JPH02295486A - 胎盤タンパク質9をコ−ドするcDNA、その単離および使用 - Google Patents
胎盤タンパク質9をコ−ドするcDNA、その単離および使用Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
庄盃豆1
本発明は、胎盤特異性タンパク質9 (PP9)をコー
ドするcDNA、その単離、およびPP9の遺伝子工学
的調製のためのその使用、に関する。
ドするcDNA、その単離、およびPP9の遺伝子工学
的調製のためのその使用、に関する。
1l肢歪
EP−Bl第0 037 963号明細書の記載によれ
ば、PP9は、次のような性質を有する。
ば、PP9は、次のような性質を有する。
a)炭水化物含有量:5.57±1.35%(ヘキソー
ス4.9±1.0%、ヘキソースアミン0.1±0.1
%、フコース0.07±0.05%、およびノイラミン
酸0.5±0.2%を含む) C)分子量(超遠心分離によって決定):35,100
±3 ,8 0 0 d)分子量(ドデシル硫酸ナトリウム<SOS)を含む
ポリアクリルアミドゲルにおいて決定):4 0 ,0
0 0±4,000 e)吸光係数(extinction coeffic
ient) :E 已(280nm)=: 1 4 .
6±1.0f)電気泳動移動度:β1〜グロプリン領域
g)等電点:pH5−0〜6.8の領域U 目
、二B 上記の特許明*Vに記載ざれているPP9の従来の単離
は、非常に複雑である。したがって、本発明の目的は、
PP9の遺伝子工学的調製を可能にするために、PP9
をコードする遺伝子を単離することであった。
ス4.9±1.0%、ヘキソースアミン0.1±0.1
%、フコース0.07±0.05%、およびノイラミン
酸0.5±0.2%を含む) C)分子量(超遠心分離によって決定):35,100
±3 ,8 0 0 d)分子量(ドデシル硫酸ナトリウム<SOS)を含む
ポリアクリルアミドゲルにおいて決定):4 0 ,0
0 0±4,000 e)吸光係数(extinction coeffic
ient) :E 已(280nm)=: 1 4 .
6±1.0f)電気泳動移動度:β1〜グロプリン領域
g)等電点:pH5−0〜6.8の領域U 目
、二B 上記の特許明*Vに記載ざれているPP9の従来の単離
は、非常に複雑である。したがって、本発明の目的は、
PP9の遺伝子工学的調製を可能にするために、PP9
をコードする遺伝子を単離することであった。
驚いたことに、PP9と頚似していることが知らていな
い異なる胎盤タンパク質P P 5 (8ohnおよび
Winkler: Arcl+. Gynaek. 2
23、179−186、1977)に対する抗体を用い
て発現遺伝子バンクをスクリーニングしたときに、5個
の個々のクローンが得られた(PP9−10、PP9−
353、PP9−357、PP9−361およびPP9
−362)。これらのクローンは、全cDNAまたはそ
の部分を含む.PP9−10の配列決定において、PP
9をコードする配列(しかし、全く完全ではないが)の
中問に約eoobpの大きさのイントロンが有りかつ3
′末端にポリ(A)配列が存在しないことから、cDN
Aは不完全にプロセスざれた外主の( heterog
enous)核RNA(HnRNA)に由来するようで
あることが見出ざれた。他の四つのクローンは全てイン
トロンを欠いているが、それらはポリ(A)配列を有し
ている。上記の工程によってPP5のcDNAを単離す
ることは可能ではなかった。
い異なる胎盤タンパク質P P 5 (8ohnおよび
Winkler: Arcl+. Gynaek. 2
23、179−186、1977)に対する抗体を用い
て発現遺伝子バンクをスクリーニングしたときに、5個
の個々のクローンが得られた(PP9−10、PP9−
353、PP9−357、PP9−361およびPP9
−362)。これらのクローンは、全cDNAまたはそ
の部分を含む.PP9−10の配列決定において、PP
9をコードする配列(しかし、全く完全ではないが)の
中問に約eoobpの大きさのイントロンが有りかつ3
′末端にポリ(A)配列が存在しないことから、cDN
Aは不完全にプロセスざれた外主の( heterog
enous)核RNA(HnRNA)に由来するようで
あることが見出ざれた。他の四つのクローンは全てイン
トロンを欠いているが、それらはポリ(A)配列を有し
ている。上記の工程によってPP5のcDNAを単離す
ることは可能ではなかった。
配列決定データによって、PP9のプロセスされた完全
なcDNAは1394個の塩基対(hp)の長さであっ
て316個のアミノ酸のタンパク質をコードするという
結果が得られる(表1)。
なcDNAは1394個の塩基対(hp)の長さであっ
て316個のアミノ酸のタンパク質をコードするという
