニン）−のような特異なアミノ酸配
列を接続部に用い、血液凝固因子Ｘａを作用させ、外来
タンパクを分離することも可能である。外来遺伝子の挿
入は、例えば以下のようにして行なえる。

例えば、第１図のように転写ベクターのコートタンパク
遺伝子領域の３゛側に存在するＡｖａ　Ｕサイト及び３
”非翻訳領域の５“側に存在するＮ５ｉｌザイトを切断
し、Ａｖａ　Ｈ−Ｎｓｉｌ断片を切り出す。切り出した
断片のかわりに、５゛端にメチオニン残基コーディング
塩基等の介在塩基を有する外来遺伝子含有ＤＮＡ断片を
挿入する。外来遺伝子含有ＤＮＡ断片の合成は（介在塩
基−外来遺伝子）がコートタンパク遺伝子と３゛非翻訳
領域遺伝子の間に挿入された以外は挿入前後の転写ベク
ターの塩基配列が同一となるように行うのが好ましい。

しかしながら、コートタンパク遺伝子及び３゛非翻訳領
域遺伝子は必ずしもその全長が再生される必要はなく、
その一部が欠失していても構わない。また、」二記にて
用いた制限酵素サイトはＡｖａ　ＩＩ、Ｎ５ｉｌサイト
に限定されるものではなく、適当なサイトを使用できる
。

上記の転写ベクターは公知の技術を用いて製造すること
ができるが、その−例を以下に示す（第１図参照）。

云　ベクター　ＬＣＬＥの マス、トマト系タバコモザイクウィルス−Ｌ株（ＴＭＶ
−Ｌ）の完全長ｃＤＮＡを転写ベクターｐＰＭ１（特開
昭６ｌ−５７７９）に組み込んだ公知のプラスミドｐＬ
ＦＷ３　　（特開昭６３−１４６９３　　：　Ｍｅｓｈ
ｉ　ｅｔ　ａｌ、　：Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　八
ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、　　Ｖｏｌ　　８３
．　５０４３５０４７　　（１９８６）　）を各種制限
酵素で切断し、複製起点、Ｐｍプロモーター、　　１３
０に／１８０にタンパク遺伝子の１部を含む約８．０Ｋ
ｂｐのＫｐｎｌ／Ｍｌｕ＋断片、１３０に／１８０にタ
ンパク遺伝子の１部および３０にタンパク遺伝子の１部
を含む約１．２ＫｂｐのＫｐｎＩ／Ａａｔ　Ｉ断片、３
０にタンパク遺伝子の１部およびコートタンバク遺伝子
の１部を含む０．５６ＫｂρのＡａｔＩ／Ａｖａ　ＩＩ
断片、さらに、３°非翻訳領域を含む約０．２２Ｋｂｐ
のＮ５ｉｌ／ＭＩｕＴ断片を調製する。つぎに、Ｌｅｕ
−エンケファリンをコートタンパクとの融合タンパクと
して発現させるため、第２図に示す、各々、３８ｍｅｒ
。

および４５ｍｅｒのデオキシオリゴヌクレオチドを合成
した。この２木のオリゴヌクレオチドをアニルすること
により、コートタンパクのカルボキシ末端６個のアミノ
酸、Ｔｈｒ、　Ｓｅｒ、　Ａｌａ、　Ｐｒｏ＋＾１ａＳ
ｅｒこれに続＜　Ｍｅｔ、さらに、Ｌｅｕ−エンケファ
リンのＴｙｒ、　Ｇｌｙ、　Ｇｌｙ、　Ｐｈｅ、　Ｌｅ
ｕの５つのアミノ酸をコードしうるリンカ−ＤＮＡ断片
を調製できる。

