JPH0242351A

JPH0242351A - 高濃度のポリオールを含有する電気泳動ゲル

Info

Publication number: JPH0242351A
Application number: JP1115912A
Authority: JP
Inventors: Bertold J Radola; ベルトルト　ヨット　ラドラ; Claus Dr Schneider; クラウス　シュナイデル
Original assignee: Serva Feinbiochemica GmbH and Co
Current assignee: Serva Feinbiochemica GmbH and Co
Priority date: 1988-05-09
Filing date: 1989-05-09
Publication date: 1990-02-13
Also published as: EP0341577A2; DE3815758A1; EP0341577A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（発明の産業上の利用分野）本発明は高濃度のポリオールを含む改良された電気泳動
ゲルに関する。

（従来の技術とその課題）現在量も重要である高分解能電気泳動技術に於いて、ゲ
ルマトリックスが主として電解質系の対流防止の（ａｎ
ｔｉｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ）安定化に使用される。

操作上の利点のため、それらは通常圧縮形態または粒状
形態のポリアクリルアミドゲル、更にまれにはアガロー
ス（寒天）もしくはデキストランのゲルである。これら
のゲルは、用途に応じて、洗剤、尿素、還元性物質及び
／または分離剤（特定の分離系に於ける分解能を改良す
るための物質）の如き種々の添加剤を含んでもよく、し
ばしばグリセロール、ソルビトール、サッカロース等の
如きポリオールの性質の物質を含むことがある。これら
の後者の物質は製造法のために成る程度ゲル中に入る。

溶液（例えば、“軽質”及び“重質”の溶液）の密度に
差異をもたらすため、ポリオールは特に勾配ゲルの製造
に於いて重合溶液に添加される。このようにして製造さ
れたゲルに於いて、ゲル中のポリオールの濃度は勾配に
従って不均等に分布される。

しかしながら、ポリオールがゲルに計画的に添加されて
ゲルの性質を改良する幾つかの適用が知られている。か
くして、例えば、５０〜２５０μｍの厚さを有する超薄
ゲルは５〜１０％のグリセロールを含み、ゲルが貯蔵、
試料適用及び分離の間に解離することを防止する（Ａ、
キンツコファー（Ｋｉｎｚｋｏｆｅｒ）及びＢ、Ｊ、ラ
ドラ（Ｒａｄｏｌａ）著、１２０〜５０μｍのポリアク
リルアミドゲルに於けるミニチュアの超薄層の等電果中
（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｆｏｃｕｓｉｎｇ）Ｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　１９８１年・２巻、１７４〜
１８３頁を参照のこと）。等電果中がポリアクリルアミ
ドゲルまたはアガロース中で行なわれる場合には、滲出
液がゲルの表面上で観察され、これが分離に影響を及ぼ
すか、あるいはそれを不可能にさえする。分離された物
質の一部及びまた電解質系の成分が滲出液中に拡散し、
汚染及び分解能の損失を生じる。滲出液の生成は、一部
ゲルマトリックスの性質により、−都電解質及びそれら
の上に分離された試料の性質に影響されるが、外部因子
、特に相対湿度、温度及び使用された装置により大きく
影響される。ＣＢ、Ｊ、ラドラ（Ｒａｄｏｌａ　）著、
“高分解能等電集中：タンパク質及び酵素の分析用分離
及び分取用分離への新しい試み“Ｈ。

ヒライ（Ｈｉｒａｉ）編集、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ
ｓｉｓ　８３、デ・グルイタ−（ｄｅ　Ｇｒｕｙｔｅｒ
　）　、ベルリン１９８４年、１９〜４１頁を参照のこ
と）。或種の平衡法、例えば等電果中のように分離が長
時間を要する場合には、これらの全ての因子が特に劣化
的な効果を有する。等電果中の変形、即ちポリアクリル
アミドゲル中の云ゆる固定化ｐＨ勾配に於ける等電果中
に於いて、良好な分離を得るために極めて長い分離時間
及び高電界強度が必要であるので、滲出液が特に頻繁に
観察される。この電気泳動技術に関し、ゲルへのポリオ
ール、例えば１０％のデキストランまたは２０％のサッ
カロース（またはソルビトール）の添加が文献に記載さ
れている。これらの添加剤はゲルを滲出液から数時間保
護した。

