JPH0222344B2

JPH0222344B2 -

Info

Publication number: JPH0222344B2
Application number: JP56074807A
Authority: JP
Inventors: Teizo Shinozaki; Keiichi Takamura; Isao Matsunaga; Hidetaka Shimada; Reiko Yamamoto; Seiji Hashimoto; Kyoshige Wakabayashi
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1981-05-20
Filing date: 1981-05-20
Publication date: 1990-05-18
Also published as: JPS57192320A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は式（式中Ｒは免疫原性担体物質であり、大括弧内
末端カルボニルはＲの一部であるアミノ基に結合
している。ｍは１〜３、ｎは５〜70の整数であ
る。）で表わされる新規なハプテン抗原及びその製造方
法に関する。本発明は、特にジソピラミドに対する特異抗体
（抗血清）を得るために必要なハプテン抗原を提
供することを目的とする。ジソピラミドは不整脈治療剤として繁用されて
いる薬剤であるが、その投与にあたつては頻回に
患者の状態を観察し、異状な場合には速やかに投
与量を減ずるか休薬する必要がある。この観察の
一手段として薬剤の血中濃度を監視する方法があ
る。ジソピラミドの血中濃度は個体によつて多少
の差はあるが通常、成人で2.6μｇ／ml位が最適と
され4.0μｇ／mlとなる過剰投与とされている。薬物の血中濃度の測定方法として、最近は試料
から直接測定できるラジオイムノアツセイ法、エ
ンザイムイムノアツセイ法、ネフエロメトリツク
イムノアツセイ法等の免疫化学的方法が繁用され
るようになつてきたが、これらの方法において重
要なことは対象薬物に対して特異性が高くかつ高
力価な抗体（抗血清）をいかにして入手するかと
いうことである。本発明はジソピラミドに対して特異性が高くか
つ高力価な抗体（抗血清）を得るために必要なハ
プテン抗原及びその製造方法に関する。本発明のハプテン抗原は式（式中Ｒは免疫原性担体物質であり、大括弧内
末端カルボニルはＲの一部であるアミノ基に結合
している。ｍは１〜３、ｎは５〜70の整数であ
る。）で表わされ、式（式中ｍは１〜３の整数である。）で表わされる化合物またはその反応性誘導体と免
疫原性担体物質のアミノ基とを反応させることに
より製造される。たとえば前記式〔〕の化合物
をジメチルホルムアミドあるいはジオキサンのよ
うな非プロトン性の溶媒中で、Ｎ−ヒドロキシサ
クシンイミドあるいは１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾールのようなエステル化剤およびカルボジイ
ミド類のような縮合剤と反応させて前記式〔〕
の化合物の活性エステルを生成させ、これを別途
適当な溶媒にアミノ基を有する免疫原性担体物質
を溶解させて調整した溶液に加え、反応させるこ
とにより製造される。また、前記式〔〕の化合物を水または適当な
有機溶媒あるいは両者の混合溶媒に溶解し、次い
でアミノ基を有する免疫原性担体物質を添加溶解
させ、これにカルボジイミド類の如き縮合剤を加
えて反応させることによつても製造される。更にはジオキサンあるいはジメチルホルムアミ
ドのような水と相溶性のある無水の非プロトン性
溶媒とトリ−ｎ−ブチルアミン、トリエチルアミ
ンあるいはピリジンのような塩基との混合溶液を
