JPH04311395A - モノクローナル抗体の取得法、ビオゲンアミンとカップリング試薬とからのカップリング生成物、モノクローナル抗体及び１級又は２級のビオゲンアミンの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、１級又は２級のビオゲ
ンアミンに対するモノクローナル抗体（この抗体は、ビ
オゲンアミンとカップリング試薬とからのカップリング
生成物に対向している）の取得法並びに試料溶液中の１
級又は２級アミンを免疫学的に測定する方法に関する。

【０００２】本発明の方法は、１級又は２級のアミノア
ルキル官能基、アミノアルキルアリール官能基又はグア
ニジノ官能基を有する生物学的に重要な物質の測定のた
めに好適である。このような化合物を以後ビオゲンアミ
ンと称する。特に、この方法は、２００ダルトン以下の
分子量を有するこのようなビオゲンアミンの測定のため
に好適である。

【０００３】本発明の意味におけるビオゲンアミンの例
は、カテコールアミン殊にアドレナリン、ノルアドレナ
リン、ドーパミン並びにスペルミジン、スペルミン、カ
ダヴェリン、トリプタミン、チラミン、セロトニン、ク
レアチニン及びヒスタミンである。

【０００４】

【従来の技術】カテコールアミンは、交感神経系の伝達
物質（神経伝達物質）である。これは、生体内で、ドー
パを経てトリプシンから合成され、３−ヒドロキシ基の
所でのメチル化、引続く酸化性の脱アミノ反応により代
謝される。

【０００５】その臨床的重要性は、カテコールアミン産
生性腫瘍又は心臓血管異常の診断から明白である。体液
中に現われるその濃度は、一般に非常に低い。

【０００６】例えば、血清中のアドレナリン濃度は約５
．９〜３５×１０−１０モル／ｌ、ノルアドレナリン濃
度は約０．５〜４．０×１０−１０モル／ｌ及びドーパ
ミン濃度は約０．４〜６．０×１０−１０モル／ｌであ
る。

【０００７】ビオゲンアミンヒスタミンは、その放出時
にアレルギー反応の範囲内で多くの種々の反応を開始さ
せ、特に気管支狭窄、平滑筋の収縮、組織の透過性上昇
及びこれに伴なう浮腫の生成並びに毛細血管の拡張（発
熱現象）及びかゆみ刺激を起こさせる媒介物質である。 消化管内では、これは、胃酸分泌を高め、腸を収縮させ
る。

【０００８】ヒスタミンの生理学的濃度は次の範囲内に
ある：完全血液　　　　　　　　２０〜１００ｎｇ／ｍ
ｌ血　　漿　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　０．１〜１ｎｇ／ｍｌ。

【０００９】血漿及び血清中のヒスタミンの測定は、主
として、多くのアレルギー性及び擬アレルギー性疾病に
おける診断及び経過管理のために、更にその発生メカニ
ズムの解明及び媒体相互の多様な関係の研究のために使
用される。

【００１０】従来使用されているビオゲンアミンの測定
法は、主としてクロマトグラフィ法（ＨＰＬＣ）で行な
われ、質量スペクトル法、電気化学的又は蛍光測定法（
ここで後者は血漿には不適）による検出を伴なう。しか
しながら、従来の測定法（オートアナライザー、マスス
ペクトル法、ＨＰＬＣ、ラジオ酵素的方法）は、作業経
費及び時間がかかり、不充分な特異性及び感度を有する
。もう１つの非常に経費のかかるラジオ酵素的方法は、
３−ヒドロキシ基の３Ｈ−メチル化（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｃｈｗｅｄｅｎのヒスタミンテ
スト）を経て進行し、１６〜２０時間を要する。

【００１１】ビオゲンアミンの測定のためには、抗原と
してのホルモンをこれに対向する抗体を用いて測定する
特別な免疫学的テスト法が好適である。

【００１２】しかしながら、従来は、実際に使用可能な
ビオゲンアミンに関するイムノアッセイの開発は、得ら
れる抗体の不充分な特異性並びにこの抗体の低すぎる親
和性（これは、テストの低すぎる感度をもたらす）によ
り失敗した。