２０％のグリセロールの添加は一層有効でないことがわ
かった。（Ｋ、アルドランド（Ａｌ　ｔｌａｎｄ）、Ｒ
，ハラフラー（Ｈａｃｋｌｅｒ）及びＵ、ロスマン（Ｒ
ｏｓｓｍａｎ）著、“キャリヤー両性電解質で補充され
固定されたｐＨ勾配に於けるハイブリッド等電集中に使
用された再水和ゲルの表面上の滲出液の回避”　Ｅｌｅ
ｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　１９８６年・７巻・２５１
〜２５９頁を参照のこと）。

（課題を解決するための手段）電気泳動ゲルが従来通常であった５〜２０％よりも実質
的に高い濃度のポリオールを含む場合に、電気泳動ゲル
、特にポリアクリルアミドゲルの多くの性質が決定的に
改良し得ることが、驚くべきことに見い出された。本発
明によれば、ポリオールの濃度は２０（好ましくは２５
）〜８０％（Ｗ／Ｖ）である。好ましい範囲は２５〜６
０％（Ｗ／Ｖ）である。特許請求の範囲に記載された濃
度は、未だ重合されていないゲルの合計容量を基準とし
たポリオールの重量（ｇ／＋　ｊ！　）から計算される
。容易に水溶性である、即ち特許請求の範囲に記載され
た範囲で水混和性または水溶性であるポリオールが好適
である。

好適なポリオールは、例えば２〜８個、好ましくは２〜
６個の炭素原子及び少なくとも２個のヒドロキシ基を有
する分岐もしくは非分岐脂肪族ポリオールを含む。ペン
トース及びヘキソースと同じ構造の型の単糖類並びに少
糖類、特に三糖類、例えばサッカロース及びその誘導体
がまた好適である。最も重要なペントース及びヘキソー
スはキシロース、グルコース及びフラクトースを含む。

またソルビトール及びキシリトールの如き糖アルコール
が好適である。

種々のポリオールの中で、下記のポリオールが特に有効
であることがわかった。グリセロール（３０〜７０％、
好ましくは３５〜７０％Ｗ／Ｖ）、エチレングリコール
（４０〜６０％−／Ｖ）、プロピレングリコール（４０
〜６０％Ｗ／Ｖ）　、サッカロース（３０〜５０％Ｉ／
ｉ／ｖ）、ソルビトール（３０〜５０％−ハ）及びデキ
ストラン（２０〜３０％Ｗ／Ｖ）及び高濃度の個々の成
分を含むこれらのポリオールの組合せ。３０〜５０％（
Ｗ／Ｖ）のグリセロールを含むボリアクリルア゛ミドゲ
ルが特に好ましい。

ポリオール、特にグリセロールの添加が、前記のアガロ
ースゲル並びにポリアクリルアミドゲルに有利であるこ
とがわかった。

電気泳動ゲル及び本発明のゲルという用語は、既知の態
様の電気泳動ゲル、例えばフィルム、ガラスシート上の
ゲル、ガラス試験管中のゲルまたは布で支持されたゲル
を云う。この種のゲルの製造方法は従来技術により知ら
れており、更に説明する必要はない。ポリオール濃度が
高まるにつれて粘度が上昇し電気泳動移動度が反比例し
て減少するので、電気泳動に高ポリオール濃度を使用す
ることは決して自明ではない。かくして、分離時間が一
層長く延長され、極めて高いポリオール濃度でそれは制
限因子となり得る。電気泳動の分野に於ける高ポリオー
ル濃度の例は密度勾配、例えば０〜５０％のサッカロー
スにより電解質系を対流防止で安定化する方法により知
られている。しかしながら、密度勾配の電気泳動は今日
では極くわずかに重要であるにすぎない。

