JPH02271255A - 標準液又は希釈液の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は標準液又は希釈液の製造方法に関するものであ
り、詳しくは免疫測定において測定されるべき被測定物
を認識する抗体を使用するアフィニティクロマトグラフ
ィーによる前記製造方法に関するものである。

（従来の技術） 例えば血清又は尿等の動物生体試料（これらは時にはヒ
トに由来する試料である）に含まれる蛋白質等の生体成
分を、該成分を認識する抗体を用いて測定する方法が知
られている。

この様な免疫測定方法においては、検量線を作製するた
めの、既知濃度の非測定物を含有する標準液や生体試料
を希釈するための希釈液（以下これらを単に免疫測定用
試薬と記載する）が使用される。

免疫測定用試薬は、生体試料と被測定物以外の成分が同
一であることが正確な免疫測定のために要求される。例
えば、生体試料がヒト血清又はヒト血漿である場合に、
ヒト血清又はヒト血漿以外の溶液を希釈液として使用す
ると、いわゆる血清効果が引起こされ、前記試料中の被
測定物濃度が正しい値を示さないことがある。

前記した様な不都合を解消するために、従来は、例えば
標準液であれば免疫測定に供される生体試料を材料とし
てこれに既知濃度の被測定物を添加したり又例えば希釈
液であれば生体試料をそのまま使用することがある。

以上の様に、生体試料自体を利用して標準液材料又は希
釈液を製造することは、特別な準備や面倒な操作を必要
としないため、簡便である。しかし、例えば生体試料が
ヒト血清又はヒト血漿である場合であって、被測定物が
フェリチン、インシュリン又は種々のホルモンである様
な場合にはこれら被測定物が通常のヒト生体試料中に初
めから存在していることから、これを予あ除去すること
が必要である。

この様な課題を考慮して、近年ではより正確な免疫測定
を実施するため、生体試料を被測定物を認識する抗体を
固定化した担体と接触させる、いイつゆるアフィニティ
クロマトグラフィーを実施することにより生体試料中の
被ｉ’１ｔｌＪ定物を除去し、標準液又は希釈液を製造
する方法が知られる様になった。この方法によれば、生
体試料を前記した様な担体に接触させることで、被測定
物以外の成分組成が同一の免疫測定用試薬を製造するこ
とができる。

（発明が解決しようとする課題） 従来のアフィニティクロマトグラフィーによる方法にお
いては、被測定物を認識する抗体の担体への結合は活性
化された担体表面の化学基と抗体との化学的結合、即ち
共有結合により実現され、　る。ところが、活性化され
た担体表面と抗体の化学反応は人為的なコントロールが
不可能であることから、例えば抗体中の抗原認識部位が
該表面と反応してしまうことがあり、該抗体がもはや被
測定物を認識する能力を失っていたり、あるいは認識能
力が低下していることがあり、十分に被測定物の除去さ
れた免疫測定用試薬を製造することができないという課
題がある。

本発明者はアフィニティークロマトグラフィーにより免
疫測定用試薬を製造する方法について検討した結果、担
体と被測定物を認識する抗体の結合を改良することで被
測定物を認識する抗体の失活を防ぎ、もってより正確な
免疫測定を実現し得る免疫測定用試薬を製造する方法を
発明するに至った。即ち本発明は、免疫測定において使
用される標準液又は希釈液の製造方法であって、前記免
疫Δ１り定において測定されるべき被測定物を認識する
抗体を吸着したポリスチレン製担体と試料を“接触させ
た後該試料と担体を分離することを特徴とする方法であ
り、以下詳細に説明する。

（課題を解決するだめの手段） 本発明は、担体と被ａｔ＋＋定物を認識する抗体を化学
的な共有結合ではなく、物理的な吸着によって行うこと
で該抗体の失活を防ぎ、もってより勝れた免疫測定用試
薬を製造するものである。

