JPH0238969A - 臓器移殖による異常応答リンパ球の検出方法並びにこれに用いる検出用試薬及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、臓器移植によって異常応答を起こしているリ
ンパ球の検出方法並びにこれに利用される検出試薬及び
検出用キットに関する。

〔従来の技術及びその課題〕

臓器移植における最大の障壁は、移植片が受容者に生着
しない拒絶反応という問題である。

これは受容者が自己と適合しない移植抗原（組織適合性
抗原）を含む移植片を非自己と認識して応答する免疫反
応、すなわち移植免疫反応である。拒絶反応は大別して
液性免疫と細胞性免疫によフて起こり、特にＴリンパ球
による細胞性免疫が中心的な役割を演じている。この拒
絶反応を抑制するために、アルキル化剤、代謝拮抗剤、
抗生物質、ステロイド剤、葉酸拮抗剤、植物アルカロイ
ドなどの免疫抑制剤の投与が行われている。

拒絶反応は、角膜等リンパ路を欠くＨ器の移植において
は極めて発生しにくいものであるが、角膜に血管が新生
した場合、移植抗原がレシピエンドの免疫系に捉えられ
る結果、発生する場合があり、免疫抑制の必要も生じる
。また、広く行われている腎移植では、移植片のドナー
から摘出後、移植前に生じたある程度の障害からは回復
することができ、更に免疫抑制剤の適切な投与により拒
絶反応による少々の免疫学的な障害にも耐えられるが、
他のＩＩＩ器好植においては、拒絶反応を抑制すること
が極めて重要である０例えば、心容積では中等度の組織
障害でも致命的な不整脈を起こしやすいため、拒絶反応
の発生及び進行程度の判断は特に重要である。また、骨
髄移植においても提供者と受容者間のＨＬ＾抗原の不一
致によって引き起こされる移植片対宿主反応が移植患者
の生命予後を大きく左右するため同様に重要である。

従って、臓器移植において拒絶反応の発生及び進行程度
を判断し、免疫抑制剤の投与時期を決定することは極め
て重要である。

〔課題を解決するための手段〕

太発明者らは、臓器移植による拒絶反応を早期に検出、
診断する方法を開発すべく鋭意研究を行っていたところ
、臓器移植によって起こる拒絶反応により異常応答を起
こしているリンパ球には共通の特徴があることを見出し
た。

すなわち、本発明者らの研究によれば、ｍ器移植の拒絶
反応により異常応答したＴ細胞には、癌細胞において表
現されている糖鎖の一つが表現されていることを見出し
た。そして、このリンパ球上の糖鎖を検出することによ
り、リンパ球のレベルで臓器移植に拒絶反応を起こして
いることが容易に判断できることを見出し、本発明を完
成した。

従フて本発明は、リンパ球を含有する検体に次の式（Ｉ
） Ｆｕｃ　ａ　１→２ＧａｌＬβ１　→４ＧｆｃＮＡｃβ
１−４Ｒ↑ Ｆｕｃα１（１） （式中、Ｒは糖残基を示す） で示される糖鎖を認識する抗体を作用させ、この抗体と
結合したリンパ球を検出することを特徴とする臓器移植
の拒絶反応による異常応答リンパ球の検出方法並びに当
該方法に用いる試薬及びキットを提供するものである。

本発明に用いる抗体が特異的に認識する糟！１１　（１
）はり、Ｙ抗原として公知のものであり（Ｈａｋｏｍｏ
ｒｉ、Ｓ、、　　ＮｕｄｅｌＩＩＩａｎ、　　Ｅ、、　
　Ｌｅｖｅｒｙ、　　Ｓ、Ｂ。

ａｎｄ　ＫａｎｎａｇＩ、　Ｒ，：　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、、　２５９．４６７２〜４６８０、１９８４）
　、従って、本発明で用いる抗体として例えば掌性によ
って、動物をり、Ｙ抗原で免疫し、該動物の抗体産生細
胞から細胞融合の手段によってハイブリドーマを得、こ
れから製造したモノクローナル抗体を利用することもで
ざる。また、本発明で用いる抗体は粗製抗体液、即ち、
例えば抗し、′抗体産生ハイブリドーマ培養上清液、あ
るいはマウス腹水のままでも良く、さらには硫酸アンモ
ニウム分画やイオン交換クロマトグラフィー、あるいは
プロティンＡや抗原カラムなどによるアフィニティクロ
マトグラフィーにより精製したものでも良い。容易に入
手できる抗体の一例としては８Ｍ−１として既に公知の
抗体（八ｂｅ、　Ｋ、、　Ｍｃｋｉｂｂｊｎ、　　Ｊ、
Ｍ。