通常のゲルに較べて、平均３０〜６０％Ｗ／Ｖの上記の
高ポリオール含量を有するゲル、特にポリアクリルアミ
ドゲルは、以下の有利な性質を有する。ゲル表面は高い
相対湿度、長い分離時間、高い電界強度、分離室中のゲ
ルと冷却板の表面との間の大きい温度差、云ゆるキャリ
ヤー両性電解質の添加を用い、または用いずに固定化ｐ
Ｈ勾配の使用（ハイブリッド等電集中）の如き特に不利
な条件下でさえも滲出液を示さない。高ポリオール含量
を有するゲルは等電果中の間に局所過熱の問題なしに極
めて高い電界強度、例えば５００〜１５００Ｖ／ａｍに
暴露し得る。４０％−／Ｖより高い含量の高ポリオール
濃度、特に高グリセロール濃度では、驚くことに、従来
必要とされていた低温槽を用いて電気泳動室を冷却する
必要はない。

高粘度のために、１５〜２５℃（周囲温度）の温度（２
〜１５℃の温度が通常である）で分離を行なうことが有
利である。即ち、サーモスタットを用いて電気泳動室を
冷却することが充分である。

通常のゲルでは、電解質の導電率の差異のため、ゲルの
幾らかの乾燥及び通電が続く場合には電線の焼け（ｂｕ
ｒｎｉｎｇ　１ｉｎｅ）が観察され、これらは−般に実
験の停止をもたらす。高電界強度の使用は、分解能を改
良するので或種の電気泳動技術に望ましい。或種の体液
あるいは先の分別後の試料のような試料中の高い塩分は
、通常のゲルよりも高ポリオール含量を有するポリアク
リルゲル中で一層劣化性ではない。ゲル中の高ポリオー
ル含量は、高電界強度を使用することを可能にするだけ
ではなく、これにより分離中の分解能を改良する。また
電界がスイッチで切られた後に、上昇された粘度が分離
成分の拡散を減少し、かくしてタンパク質の染色または
特異的な酵素の視覚化の如き、連続の視覚化段階に於い
て分解の鮮鋭度が保持されることを確実にすることを助
ける。これは極く小さい間隔、例えば数分の１　ｍｍだ
けゲル中で分離された成分が拡散により合体しないこと
を確実にする。

超薄ゲルに於いて、高ポリオール含量は安定化効果を有
し、得られた分離パターンは通常のゲルの場合よりも一
層規則的である。高ポリオール含量を有する超薄ゲルの
製造は低ポリオール濃度を有するゲルよりも一層容易で
ある。何となれば、超薄ゲルに於いて、特に気泡の望ま
しくない包含が重合溶液の高密度により避は得るからで
ある。

高ポリオール含量を有するゲルは、通常のゲルよりも乾
燥する傾向が一層少なく、また細菌学的に一層安定であ
ることから、通常のゲルよりも貯蔵し易い。高濃度のグ
リセロールは殺菌効果を有し、これはその他の防腐剤を
添加する必要のないことを意味し、防腐剤はゲルを長期
間貯蔵する時に成る場合には分離法を妨害することがあ
る。

高濃度のポリオール、例えば３０〜６０％のグリセロー
ルがタンパク質及び酵素に対して安定化効果を有するこ
とは文献から知られている。かくして、例えば、感受性
酵素はそれらをしばらくの間変質することを防止するた
め高グリセロール濃度を有する溶液中で販売される。ま
た、このポリオールの安定化効果は、電気泳動中に特に
有利である。何となれば、分離系中の長い保持時間のた
めに、タンパク質及び酵素は極限ｐ■値により、あるい
はそれらの等電点付近で容易に失活または変性され得る
からである。高ポリオール濃度の安定化効果は、分析用
電気泳動及び分取用電気泳動に有利である。何となれば
分離画分（天然タンパク及び変性タンパクはそれらの電
荷の性質を異にすることがある）が避けられ、収率が増
大されるからである。低分子ポリオールは、分解タンパ
ク質またはその他の高分子量物質から容易に分離し得る
ので、分取電気泳動を妨害しない。