【００１３】例えば、スペクト−ル（Ｓｐｅｃｔｏｒ）
等の実験（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　　ｉｎ　　Ｃａｔｅｃ
ｈｏｌａｍｉｎ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅ．Ｕｓｄｉｎ
ｕｎｄＳ．Ｈ．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ　　Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ（１９７３）、３４５〜
３４９頁）が行なわれ、ここでは、そのアミノ官能基を
介して、ポリマー担体のカルボキシル基に結合したドー
パミンが免疫原として使用されており、しかも、その特
異性が低く、他のカテコールアミンへのその交叉反応が
非常に高い抗体が使用されていた。

【００１４】ゲファード（Ｇｅｆｆａｒｄ）等（Ｎｅｕ
ｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．７（１９８５）、４０３〜４１
３）も、ドーパミンを、そのアミノ官能基を介してポリ
マー担体に結合させており、この際、ドーパミンと担体
との間のリンカーとしてグルタールジアルデヒドが使用
された。こうして得られたドーパミン−抗体は、ドーパ
ミン（６．７×１０３）及びノルアドレナリン（６．４
×１０５）に対して低い親和性定数を示したが、相応す
るカテコールアミン−グルタールジアルデヒド−誘導体
に対しては明らかに高い値（６．７×１０７及び３．８
×１０７）を示した。この作用は、小さいハプテン（こ
れにはビオゲンアミンが挙げられる）に関して典型的で
あり、「リンカー作用（Ｌｉｎｋｅｒｅｆｆｅｋｔ）」
と称される。

【００１５】それによって、得られた抗体が、かなりの
程度で、免疫原中で使用されたハプテンと担体物質との
間のリンカーを認識し、ハプテンそのものを認識しない
ことが理解される。ハプテン−リンカー接合体に対する
この抗体の親和性は、しばしば、誘導体化されていない
ハプテンに対するよりも高い。

【００１６】従って、分析質溶液中のこのビオゲンアミ
ンをリンカーで誘導体化することができ、引続き、この
分析質の免疫学的測定を、この誘導体の測定により行な
う方法を開発することが試みられた。

【００１７】例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル（ＥＰ−Ａ　　０１６１１９５）もしくはベンゾ
キノン（ＥＰ−Ａ　　０１９２５６５）を用いると同様
に、ビオゲンアミンのこのような誘導体化及び引続くこ
の誘導体の測定を実施することが記載されている。しか
しながら、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用
いる誘導体化は、これにより、実質的に１級アミンのみ
が、充分に把握されうる欠点を有する。２級アミン（例
えばアドレナリン）に対するこのような活性エステルの
反応性は、水性媒体中では、１級アミン（例えばノルア
ドレナリン又はドーパミン）に比べて明らかに低い。

【００１８】媒体例えば、多数の種々のアミノ基含有化
合物を含有しうる完全血液又は血清中でのアミンとベン
ゾキノンとの反応の際に、更に、２官能性のベンゾキノ
ンを介しての交叉結合により多くの副反応が起こる。こ
れにより、測定すべきアミンの有効に測定される濃度は
、再現不能な程度に低減されうる。

【００１９】西ドイツ特許（ＤＥ−Ａ）第２６０８０９
６号明細書中には、部分的にメタネフリン（Ｍｅｔａｎ
ｅｐｈｒｉｎ）及びシネフリン（Ｓｙｎｅｐｈｒｉｎ）
に対して高い交叉反応をも有する、アドレナリンに対す
る抗体が記載されている。

【００２０】この免疫原合成は、ホルムアルデヒドを用
いるマンニヒ縮合による芳香族化合物の５−位を介して
の担体蛋白質のリジン残基へのカップリングにより行な
った。