先に調製したＫｐｎｌ／Ｍｌｕｌ、　Ｋｐｎｌ／Ａａｔ
ｒ、八ａｔＩ／Ａｖａ　Ｕ　。

Ｎ５ｉｌ／Ｍｌｕｌ断片に、合成リンカ−を加え、Ｔ、
ＤＮＡリガーゼにより、結合し、大腸菌ＨＢＩＯＩに導
入し、目的のコートタンパク＋Ｌｅｕ−エンケファリン
融合タンパクの発現を荷負う転写ベクターｐＬＣＬＥを
単離した。第３図から明らかなように、転写プラスミド
ｐＬＣＬＥはＭｅｔ　＋１．ｅｕ−エンケファリンをコ
ードする配列が挿入されている以外、ｐＬＦＷ３と同一
である。本発明により植物細胞へ導入される遺伝子とし
ては、単に生理活性ペプチドの遺伝子に限定されるもの
ではなく、例えば高温や低温のストレスに対する耐性を
改善する遺伝子、霜、害虫、病原微生物、ウィルス等に
対する耐性を改善する遺伝子、植物の成長に関与する遺
伝子、窒素固定化に関与する酵素の遺伝子、光合成に関
与する遺伝子、植物の栄養上の特性や風味に関する遺伝
子などのを用物質の遺伝子が挙げられる。

云１、　　　　　への座込 上記のように製造した転写ベクターｐＬＣＬＥを制限酵
素Ｍｌｕｌで消化後、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼを用い
公知法（Ａｈｌｑｕｉｓｔ　ｅｔ、ａｌ、Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８１．７０６６−７０
７０　（１９８４）　）により転写した。得られたＲＮ
Ａをフェノール抽出およびエタノール沈澱で精製した。

これを公知のエレクトロポレーション法（ＦＥＢＳ　Ｌ
ｅｔｔｅｒ、　２１９．６５−６９、Ｗａｔａｎａｂｅ
　ｅｔ、ａｌ、１９８７　）により直接タバコのプロト
プラストに導入した。プロトプラストを洗浄後、プロト
プラスト培地を加え、２８°Ｃでインキュベートシ約１
０５セルのプロトプラストをエッペンドルフ管にとり遠
心した。集めたプロトプラストを５０μ℃のゲル・ザン
プルハノファ−（１０χグリセロール、６２．４ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−１１ＣＩ（ｐＨ６，８，２５°Ｃ）２χＳＤ
Ｓ。

３χβ−メルカプトエタノール、０．００８χブロモフ
エニール　ブルー（ＢＰＢ）　’）に懸濁したのち、１
００°Ｃで２分間処理した。また、エレクトロポレーシ
ョン法のかわりに、組換えＲＮＡベクターを感染により
植物細胞へ導入することができる。この際、ウィルスの
コートタンパクを用いウィルスの再構成を行った後に、
植物へ接種することにより植物細胞へ感染させることに
より、感染率を増大させることができる。植物細胞への
感染は、再構成反応液を必要に応し、水、緩衝液等で適
当な濃度へ希釈後、あるいはウィルスまたはＲＮＡを緩
衝液等で懸濁し、カーボランダムと共に植物へ接種する
ことにより容易に行うことができる。

−■タンパクのノ＼ プラスミドｐＬＣＬＥ由来のｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写物を
エレクトロポレーション法によりタバコプロトプラスト
に感染後、２０時間後に細胞を集め、先に示した方法に
より電気泳動用試料を調製した。Ｌａｅｍｍ　Ｉ　ｉの
方法（Ｎａｔｕｒｅ　２２７６８０−６８５．　（１９
７０））に従って、５ＤＳ−１２％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動に供し、泳Ｍｆ＆、ゲルをコマシー・ブリ
リアント・ブルーで染色後、脱色した。コートタンパク
とＬｅｕ−エンケファリンの融合タンパクに相当するバ
ンドを切り出し、試験管に入れ、ガラス棒ですりつぶし
た。

３〜５倍量の蒸留水を加え、３０’Ｃで一晩溶出した。

得られたン容出液をガラス・ウールをつめたチップに通
し、溶出液を回収した。さらに、溶出液を凍結乾燥機に
かけ、凍結乾燥した。得られた融合タンパク質を蒸留水
に溶解し、融合クンバクの分子数の約２，０００倍の分
子数のシアノジエンブロマイド（ＢｒＣＮ）を含む７０
％ギ酸中で３０°Ｃで一晩処理し、コートタンパクと外
来タンパクを切断する。処理後、１０倍量の蒸留水を加
え、凍結乾燥する。適当量の蒸留水に溶かし、再度凍結
乾燥する。同様の操作をさらにもう１度くり返す。