担体に担持させる抗体は、被測定物を認識する抗体であ
れば制限なく使用できる。それらは例えばポリクローナ
ル抗体であっても良いし、モノクローナル抗体であって
も良い。例えば、本発明の方法により製造された免疫測
定用試薬を使用する免疫測定で用いられる抗体を使用す
れば、本発明を行うために新たな抗体を調製する必要が
なくなる。

本発明で使用するポリスチレン製担体は、形状又はその
大きさにおいて特別な制限はない。また、ポリスチレン
製との言葉は、他の物質によりその核を形成し、表面に
ポリスチレン被覆を施した担体を使用することを妨げな
い。即ち本発明で使用する担体は表面がポリスチレンに
由来する抗体吸着能力を有する担体をであれば良い。担
体は、以下説明する手順で抗体を吸着させた後、通常行
われる様に、例えば牛血清アルブミン等を用いてブロッ
キング処理することにより他の蛋白質の吸着を阻止し得
る様にしておくことが好ましい。ブロッキング操作自体
は公知の方法を適用することができる。その−例として
、例えば本発明の実施例で採用した様に、重量比０．１
％の牛血清アルブミンを含むＰＢＳを担体を吸着担持し
た担体と接触させ、４℃にて２４時間放置する等の作業
を例示することができる。

本発明で使用する、被測定物を認識する抗体を担持する
担体は、前記した様に物理的な吸着により調製されるか
ら、繁雑な操作を行うことなしに得ることができる。例
えば担体を予めメタノール等で洗浄し乾燥させた後、担
持させようとする抗体と混和し、撹拌しながら４８時間
放置するなどしても良いが、放置する時間、その温度等
は検討の上、適宜決定すれば良い。

本発明の製造方法は、例えば適当な空間を提供する反応
容器中に被測定物を認識する抗体を担持する担体及び試
料を入れることで行っても良いし、容器自体又は容器内
へきをポリスチレンで被覆したものを担体として使用し
、抗体を担持させ、そこに試料を添加することで行って
も良いが、製造された免疫測定用試薬と担体との分離等
を容易にするためには、抗体を担持する担体を適当なカ
ラムに充填し、カラムクロマトグラフィーの形態で行う
ことが好ましい。カラムクロマトグラフィーの形態によ
れば、担体に担持された抗体と被測定物の接触をむらな
（しかも速やかに行うことができ、また、カラムからの
溶出液をフラクションコレクター等を用いて採取するこ
とで、担体と試料の分離を実現することもできる。

本発明の製造方法をカラムクロマトグラフィーの形態で
行うためには、担体を５〜３００μｍの球状に形成する
と良い。この様な担体によればカラムからの溶液の流出
も速く、その表面積も比較的大きいからより多くの抗体
を担持させることができる。

試料はこれまで説明してきた様に、免疫測定に供される
生体試料と同一のものを使用することが、正確な免疫測
定を行うための試薬を製造するために好ましい。例えば
免疫測定に供される生体試料がヒト血清である場合には
試料としてヒト血清を、生体試料がヒト血漿である場合
には試料としてヒト血漿を使用することが好ましい。

本発明の方法に従って製造された免疫測定用試薬は、担
体と分離された後、特別の操作をすることなしに希釈液
又は濃度Ｏ（零）の標準液として、また被測定物を必要
量添加することにより、既知の被測定物濃度を示す標準
液として使用できる。

（発明の効果） 本発明の方法により、より正確な免疫測定を実現するた
めの標準液又は希釈液を製造することができる。本発明
の製造方法では、被測定物を認識する抗体をポリスチレ
ンが６する特別な吸着性質を利用して、該抗体の活性を
低下させることなしに担持させた担体を使用することに
より、より効率的に試料中の被測定物を補足し、除去す
ることができる。

本発明の製造方法に使用される、例えば抗体を担持した
担体等は、複雑な操作なしに簡単に準備することが可能
であり、従って、本発明の方法はその準備をも含め、短
時間で、しかも簡便に行うことができる。