結果が得られる(表1)。
35853dの分子量およびアミノ酸組成は、上記に記
載の特許明!IIIM中に含まれるデータに大変よく一
致する(表2を参照されたい)。
載の特許明!IIIM中に含まれるデータに大変よく一
致する(表2を参照されたい)。
六九
く0 く口
α C
ト
べ山IJQ閤11Ll(j工H×一Σ
図は、入gtl!−10の位置を、入gt 11362
との関係において図式的に示すものである.二つのクロ
ーンが塩基交換を示す。すなわち、PP9−361の位
直255(Gの代わりにC、アミノMEの代わりにQ)
、および PP9−362の位置925(Aの代わりにG1アミノ
陵Kの代わりにR)。
との関係において図式的に示すものである.二つのクロ
ーンが塩基交換を示す。すなわち、PP9−361の位
直255(Gの代わりにC、アミノMEの代わりにQ)
、および PP9−362の位置925(Aの代わりにG1アミノ
陵Kの代わりにR)。
このようにしてPP9のcDNA配列を有することによ
って、他の既知の核酸配列との比較が可能になった。ラ
ットのアルドースレダクターゼのDNA配列( Car
perら: FEBS Letters 220、20
9−213、1987)ならびにロークリスタリン(r
ho−crystallin)およびアルデヒドレダク
ターゼの遺伝子との相同性( homologies)
があることが見出された。これらのタンパク質がアルデ
ヒドレダクターゼとして同一の上科(superfaI
Wily)に属することが可能であり、PP9がヒ1・
アルドースレダクターゼと同一である可能性が非常に高
い。
って、他の既知の核酸配列との比較が可能になった。ラ
ットのアルドースレダクターゼのDNA配列( Car
perら: FEBS Letters 220、20
9−213、1987)ならびにロークリスタリン(r
ho−crystallin)およびアルデヒドレダク
ターゼの遺伝子との相同性( homologies)
があることが見出された。これらのタンパク質がアルデ
ヒドレダクターゼとして同一の上科(superfaI
Wily)に属することが可能であり、PP9がヒ1・
アルドースレダクターゼと同一である可能性が非常に高
い。
本発明によれば、適当な発現系を利用して、コードcD
NAを用いてPP9を発現させることが可能である。さ
らに、宿主の選択によって、PP9の修飾型に影響を及
ぼすことができろ。例えば、纏苗中ではグリコシル化(
g1ycosylation)は起きないが、一方、酵
母細胞で起きるグリコシル化は高等真核纏胞におけるも
のとは異なる。
NAを用いてPP9を発現させることが可能である。さ
らに、宿主の選択によって、PP9の修飾型に影響を及
ぼすことができろ。例えば、纏苗中ではグリコシル化(
g1ycosylation)は起きないが、一方、酵
母細胞で起きるグリコシル化は高等真核纏胞におけるも
のとは異なる。
PP9は、発現ベクターpTrc99CまたはpTac
T7Lを用いて大腸菌中でとくに有利に発現ざれる(諸
例を参照されたい)。
T7Lを用いて大腸菌中でとくに有利に発現ざれる(諸
例を参照されたい)。
PP9のアミノ酸配列が解ると、ポリクローナルまたは
モノクローナル抗体の製造のための抗原として用いられ
るアミノ酸部分配列物 ( sequences)を従来法または遺伝子工学的
手法によって調製することができる。そのような抗体は
、診断的用途だけでなく、抗体力ラムの調製にも用いら
れ得る。そのようなカラムによって、PP9を他のタン
パク質とともに含む溶液からPP9を分離することが可
能である。また、PP9をコードし、真核細胞中での発
現を促進し、さらには診断的情報をも得ることができる
ようなゲノムクローンを、cDNAまたはその部分を用
いてゲノムバンクから簡単な方法で!iimすることも
可能である。
モノクローナル抗体の製造のための抗原として用いられ
るアミノ酸部分配列物 ( sequences)を従来法または遺伝子工学的
手法によって調製することができる。そのような抗体は
、診断的用途だけでなく、抗体力ラムの調製にも用いら
れ得る。そのようなカラムによって、PP9を他のタン
パク質とともに含む溶液からPP9を分離することが可
能である。また、PP9をコードし、真核細胞中での発
現を促進し、さらには診断的情報をも得ることができる
ようなゲノムクローンを、cDNAまたはその部分を用
いてゲノムバンクから簡単な方法で!iimすることも
可能である。
アルドースレダクターゼ(. E C l.1.1.2
1)は、NADPH一依存性酵素で、糖アルコールへの
アノレドースの還元を触媒する。糖尿病およびガラクト
ース血症( galactosemia)の病理的な状
態ξこおI,)で、多くの組織におけるアルドースレダ
クターゼ活性の上昇の結果、ソルビトールおよびガラク