Ｌｅｕ−エン　ファリンのゝ 上記の凍結乾燥品を１００μｌの０．１％トリフルオロ
酢酸（ＴＦＡ）／蒸留水に熔解し、そのうち９０μｌを
ＨＰＬＣの分析に用いた。μＢｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１０
（ウォーターズ社製）　　３．９Ｘ３００ｍｍのカラム
を溶液Ａとして、０．１％ＴＦＡ／蒸留水、溶液Ｂとし
ては、０．１％ＴＦＡ／９５％アセトニトリルを用いた
。溶液の濃度勾配は、０〜２分ばＢ液０％、２分〜５７
分までは１％ＢＭアップでＢ液５５％まで上昇させ、５
７−６０分でＢ液１００％に達した。６０〜６２分まで
Ｂ液１００％とし、以降６５分まででＢ液を０％までに
減じた。送液の流速は１分間あたり１成とし、目的タン
パクの検出はＡ２□。で行った。第４図ａに明らかなよ
うに、調製したＬｅｕ−エンケファリンは、陽性対照と
して用いた基準Ｌｅｕ−エンケファリンと全く同じＲｅ
ｔｅｎｓｉｏｎ　ｔｉｍｅの位置に検出された。ピーク
画分を分取した後、凍結乾燥液、再度アセトニトリルに
溶解し、アミノ酸配列を決定するために、アプライド・
バイオシステム社４７０Ａ型のアミノ酸シーケンサ−に
かけた。ＰＴＩ＋アミノ酸の分析は、標品を逆相Ｃ１Ｂ
カラムにかけたあと、Ａ液：１．３％ＢｕＣ１６，７％
イソプロパ／　−ル／Ｃ８，ＣＮ、　　Ｂ液：　４０ｍ
Ｍ　Ｎａ−Ａｃｅｔａｔｅ、　Ｃ液：Ｈ２Ｏの３液温合
による濃度勾配をかけ、目的ピークをＡ２５．で検出し
た。その結果、５つのアミノ酸配列のうち、アミノ末端
から３番目までのチロシン、グリシン、グリシンの配列
が検出され、基準ザンプルのＬｅｕ−エンケファリンと
同一であることが明らかとなった。

従って、植物細胞中で発現したコートタンパクとＬｅｕ
エンケファリンの融合タンパクから比較的容易にＬｅｕ
−エンケファリンを分離・精製することが可能となった
。

参考例 完全長のＴＭＶ−ＬのｃＤＮＡを含む転写ベクターｐＬ
ＦＷ３の構築： ＴＭＶ−ＲＮ　Ａの完全長ｃＤＮＡの合成１）　ＴＭＶ
−Ｌ株あるいは弱毒株ＬｚＡをタバコに接種し増殖させ
た。感染されたタバコを磨砕後、ウィルス粒子を公知の
方法で精製し、次いでウィルス粒子からＲＮＡを公知法
（Ｔａｋａｍａｔｕ　ｅｔ　ａｌ。

ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１１．３７６７
−３７７８　（１９８３）　）で精製した。このＲＮＡ
を過剰の合成プライマー（ＴＭＶ−ＲＮ　Ａの３゛末端
の１８残基に相補的な配列を有する。或いは、必要に応
し３゛末端の第９番目に相当するＡをＴに変換したもの
を使用）とアニールにした。このアニールしたＲＮＡを
用い、５ｃＩｇ／ｄのアニールＲＮＡおよび２５０単位
／　ｍｌの逆転写酵素を含む反応液を調製、これを４２
°Ｃ１９０分間反応しｃＤＮＡを合成した。フェノール
抽出、エノタール沈澱によりＤＮＡを回収後、０．　ｌ
ＮＮａＯＨによりＲＮＡを分解した。これを５〜２０％
アルカリショ糖密度勾配遠心あるいは２．５％ポリアク
リルアミド／８．３Ｍ尿素ゲル電気泳動にかけ完全長の
ＲＮＡに相当するｃＤＮＡを分取した。上記のように合
成した完全長ｃＤＮΔに過剰の合成プライマー（ＴＭＶ
−ＲＮ　Ａの１〜１９残基に相当する配列を有する）を
加え１０ｍＭＴｒｉｓ−）１ｃＩ　（ｐＨ７，５）、１
０ｍＭＭｇＣｌ　ｚ、５０ｍＭＮａＣ１中で、９０°Ｃ
で５分間加熱した後、徐々に冷却しアニールした。