また、ゲル中の高濃度のポリオールは、電気泳動の最も
重要な適用の一つ、即ちプロッティング（ｂｌｏｔｔｉ
ｎｇ　）に有利である。プロティングに於いて、ゲル中
で電気泳動で分離された成分は、更に視覚化工程のため
、固定化マトリックス、例えばニトロセルロース膜に移
される。しばしば行き当たる一つの難点は膜の過度の接
着であり、これはゲルの表面から膜を引き離すことを困
難にし、また不可能にする。ゲル中の高濃度のグリセロ
ールは、滑性を改良し、その結果膜がゲルの表面から持
ち上げ易くし得る。本発明によれば、最終のゲルのみな
らず、それに応じて調製された溶液に対する保護が特許
請求されており、それらの溶液は使用に供するゲルを製
造するために好適な担体上で単に重合される必要がある
。このようなゲル組成物は、実際のモノマー溶液、例え
ばポリアクリルアミド溶液またはアガロースの如き水性
溶液、通常のアジュバント及び添加剤並びに本発明のポ
リオール濃度からなる。使用のため、調製された溶液は
好適な触媒と混合され、好適な担体（ガラスシート、布
またはフィルム）上で重合される。

高ポリオール濃度を有する本発明の電気泳動ゲルは二つ
の異なる方法により製造し得る。第一の別法に於いて、
必要によりキャリヤー両性電解質、架橋剤、例えばＮ、
Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレンジアクリ
レート等の如き通常の添加剤及び触媒としての遊離基開
始剤が添加された、モノマーが相当するポリオールの存
在下で重合される。本発明の高濃度の添加ポリオール（
例えばグリセロール）は重合速度に影響し、これは触媒
の量がポリオール濃度に従って調節される必要があるこ
とを意味する。通常、触媒の量は５〜３０分の重合時間
を与えるように調節すべきである。その他の添加剤と異
なり、ポリオールは重合を改質するだけで、重合を全く
抑制しない。全ての通常のゲル、例えばフィルム、例え
ば薄いポリエステルフィルムもしくはガラスシート上の
ゲルまたは布で支持されたゲル、例えばポリエステル布
をベースとしたゲルが製造し得る。

第二の別法は、既に重合されたゲルを高ポリオール含量
を有するゲルに変換するのに好適である。

ゲル中に重合されたｐＨ勾配（云ゆる固定化ｐＨ勾配）
を含み、または含まない乾燥ポリアクリルアミドゲルが
例えばキャリヤー両性電解質、還元性物質、洗剤、尿素
等を含む溶液で再水和して重合後に得られるようなもの
と“含水”ゲル容量にし得ることが知られている。好ま
しい態様は容量監視による再水和に関するものであり、
ここで乾燥ゲルはゲルのもとの“含水”容量に相当する
特定容量の皿キュベツト中に置かれる。

既知の再水和法に類似して、本発明に於いてポリオール
が特定量の水中に溶解され、乾燥ゲルがそれに応じて処
理される。市販の乾燥ゲルは、ゲルが完全に乾燥するこ
とを防止するため或種の条件下で少濃度のポリオール、
例えば原則として２〜５％のグリセロールを既に含む。