チトール(galactitol)が高レベルになる。
1)は、NADPH一依存性酵素で、糖アルコールへの
アノレドースの還元を触媒する。糖尿病およびガラクト
ース血症( galactosemia)の病理的な状
態ξこおI,)で、多くの組織におけるアルドースレダ
クターゼ活性の上昇の結果、ソルビトールおよびガラク
チトール(galactitol)が高レベルになる。
これζこよって、例えば、水晶体の白内障および網膜の
網細膜(capillary membrane)の肥
厚化( th i cken i n3)などが起きる
かも知れな0。さらに、アルドースレダクターゼレベル
の上昇心よ、神経または腎臓などの糖尿病合併症の原因
とみなされる。これらの理由で、最近アルドース阻害剤
の開発のための仕事がさかんである。これまで、この目
的のために、動物のMi織や器官からアノレドースレダ
クターゼを苦心して単離することが必要であり、これに
よって、さらに収率が非常ζこ低くなる結果になってい
た。アルドースレダクターゼの大腸菌(Escheri
chia coli)における発現の可能性は、今や細
菌抽出物を用いて分析システムを作ること、その結果、
動物の器官や組織への依存に取って代わること、を可能
にする。分析方法は、全体としてかなり単純化される。
網細膜(capillary membrane)の肥
厚化( th i cken i n3)などが起きる
かも知れな0。さらに、アルドースレダクターゼレベル
の上昇心よ、神経または腎臓などの糖尿病合併症の原因
とみなされる。これらの理由で、最近アルドース阻害剤
の開発のための仕事がさかんである。これまで、この目
的のために、動物のMi織や器官からアノレドースレダ
クターゼを苦心して単離することが必要であり、これに
よって、さらに収率が非常ζこ低くなる結果になってい
た。アルドースレダクターゼの大腸菌(Escheri
chia coli)における発現の可能性は、今や細
菌抽出物を用いて分析システムを作ること、その結果、
動物の器官や組織への依存に取って代わること、を可能
にする。分析方法は、全体としてかなり単純化される。
本発明は、特許請求の範囲にさらに定義され、以下の諸
例に詳細にさらに説明される通りである。
例に詳細にさらに説明される通りである。
上記で説明したものの他に、次の略語を用いる。
EDTA=エチレンジアミン四酢酸ナトリウムSDS=
ドデシル硫酸ナトリウム DTT=ジチオスレイトール BSA=ウシ血清アルブミン IPTG=イソブロビルチオガラクトシド例≦2 l.抗−PP5抗体を用いる、ヒト胎盤からの発現cD
NAバンクのスクリーニング Genofit Gn+bH (Heidelberg
)からのファージλgtll中の発現cDNAバンクを
、寒天プレート(直径13.5cm)当り約30,OO
OPFUの濃度で塗布した。このために、大腸菌yl0
90株(ATCC 3 7 1 9 7) (R.A
. YoungおよびR.W. Davis: Sci
=nce Vol. 222、778−782、198
3)のコンビテントな細胞に37℃で30分間ファージ
を感染させて、次いでLブロスプレート上の上層寒天に
塗布した。プレートを42℃で4時間インキユベートし
て、次いで各々を乾燥したニトロセルロースフィルター
(Schleicher and Schuell、B
A 85、Ref. No. 401124)でカバー
した。フィルターは10mMIPTG水溶液によって予
め飽和させておいた。フィルターでカバーしたプレート
を再び37℃で4時間インキユベートした。次いで、フ
ィルターを再び除去する前に、フィルターおよびプレー
トをカーボンブラックに漬けた針でともに印付した。フ
ィルターをTBST(10mM}リスーHCI、pH8
.0、1 50mM NaC l,0.05%ツィーン
20および5%脱脂粉乳)中で4℃で一晩インキユベー
トした。次に、フィルターをTBST中で室温で10分
間3回洗浄して、次いで、フィルター当り15mlのT
BSTに溶解した抗−PP5ウサギ抗体とともに室温で
1時問イシキュベートした。(抗体溶液は予め1:20
0に希釈して、非組換え入gt 1 1溶解大腸菌細胞
とともにニトロセルロースフィルター上で1時間飽和さ
せておいた。)一次抗体とともにインキユベートした後
、フィルターをTBSTで4×10分問洗浄した。次い
て、フィルターをアルカリフオスファターゼ(米国ブロ
メガ社製、ハイデルベルグのアトランタ社販売)と抱合
させて予めTBSTで1:5000に希釈しておいた二
次の抗−ウサギ抗体とともに1時間賑盪しながらインキ
ユベートした。次いで、フィルターをTBSTで4×1
0分間再び洗浄した。
ドデシル硫酸ナトリウム DTT=ジチオスレイトール BSA=ウシ血清アルブミン IPTG=イソブロビルチオガラクトシド例≦2 l.抗−PP5抗体を用いる、ヒト胎盤からの発現cD
