JPH02243623A - 脂肪酸による治療および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は脂肪酸による治療と組成物に関する。

背　　　　景 筋痛性脳脊髄炎（ＭＥ）、あるいは良性ＭＥ、ロイヤル
・フリー病（Ｒｏｙａｌ　Ｆｒｅｅ　ｄｉｓｅａｓｅ）
、アイスランド病（Ｉｃｅｌａｎｄｉｃ　ｄｉｓｅａｓ
ｅ）、流行性神経衰弱症、ウィルス感染性症候群（ｐｏ
ｓｔ−νｉｒａｌｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウィルス感染性
疲労症候群（ｐｏｓ　ｔ−ｖｉｒａｌ　ｆａｔｉｇｕｅ
　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）および種々の他の名称で知られて
いる疾患は治療が知られていない点で共通した疾患であ
る。この疾患の特有の特徴は、今まで健康な人、しばし
ば若い人または中年の成人が烈しい疲労、筋肉痛、精神
集中の喪失、頭痛および恐らく心搏の異常を示している
であろう心悸昂進を示すことにある。

この症状は数か月または数年継続する。

その原因は知られていないが、注意深く経歴をみると、
その症状の始まる以前に熱性ウィルス性感染の存在が明
らかである。患者の大部分は免疫機能低下および慢性ウ
ィルス性感染のいくつかの証拠を有している。

コックスサラクル（Ｃｏｘｓａｃｋｌｅ）およびエプス
タイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウィルス
が去通して含まれているが、単一の特定のウィルスは含
まれていない。恐らくは、種々のウィルスが慢性感染に
かかり易い免疫反応が低下した人に上記症状を起こさせ
るものと思われる。

−船釣議論 食品中に、ｎ−６系列のリノール酸（ＬＡと略記）とｎ
−３系列のα−リルン酸（Ａ　Ｌ　Ａと略記）の二つの
主要な必須脂肪酸（ＥＦＡと略記）が見出されている。

人体によって十分に利用されるためには、そして、これ
ら酸の必須の機能を達成するためには、ＬＡおよびＡＬ
Ａは共に、ＬＡの場合にはＴ−リルン酸（ＧＬＡと略記
）に、ＡＬＡの場合にはステアリドン酸（ＳＡと略記）
に６の位置が脱飽和（６−脱飽和と略記）されねばなら
ない。ＧＬＡおよびＳＡは次いで更に第１表経路に沿っ
て代謝される。

６−脱飽和代謝産物は、特に全ての細胞膜のリン脂質構
造の成分として、またプロスタグランジン、ロイコトリ
エンおよびヒドロキシ脂肪酸を含む種々の高活性制御物
質の先駆体として体内における多くの異なるａ能を有し
ている。

（本頁以下余白） 第１表 第１表の経路は通常では非可逆的であり、ヒトではｎ−
３系列酸およびｎ−６系列酸は相互に変換不可能である
。

これら酸は天然では全てシス構造であり、組織的には対
応するオクタデカン酸、エイコサン酸またはトコサン酸
の誘導体として、たとえばΔ−９．１２−オクタデカジ
エン酸またはΔ−４，７，１０゜１３、１６．１９−ド
コサヘキサエン酸と命名されるが、これら酸に対応して
１８：２ｎ−６または２２：６ｎ３のような数字表示も
便利である。イニシャル、たとえば２２：６ｎ−３（ド
コサヘキサエン酸、ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ　
ａｃｉｄ）についてＤＨＡも用いられるが、同一の鎖長
および不飽和度のｎ−３酸およびｎ−６酸が存在する場
合には役に立たない。

第１表に示したように、ｎ−６系列では俗名が多少は一
般に用いられる。ｎ−３系列では、１８：３ｎ−３が一
般的に用いられる俗名、α−リルン酸を有するのみであ
る。

Ｔ−リルン酸が用いられる以前は、文献には単にリルン
酸と記載され、特に初期の文献ではα−酸と呼ばれてい
るのが特徴的である。

培養中の細胞のウィルス感染は、これら細胞の６−脱飽
和を行なう能力を低下させるとの証拠がある。この結果
、ＬＡおよびＡＬＡから導かれた６−脱飽和脂肪酸の細
胞内における製造に欠陥が生ずる。