ａｎｄ　Ｈａｋｏｍｏｒｊ、Ｓ、　：　Ｊ、Ｂｉｏｌ、
ＣｈｅＩｌｌ、、２５８．１１７９３〜１１７９７．１
９８３）が挙げられる。なお、Ｎ）式中の基Ｒの例とし
ては、−３Ｇａｊ２β１→４Ｇｆｌｃβ１→Ｃｅｒが挙
げられる。

リンパ球を含有する検体としては、例えば血液、細胞組
織液、リンパ液、腹水、羊水、髄液等を使用することが
できる。血液を使用する場合は、血液０．１〜１０ｏ＋
ｊ！を採取し、通常血清、血漿、またはリンパ液として
使用するのが好ましい。

本発明方法において、前記抗体と結合したリンパ球は、
公知の方法により検出することができる０例えば、通常
の免疫学的測定方法である競合法によるラジオイムノア
ッセイ法（ＲＩ八）、酵素免疫測定法（ＥＴＡ）、また
は蛍光抗体法（ＦＡＴ）により行うのが好ましいが、中
でも蛍光抗体法はステップが少なく簡便である。これら
方法の操作、手順も通常の方法によって実施することが
できる。より具体的には、通常の方法によりて検体から
Ｔ細胞を分離し、これをスライドに塗布し、この上に本
発明の抗体を滴下し、洗浄後、蛍光法、酵素法あるいは
二次抗体を用い、反応Ｔ細胞を検出する方法が挙げられ
る。

本発明で用いる抗体または二次抗体に標識として酵素を
つける方法は、例えば蛋白質・核酸・酵素、２０．（１
１）　、１００７〜１０１３．　（１９７５）に記載の
方法に準じることができる。また、抗体または二次抗体
に蛍光標識をつける方法は、例えば基礎生化学実験法６
（生化学的測定）、１６７頁に記載の方法に準じること
ができる。

また、使用される二次抗体は抗体と結合力を持つ抗体で
あれば何でもよく、例えば、キットに使用する一次抗体
としての抗体でウサギ、ヤギ、マウスなど人以外の動物
を免疫して血清や腹水から得ることもできるし、各アイ
ソタイプごとに、前記の抗体に特異的に結合する抗体を
購入して使用することも可能である。また酵素標識ある
いは蛍光標識のついた二次抗体は上記方法で作成しても
よいし、市販のものを購入してもよい。酵素基質液は抗
体に担持された酵素の種類によって適宜選択される。す
なわち、酵素がホースラデイツシュペルオキシダーゼで
あれば、３’　、３’　−ジアミノベンジチン溶液、９
−アミノ−９−エチルカルバミゾール溶液など、アルカ
リフォスファターゼであれば５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドツルフォスフェートＰ−）−ルイジン塩溶液
などが使用される。また、発色剤も酵素によって適宜選
択され、酵素がホースラデイツシュペルオキシダーゼで
あれば、５−アミノサリシリツクアシッド、０−フェニ
レンジアミンなど、アルカリフォスファターゼであれば
、Ｐ−ニトロフェニルフォスフェートなどが使用される
。

直接法は抗体自体を蛍光標識あるいは酵素標識し、これ
を用いるもので、二次抗体を用いる間接法に比べ染色の
ステップが少なくてすむが、バックグランドが高いとい
う欠点もある。

本発明方法は、式（Ｉ）の糖鎖を特異的に認識する抗体
を含有する試薬を用いることにより容易に実施されるが
、更に（１）蛍光標識をつけた本発明の抗体からなる直
接蛍光抗体法のキット、（２）本発明の抗体と該抗体と
結合し得る蛍光標識を担持する二次抗体とからなる間接
蛍光抗体法のキット、（３）酵素標識をつけた本発明抗
体からなる直接酵素抗体法用のキット、（４）本発明抗
体と該抗体と結合し得る酵素標識を担持する二次抗体と
からなる間接酵素抗体法用のキット等を利用することに
より、より容易かつ簡便に実施することができる。

キットには本発明抗体及び必要により二次抗体を含有さ
せる。またこの抗体試薬には、例えばグリセロールや牛
血溝蛋白等の安定化剤及び／又は保存剤を添加すること
ができる。この抗体試薬は、凍結乾燥してもよく、該キ
ットには水溶性もしくは水と混和し得る溶媒を含有させ
ることがでとる。更に抗体試薬には、再構成された試薬
系を一定のｐＨに保つために緩衝液及び／又は試料が悪
化ず−るのを防止するための保存剤及び／又は安定化剤
を配合することもできる。緩衝液はキット試薬の必須成
分ではないが、本発明測定法を実施する際に、ｐＨを５
．０〜９．０程度とするものを用いるのが好ましい、ま
た再構成剤は、好ましくは水を含んだものであるが、水
の一部又は全部を水と混和し得る溶媒で置き換えること
もできる。この水と混和し得る溶媒としては、グリセリ
ン、アルコール類、グリコールエーテル類等を例示でき
る。