NAバンクのスクリーニング Genofit Gn+bH (Heidelberg
)からのファージλgtll中の発現cDNAバンクを
、寒天プレート(直径13.5cm)当り約30,OO
OPFUの濃度で塗布した。このために、大腸菌yl0
90株(ATCC 3 7 1 9 7) (R.A
. YoungおよびR.W. Davis: Sci
=nce Vol. 222、778−782、198
3)のコンビテントな細胞に37℃で30分間ファージ
を感染させて、次いでLブロスプレート上の上層寒天に
塗布した。プレートを42℃で4時間インキユベートし
て、次いで各々を乾燥したニトロセルロースフィルター
(Schleicher and Schuell、B
A 85、Ref. No. 401124)でカバー
した。フィルターは10mMIPTG水溶液によって予
め飽和させておいた。フィルターでカバーしたプレート
を再び37℃で4時間インキユベートした。次いで、フ
ィルターを再び除去する前に、フィルターおよびプレー
トをカーボンブラックに漬けた針でともに印付した。フ
ィルターをTBST(10mM}リスーHCI、pH8
.0、1 50mM NaC l,0.05%ツィーン
20および5%脱脂粉乳)中で4℃で一晩インキユベー
トした。次に、フィルターをTBST中で室温で10分
間3回洗浄して、次いで、フィルター当り15mlのT
BSTに溶解した抗−PP5ウサギ抗体とともに室温で
1時問イシキュベートした。(抗体溶液は予め1:20
0に希釈して、非組換え入gt 1 1溶解大腸菌細胞
とともにニトロセルロースフィルター上で1時間飽和さ
せておいた。)一次抗体とともにインキユベートした後
、フィルターをTBSTで4×10分問洗浄した。次い
て、フィルターをアルカリフオスファターゼ(米国ブロ
メガ社製、ハイデルベルグのアトランタ社販売)と抱合
させて予めTBSTで1:5000に希釈しておいた二
次の抗−ウサギ抗体とともに1時間賑盪しながらインキ
ユベートした。次いで、フィルターをTBSTで4×1
0分間再び洗浄した。
最後に、一次および二次抗体が結合しているPP9−i
性のクローンを可視化するために、アルカリフォスファ
ターゼと発色剤(プロトジエン社からのブロトプロット
( ProtoBIot)システム)との反応によって
発色反応を行わせた。各々の発色反応のために、99μ
1のNBT (ニトロブルーテトラゾリウム)基質(5
0mg/1、70%ジメチルホルムアミド溶冫夜)およ
び49.5μ1のBCrP(5−ブロモー4−クロロ−
3−インドリルフォスフェート)基質( 5 0 B/
ml、70%ジメチルホルムアミド溶液)を二口トセル
ロースフィルターのための15mlのAP緩衝液(10
0mM}リスーHCI、1)H9.5、1 00mM
NaC 1,5n+MMgCl2)に加えた。陽性ブラ
ークが十分な青色を呈するまで、フィルターを発色溶液
中で暗所で約20分閏から1時閏回すように揺り動かし
た。発色反応を、停止溶液(20mM}リスーHCI%
pH8.0、および5mMEDTA)中にフィルターを
浸漬して停止させた。
性のクローンを可視化するために、アルカリフォスファ
ターゼと発色剤(プロトジエン社からのブロトプロット
( ProtoBIot)システム)との反応によって
発色反応を行わせた。各々の発色反応のために、99μ
1のNBT (ニトロブルーテトラゾリウム)基質(5
0mg/1、70%ジメチルホルムアミド溶冫夜)およ
び49.5μ1のBCrP(5−ブロモー4−クロロ−
3−インドリルフォスフェート)基質( 5 0 B/
ml、70%ジメチルホルムアミド溶液)を二口トセル
ロースフィルターのための15mlのAP緩衝液(10
0mM}リスーHCI、1)H9.5、1 00mM
NaC 1,5n+MMgCl2)に加えた。陽性ブラ
ークが十分な青色を呈するまで、フィルターを発色溶液
中で暗所で約20分閏から1時閏回すように揺り動かし
た。発色反応を、停止溶液(20mM}リスーHCI%
pH8.0、および5mMEDTA)中にフィルターを
浸漬して停止させた。
陽性シグナルを、対応する寒天プレート上のブラークと
照合した。ブラークをパスツールピペットで切り出して
、lmlのSM!l衝液(10mM}リスーHCI,p
H7.5、1 0mM MgC I 2 )に再懸濁さ
せて、単一の陽性ブラークを単離して取り出した。その
結果、陽性反応を呈するクローン、PP9−10、PP
9−353、PP9−357、PP9−361およびP
P 9 −3 6 2が得られた。
照合した。ブラークをパスツールピペットで切り出して
、lmlのSM!l衝液(10mM}リスーHCI,p
H7.5、1 0mM MgC I 2 )に再懸濁さ
せて、単一の陽性ブラークを単離して取り出した。その