このｃＤＮＡを１０ｍＭＴｒｉｓ−ＩＩＣＩ（ｐＨ７，
５）、２５ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５ｍ
Ｍジチオスレイトール、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ中で２
５０単位／　ｍｌの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩラージ
フラグメントを加え２１°Ｃで３時間反応し二本鎖ｃＤ
ＮＡに変換した。低融点アガロースゲルにより精製し完
全長の二本鎖ＣＤＮＡを得た。

完全長ｃＤＮＡのクローニング ｐＵｃＧ９１の構築 ｐＵＣ９のポリリンカー配列部位にＭＩｕＴサイトを導
入するために、ｐＣＧ９Ｆ２（Ｍｅｓｉ　ｅｔ　ａｌ、
νｉｒｏｌｏｇｙ１２７．５４−６４　（１９８３）　
；　ｃｕｃｕｍｂｅｒ　ｇｒｅｅｎ　ｍｏｔｔｌｅｍｏ
ｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓのＭｌｕｌサイトを含む約１．６
Ｋｂを含む）の０．２１Ｋｂの旧ｎｄＩ［ｌ／フィル−
イン旧ｕｒフラグメントをｐＵｃ９　（Ｖｉｅｉｒａ　
ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ　１９＋　２５９２６８　（１
９８２）の旧ｎｄｌＩＩ／フィルーインＳａｌ■サイト
へ挿入しｐＵｃＧ９１を構築した。

ＴＭＶ−Ｌ株の完全長ｃＤＮＡを含むプラスミドｐ１、
ＦＷＩの構築 １）　　ｐＬＭ５１および９１Ｍ３１の構築上記のよう
にして得られた完全長二本鎖ｃＤＮＡ　（ＴＭＶ−Ｌ株
）をＢｇｌ　［［テ消化し、ＲＮＡ（７）５’末端部分
に相当する２、６２Ｋｂを得た後、精製した。

これをｐＰＭｌのＰｍプロモーターを含む３．０３Ｋｂ
のＡａｔｌｌ／ＳｍａＴフラグメントおよびｐＵｃ９の
０．４７ＫｂのＡａ　ｔ　ＩＩ　／　ＢａｍＨＴフラグ
メントと結合した。結合したＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ　Ｍ
Ｃ１０６１（Ｃａｓａｄａｂａｎ　ｅｔ　ａｌ、：ＪＭ
ｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　１３８．１７９−２０７　（１９
８０）　）へ形質転換した。コロニーハイブリダイジョ
ンおよび制限酵素地図を作成し、ｐＬＭ５１を含む大腸
菌を選択した。

２）　　９１Ｍ３１の構築 上記のようにして得られた完全長二本鎖ｃＤＮＡ　（Ｔ
ＭＶ−Ｌ　　３’末端の第９番目のＴがＡへ変換された
変異体のｃＤＮＡ）をＰｓｔｌで消化し、ＲＮＡの３”
末端部分に相当する４、５４Ｋｂを得た後、精製した。

これをｐＨｃ９の２．１８ＫｂのＡａｔ　ＩＩ　／　Ｐ
ｓｔｌフラグメントおよびｐＵｃＧ９１の０．４９Ｋｂ
のへａｔｌＩ／フィルインＭｌｕｌフラグメントを結合
した。　結合したＤＮＡをＥ。

ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１へ形質転換した。コロニーハイ
ブリデイジョンおよび制限酵素地図を作成し、９１Ｍ３
１を選択した。

３）　　ｐＬＦＷｌの構築 ９１Ｍ３１のＰｓｔＩサイトに、ｐＬＭ５１のＰｓｔｌ
フラグメント　（Ｐｍプロモーターおよび５゛末端を含
む、）を挿入することにより完全長ｃＤＮＡを含むｐＬ
ＦＷｌを構築した。