本発明の製造方法は特に、担体を適当なカラムに充填し
て実施することが好ましい。即ち、カラムクロマトグラ
フィーによれば、担体に担持された抗体と被測定物の接
触をむらなくしかも速やかに行うことができ、またカラ
ムからの溶出液をフラクションコレクター等を用いて採
取することで、担体と試料の分離を実現することもでき
るからである。これらのことは、被測定物の除去が実質
的に一部の抗体のみで行われることによる急激な被測定
物除去能力の低下を防ぎ、より長期間に渡って均一な免
疫測定用試薬を製造できることを意味するものである。

また、−度使用されたカラムの洗浄等も、抗体が被測定
物を遊離する様な緩衝液等を添加することで簡便に行う
ことができるという効果も有している。これは、例えば
３Ｍ濃度程度のチオシアン酸を添加した緩衝液等を使用
して行えば良い。

（実施例） 以下本発明を更に詳細に説明するたあに実施例を示すが
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例　１ 粒径４０〜６０μｍの、アミノ基と結合するＮ−ヒドロ
キシサクシンイミドエステルを有するポリメタクリレー
ト製ゲル（バイオラッド社製アフィプレップ１０（商品
名）；以下ゲル１と記載する）及びポリスチレンゲル（
東ソー（株）製；粒径約５０μｍ１以下ゲル２と記載す
る）を担体として、以下の操作により被測定物を認識す
る抗体を担持させた。

まず、両ゲルを１．Ｏｍｌのゲル容量となるように計り
とり、ゲル１については４℃のＡ液（塩化ナトリウム５
ｇ／ｌ、リン酸カリウム０゜４ｇ／ｌ、リン酸水素２カ
リウム２．３ｇ／ｌ１、アジ化すトリウム１ｇ／ｌを含
むｐＨ７，５の水溶液）にて洗浄した後、ミルシュタイ
ンとケーラー　（Ｇ、Ｋｏｈｌｃｒ、Ｃ，Ｍｉｌｓｔｃ
ｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻４９５頁１９７５年）の
方法に従って調製された抗ヒトフェリチンマウスモノク
ローナル抗体（ＩｇＧクラス）１．０ｍｇを１．Ｏｍｌ
のＡ液に溶解したものをゲル１に添加して懸濁し、更に
４°Ｃにて４８時間反応させた。

ゲル２に対しては、メタノールにて洗浄した後、減圧下
で乾燥させ、１．ＯｍｌのＡ液にて希釈された１、Ｏｍ
ｇの前記抗体を添加して懸濁し、更に４８時間反応させ
た。

ゲル１及びゲル２の前記懸濁液をＡ液にて洗浄した後、
重量比０．１％の牛血清アルブミン及び１０ｍＭモノエ
タノールアミンを含むＡ液を添加し、４℃にて２４時間
放置してブロッキング処理を行った。

以上のようにして調製された被測定物（ヒトフェリチン
）認識抗体を担持する担体を、ガラスカラムにそれぞれ
充填し、Ａ液にて洗浄、平衡化した。なお、該カラムの
ベツドボリュームは］−ｍｌである。

実施例　２ 実施例１で調製された２種のカラムに対し、最終的に５
Ｑｎｇ／ｍｌとなるようにヒトフェリチン（サンフレン
ドケミカル社製）を添加した正常牛血清を３ｍｌずつ添
加した。それぞれのカラムからの溶出液をフラクション
コレクターにて１ｍｌずつ分画した。

なお、以上の操作は４℃条件下にて行い、カラムからの
溶出液の流速は０．０２ｍ１／ｍｉｎとした。

実施例　３ 実施例２の操作に引続き、５ｍｌのＡ液をカラムに添加
して溶出させた。続いてカラムからの流速を０．１５ｍ
１／ｍｉｎに変更して実施例２と同様の４ｍｌの試料に
ついて同様の操作を行った。

実施例　４ 実施例３の操作に引続き５ｍｌのＡ液をカラムに添加し
て溶出させた。続いてカラムからの流速を１　、　０ｍ
　ｌ／ｒｎ　ｉ　ｎに変更して実施例２と同様の６ｍｌ
の試料について同様の操作を行った。

