PT93381B - Processo para a preparacao de proteina placentaria 9(pp9), de anticorpos contra esta proteina, de composicoes farmaceuticas que a contem e de agentes de diagnostico que contem uma sequencia de adn que codifica para a respectiva sequencia de acidos aminados - Google Patents

Processo para a preparacao de proteina placentaria 9(pp9), de anticorpos contra esta proteina, de composicoes farmaceuticas que a contem e de agentes de diagnostico que contem uma sequencia de adn que codifica para a respectiva sequencia de acidos aminados Download PDF

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Description

DescriçSo
A presente invençSo refere-se ao isolamento do ADNc que codifica para a proteína placentária 9 (PP9) e ao seu uso para a preparação por tecnologia genética da proteína PP9. A proteína PP9 possui, de acordo com a memória descritiva da Patente EP-B1-0 037 963, as seguintes propriedades:
a) um conteúdo em hidratos de carbono de 5,57 * 1,35% e entre estes: hexoses 4,9 ± 1,0%; hexosaminas 0,1 ± 0,1%; fucose 0,07 ± 0,05%; ácido nfeuramínico 0,5 ± 0,2%;
b) um coeficiente de sedimentação s°20.wde 3,2 * 0,2 S;
c) um peso molecular determinado por ultracentrifugação de 35 000 ± 3 800;
d) um peso molecular por determinação em gel de poliacrilamida contendo dodecilsulfato de sódio (SDS) de 40 000 i 4 000;
15»
e) um coeficiente de extinção E. (280 nm) de 14,6 + 1,0;
cm —
f) uma mobilidade electroforética no domínio das β^-globulinas;
g) um ponto isoelétrico na gama de pH de 5,0 a 6,8.
Uma vez que o método de isolamento da proteína PP9 descrito na Patente acima referida é muito dispendioso, existia a necessidade de isolar o gene que codifica a PP9 a fim de possibilitar a Preparação por tecnologia genética da PP9.
Surpreendentemente foram obtidos cinco clones individuais (PP9-10, PP9-353, PP9-357, PP9-361 e PP9-362) quando se procedia a uma busca de um banco de genes de expressão com anticorpos contra uma outra proteína placentária PP5 que não é semelhante à PP9 (Bohn e Winkler, Arch. GynSk. 223, 179-186, 1987). Estes clones contêm o ADNc integral ou partes deste. Na sequenciaçâo de PP9-10 verificou-se que o ADNc parece ser originário de um ARN de núcleo heterogéneo (HnARN) não completamente processado, uma vez que neste no interior da sequência que codifica para a PP9 - de facto nSo completamente - se encontra um intrâo de cerca de 600 pb de dimensão e na extremidade 3’ não existe qualquer sequência poli(A). Os outros quatro clones não possuem qualquer intrão e têm a sequência poli(A). Não foi possível isolar o ADNc para PP5 com o processo referido.
Os dados da sequenciaçâo fornecem o resultado de que o ADNc integral da PP9 processado tem o comprimento de 1394 pares de bases (pb) e codifica para uma proteína com 316 ácidos aminados (AA) (Quadro 1). 0 peso molecular de 35 853 D e a composição em AA estão em concordância completa com os dados mencionados na Patente referida (ver Quadro 2).