ｐＬＦＷ３の構築 ｐＬＦＷｌの１ｌｃｏ＋／八ｐａ＋フラグメントをｐＬ
−１−１３（Ｔａｋａｍａｔｓｕ　ｅｔ　ａｌ、　Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１３７６−３７
７８（１９８３）　　：約１．６００ｂｐ（７）ＴＭＶ
−Ｌ株ノ３゛末端のｃＤＮＡを含む、）のＮｃｏｌ／Ａ
ｐａｌｃｏｌｉントで、ＥｃｏＲＩ　／　ＮｃｏＩフラ
グメントをｐＬＴ−０２７（Ｏｈｎ。

ｅｔａｌ、：　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、９６．１９１５−
１９２３（１９８４）　：ＴＭＶ−Ｌ株Ｒ’ＮＡの５゛
末端から６２１５番までのｃＤＮＡを含む）のＥｃｏＲ
Ｉ　／　Ｎｃｏｌフラグメントで置換することによりｐ
ＬＦＷ３が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、転写ベクターｐＬＣＬＥ構築の概略を示す図
である。図中Ｐｍは、アールキストの開発したｐＰＭ１
由来のλファージのプロモーターを示す。 １３０に／１８０に、　３０におよびｃｐは、各々、Ｔ
ＭＶ　ノ１３０に／１８０にタンパク遺伝子、３０にタ
ンパク遺伝子およびコートタンパク遺伝子を示す。その
前後の四角で囲んだ５”および３゛ば、それぞれ５”末
端非翻訳領域および３゛末端非翻訳領域を示す。ＥｎＫ
は、導入するＬｅｕ−エンケファリン遺伝子を示す。同
遺伝子は合成リンカ−ＤＮＡ中にコードされている。 第２図はしｅｕ−エンケファリン遺伝子を含む合成りＮ
Ａリンカ−を作製するために用いた２本の合成オリゴヌ
クレオチドの塩基配列を示す。２本の合成オリゴヌクレ
オチドをアニールすることにより、両端に各々、Ａｖａ
　Ｕ、Ｎ５ｉｒ部位が形成される。 第３図は、構築された転写ベクターｐＬＣＬＥのコート
タンパクとＬｅｕ−エンケファリンタンパク遺伝子の融
合部分の塩基配列を示したのものである。 Ｌｅｕ−エンケファリンはコートクンバクのカルボキシ
末端とメチオニン残基を介して結合している。 第４図ａは、標準Ｌｅａ−エンケファリンのＩ　Ｐ　１
．Ｃプロファイルを示し、第４図すは、植物細胞から調
製したコートタンパクとＬｅｕ−エンケファリンの融合
タンパクから、調製したＬｅｕ−エンケファリンのＨＰ
ＬＣプロファイルを示す。 昭和６３年１２月１６０ １゜ ２゜ ３゜ ４、

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）トバモウィルスＲＮＡのコートタンパク遺伝子の
   下流に外来遺伝子を接続し、コートタンパクと外来タン
   パクの融合タンパクを生産する植物ＲＮＡベクター
2. （２）トバモウィルスＲＮＡのコートタンパク遺伝子の
   下流に外来遺伝子を接続し、コートタンパクと外来タン
   パクの融合タンパクを生産するトバモウィルスＲＮＡを
   転写産物とする転写ベクター
3. （３）複製開始領域、選択マーカー、プロモーターおよ
   びコートタンパク遺伝子の下流に外来遺伝子を接続し、
   コートタンパクと外来タンパクの融合タンパクを生産す
   る配列を有するトバモウィルスＲＮＡのｃＤＮＡからな
   り、該プロモーターの転写開始ヌクレオチドが該ｃＤＮ
   Ａの最初のヌクレオチドであるように接続されている特
   許請求の範囲第２項記載の転写ベクター
4. （４）プロモーターがλファージのプロモーターである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第２あるいは第３項記
   載の転写ベクター
5. （５）転写ベクターｐＬＣＬＥ
6. （６）トバモウィルスＲＮＡのコートタンパク遺伝子の
   下流に外来遺伝子を接続し、コートタンパクと外来タン
   パクの融合タンパクを生産する植物ＲＮＡベクター、あ
   るいは該植物ＲＮＡベクターを用い再構成したウィルス
   を接種することを特徴とする植物細胞へ外来遺伝子を組
   み込む方法