調製し、これに前記式〔〕の化合物を溶解さ
せ、更に撹拌下クロル蟻酸イソブチルを加えて反
応させた後、別途アルカリ水溶液にアミノ基を有
する免疫原性担体物質を溶解して調製した溶液を
加えて反応させることによつても製造される。上述した製造方法は、いずれもアミド結合を形
成させる方法であり、それぞれ活性エステル法、
縮合剤を用いる方法、混合酸無水物法として一般
によく知られた方法である。また、この他に酸ハ
ライド法、アザイド法、活性アミド法等の方法に
よつても製造される。本発明で用いる免疫原性担体物質としては、牛
血清アルブミン（BSA）、人血清アルブミン
（HSA）、ポリリジン、ヘモシアニン等の異種蛋
白あるいはリポポリサツカライド、ポリサツカラ
イド、脂質、更にはアミノ基を有するラテツクス
粒子等が好適な例として挙げられる。本発明のハプテン抗原（前掲式〔〕）を常法
により宿主動物に免疫して得た抗体（抗血清）
は、ジソピラミドに対し特異性が高く、かつ高力
価なものであつた。本発明の原料化合物である前掲式〔〕の化合
物は新規化合物であり、たとえば以下の反応式に
沿つて製造される。前掲式〔〕で示す化合物は公知化合物であ
り、たとえば文献ジヤーナル・オブ・メデイシナ
ル・ケミストリー（Journal of Medicinal
Chemistry）17（11）巻1131頁〜1135頁（1974年）
に示される方法によつて製造される。前掲式
〔〕で示す化合物は前掲式〔〕の化合物と低
級アルカノールアミンとを反応させることによつ
て製造されるが、ころ反応において該低級アルカ
ノールアミンは反応溶媒としての役目もあり該
〔〕の化合物に対して大過剰量用いる。この反
応は室温乃至溶媒沸点の間で行われ、反応時間は
１乃至24時間位である。なお、炭酸カリウムの如
き塩基触媒の存在下に該反応を行うと、反応がよ
り容易に進行するので好ましい。反応終了後反応
液を酢酸エチルで抽出し、次いで酢酸エチルを除
去後残留物をカラムクロマトグラフイーで精製し
式〔〕の化合物を得る。式〔〕に示す化合物
は非プロトン性有機溶媒（例えばピリジン、クロ
ロホルム、ベンゼンあるいはトルエンの如き）中
で前記式〔〕の化合物と無水コハク酸とを当モ
ルづつ反応させ、反応終了後溶媒を除去しカラム
クロマトグラフイーで精製して得られる。この反
応も上記の反応と同様室温乃至溶媒沸点の間で行
われ、反応時間は１乃至24時間位である。次に実施例によつて本発明を詳細に説明する。実施例１原料化合物の合成以下の反応式に沿つて３−｛２−〔４−ジイソプ
ロピルアミノ−２−フエニル−２−（２−ピリジ
ル）酪酸アミド〕エトキシカルボニル｝プロピオ
ン酸を合成した。 (1) ２−フエニル−２−（２−ピリジル）酢酸エ
チルの合成水素化ナトリウム（油性、約50％）13.2ｇをジ
メチルホルムアミド200mlに懸濁し、これにジメ
チルホルムアミド50mlにフエニル酢酸エチル41.3
ｇを溶解した液を撹拌下室温で滴下した。徐々に
加熱し、40〜50℃で約40分間撹拌下反応させた。
次いで50℃で２−クロルピリジン26.0ｇを滴下
し、70〜80℃で約４時間撹拌下反応させた。反応
終了後反応液を冷却した後、冷水約750mlに移し、
酢酸エチル約300mlで抽出した。抽出液を水洗し
無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮によつて
溶媒を除去し油状物を得た。この油状物をワコー
ゲルＣ−200（和光純薬工業株式会社製、カラムク
ロマトグラフ用シリカゲル充填剤）400ｇを充填
したカラムクロマトグラフイーにかけ、溶出溶媒
としてヘキサン：クロロホルム（容積比１：１）
並びにクロロホルムを順次流した。目的物を含む
分画を採り、減圧濃縮によつて溶媒を除去し２−