Quadro 1
30 50 GAGCGCAGCAGCCATGGCAAGCCGTCTCCTGCTCAACAACGGCGCCAAGATGCCCATCCT
MASRLLLNNGAKMPIL
90 110 GGGGTTGGGTACCTGGAAGTCCCCTCCAGGGCAGGTGACTGAGGCCGTGAAGGTGGCCAT
GLGTWKSPPGQVTEAVKVAI
130 150 170
TGACGTCGGGTACCGCCACATCGACTGTGCCCATGTGTACCAGAATGAGAATGAGGTGGG
DVGYRHIDCAHVYQNENEVG
190 210 230 GGTGGCCATTCAGGAGAAGCTCAGGGAGCAGGTGGTGAAGCGTGAGGAGCTCTTCATCGT
VAIQEKLREQVVKREELFIV
250 270 290
CAGCAAGCTGTGGTGCACGTACCATGAGAAGGGCCTGGTGAAAGGAGCCTGCCAGAAGAC
SKLWCTYHEKGLVKGACQKT
310 330 350
ACTCAGCGACCTGAAGCTGGACTACCTGGACCTCTACCTTATTCACTGGCCGACTGGCTT
LSDLKLDYLDLYLIHWPTGF
370 390 410
TAAGCCTGGGAAGGAATTTTTCCCATTGGATGAGTCGGGCAATGTGGTTCCCAGTGACAC
KPGKEFFPLDESGNVVPSDT
430 450 470
CAACATTCTGGACACGTGGGCGGCCATGGAAGAGCTGGTGGATGAAGGGCTGGTGAAAGC
NILDTWAAMEELVDEGLVKA
490 510 530
TATTGGCATCTCCAACTTCAACCATCTCCAGGTGGAGATGATCTTAAACAAACCTGGCTT
IGISNFNHLQVEMILNKPGL
550 570 590
GAAGTATAAGCCTGCAGTTAACCAGATTGAGTGCCACCCATATCTCACTCAGGAGAAGTT
KYKPAVNQIECHPYLTQEKL
610 630 650 AATCCAGTACTGCCAGTCCAAAGGCATCGTGGTGACCGCCTACAGCCCCCTCGGCTCTCC
IQYCQSKGIVVTAYSPLGSP
670 690 710
TGACAGGCCCTGGGCCAAGCCCGAGGACCCTTCTCTCCTGGAGGATCCCAGGATCAAGGC
DRPWAKPEDPSLLEDPRIKA
730 750 770
GATCGCAGCCAAGCACAATAAAACTACAGCCCAGGTCCTGATCCGGTTCCCCATGCAGAG
IAAKHNKTTAQVLIRFPMQR 790 810 830
- 3 GAACTTGGTGGTC-ATCCCCAAGTCTGTGACACCAGAACGCATTGCTGAGAACTTTAAGGT
NLVVIPKSVTPERIAENFKV
850 870 890
CTTTGACTTTGAACTGAGCAGCCAGGATATGACCACCTTACTCAGCTACAACAGGAACTG
FDFELSSQDMTTLLSYNRNW
910 930 950
GAGGGTCTGTGCCTTGTTGAGCTGTACCTCCCACAAGGATTACCCCTTCCATGAAGAGTT
RVCALLSCTSHKDYPFHEEF
970 990 1010
TTGAAGCTGTGGTTGCCTGCTCGTCCCCAAGTGACCTATACCTGTGTTTCTTGCCTCATT
1030 1050 1070
TTTTTCCTTGCAAATGTAGTATGGCCTGTGTCACTCAGCAGTGGGACAGCAACCTGTAGA
1090 1110 1130
GTGGCCAGCGAGGGCGTGTCTAGCTTGATGTTGGATCTCAAGAGCCCTGTCAGTAGAGTA
1150 1170 1190
GAAGTCTCTTCCAGTTTGCTTTGCCCTTCTTTCTACCCTGCTGGGGAAAGTACAACCTGA
1210 1230 1250
ATACCCTTTTCTGACCAAAGAGAAGCAAAATCTACCAGGTCAAAATAGTGCCACTAACGG
1270 1290 1310
TTGAGTTTTGACTGCTTGGAACTGGAATCCTTTCAGCAAGACTTCTCTTTGCCTCAAATA
1330 1350 1370
AAAAGTGCTTTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
1390
AAAAAAAAAAAAAA
Quadro 2: Composição em ácidos aminados da PP9
Ácido aminado Número
A = Ala 19
B = Asx 0
C = Cys 7
D = Asp 15
E = Glu 23
F = Phe 11
G = Gly 16
H = His 9
I = Ile 18
K = Lys 25
L = Leu 34
M = Met 6
N = Asn 15
P = Pro 20
Q = Gin 13
R = Arg 11
S = Ser 17
T = Thr 15
V = Vai 25
W = Trp 6
Y = Tyr 11
Z = Glx 0
A+G 35
S+T 32
D+E 38
D+E+N+Q 66
H+K+R 45
D+E+H+K+R 83
I+L+M+V 83
F+W+Y 28
* = Soma de Asp + Asn
” = Soma de Glu + Gin
ADNc PP9 (EP-B1-0 037
6.013 5.69
0.000 0.00
2.215 2.29
4.747 10.30
7.278 11.18
3.481 3.87
5.063 5.50
2.848 2.58
5.696 5.28
7.911 8.04
10.759 10.55
1.899 1.47
4.747 10.30
6.329 6.17
4.114 11.18
3.481 3-49
5.380 5.70
4.747 4.29
7.911 7.12
1.899 2.36
3.481 3.95
0.000 0.00
11.076 11.19
10.127 9.99
12.025 —
20.886 —
14.241 14.11
26.266 —
26.266 14.42
8.861 10.18
A figura mostra esquematicamente a posição desde lambda gtii-1O até lambda gtii-362. Dois clones apresentam uma permutação de bases:
PP9-361 na posição 255 (C em vez de G; AA Q em vez de E) e PP9-362 na posição 925 (G em vez de A; AA R em vez de K).