また、ポリ不飽和脂肪酸およびこれらの誘導体は、ある
種のウィルスを直接不活性化するとの証拠もある（たと
えば、Ｊ、Ｄ、５ａｎｄｓら、”Ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏ
ｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ
ａｐｙ　１５’　％第６７〜７３頁、１９７９年）。従
って、正常な方法では６−脱飽和を行ないえない細胞は
、初期におけるウィルス感染とたたかう能力が低下して
いる可能性がある。

６−脱飽和の低下は、多くの異なる目的のための６−脱
飽和ＥＦＡの減少した流れの故に、ウィルス感染細胞が
正常に機能しえないことを意味し、たとえばエプスタイ
ン−バールウィルス感染後のＥＦＡの異状は臨床性疾患
の持続と相関性があることが示されている。

実験結果 ＭＥにかかった７０人の患者が適切であると考えられ、
この中の女性３６人および男性２７人が、月見草油（Ｅ
　Ｐ　Ｏと略記）８０％と魚油〔ここでは、ＥＦＡＭＯ
Ｌ　ＭＡＲＩＮＥ　（商標名）を使用〕２０％の混合物
の無作為の、ダブルブラインド（ｄｏｕｂｌｅｂｌｉｎ
ｄ）、凝集制御試験を承諾した。

各々がＧ　Ｌ　Ａ　７．２％（３５ｍｇ）　、エイコサ
ペンクエン酸（ＥＰＡ）３．６％（１７ｍｇ　）および
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）１．８％（Ｉｌｍｇ）な
らびにリノール酸２５５■の明確な量を含む５００■の
カプセルを用いた。凝集は、主としてオレイン酸および
少量のＬＡ　（カプセル当り５０■）から成り、６−脱
飽和または高級ＥＦＡを含まない。患者は１５週間の間
、無作為に上記の活性剤または凝集による治療を受けた
。実験開始時および５．１０および１５週の後に、患者
は動悸、頭痛および筋肉痛の激しさについて採点した。

試験終了時に、患者は試験開始時の状態と対比して極め
て良好、良好、変化なし、または悪化と状態を評価する
ことが要求された。結果を添付第１図囚、■、０および
第２表に示す。第１囲いは患者が筋肉痛、第１図■は頭
痛、第１図りは動悸の場合であり、直線Ａ−ＡはＥＦＡ
　（活性剤）投与群を示し、直線Ｐ−Ｐは凝集投与群を
夫々示す。

患者には活性剤または凝集のいずれかの上記５００ｍｇ
カプセルを４個、１日当り２回投与した。

各図における採点数の増加は病状軽減を示し、採点数の
減少は病状悪化を示す。第１図から明らかなように、結
果は極めて明解であった。

活性剤投与群の８４％は良好または極めて良好、１６％
は変化なしであり、悪化は全くなかった。

凝集投与群では、２２％が良好または極めて良好であり
、変化なしは７０％、悪化は８％であった。

二つの群の結果の差は統計学的に極めて高度で有意であ
った（ｐ　＜　０．０００１）。

（本頁以下余白） 第２表 試験終了時において、開始時と比較して極めて良好、良
好、変化なし、または悪化であるか否かについての患者
の評価。評価はブラインドベースで行なわれ、患者はい
ずれの治療を受けているかについて気付いていない。

活性剤　　　凝　集 極めて良好　　　　　３２％　　　　９％良好　　　５
２％　　１３％ 変化なし　　　　１６％　　　７０％ 悪化　　　０％　　８％ 症状の根底的原因の不確実さによって影響されない臨床
的判断によるこの検討は６−脱飽和またはより高級のＥ
ＦＡの投与がＭＥの今まで治療不可能と考えられていた
主観的な症状の軽減に極めて有効であることを明確にし
ている。