結果、陽性反応を呈するクローン、PP9−10、PP
9−353、PP9−357、PP9−361およびP
P 9 −3 6 2が得られた。
2.DNAの配列分析
上記のファージクローンを増やして、それぞれのDNA
を抽出した。特定のEcoRI断片を単離して、ブルー
スクリプトM13ベクター( Stratagene、
サンジエゴ、CA,米国)のEcoRI部位に連結させ
た。配列分析をSangerらの酵素的ジデオキシ法(
Proc. Natl. Acad.Sci. USA
74、5463−5467、1977)を用いて行った
。
を抽出した。特定のEcoRI断片を単離して、ブルー
スクリプトM13ベクター( Stratagene、
サンジエゴ、CA,米国)のEcoRI部位に連結させ
た。配列分析をSangerらの酵素的ジデオキシ法(
Proc. Natl. Acad.Sci. USA
74、5463−5467、1977)を用いて行った
。
配列は、転写解読枠を示し、最大316個のアミノ酸を
有するタンパク質をコードする。
有するタンパク質をコードする。
3.PP11i!k合タンパク質の発現p T r c
9 9C (E. A+mannら: Gene 6
9、3o1〜315、198B)をEcoRIによって
消化した.クローン入gtll−361をEcoRIで
消化して、1387bpの大きさのEcoRI挿入物を
、上記のpTrc99cベクター断片に連結させた。結
果として得られたブラスミドpTrc99C−PP9は
、約36kDのタンパク質の大腸菌細胞中での合成を誘
導することができる。このタンパク質を、ヒト胎盤から
単離されたPP9による免疫によって産生される単一特
異性(n+onospecific)ウサギ抗一PP9
抗血清を用いて特異的に免疫沈降させることができる。
9 9C (E. A+mannら: Gene 6
9、3o1〜315、198B)をEcoRIによって
消化した.クローン入gtll−361をEcoRIで
消化して、1387bpの大きさのEcoRI挿入物を
、上記のpTrc99cベクター断片に連結させた。結
果として得られたブラスミドpTrc99C−PP9は
、約36kDのタンパク質の大腸菌細胞中での合成を誘
導することができる。このタンパク質を、ヒト胎盤から
単離されたPP9による免疫によって産生される単一特
異性(n+onospecific)ウサギ抗一PP9
抗血清を用いて特異的に免疫沈降させることができる。
大腸菌細胞におけるPP9の発現は、ざらに上記の血清
を用いるウエスタンプロット分析によって示された。こ
の実験において、pTrc99C−PP9プラスミドを
含む[PTC;一誘導細胞からの抽出物のみとの反応が
あり、約36kDのタンパク質バンドが再び特異的に可
視化された。
を用いるウエスタンプロット分析によって示された。こ
の実験において、pTrc99C−PP9プラスミドを
含む[PTC;一誘導細胞からの抽出物のみとの反応が
あり、約36kDのタンパク質バンドが再び特異的に可
視化された。
ブラスミドを有しない大腸菌対照抽出物、およびpT
r c 99C−PP9を含むがrp’rcで誘導ざれ
ていなかった抽出物は、と記の抗−PP9抗血清と反応
しなかった。前記のようにして産生されたプラスミド構
造物によって生産されたPP9融合タンパク質は、以下
のヌクレオチド配列で定義される次のようなN一末端ア
ミノ酸配列を有した。
r c 99C−PP9を含むがrp’rcで誘導ざれ
ていなかった抽出物は、と記の抗−PP9抗血清と反応
しなかった。前記のようにして産生されたプラスミド構
造物によって生産されたPP9融合タンパク質は、以下
のヌクレオチド配列で定義される次のようなN一末端ア
ミノ酸配列を有した。
ベクター/リンカー/
5′π領域
PP9
Met Gly Asn Sir妃.a Ala Me
t Ala Ser... ATGGGGAAT この構造によって定義されるPP9融合タンパク質は、
PP9 cDNAによってコードされる完全なPP9
アミノ酸配列に加えて、N一末端の前に6個のアミノ酸
を有している。4個のアミノ酸はベクターによってコー
ドざれるアミノ酸であり、2個はPP9c DNAに
ある5′非翻訳領域によって特定ざれるアミノ酸である
。確認のために、前記に示された構築を、発現ベクター
pTrc99Aおよびp T r c 9 9 B (
Amannら:前出)を用いて同様に行った。これらの
ベクターは、2bp(pTrc99Aの場合)およびl
bp(pTrc99Bの場合)のみがpTrc99Cと
異なっており、これによってU訳解読枠においてシフト
が起きる。予想されたように、pTrc99A−PP9
およびpTrc99B−PP9のいずれも、抗−PP9
抗血清と反応するPP9タンパク質の合成を誘導するこ
とができなかった。