Através da sequência de ADNc da PP9 apresentada tornaram-se possíveis comparações com outras sequências conhecidas de ácidos nucleicos. Verificou-se que ocorrem homologias cora as sequências de ADN da redutase de aldose da ratazana (Carper et al.(1987) FEBS Letters 220, 209-213) bem como com os genes de rho-cristalino e da redutase de aldeído. Possivelmente estas proteínas pertencem à mesma superfamília” da redutase de aldeído; com maior verosimilhança a PP9 é idêntica à redutase de aldose humana.
De acordo com a presente invenção é possível obter a expressão de PP9 por ADNc que codifica para esta proteína por meio de um sistema de expressão apropriado. Por meio da selecçâo do hospedeiro é possível ainda influenciar a forma da modificação da PP9. Deste modo em bactérias não ocorre qualquer glicosilação e em células de leveduras ocorre uma glicosilação diferente das células eucarióticas superiores. A expressão de PP9 dá-se de forma especialmente vantajosa em E. coli com o vector de expressão pTrc99C ou pTacT7L (ver exemplos).
Conhecendo a sequência de ácidos aminados da PP9 é possível, de acordo com métodos convencionais ou de tecnologia genética, preparar sequências parciais de ácidos aminados que servem como antigenes para a preparação de anticorpos monoclonais ou policlcnais. Estes anticorpos não servem apenas para utilização como agentes de diagnóstico mas sim também para a preparação de colunas de anticorpos. A PP9 pode deste modo ser isolada a partir de soluções que contêm tabém outras protínas. Com o auxílio do ADNc ou de partes deste é possível também a partir de um banco genómico e de uma forma simples isolar clones genómicos que codificam para a PP9, com os quais não apenas se elucida a expressão em células eucarióticas mas também se tornam possíveis outras utilizações em diagnóstico.
A redutase de aldose (EC1.1.1.21) é uma enzima dependente de NADPH e cataliza a redução da aldose em açúcar e álcool. Em quadros patológicos de diabetes e de galactosemia uma actividade de aldose de redutase elevada provoca em vários tecidos um aumento do nível de sorbitol e de galactitol. Esta circunstância pode provocar por exemplo cataratas no cristalino bem como um espessamento das menbranas dos capilares da retina. Para além disso os níveis elevados de redutase de aldose estãc na origem de complicações diabéticas, tanto dos nervos como dos rins. Por este motivo, tem-se trabalhado intensamente no desenvolvimento de inibidores de aldose. Até agora para este fim tornava-se necessário isolar a redutase de aldose a partir de tecidos e de órgãos animais com grandes gastos e em geral com rendimentos muito reduzidos. A possibilidade da expressão da redutase de aldose em Escherichia coli (E. coli) possibilita agora a preparação de um sistema de ensaio por meio de extractos bacterianos e substitui deste modo a dependência de órgãos e de tecidos animais. 0 processo de ensaio é no geral consideravelmente facilitado.
A presente invenção é definida mais completamente por meio das reivindicações e encontra-se elucidada mais em pormenor nos exemplos que se seguem.