明らかに、この比率は再水和中に考慮される。

試薬：１．７５ｍＪのアクリルアミド（３０％Ｗハの水中の素
材溶液）１．５　　ｍｌのＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミ
ド（１％−／Ｖの水中の素材溶液）０．７５ｍＪのキャリヤー両性電解質（例えば、４０％
−／Ｖのサーバライト（Ｓｅｒｖａ　ｌｙ　ｔ）　）３
．７４ｎ＋ｊ２のグリセロール（８５％ｄｚｏ＝１．２
２）０．２　　ｍｌのアンモニウムペルオキソジスルフ
エート（３％Ｗ／Ｖの水溶液）脱イオン水１０ＩＩｌｌに対して重合溶液は、諸成分を上記の順序で混合し、過硫酸アン
モニウム（触媒）の添加直後にそれを好適な重合装置（
例えば、ゲル製造のキャピラリー技術及びフラップ技術
のためのカセットまたは二枚のガラスシートの間）に入
れることによりつくられる。重合は周囲温度または昇温
（例えば５０”ｃ）のいずれかで行ない得る。高濃度の
グリセロールまたはその他のポリオールは重合に影響を
及ぼし、それ故触媒の量は最適値に調節する必要がある
。通常、最適値は５〜３０分の重合時間を与える。その
他の添加剤と異なり、ポリオールは重合を改質するだけ
であり、重合を全く抑制しない。

重合が光化学的に行なわれる場合には、リボフラビンが
触媒として使用される。

実施１グリセロール　　・　　ボｉアク１ルアミドの５％のグ
リセロールを含む乾燥ポリアクリルアミドゲルを、以下
のようにして処理・する。８５％グリセロール（ｄｚｏ
＝　１．２２）　３．２７　ｍｌを脱イオン水により１
０ｍ１ｔとし、これは３５％Ｗ／Ｖの含量に相当する。

実際の再水和は既知の方法で行なわれる。再水和が完結
した後、ゲルは４０％Ｗ／Ｖのグリセロールを含む。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）２０〜８０％の一種以上のポリオールを含むこと
を特徴とする、電気泳動ゲル。
（２）上記のゲルがポリアクリルアミドであることを特
徴とする、請求項１記載の電気泳動ゲル。
（３）上記のゲルがアガロースであることを特徴とする
、請求項１記載の電気泳動ゲル。
（４）相当するモノマー及び通常の添加剤及びアジュバ
ントを含む請求項１〜３のいずれか一項記載の電気泳動
ゲルの製造用ゲル組成物であって、その他の成分として
２０〜８０％（Ｗ／Ｖ）の一種以上のポリオールを含む
ことを特徴とする、ゲル組成物。
（５）モノマーのアクリルアミド及び通常の添加剤及び
アジュバントを含む請求項２記載の電気泳動ゲルの製造
用ゲル組成物であって、その他の成分として２０〜８０
％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは３０〜６０％（Ｗ／Ｖ）の一
種以上のポリオールを含むことを特徴とする、ゲル組成
物。
（６）ポリオールがグリセロール、エチレングリコール
、プロピレングリコール、サッカロース、ソルビトール
及び／またはデキストランからなる群から選ばれること
を特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項記載の電気
泳動ゲルまたはゲル組成物。
（７）ポリオールの濃度が３０〜６０％であることを特
徴とする、請求項１〜５のいずれか一項記載の電気泳動
ゲルまたはゲル組成物。
（８）ポリオールがグリセロールであることを特徴とす
る、請求項６記載の電気泳動ゲルまたはゲル組成物。
（９）好適なモノマー及び通常の添加剤及びアジュバン
トの混合物から出発する請求項１〜３または６〜８のい
ずれか一項記載の電気泳動ゲルの製造方法であって、２０〜８０％（Ｗ／Ｖ）の一種以上のポリオールが重合
前に上記の混合物に添加され、ついで必要により重合が
担体上で行なわれることを特徴とする、電気泳動ゲルの
製造方法。
（１０）乾燥ゲルが一種以上のポリオールの水性溶液で
再水和されることを特徴とする、請求項１〜３または６
〜８のいずれか一項記載の電気泳動ゲルの製造方法。