【００２１】しかしながら、この結果は、他の研究者（
Ｄｉｅｎｅｒ等のＣｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ１０９
（１９８１）、１〜１１）によっては確認できなかった
。西ドイツ特許（ＤＥ−Ａ）第２６０８０９６号に基づ
く市販のテストも、その研究が１０年以上も前からなさ
れているのに、未知であった事実は、実際に評価可能な
結果は得られていないことを示している。

【００２２】従って、従来、慣用の免疫原合成によって
は、それを用いて障害性の交叉反応なしに充分に敏感な
免疫学的テストを行なうことのできる、１級及び２級の
ビオゲンアミンに対する抗体を得ることは成巧していな
い。文献で追跡された評価の１つが理論的な結果見込み
を保証しているよりもパラメータの濃度は、一方では低
すぎ、他方では交叉反応する代謝生成物の数が多すぎる
。

【００２３】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、低分子量の、殊に分子量＜２００を有する一級又は
２級のアミン（ビオゲンアミン）例えばカテコールアミ
ンを測定する方法を開発することであった。この方法は
、原理的に、１級及び２級のアミノ官能基を有する全て
の低分子量ハプテン（これに対して、従来は、充分な親
和性を有する抗体は得ることができなかった）上で使用
可能であるべきである。

【００２４】

【課題を解決するための手段】この本発明の課題は、１
級又は２級ビオゲンアミンに対するモノクローナル抗体
（ここで、この抗体は、ビオゲンアミンとカップリング
試薬とからのカップリング生成物に対向している）の取
得法により解決され、これは（１）　１級又は２級のビ
オゲンアミンをそのアミノ官能基を介して、一般的化学
構造：Ｘ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ−Ｙ［式中ＸはＯ又はＳを表わし
、Ｒは非置換の又は置換された芳香族、ヘテロ芳香族又
はシクロアルキル基を表わし、Ｙは一般式：

【００２５
】

【化５】

【００２６】のカルボキシ基を表わし、ここでＺは（ａ
）ＯＨ又はＯ−であるか又は（ｂ）カップリング反応の
条件下にアミノ官能基と反応しないが１以上の反応工程
で反応性のエステル−、酸クロリド−又は酸アンヒドリ
ド基に変換可能である基Ｚ１である］を有するカップリ
ング試薬に結合させ、（２）　工程（１）で生じるカッ
プリング生成物のカルボキシル基の残基Ｚを、反応性の
エステル−、酸クロリド−又は酸アンヒドリド基に変え
、（３）　工程（２）からの活性化カップリング生成物
を担体物質に結合させて、免疫原としての作用をする担
体結合カップリング生成物を得、（４）　工程（３）か
らの免疫原を用いて実験動物を免疫化し、（５）　この
免疫化された実験動物から、公知方法で、ビオゲンアミ
ンとカップリング試薬とからのカップリング生成物に対
するモノクローナル抗体を取得することより成る。

【００２７】本発明方法により得られたこのモノクロー
ナル抗体は、１級又は２級のビオゲンアミンとカップリ
ング試薬とからのカップリング生成物に対向している。 この場合、ビオゲンアミンのアミノ官能基は、イソシア
ネートもしくはイソチオシアネートとの反応により尿素
もしくはイソ尿素にされ、迅速にかつ副反応なしに誘導
体化され、この際、１級又は２級のアミンよりも良好に
免疫化に好適である大きいハプテンが生じる。

【００２８】このカップリング試薬は、一般的化学構造
：Ｘ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ−Ｙ［式中ＸはＯ又はＳ、有利にＳを
表わし、Ｒは、非置換の又は置換された芳香族、ヘテロ
芳香族又はシクロアルキル基を表わし、有利なＲはフェ
ニル−、ニトロフェニル−、ジニトロフェニル−、ナフ
チル−、ベンジル−、キシリル−、ピリジル−又はシク
ロヘキシル基である］を有する。特に有利なＲはフェニ
ル基である。