Sempre que no texto não seja dada qualquer elucidação utilizaram-se as seguintes abreviaturas:
EDTA = Etilenodiaminatetra-acetato de sódio
SDS = Dodecilsulfato de sódio
DTT = Ditiotreitol
BSA = Albumina de soro de bovino
IPTG = Isopropiltiogalactosido
Exemplos
1. Busca num banco de ADNc de expressão de placenta humana com anticorpos anti-PP5
Cultivou-se um banco de ADNc de expressão no fago
lambda gtii da firma Genofit GmbH, Heidelberg, com uma densidade de cerca de 30 000 PFU por placa de agar-agar (13,5 cm de diâmetro). Nestas placas infectaram-se células competentes da estirpe de E. coli y1090 (ATCC 37197) (R.A. Young e R.W. Davis, Science, vol. 222, 778-782/1983) com os fagos durante 30 minutos a 37°C e em seguida inocularam-se placas de caldo L em agar-agar superior. Incubaram-se estas placas durante 4 h a 42°C e em seguida cobriu-se cada uma com ura filtro seco de nitrocelulose (Schleicher und Schell, BA 85, Ref. NS. 401124). Os filtros tinham sido previamente saturados com IPTG 10 mM em água. Incubaram-se novamente as placas com os filtros durante 4 h a 37°C. Antes de se retirarem os filtros, marcaram-se as placas e os filtros de modo idêntico com uma agulha enegracida com negro de fumo. Incubaram-se em seguida os filtros em TBST (tris-HC1 10 mM, pH 8,0, NaC1 150 mM, Tween 20 a 0,05? e leite em pó magro a 5?) de um dia para o outro a 4°C. Em seguida lavaram-se os filtros três vezes durante 10 minutos em TBST à temperatura ambiente e em seguida incubaram-se com anticorpos de coelho anti-PP5 em 15 ml de TBST por filtro à temperatura ambiente durante 1 hora. (A solução dos anticorpos tinha sido previamente diluída a 1:200 e tinha sido saturada com células de E. coli lisadas com gtii lambda não recombinante durante 1 hora sobre filtros de nitrocelulose). Depois da incubação com o anticorpo primário lavaram-se os filtros 4 x 10 min com TBST.
Em seguida incubaram-se com agitação durante 1 hora os filtros com o anticorpo anti-coelho secundário conjugado com fosfatase alcalina (da firma Promega, EUA - representação da firma Atlanta, Heidelberg) e que tinha sido previamente diluído a 1:5000 em TBST. Em seguida lavaram-se os filtros novamente 4 x 10 min com TBST.
Em seguida efectuou-se a reacção de coloração a fim de visualizar por reacção com fosfatase alcalina e com um reagente de coloração (Sistema ProtoBlot da firma Protogen) os clones positivos de PP9 que se tinham ligado ao anticorpo primário e ao anticorpo secundário. Por reacção de coloração utilizaram-se para um filtro de nitrocelulose 15 ml de tampão AP (tris-HC1 100 mM, pH 9,5, NaC1 100 mM, MgC12 5 mM 2) com 99 pl
- 8 de substrato de NBT - (Azul de Nitro-Tetrazólio) (50 mg/ml em dimetilformamida a 70$) e 49,5 μΐ de substrato de BCIP (fosfato de 5-brorao-4-cloro-3-idolilo) (50 mg/ml em dimetilformamida a 70$). Os filtros foram feitos girar ao abrigo da luz na solução de coloração durante cerca de 20 min a 1 hora até as placas positivas apresentaram uma coloração azul suficiente. Fez-se parar a reacção de coloração mergulhando os filtros numa solução de paragem (tris-HC1 20 mM, pH 8,0 e EDTA 5 mM).
Fizeram-se corresponder as placas com sinais positivos às placas de agar-agar correspondentes. Puncionaram-se as placas com uma pipeta de Pasteur, ressuspenderam-se em 1 ml de tampão SM (tris-HC1 10 mM, pH 7,5, MgCI^) θ isolaram-se até existir uma única placa positiva. Obtiveram-se os clones que deram reacção positiva PP9-10, PP9-353, PP9-357, PP9-361, e PP9-362.
2. Análise de sequenciação de ADN
Multiplicaram-se os clones fágicos anteriormente referidos e extraiu-se de cada vez o respectivo ADN. Isolou-se o respectivo fragmento EcoRI e integrou-se no local EcoRI do vector Bluescript M13 (Stratagene, San Diego, CA, EUA). Efectuou-se a análise de sequenciação por meio do método de didesoxi enzimático de acordo com Sanger et al. (Proc.Natl.Acad.Sei.USA 74, (1977); 5463-5467). A sequência apresenta um quadro de leitura livre e codifica para uma proteína com um máximo de 316 ácidos aminados.