ｎ−６ＥＦＡ単独またはｎ−３ＥＦＡ単独でも有効であ
るが、両系列のＥＦＡを共に投与することによって最適
の結果が得られる。

上記臨床実験に加えて、赤血球膜リン脂質中の脂肪酸水
準の広範な測定を行なった。結果を第３表に示す。第３
表においては、ウィルス感染性疲労症候群（ｐｏｓｔ−
ｖｉｒａｌ　ｆａｔｉｇｕｅ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を有
する患者における赤血球膜リン脂質中の主要脂肪酸の濃
度（■／１００ｇ脂質で表わし、±ＳＤを意味する）を
、基準線において正常コントロールと比較した。また第
３表には、ＥＦＡＭＯＬＭＡＲＩＮＢおよび凝集を投与
された患者群における実験開始時および試験終了時の脂
肪酸レベルも示した。

１■／１００ｇを越える濃度で存在する全ての脂肪酸を
示した。コントロールとウィルス感染性疲労症候群患者
群との差はｕｎｐａｉｒｅｄ　５ｔｕｄｅｎｔ’ｓｔ試
験によって比較した。一方、実験開始時および実験後の
差はｐａｉｒｅｄ　を試験によって比較した。第３表の
結果は上記投薬の効果を示している。

（本頁以下余白） イン　−フェロンおよびＥＦＡ インターフェロン（α、βおよびＴ）は、これらの抗ウ
ィルス作用の故に最初に見出された内因性サイトカイン
（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）である。インターフェロンは天然
産内因性化合物と類似の、またはそれと同様な生物工学
的方法によって現在合成することができる。

インターフェロンは、一部ではｎ−６必須脂肪酸のアラ
キドン酸（ＡＡと略記）からプロスタグランジンへの変
換を促進する作用をする。

もしもこの作用が起こらなければ、インターフェロンは
抗ウィルス作用の多くを、または全てを失なう。

前記実験が示すように、本発明者らはウィルス感染の後
に疲労に苦しむ患者は正常な個人に比較してｎ−６ＥＦ
Ａおよびｎ−３ＥＦＡ両方の水準が低下していることを
見出した。また本発明者らは、ｎ−６ＥＦＡのＧＬＡお
よびＤＧＬＡを、ｎ−３ＥＦＡのＥＰＡおよびＤＨＡと
共に投与すると、凝集を与えた患者に比較してウィルス
感染後の症候群を有する患者の臨床上の症状に劇的な改
善をもたらすことを見出した。

従って、ｎ−３およびｎ−６ＥＦ’Ａは共にウィルス感
染に対する人体の応答を促進し、かつインターフェロン
をより効果的に機能させる作用を含むと考えられる。Ｇ
ＬＡ、ＤＧＬＡおよびＡＡから選ばれた１種以上のｎ−
６ＥＦＡおよび／またはステアリドン酸、ＥＰＡ、　　
ドコサペンクエン酸およびＤＨＡから選ばれた１種以上
のｎ−３ＥＦＡと１種以上のインターフェロンとの共同
投与はインターフェロンの治療効果を著しく高めるであ
ろう。

主ｊＬ所 本発明者らは、ウィルス感染性症候群を有する患者の改
善のために、ｎ−６系列およびｎ−３系列の６−脱飽和
ＥＦＡまたはこれらから導かれたより高級の酸を同時に
投与することを提案する。

このことは人体のＥＦＡの状態の゛正常化に役立ち、更
に直接的な抗ウイルス効果も有するであろう、更に、イ
ンターフェロンをかかる投与と共に用いることもできる
。

より詳細には、本発明は下記の点にある。

１、ｒ＋−６系列の１種以上の６−脱飽和および高級の
ＥＦＡおよびｎ−３系列の１種以上の６−脱飽和および
より高級のＥＦＡの、選択的には１種以上のインターフ
ェロンと共同の投与から成る新規なＭＥ治療方法。

２、上述したような、ＭＥ治療のための組成物。

３、上述したような、ＭＥ治療のための医薬組成物の製
造方法。

投与量範囲 各々のＥＦＡは１日当り１ｍｇ〜１００ｇ、好まししく
は１日当り５０ｍｇから２０ｇ、特に好ましくは１日当
り５００ｒｎｇ〜５ｇの投与量範囲で与えられる。α、
βまたはγ−インターフェロンは、望ましくは週当り５
００，０００〜５００百万単位、好ましくは週当り２か
ら５０百万単位、よ１り好ましくは週当り５〜２５百万
単位の範囲の投与量であり、分割して、毎日または週当
り２〜５回投与される。