より好ましいキットの例としては、例えば式（１）の′
ｍ鎗を特異的に認識する抗体のほか、シリカ懸濁液及び
ホルマリン含有リン酸緩衝液等のリンパ球固定液を含む
ものが挙げられる。

本発明方法により検出される異常応答を起こしたリンパ
球は、後記実施例に示すように臓器移植によって起こる
拒絶反応を反映するものである。

（本発明の効果〕 本発明によれば、臓器移植によって起こる拒絶反応によ
るリンパ球の異常応答を直接検出することができるので
、各種臓器移植によって起こる拒絶反応を早期に診断で
きるほか、疾病の進行程度等を直接に判断することがで
きる。したがって、＠器移植患者に免疫抑制剤を投与す
る時期を決定することがでとる。

（実施例〕 次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例 腎移植患者の末梢血を移植１日前、穆植後１日目、及び
９日目に採取し、二重染色フローサイトメトリーを行い
、Ｔ細胞（Ｃ０３陽性細胞）上のり、Ｙ抗原の存在を経
口的に調べた。

なお、二重染色フローサイトメトリーは、患者静脈から
ヘバリナイズした血液１０ａ＋ＪＺをｔ呆血し、これに
に＾Ｃ−２（５％シリカ懸濁液、日本抗体研究所）を１
　　ｔａｉｌ加え、賞食細胞除去のため、３７℃で１時
間反応させた後、この血液をフィコールハイバーク勾配
遠心分動を行い、単核細胞画分を得た０次いで、このリ
ンパ球（５〜１０　ｘ　１０’ｃｅｌｌ／１００　ｕｊ
２）にＢＭ−１抗体５μｇ／ＩＩＩＩｌのものを１００
μＬ加えて１時間反応させた後、生理食塩水含有リン酸
ｉａ５液（ＰＢＳ）で１回洗浄した０次いでフルオレシ
ン−イソチオシアネート（ＦＩＴ（：）で標識した抗マ
ウスＩｇＭ　　（Ｔａｇｏ社製）１５μｇ／ｍｌ！の濃
度の溶液を１００μｍ加えて３０分間反応させた後、Ｐ
ＢＳで１回洗浄した０次いでフィコエリシン標識された
Ｔｍｍママ−カー　Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
社製）のＣＤ３　（Ｐａｎ−Ｔマーカー）を１０μｍ１
加え、３０分間反応し、ＰＢＳで１回洗浄した。洗浄後
、　１．５％のホルマリンＰＢＳを１　　ｔｎｆＬ加え
、氷冷水中で１５分間固定後、ＰＢＳで１回洗浄した。

これに３００μａのＰＢＳを加えて細胞懸濁液を調製し
、測定に供した。測定はＦＩＴＣ標識ＢＭ−１抗体を検
出するためには励起波長４８８　ｎａ＋、蛍光波長５２
０ｎｍで蛍光強度を測定した。また、フィコエリシン（
Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｉｎ）で直接標識されたＴ細胞マ
ーカーの測定は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５８０　
ｎｏ＋で蛍光強度を測定することにより行った。

その結果、Ｌ、Ｙ抗原の陽性細胞（ＣＤ３）の割合は下
記表に示す如く、移植前１日及び移植後１日目ではそれ
ぞれ７．３％および６．４％であった。一方移植９日後
では２５．８％を示した。これは穆植後９日目で拒絶反
応が発現し始めていることを示すものである。

腎移植患者のり、Ｙ抗原発現率 以　　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リンパ球を含有する検体に、次の式（ I ）▲数式
   、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒは糖残基を示す） で示される糖鎖を特異的に認識する抗体を作用させ、こ
   の抗体と結合したリンパ球を検出することを特徴とする
   臓器移植による異常応答リンパ球の検出方法。 ２、次の式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒは糖残基を示す） で示される糖鎖を特異的に認識する抗体を含有する臓器
   移植による異常応答リンパ球検出試薬。 ３、（１）標識化合物を結合した、次の式（ I ）▲数
   式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒは糖残基を示す） で示される糖鎖を特異的に認識する抗体、 （２）シリカ懸濁液、及び （３）リンパ球固定液 を含む臓器移植の拒絶反応による異常応答リンパ球検出
   用キット。