3· Expressão de uma proteína de fusão PP11
Digeriu-se o vector pTrc99C (E. Amann et al., Gene 69 (1988), págs. 301-315) com EcoRI. Digeriu-se o clone lambda gtii-361 com EcoRI e ligou-se a inserção EcoRI de 1387 pb de dimensão com o fragmento do vector pTrc99C antes descrito. 0 plasmídeo pTrc99C-PP9 deste modo obtido está em condiçOes de induzir a síntese de uma proteína de cerca de 36 kD em células de E. coli. Esta proteína pode ser imunoprecipitada especifica- 9 mente cora o auxílio de anti-soro anti-PP9 de coelho monoespecífico, o qual foi obtido por imunização cora PP9 isolada de placenta humana. Efectuou-se uma outra detecção da expressão de PP9 em células de E. coli por meio da análise de mancha de Western usando o soro referido. Nesta experiência apenas reage o extracto das células induzidas por IPTG que contêm o plasmídeo pTrc99C-PP9, sendo visível específicamente uma banda de uma proteína de cerca de 36 kD.
Extractos de E. coli de comparação sem o plasmíedo ou extractos contendo o plasmídeo pTrc99C-PP9 não induzidos por IPTG não reagem com o anti-soro anti-PP9 acima referido. A proteína de fusão PP9 obtida por meio da construção do plasmídeo anteriormente descrita tem a seguinte sequência de ácidos aminados N-terminal, definida pela seguinte sequência de nucleótidos:
Vector/adaptador/
Região UT 5’ /
PP9
3 4 5 6 12 3
Met Gly Asn Ser Ala Ala Met Ala Ser
...CC ATG GGG AAT TCT GCA GCC ATG GCA AGC
A proteína de fusão definida por meio desta construção possui adicionalmente à sequência de ácidos aminados integral da proteína PP9 codificada pelo ADNc de PP9 6 ácidos aminados intercalados em posição N-terminal: quatro ácidos aminados codificados pelo vector e dois ácidos aminados que são especificados pela região não traduzida. Para comparação efectuou-se novamente a construção referida igualmente com os vectores de expressão pTrc99A e pTrc99B (Aman et al., ver acima). Estes vectores distinguem-se do vector pTrc99C simplesmente em 2 pb (pTrc99A) ou em 1 pb (pTrc99B) respectivamente, provocando deslocamentos do quadro de leitura da tradução. Como era de es10
perar, tanto o vector pTrc99A-PP9 como o vector pTrc99B-PP9 estão em condições de induzir a sintese de proteínas PP9 que reagem com anti-soros anti-PP9.
A. Expressão da proteína PP9 não fundida madura
ADNc da PP9 apresenta perto do local Ncol (5’CCATCG3’) no codâo de iniciação um outro local Ncol no gene estrutural. A fim de conseguir a expressão da proteína PP9 madura, ligou-se em primeiro lugar o fragmento EcoRI de 1387 pb comprimento (ver acima) no vector pMa5-8 (Stanssens et al., 1989). Obteve-se um plasmídeo (pMa5-8-PP9) em que o fragmento EcoRI está na orientação pretendida (codão de iniciação ATG de PP9 na extremidade esquerda distai 5’), plasmídeo este que foi multiplicado. Digeriu-se o ADN plasmídico completamente com HindIII e parcialmente com Ncol. Isolou-se o fragmento NcoI-HindIII de 1415 pb e ligou-se no local correspondente no vector de expressão pTrc99A cortado com as mesmas enzimas de restrição. 0 plasmídeo resultante pTrc99A-PP9R (R significa maduro =reif) abrange 5535 pb e expressa após indução com IPTG a proteína PP9 madura não fundida. A sequência de ácidos afinados N-termir?.l da proteína PP9 é definida pela seguinte sequência nucleotídica
Met Ala Ser Arg Leu
... AGGAAACAGACC ATG GCA AGC CGT CTC :::
A proteína cuja expressão se obtêm deste modo reage com anti-soros anti-PP9 na análise de mancha de Western e na imunoprecipitaçâo, sendo possível por meio destas técnicas detectar uma proteína de cerca de 36 kD de dimensão. Verificou-se agora que esta proteína PP9 madura é transportada para o periplasma de células de E. coli e que aí ostenta a sua actividade enzimática (redutase de aldose).