誘導体 酸はそれ自体で、または薬学的に許容され生理学的に等
価な、たとえばＧＬＡおよびＤＧＬＡについて詳細に後
述するような誘導体として用いられ、いずれかの酸に関
する記述は、その酸がそのような誘導体の形状の場合の
記述も含むとして扱われるべきである。

誘導体が等価であることは、上述した代謝経路に入れて
、酸自身またはそれらの天然産グリセライドエステルの
効果に相当する効果で証明することにより明らかにされ
る。すなわち、有用な誘導体の間接的確認は、それら誘
導体が酸自体の人体における価値のある効果を有するこ
とによってであるが、誘導体の変換は血液、体脂または
他の組織中の濃度の標準的技術、たと場合　Ｕ、Ｓ、Ｓ
、、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ、　　Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、　　
ＡｍｅｒｉｃａｎＯ３ｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｓ　５ｏｃｉ
ｅｔｙ、Ｐｅｒｋｉｎｓｉ、Ｐｅ１ｉｃｋら、”Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｌｉｐｉｄｓ　ａｎｄ　Ｌｉｐｏｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ　、第２３頁記載のガス・クロマトグラ
フ分析によって直接示される。

概略を云えば、この方法は適切には血漿試料（１ｍｌ）
がクロロホルム：メタノール（２：１）によって抽出さ
れる。抽出物は硫酸ナトリウムを経て濾過され、蒸発乾
固され、０．５　ｄのクロロホルム：メタノールに溶解
される。脂質骨は薄層クロマトグラフィまたはシリカゲ
ル板によって分離される。最も鋭敏に必須脂肪酸含有量
を反映するリン脂質は三フッ化ホウ素−メタノールを用
いてメチル化され、得られた脂肪酸のエステルは分離さ
れ、１０％のシラール（ｓｉｌａｒ）を含むクロモソー
ブ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｒｂ）　ＷＡＷ１０６／２３０を
充填した６フイートのカラムを有するｌｌｅｗｌｅｔｔ
Ｐａｃｋａｒｄ　５８８０ガス・クロマトグラフを用い
て測定される。キャリアガスはヘリウム（３０ｄ／分）
である。炉の温度は２°Ｃ／分で１６５〜１９０°Ｃに
昇温するようにプログラムされる。検出器温度は２２０
°Ｃであり、注入器温度は２００″Ｃである。

保持時間およびピーク面積はｌｌｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃ
ｋａｒｄｌｅｖｅｌ　４積分器で自動的に計算される。

ピークは標準の脂肪酸メチルエステルとの比較によって
確認される。

パック もしも異なる活性物質を共に含む組成物が望ましくない
ならば、提供された物質を別個に含む、または合併投与
部分と別個の投与部分を適切な相対量で含むパックを製
造することができる。そして、かかるパックの使用も本
発明の範囲に含まれる。

健康食品組成物 本発明を主として治療方法および薬品組成物に関して述
べたが、γ−リルン酸および他の酸は健康食品添加物の
性質を持っているので、健康食品マーガリンまたは他の
食品に添加することができる。

そして、かかる健康食品も上述した目的に使用するとき
は薬品組成物の概念に含まれると理解すべきである。

γ−リルン酸および他の酸の形状と供給源本発明に従っ
て、他の酸と共に使用するためのＴ−リルン酸およびジ
ホモ−γ−リルン酸の生理学的に等価で便利な誘導体に
は、塩、アミド、グリセライドエステルおよびアルキル
（たとえば０１〜Ｃ，）エステルを含むエステルおよび
す、ン脂質が含まれる。

もしも望むならば、本発明において使用するだめの薬品
組成物を、天然産または合成の酸それ自体、または誘導
体を薬学的に許容される賦形剤と組合せて製造すること
ができる。