t Ala Ser... ATGGGGAAT この構造によって定義されるPP9融合タンパク質は、
PP9 cDNAによってコードされる完全なPP9
アミノ酸配列に加えて、N一末端の前に6個のアミノ酸
を有している。4個のアミノ酸はベクターによってコー
ドざれるアミノ酸であり、2個はPP9c DNAに
ある5′非翻訳領域によって特定ざれるアミノ酸である
。確認のために、前記に示された構築を、発現ベクター
pTrc99Aおよびp T r c 9 9 B (
Amannら:前出)を用いて同様に行った。これらの
ベクターは、2bp(pTrc99Aの場合)およびl
bp(pTrc99Bの場合)のみがpTrc99Cと
異なっており、これによってU訳解読枠においてシフト
が起きる。予想されたように、pTrc99A−PP9
およびpTrc99B−PP9のいずれも、抗−PP9
抗血清と反応するPP9タンパク質の合成を誘導するこ
とができなかった。
4.成熟非融合PP9タンパク質の発現PP9 cD
NAは、開始コードンにおけるNeo I部位( 5
’ CCATGG3 ’ )の他にも、構造遺伝子中に
別のNcoI部位を有する。PP9タンパク質の成熟発
現を達成するために、先ず、1387bpの大きさ(上
記を参照されたい)のEcoRI断片を、ベクターpM
a5−8( Stanssensら: 1989)に連
結させた。その中にEcoRI断片が所望の位置方向(
5′末端、左手にPP9 ATG開始コードンが位置
している)に存在しているブラスミド(pMa5−8−
PP9)を得て、増殖させた。ブラスミドDNAを、H
indmによって完全に、Ncolによって部分的に、
消化した。1415bpの大きさのNcoI−Hind
lII断片を単離して、同じ制限酵素で切断しておいた
発現ベクターpTrc99A中の対応する部位の閏に連
結させた。その結果得られるブラスミドpT r c
99A−PP9M ( rMJは「成熟J (+aat
ure)を意味する)は、5535bpからなり、ip
’rc誘導の後、成熟非融合PP9タンパク質を発現す
る。このPP9タンパク質のN一末端アミノ敢配列は、
以下のヌクレオチド配列によって定債ざれる。
NAは、開始コードンにおけるNeo I部位( 5
’ CCATGG3 ’ )の他にも、構造遺伝子中に
別のNcoI部位を有する。PP9タンパク質の成熟発
現を達成するために、先ず、1387bpの大きさ(上
記を参照されたい)のEcoRI断片を、ベクターpM
a5−8( Stanssensら: 1989)に連
結させた。その中にEcoRI断片が所望の位置方向(
5′末端、左手にPP9 ATG開始コードンが位置
している)に存在しているブラスミド(pMa5−8−
PP9)を得て、増殖させた。ブラスミドDNAを、H
indmによって完全に、Ncolによって部分的に、
消化した。1415bpの大きさのNcoI−Hind
lII断片を単離して、同じ制限酵素で切断しておいた
発現ベクターpTrc99A中の対応する部位の閏に連
結させた。その結果得られるブラスミドpT r c
99A−PP9M ( rMJは「成熟J (+aat
ure)を意味する)は、5535bpからなり、ip
’rc誘導の後、成熟非融合PP9タンパク質を発現す
る。このPP9タンパク質のN一末端アミノ敢配列は、
以下のヌクレオチド配列によって定債ざれる。
Met Ala Sar Arg Leu...AGG
AAACAGACC ATG GCA AGC CGT
CTC ...このようにして発現されたタンパク質
は、ウエスタンプロットおよび免疫沈降において抗−P
P9抗血清と反応し、約36kOの大きさのタンパク質
を検出することが可能である。今や、この成熟PP9タ
ンパク質が大腸菌細胞のべリブラズム( peripl
asm)中に軸送されることおよびそこでその酵素(ア
ルドースレダクターゼ)活性を示すことが見出されてい
る。
AAACAGACC ATG GCA AGC CGT
CTC ...このようにして発現されたタンパク質
は、ウエスタンプロットおよび免疫沈降において抗−P
P9抗血清と反応し、約36kOの大きさのタンパク質
を検出することが可能である。今や、この成熟PP9タ
ンパク質が大腸菌細胞のべリブラズム( peripl
asm)中に軸送されることおよびそこでその酵素(ア
ルドースレダクターゼ)活性を示すことが見出されてい
る。
さらに、大腸菌におけるアルドースレダクターゼの発現
率を上げるために、改良された発現ベクター(pTac
T7L)を構築した。これには、T7ファージの遺伝子
10のリポソーム結合部位が利用される。異種の( h
etero logous)遺伝子の直前のこの配列は
、より効果的なリポソーム結合によってその発現率を上
げることができることが知られている(Olinsら:
Gene 73、227−235、1988) .