フエニル−２−（２−ピリジル）酢酸エチルの精
製物（油状）12.3ｇを得た。（NMRで本品である
ことを確認した。） (2) ４−ジイソプロピルアミノ−２−フエニル−
２−（２−ピリジル）酪酸エチルの合成 (a) 上記(1)で得た２−フエニル−２−（２−ピリ
ジル）酢酸エチル6.5ｇをジメチルホルムアミ
ド20mlに溶解しＡ液とした。 (b) ２−ジイソプロピルアミノエチルクロライド
塩酸塩6.5ｇを水に溶解し、過剰の20％炭酸カ
リウム水溶液で中和し油状の２−ジイソプロピ
ルアミノエチルクロライドとし、ベンゼンで抽
出した。次いで抽出液を無水硫酸ナトリウムで
乾燥した後、減圧濃縮によつてベンゼンを除去
して油状物を得、これをジメチルホルムアミド
20mlに溶解しＢ液とした。 (c) 水素化ナトリウム（油性、約50％）1.9ｇを
ジメチルホルムアミド100mlに懸濁し、撹拌下
前記Ａ液を滴下した。40℃で30分間撹拌反応
後、前記Ｂ液を滴下し40〜45℃で更に30分間撹
拌反応の後、反応液を冷却し冷水500mlに移し
た。酢酸エチル300mlで抽出し、水洗後無水硫
酸ナトリウムで乾燥し、次いで減圧濃縮によつ
て溶媒を除去して油状物を得た。この油状物を
ワコーゲルＣ−200（和光純薬工業株式会社製、
カラムクロマトグラフ用シリカゲル充填剤）
100ｇを充填したカラムクロマトグラフイーに
かけ、溶出溶媒としてクロロホルム並びにメタ
ノール：クロロホルム（容積比１：19）を順次
流した。目的物を含む分画を採り、減圧濃縮に
よつて溶媒を除去して４−ジイソプロピルアミ
ノ−２−フエニル−２−（２−ピリジル）酪酸
エチルの精製物（油状）6.7ｇを得た。（NMR
で本品であることを確認した。） (3) ２−〔４−ジイソプロピルアミノ−２−フエ
ニル−２−（２−ピリジル）酪酸アミド〕エタ
ノールの合成上記(2)で得た４−ジイソプロピルアミノ−２−
フエニル−２−（２−ピリジル）酪酸エチル５ｇ
と無水炭酸カリウム５ｇをエタノールアミン50ml
に加えて約75℃で６時間撹拌下反応させた。反応
液を冷却した後冷水500mlに移し、酢酸エチル300
mlで抽出した。水洗後無水硫酸ナトリウムで乾燥
した後減圧濃縮によつて溶媒を除去し油状物を得
た。この油状物をワコーゲルＣ−200（和光純薬工
業株式会社製、カラムクロマトグラフ用シリカゲ
ル充填剤）100ｇを充填したカラムクロマトグラ
フイーにかけ、トリエチルアミン：エーテル（容
積比１：40）で溶出した。目的物含有分画を採り
減圧濃縮によつて溶媒を除去して２−〔４−ジイ
ソプロピルアミノ−２−フエニル−２−（２−ピ
リジル）酪酸アミド〕エタノールの精製物（油
状）2.6ｇを得た。 NMRスペクトル：CDCl₃，60MHz，δ，0.94
（12H，ｄ，Ｊ＝6.8Hz），2.0〜3.0（4H，
ｍ），2.87（2H，ｈ，Ｊ＝6.8Hz），3.23〜
3.87（5H，ｍ），6.80〜7.87（8H，ｍ），8.40
〜8.60（1H，ｍ），9.25（1H，broad ｓ） (4) ３−｛２−〔４−ジイソプロピルアミノ−２−
フエニル−２−（２−ピリジル）酪酸アミド〕
エトキシカルボニル｝プロピオン酸の合成上記(3)で得た２−〔４−ジイソプロピルアミノ
−２−フエニル−２−（２−ピリジル）酪酸アミ
ド〕エタノール26.2と無水コハク酸0.73ｇをピリ
ジン30mlに溶解し１時間加熱還流下反応させた。
反応終了後減圧濃縮によつてピリジンを除去し油
状物を得た。この油状物をワコーゲルＣ−200（和
光純薬工業株式会社製、カラムクロマトグラフ用
シリカゲル充填剤）140ｇを充填したカラムクロ
マトグラフイーにかけ、溶出溶媒としてエタノー
ル：クロロホルム（容積比１：19）並びに同（容
積比１：４）を順次流し、目的物含有分画を採つ