A fim de aumentar a taxa de expressão da redutase de aldose em E. coli, construiu-se um vector de expressão melhorado (pTacT7L) que utiliza o local de ligação ribossomal do gene
do fago T7. É sabido que esta sequência imediatamente antes de um gene heterólogo pode aumentar a respectiva taxa de expressão por meio de uma ligação ribossomal mais eficiente (Olins et al. (1988), Gene 73, 227-235). 0 vector pTacT7L depende essencialmente do vector conhecido pKK223-3 (Brosius & Holy (1984), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 6929-6933), mas apresenta ao contrário deste a sequência T7 já mencionada imediatamente antes do adaptador de clonagem. Ligou-se o fragmento NcoI-HindIII de 1415 pb de comprimento que codifica para a proteína PP9 acima referido no vector pTacT7L cortado com as mesmas enzimas de restrição. 0 plasmídeo resultante pTacT7L-PP9 serve igualmente de mediador da expressão da proteína PP9 não fundida, no entanto o rendimento da proteína PP9 é cerca de 20 vezes mais elevado do que o obtido com o plasmídeo pTrc99A-PP9R
5. Actividade de redutase de aldose da proteína PP9 após expressão em E. coli
ComparaçOes de homologia de sequências do ADNc da proteína PP9 deram uma homologia de 94% (identidade de 85?) na análise por computador com a redutase de aldose da ratazana (Carper et al. (1987) FEBS Lett. 220, 209-213). Foram descobertas outras homologias com o rho-cristalino da rã bem como com a redutase de aldeído do cristalino da ratazana. Esta descoberta deixa supor que a PP9 é um novo membro de uma família de proteínas maior que com grande probabilidade abrange a redutase de aldose humana.
Prepararam-se fracçOes de periplasma de E. coli K12 Y'31101acIQ (pTacT7L-PP9) de acordo com o método de Hsiung et al (1986) (Bio/Technology 4, 991-995). Estes extractos apresentam uma actividade de redutase de aldose que não existe em extractos de comparação. Para detectar a actividade de redutase de aldose seguiram-se métodos de ensaio conhecidos (por exemplo, Kawasaki et al., (1989) Biochem. Biophys. Acta 996, 30-36) que se baseiam numa medição da absorção a 340 nm na dependência da oxidação de NADPH na amostra a analisar.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    - 1§ Processo para a preparação de PP9 caracteri zado por se integrar uma sequência de ADN que codifica para a sequência de ácidos aminados de acordo com a Tabela 1
    10 30 50
    GAGCGCAGCAGCCATGGCAAGCCGTCTCCTGCTCAACAACGGCGCCAAGATGCCCATCCT
    MASRLLLNNGAKMPIL
    70 90 110 GGGGTTGGGTACCTGGAAGTCCCCTCCAGGGCAGGTGACTGAGGCCGTGAAGGTGGCCAT
    GLGTWKS PPGQVTEAVKVAI
    130 150 170 TGACGTCGGGTACCGCCACATCGACTGTGCCCATGTGTACCAGAATGAGAATGAGGTGGG
    DVGYRHIDCAHVYQNENEVG
    190 210 230 GGTGGCCATTCAGGAGAAGCTCAGGGAGCAGGTGGTGAAGCGTGAGGAGCTCTTCATCGT
    VAIQEKLREQVVKREELFIV
    250 270 290
    CAGCAAGCTGTGGTGCACGTACCATGAGAAGGGCCTGGTGAAAGGAGCCTGCCAGAAGAC
    SKLWCTYHEKGLVKGACQKT
    310 330 350
    ACTCAGCGACCTGAAGCTGGACTACCTGGACCTCTACCTTATTCACTGGCCGACTGGCTT
    LSDLKLDYLDLYLIHWPTGF
    370 390 410
    TAAGCCTGGGAAGGAATTTTTCCCATTGGATGAGTCGGGCAATGTGGTTCCCAGTGACAC
    KPGKEFFPLDESGNVVPSD T
    430 450 470