実施例　５ 実施例２〜４で得られた溶出液分画中のヒ！・フェリチ
ン濃度を測定した。

ポリスチレン製マイクロタイタープレート（ヌンク社製
、９６ウエル）の各ウェルに、実施例１で使用いた抗ヒ
トフェリチンマウスモノクローナル抗体を５０ｍＭ炭酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，６）に１．Ｏμｌ／ｍｌに
なるように溶解し、１００μｍずつ分注し、４℃にて２
４時間放置した。

Ｂ液（塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、リン酸水素ナトリウム
０．２ｇ／ｌ、リン酸水素２ナトリウム１．１５ｇ／Ｌ
塩化カリウム０．２ｇ／ｌ、ｔｗｅｅｎ−２００，５ｍ
ｌ／ｍｌを含むｐＨ７，４の水溶液）にて各ウェルを洗
浄した後、重量比０．１％の牛面清アルブミンを含むＢ
液を３００μｍずつ各ウェルに分注し、４°Ｃにて２４
時間放置してブロッキング処理した。

ヒトフェリチンをそれぞれ０．１．２５．２．５．５．
１０，２０．４０．８０．１６０．３２０ｎｇ／ｍｌと
なるように添加した正常牛血清を１００μｍずつ各ウェ
ルに添加し、３７℃にて２時間反応させた後、Ｂ液にて
３回洗浄し、実施例１とは異なる部位でヒトフェリチン
を認識する、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された
マウスモノクローナル抗体を添加し、３７℃で更に２時
間反応させた。各ウェルにに１００μｍの酵素基質（２
，２”−アジノビス（３−エチルベンゾジアゾリン６−
スルホン酸）２アンモニウム及び過酸化水素を含有する
ｐＨ４の緩衝液）を分注し、室温にて２時間放置した後
、シュウ酸溶液（ｐＨ１）を添加して酵素反応を停止さ
せ、各ウェルの４１５ｎｍにおける吸光度を測定し、こ
の免疫測定におけるヒトフェリチン濃度と吸光度の関係
を明らかにした。

なお、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体は、Ｎａｋ
ａｎｅ、Ｐ、に、らの方法（Ｊ。

１１ｉｓｔｃｈｃｍ、Ｃｙｔｏｃｈｃｍ、、ｖｏｌ　、
２２．１０８４〜１０９１頁１９７４年）に従って調製
した。

続いて、実施例２〜４で得られた各分画について同様の
測定を行い、先の結果を標準値として各フラクション中
のヒトフェリチン含有濃度を算出した。これらの結果を
図１に示す。

各フラクション中のヒトフェリチンはいずれの流速で溶
出を行った場合でも均一に除去されていることが分る。

特に、カラムからの溶出液の流速を０．１５ｍ１／ｍｉ
ｎ程度以下とした時には、この傾向が明確である。

なお、実施例２及び３において、Ａ液を添加した後のフ
ラクションからは、ヒトフェリチンは測定されなかった
。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明の実施例の結果を示す。図中の黒丸はゲル
１の結果を、白丸はゲル２の結果を示している。 図１−Ａは実施例２で得られフラクションについての、
図１−Ｂは実施例３で得られたフラクションについての
、図１−Ｃは実施例４で得られたフラクションについて
の、実施例５での結果を示す。 各図において、横軸は実施例２〜４得られたフラクショ
ンの内、平衝化に用いたＡ液置換に取得されたフラクシ
ョンのＮｏ、を示し、縦軸は各フラクションに含有され
ていたヒトフェリチンの濃度を示す。 特許出願人　　東ソー株式会゛社 図１ フラクノヨンＮ。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）免疫測定において使用される標準液又は希釈液の
   製造方法であって、前記免疫測定において測定されるべ
   き被測定物を認識する抗体を吸着したポリスチレン製担
   体と試料を接触させた後該試料と担体を分離することを
   特徴とする方法