しかしながら、現時点においては、少なくともＴ−リル
ン酸を高γ−リルン酸含有量を有する入手可能な油（以
下、本明細書では“油”と称する）の形状で用意するの
が便利である。

現在、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ａｌｐｉｎｅ菌が供給
源を提供するが（Ｓｈｉｍｉｚｕら、ＪＡＯＣ５６６、
Ｎｏ、　２　、ｐ、２３７−２４１）、γ−リルン酸の
高含有量を存する油の既知天然供給源は極めて少なく、
またジホモ−Ｔ−リルン酸の市販供給源は知られていな
い。

現在入手可能な油の一つの供給源は、Ｏｅｎ。

ｔｈｅｒａ　ｂｉｅｎｎｉｓ　Ｌ、および０ｅｎｏｔｈ
ｅｒａ　Ｌａｍａｒｃｋｉａｎａのような月見草種の種
子であり、この種子からの油抽出物はγ−リルン酸（約
８％）およびリノール酸（約７２％）をグリセライドの
形で他のグリセライドと共に含む（％は全脂肪酸をベー
スとする）。

γ−リルン酸の他の供給源は、ハ胆赳 ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓのようなルリジサ種であり、ニ
ーカー当りの現在の収量は低いが、０ｅｎｏ　ｔｈｅｒ
ａ油よりもＴ−リルン酸のより豊富な供給源を与える。

醗酵によって培養することができる菌類の最近の研究に
よれば、菌類からの油供給源が約束される。

油は、常温圧縮、種子を部分的に煮込んだ後のねじ締め
圧縮、または溶媒抽出のような慣習的抽出方法の一つに
よって種子から抽出される。

この油の代表的試料の分溜によれば、メチルエステルの
形での相対比率は下記のとおりである。

パルミテート　　　　　　　６．１５ ステアレート１．６ オレエート　　　　　　　　　１０．１５リルエート　
　　　　　　７２．６ Ｔ−リルネート　　　　　８．９ 上述した種子油抽出物はそれ自体で使用することができ
、または、たとえば、もしも望むならば更に分溜して脂
肪酸の主成分としてγ−リルン酸およびリノール酸のト
リグリセライドを含み、もしも望むならばＴ−リルン酸
含有量が主要部分である油状組成物を得ることができる
。

種子油抽出物は、もしも存在すればジホモＴ−リルン酸
を安定化させる効果を有するように思われる。

他の酸の供給源 ２２：４および２２：５ｎ−６酸の天然供給源には、屠
殺場から得られる副腎（２２：５ｎ−６酸）および腎臓
（２２：４ｎ−６酸）およびアメリカ・スツポン（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ　Ｓｎａｐｐｉｎｇ　Ｔｕｒｔｌｅ）の脂
肪中の２２：４ｎ−６酸が含まれる。

ｎ−３酸は魚油から、特に２０：５ｎ−３酸および２２
　：　６　ｎ−３酸が入手可能である。

酸は、これら供給源から、たはえば温和な非酸化条件下
でのケン化、次いで予備的な気液クロマトグラフィによ
り分離される。

酸の合成は困難ではあるが不可能ではなく、他の供給源
を与える。

薬剤としての提供 本発明における組成物は、本発明が参照する英国特許第
１．０８２，６２４号明細書にＷｉｌｌｉａｍｓが詳細
に論じたような、かついずれの場合もいずれかの特定の
種類の製剤に一般に極めて良く知られている、適切な薬
学的賦形剤による経口、経腸または非経口投与に適切な
形状であるのが好都合である。

すなわち、たとえば錠剤、カプセル剤、摂取可能な液体
または粉末製剤を要求により製造することができ、γ−
リルン酸または°他の酸が皮膚を通して吸収されるとき
は局所用製剤が製造される。

加水分解０ｅｎｏｔｈｅｒａ油の注射液は遊離酸を溶解
させるためにアルブミンを用いて製造される。

製剤への防腐剤の添加は有利である。約０．１重量％濃
度のα−トコフェロールがこの目的に好適であることが
見出された。

いずれの投与量単位中に存在する活性物質の絶対量は、
採用される適切な投与量および方法を越えるべきではな
いが、また一方では、望ましくは少ない投与数量によっ
て達成される望ましい投与量を可能にするのに適切な量
であるべきである。