p T a c T ? Lは本質的には既知のべク
ターp K K 2 2 3 −3 (Brosius
および}loly:Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 81、6929−6933、1
984)を基礎としたものであるが、後者と対照的に、
クローニングリンカーの直前に上記のT7配列を有して
いる。上記の1415bpの長さのPP9をコードする
NcoI−Hind[II断片を、同じ制限酵素で切断
したpTacT7Lベクターに連結させた。その結果と
して得られるプラスミドpTacT7L−PP9は、同
様に、非融合PP9タンパク質の発現を仲介するが、P
P9の収率は、pTr c 99A−PP9Mで得られ
るものの約20倍である。
率を上げるために、改良された発現ベクター(pTac
T7L)を構築した。これには、T7ファージの遺伝子
10のリポソーム結合部位が利用される。異種の( h
etero logous)遺伝子の直前のこの配列は
、より効果的なリポソーム結合によってその発現率を上
げることができることが知られている(Olinsら:
Gene 73、227−235、1988) .
p T a c T ? Lは本質的には既知のべク
ターp K K 2 2 3 −3 (Brosius
および}loly:Proc. Natl. Acad
. Sci. USA 81、6929−6933、1
984)を基礎としたものであるが、後者と対照的に、
クローニングリンカーの直前に上記のT7配列を有して
いる。上記の1415bpの長さのPP9をコードする
NcoI−Hind[II断片を、同じ制限酵素で切断
したpTacT7Lベクターに連結させた。その結果と
して得られるプラスミドpTacT7L−PP9は、同
様に、非融合PP9タンパク質の発現を仲介するが、P
P9の収率は、pTr c 99A−PP9Mで得られ
るものの約20倍である。
5.大腸菌における発現の後のタンパク質PP9のアル
ド ース レダクターゼ活性 PP9 cDNA配列の相同性の比較によって、コン
ピューター分析において94%の相同性(85%の同一
性)がラットのアルドースレダクターゼ( Carpe
rら: FEBS Lett. 220、209−21
3、1987)との間に認められた。ざらに、カエルの
目のローグリスタリンおよびラット水晶体のアルデヒド
レダクターゼとの相同性が発見された。この知見によっ
て、PP9は、比較的大きなタンパク質群(famil
!/)のあるものであって、ヒトアルドースレダクター
ゼである可能性がきわめて強い。
ド ース レダクターゼ活性 PP9 cDNA配列の相同性の比較によって、コン
ピューター分析において94%の相同性(85%の同一
性)がラットのアルドースレダクターゼ( Carpe
rら: FEBS Lett. 220、209−21
3、1987)との間に認められた。ざらに、カエルの
目のローグリスタリンおよびラット水晶体のアルデヒド
レダクターゼとの相同性が発見された。この知見によっ
て、PP9は、比較的大きなタンパク質群(famil
!/)のあるものであって、ヒトアルドースレダクター
ゼである可能性がきわめて強い。
ベリブラズムの画分を、大腸菌K12
W31 10 1ac IQ (pTacT7L−PP
9)からHsiungら(Bio/Technolog
y 4、991〜995、1986)の方法によって調
製した。これらの抽出物は、対応する対照抽出物には存
在しないアルドースレダクターゼ活性を有している。ア
ルドースレダクターゼ活性は、分析混合物中のHADP
Hの酸化による3 4 0 r+mにおける吸収の減少
に基づく既知の分析法(例えば、Kawasak iら
: Biochim. Biophys.Acta 9
96、30−36、1989)を用いて検出した。
9)からHsiungら(Bio/Technolog
y 4、991〜995、1986)の方法によって調
製した。これらの抽出物は、対応する対照抽出物には存
在しないアルドースレダクターゼ活性を有している。ア
ルドースレダクターゼ活性は、分析混合物中のHADP
Hの酸化による3 4 0 r+mにおける吸収の減少
に基づく既知の分析法(例えば、Kawasak iら
: Biochim. Biophys.Acta 9
96、30−36、1989)を用いて検出した。
図は、入gtll−10の位置を入gtl1362との
閏係において示す、説明図である。
閏係において示す、説明図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、表1に示されたアミノ酸配列をコードするDNA配
列物、その対立形質および変異体。 2、表1に示されたコード鎖を含む、胎盤特異性タンパ
ク質PP9をコードするDNA配列物。 3、請求項1に記載のDNAと緊縮条件 (stringentconditions)下でハイ
ブリダイズする、DNAまたはRNA。 4、請求項1〜3のいずれか1項に記載のDNAまたは
RNAを含む、遺伝子構造物。 5、請求項1〜4のいずれか1項に記載のDNAまたは
RNAを含む、ベクター。 6、請求項1〜5のいずれか1項に記載のDNAまたは
RNAを含む、形質転換細胞。 7、請求項2に記載のDNA配列の大腸菌、酵母または
動物細胞における発現によって遺伝子工学的に得られる
、PP9。 8、請求項1〜4のいずれか1項に記載のcDNAまた
はRNAを発現系へ導入してそこで発現させることから
なる、PP9の製造法。 9、遺伝子工学によって製造されるPP9で免疫化を行
うことによって得られる、PP9に特異的なポリクロー
ナルまたはモノクローナル抗体、または抗原活性を有す
るその部分。 10、請求項1〜4のいずれか1項に記載のDNAまた
はRNAの全部または部分を含んでなる、診断補助物。 11、請求項9に記載の抗体を含んでなる、診断補助物
。 12、体液、組織またはそれらから分離した核酸を請求
項10または11に記載の診断補助物と接触させること
を含む、診断法。 13、医薬物としてのPP9。 14、PP9を含んでなる、医薬物。 15、請求項7に記載のPP9を用いることを含む、ア
ルドースレダクターゼ阻害因子の検出またはスクリーニ
ング法。 16、アルドースレダクターゼ阻害因子のスクリーニン
グまたは検出のための、請求項7に記載のPP9の使用