た。減圧濃縮によつて溶媒を除去し３−｛２−〔４
−ジイソプロピルアミノ−２−フエニル−２−
（２−ピリジル）酪酸アミド〕エトキシカルボニ
ル｝プロピオン酸の精製物（油状）3.0ｇを得た。 NMRスペクトル：CDCL₃，60MHz，δ，1.19
（6H，ｄ），1.22（6H，ｄ），2.51（4H，
broad ｓ），2.00〜3.00（2H，ｍ），3.00〜
3.82（4H，ｍ），3.82〜4.73（2H，ｍ），6.80
〜7.73（8H，ｍ），7.91（1H，broad，ｔ），
8.70〜9.80（1H，ｍ） C¹³NMRスペクトル：CDCl₃，ppm，17.5（ｑ，
ＣH₃），17.8（ｑ，ＣH₃），31.0（ｔ，Ｃ
H₂），32.7（ｔ，ＣH₂），34.5（ｔ，Ｎ−Ｃ
H₂），39.0（ｔ，ＣH₂），45.0（ｔ，Ｎ−
ＣH₂），54.0（ｄ，−ＣＨ×２），62.0（ｓ，
Ｃ），63.0（ｔ，ＣH₂O），122.5（ｄ，
arom），125.7（ｄ，arom），127.0（ｄ，
arom），128.0（ｄ，arom×４），136.5（ｄ，
arom），143.0（ｓ，arom），148.0（ｄ，
arom），160.0（ｓ，arom），173.0（ｓ，
CO），174.0（ｓ，CO），178.0（ｓ，CO）実施例２３−｛２−〔４−ジイソプロピルアミノ−２−フ
エニル−２−（２−ピリジル）酪酸アミド〕エ
トキシカルボニル｝プロピオン酸の牛血清アル
ブミンへの結合実施例１で得た３−｛２−〔４−ジイソプロピル
アミノ−２−フエニル−２−（２−ピリジル）酪
酸アミド〕エトキシカルボニル｝プロピオン酸
471mgとＮ−ヒドロキシサクシイミド110mgを５ml
のジメチルホルムアミドに溶解する。これに水溶
性カルボジイミド160mgを添加、室温にて１時間
撹拌する。薄層クロマトグラフイー（展開溶媒；
CHCl₃：メタノール＝９：１）で活性エステルの
生成を確認し、溶媒を減圧溜去して油状物を得
る。然る後、該油状物をワコーゲルＣ−200（和光純
薬工業株式会社製、カラムクロマトグラフ用シリ
カゲル充填剤）20ｇを充填したカラムクロマトグ
ラフイーにかけ、クロロホルム：メタノール（容
積比99：１）で溶出し活性エステルを含む分画を
採取した。得られた該活性エステルをイソプロピ
ルアルコールから再結し、精製物391mg（収率
67.4％）を得た。次いで該活性エステル292mgをジメチルホルム
アミド10mlに溶解した後、これを別途50mMリン
酸緩衝液（PH7.0）100mlに牛血清アルブミン
（BSA）350mgを溶解して作製したBSA溶液に
徐々に添加し、撹拌下室温で３時間反応させた。
反応終了後、硫安を白濁が生ずるまで添加し、沈
澱を15000r.p.m.15分で回収した。沈澱を0.9％
NaCl溶液20mlに溶解し、セフアデツクスＧ−25
カラムクロマトグラフイーにより脱塩し、３−
｛２−〔４−ジイソプロピルアミノ−２−フエニル
−２−（２−ピリジル）酪酸アミド〕エトキシカ
ルボニル｝プロピオン酸とBSAの結合物250mg
（収率55％）を得た。紫外部吸収法により定量し
た結果BSA1分子当り58個のハプテンの結合を確
認した。

Claims

【特許請求の範囲】１式（式中Ｒは免疫原性担体物質であり、大括弧内
末端カルボニルはＲの一部であるアミノ基に結合
している。ｍは１〜３、ｎは５〜70の整数であ
る。）で表わされるハプテン抗原。２式（式中ｍは１〜３の整数である。）で表わされる化合物またはその反応性誘導体と免
疫原性担体物質のアミノ基とを反応させることを
特徴とする式（式中Ｒは免疫原性担体物質であり、大括弧内
末端カルボニルはＲの一部であるアミノ基に結合
している。ｍは１〜３、ｎは５〜70の整数であ
る。）で表わされるハプテン抗原の製造方法。