更に投与量は望ましい正確な薬理学的作用に依存する。

実施例 下記のようにしてＭＥを治療した。

１、　ＥＰＯ４００ｍｇおよび魚油１００ｍｇを含む軟
質ゼラチンカプセルの４個を１日当り２回投与した。

２、ルリジサ油３５０■およびマグロ油１５０ｍｇを含
む軟質ゼラチンカプセル。１日当り３個のカプセルを２
回投与。

３．８０％黒スグリ（ｂｌａｃｋｃｕｒｒａｎｔ）種子
油および２０％の鯨油の５００■を含む軟質ゼラチンカ
プセル。１日当り４個のカプセルを２回投与。

４．２０％のＧＬＡを含む細菌油８０％と１７％のＤＨ
Ａ、４％のＥＰＡおよび３％のアラキドン酸を含むオー
ストラリア産魚油２０％とから成る油の５００■を含む
軟質ゼラチンカプセル。

１日当り４個のカプセルを２回投与。

５、遊離酸、エチルまたは他のエステル、アミド、トリ
、ジまたはモノグリセライド、リン脂質または他のいず
れかの生理学的に許容される形状の精製Ｇ　Ｌ　Ａ　２
５Ｃ１ｍｇおよびいずれかの許容可能形状のＥＰＡ　２
５０ｍｇ　（いずれも遊離酸として計算）。１日当り２
個のカプセルを２回投与。

６．６−脱飽和またはより高級のｎ−６ＥＦＡの３５０
■と６−脱飽和またはより高級のｎ−３ＥＦＡの３５０
ｍｇとの組合せ。１日当り１個のカプセルを２回投与。

７．　ＧＬＡ　２８０ｍｇおよびＥＰＡｌｏｏｍｇを含
む軟質ゲルカプセル１日当り６個の割合いの経口投与と
共に、１日当りα−インターフェロンの３百万単位を非
経口製剤として投与。

８．５００ｍ１当りインターフェロンの３百万単位を含
む溶液を、リチウム−〇ＬＡ２ｇおよびナトリウム−Ｅ
ＰＡ　Ｉｇと共に静脈内投与。

【図面の簡単な説明】

第１囲いは筋肉痛、第１図■は頭痛、第１図（Ｑは心悸
昂進を有する患者への本発明における組成物（直線Ａ−
Ａ）および凝集（直線Ｐ−Ｐ）の投与実験結果を示す図
である。 代理人　弁理士　小　川　信　−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ウィルス感染性疲労症候群あるいは筋痛性脳脊髄炎
   （ＭＥ）として知られる疾患の治療に使用するための薬
   剤の製造のためにｎ−６系およびｎ−３系各々の１種以
   上の６−脱飽和またはより高級の必須脂肪酸の使用。 ２、前記薬剤にインターフェロンが混合される請求項１
   記載の使用。 ３、ウィルス感染性疲労症候群をわずらう人にｎ−６お
   よびｎ−３系各々の１種以上の脱飽和またはより高級の
   必須脂肪酸が投与されるウィルス感染性疲労症候群ある
   いは筋痛性脳髄膜炎（ＭＥ）として知られている疾患の
   治療方法。 ４、前記酸に加えてインターフェロンが投与される請求
   項３記載の治療方法。 ５、夫々の必須脂肪酸が、単一投与量または分割投与量
   において１日当り１ｍｇ〜１００ｇ、好ましくは１日当
   り５０ｍｇ〜２０ｇ、特に好ましくは１日当り５００ｍ
   ｇ〜５ｇの量である請求項１記載の使用または請求項３
   記載の方法。 ６、インターフェロンが分割された、毎日の、または週
   当り２〜５回の投与量において、週当り５００，０００
   〜５００百万単位、好ましくは週当り２〜５０百方単位
   、より好ましくは週当り５〜２５百万単位の量である請
   求項２記載の使用または請求項４記載の方法。