。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3907744A DE3907744A1 (de) | 1989-03-10 | 1989-03-10 | Fuer das plazentaprotein 9 (pp9) kodierende cdna, ihre isolierung und verwendung |
DE3907744.6 | 1989-03-10 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02295486A true JPH02295486A (ja) | 1990-12-06 |
Family
ID=6375984
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2059800A Pending JPH02295486A (ja) | 1989-03-10 | 1990-03-09 | 胎盤タンパク質9をコ−ドするcDNA、その単離および使用 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0386733B1 (ja) |
JP (1) | JPH02295486A (ja) |
KR (1) | KR900014595A (ja) |
AT (1) | ATE124722T1 (ja) |
AU (1) | AU625082B2 (ja) |
CA (1) | CA2011877A1 (ja) |
DE (2) | DE3907744A1 (ja) |
DK (1) | DK0386733T3 (ja) |
ES (1) | ES2076238T3 (ja) |
IE (1) | IE67797B1 (ja) |
PT (1) | PT93381B (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05317083A (ja) * | 1992-02-12 | 1993-12-03 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | 人アルドース還元酵素に結合する抗体およびその使用法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3013724A1 (de) * | 1980-04-10 | 1981-10-15 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Neues protein pp (pfeil abwaerts)9(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner anreicherung und gewinnung sowieseine verwendung |
-
1989
- 1989-03-10 DE DE3907744A patent/DE3907744A1/de not_active Withdrawn
-
1990
- 1990-03-07 AT AT90104352T patent/ATE124722T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-03-07 DE DE59009360T patent/DE59009360D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-07 EP EP90104352A patent/EP0386733B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-07 DK DK90104352.1T patent/DK0386733T3/da active
- 1990-03-07 ES ES90104352T patent/ES2076238T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-08 AU AU51103/90A patent/AU625082B2/en not_active Ceased
- 1990-03-09 JP JP2059800A patent/JPH02295486A/ja active Pending
- 1990-03-09 PT PT93381A patent/PT93381B/pt not_active IP Right Cessation
- 1990-03-09 IE IE85390A patent/IE67797B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-03-09 CA CA002011877A patent/CA2011877A1/en not_active Abandoned
- 1990-03-09 KR KR1019900003102A patent/KR900014595A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH05317083A (ja) * | 1992-02-12 | 1993-12-03 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | 人アルドース還元酵素に結合する抗体およびその使用法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE124722T1 (de) | 1995-07-15 |
IE67797B1 (en) | 1996-05-01 |
EP0386733A1 (de) | 1990-09-12 |
CA2011877A1 (en) | 1990-09-10 |
AU5110390A (en) | 1990-09-13 |
DE59009360D1 (de) | 1995-08-10 |
DK0386733T3 (da) | 1995-11-20 |
ES2076238T3 (es) | 1995-11-01 |
KR900014595A (ko) | 1990-10-24 |
DE3907744A1 (de) | 1990-09-20 |
EP0386733B1 (de) | 1995-07-05 |
IE900853L (en) | 1990-09-10 |
AU625082B2 (en) | 1992-07-02 |
PT93381A (pt) | 1990-11-07 |
PT93381B (pt) | 1996-02-29 |
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