    CAACATTCTGGACACGTGGGCGGCCATGGAAGAGCTGGTGGATGAAGGGCTGGTGAAAGC
    NILDTWAAMEELVDEGLVKA
    490 510 530
    TATTGGCATCTCCAACTTCAACCATCTCCAGGTGGAGATGATCTTAAACAAACCTGGCTT
    IGISNFNHLQVEMILNKPGL
    550 570 590
    GAAGTATAAGCCTGCAGTTAACCAGATTGAGTGCCACCCATATCTCACTCAGGAGAAGTT
    KYKPAVNQIECHPYLTQEKL
    610 630 650 AATCCAGTACTGCCAGTCCAAAGGCATCGTGGTGAGCGCCTACAGCCCCCTCGGCTCTCC
    IQYCQSKGIVVTAYSPLGSP
    13 λ
    670 690 710
    TGACAGGCCCTGGGCCAAGCCCGAGGACCCTTCTCTCCTGGAGGATCCCAGGATCAAGGC
    DRPWAKPEDPSLLEDPRIKA
    730 750 770
    GATCGCAGCCAAGCACAATAAAACTACAGCCCAGGTCCTGATCCGGTTCCCCATGCAGAG
    IAAKHNKTTAQVLIRFPMQR
    790 810 830
    GAACTTGGTGGTGATCCCCAAGTCTGTGACACCAGAACGCATTGCTGAGAACTTTAAGGT
    MLVVIPKSVTPERIAENFKV
    850 870 890
    CTTTGACTTTGAACTGAGCAGCCAGGATATGACCACCTTACTCAGCTACAACAGGAACTG
    FDFELSSQDMTTLLSYNRNW
    910 930 950
    GAGGGTCTGTGCCTTGTTGAGCTGTACCTCCCACAAGGATTACCCCTTCCATGAAGAGTT
    RVCALLSCTSHKDYPFHEEF
    970 990 1010
    TTGAAGCTGTGGTTGCCTGCTCGTCCCCAAGTGACCTATACCTGTGTTTCTTGCCTCATT
    1030 1050 1070
    TTTTTCCTTGCAAATGTAGTATGGCCTGTGTCACTCAGCAGTGGGACAGCAACCTGTAGA
    1090 1110 1130
    GTGGCCAGCGAGGGCGTGTCTAGCTTGATGTTGGATCTCAAGAGCCCTGTCAGTAGAGTA
    1150 1170 1190
    GAAGTCTCTTCCAGTTTGCTTTGCCCTTCTTTCTACCCTGCTGGGGAAAGTACAACCTGA
    1210 1230 1250
    ATACCCTTTTCTGACCAAAGAGAAGCAAAATCTACCAGGTCAAAATAGTGCCACTAACGG
    1270 1290 1310
    TTGAGTTTTGACTGCTTGGAACTGGAATCCTTTCAGCAAGACTTCTCTTTGCCTCAAATA
    1330 1350 1370
    AAAAGTGCTTTTGTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
    1390
    ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑΔΑΑΑ ou um seu alelo ou variante num sistema de expressSo e provocar a expressSo neste sistema.
    - 2§ Processo de acordo com a reivindicaçSo 1, caracterizado por se utilizarem para sistema de expressão células procarióticas.
    - 3β Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizarem para sistema de expressão células eucarióticas.
    Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se utilizarem para sistemas de expressão leveduras .
    _ 5ã _
    Processo para a preparação de anticorpos policlonais ou monoclonais contra PP9 caracterizado por se utilizar para a imunização uma PP9 preparada de acordo com a reivindicação 1 ou uma parte desta.
    - 6ã Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se misturar com substâncias veiculares habituais PP9 preparada de acordo com a reivindicação 1 _ 7ã _
    Processo para a preparação de um agente de diagnóstico caracterizado por se utilizar uma sequência de ADN que codifica para a sequência de ácidos aminados de acordo com a Tabela 1 ou para uma parte desta.
    _ 8ã Processo para a detecção ou para a selecçâo
    - 15 de inibidores de redutase de aldose caracterizado por se utilizar PP9 preparada de acordo con a reivindicação 1.
PT93381A 1989-03-10 1990-03-09 Processo para a preparacao de proteina placentaria 9(pp9), de anticorpos contra esta proteina, de composicoes farmaceuticas que a contem e de agentes de diagnostico que contem uma sequencia de adn que codifica para a respectiva sequencia de acidos aminados PT93381B (pt)

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