【００２９】本発明の特に有利な実施形では、カップリ
ング試薬として３−イソチオシアナト安息香酸（ＩＴＣ
Ｂ）又はその誘導体を使用する。ＩＴＣＢは、比較的容
易に、公知方法で、３−アミノ−安息香酸及びチオホス
ゲンから得ることができる。

【００３０】カップリング試薬がイソシアネートである
場合には、これは、簡単な方法で、相応する１級アミン
とホスゲンとの反応により得られる。このカップリング
試薬がイソチオシアネートである場合には、これは相応
する１級アミンとチオホスゲンとの反応により得られる
。苛性ソーダの存在で適当な１級アミンと二硫化炭素と
を反応させる際に、イソシアネートを製造するもう１つ
の可能性がある。この場合、生じるＮ−置換ジチオカル
バミド酸のＮａ−塩は、クロルギ酸エチルエステルと反
応してＣＯＳ、エタノール及びイソチオシアネートを生
じる。

【００３１】Ｙは、一般式：

【００３２】

【化６】

【００３３】［式中Ｚは（ａ）ＯＨ又はＯ−又は（ｂ）
カップリングの条件下にアミノ官能基と反応しないが、
１個以上の反応工程で反応性エステル−、酸クロリド−
又は酸アンヒドリド基に変換しうる基Ｚ１である］を有
するカルボキシル基を表わす。

【００３４】Ｚが例えばＯＨ又はＯ−を表わしうる場合
には、カルボキシル基Ｙはカルボン酸−又はカルボキシ
レート基である。カルボン酸−又はカルボキシレート基
は、カップリング反応即ち尿素−又はチオ尿素形成の条
件下で、当業者に公知であるようにアミノ基とは反応し
ない。

【００３５】このカップリング反応のためにビオゲンア
ミンでの誘導体化反応の間の良好な可溶性を達成するた
めに、カルボキシル基Ｙは基Ｒ１で置換されていてもよ
い。従ってＺ１は、水性媒体中でのカップリング試薬の
溶解性を高める親水性基を表わす。Ｚは有利にＯＲ１又
はＮＲ２Ｒ３を表わしてよく、この際、Ｒ１はアルコー
ルＲ１ＯＨの残基であり、これは、そのヒドロキシル官
能基と共に少なくとももう１個の親水性基を含有し、こ
の際、Ｒ２及びＲ３の少なくとも１方は、アミノ基と共
になお少なくとも１個の他の親水性基を含有するアミノ
化合物ＨＮＲ２Ｒ３の残基であり、他方は水素又はＣ１
〜Ｃ３−アルキルであってよい。

【００３６】Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、少なくとももう１
個の他の親水性基を含有する基であってよい。ここで、
親水性基とは、ヒドロキシ−、エーテル−、カルボン酸
−、カルボン酸アミド−、アセタール−、ケタール−又
はアミノ基である。基Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、数個の同
じかつ／又は異なる親水性基を含有していてもよい。

【００３７】好適なアルコールＲ１ＯＨの例は次のもの
である：エチレングリコール、プロピレングリコール、
ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチ
レングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコー
ルモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチ
ルエーテル、トリエチレングリコールモノメチルエーテ
ル及び類似物。アルコールＲ１ＯＨはエチレングリコー
ル、ジエチレングリコール又はトリエチレングリコール
が有利である。

【００３８】アミノ化合物Ｒ２Ｒ３ＮＨは、例えばエタ
ノールアミン、アミノプロパノール、アミノプロパンジ
オール、アミノブタノール、アミノブタンジオール、ジ
エタノールアミン、メトキシエチルアミン、アミノエト
キシエタノール、モルホリン、４−アミノモルホリン、
３−モルホリノ−１−エチルアミン、３−モルホリノ−
１−プロピルアミン、グリシン、セリン、アラニン、グ
リシルグリシン、グルコサミン、フルクトサミン、ガラ
クトサミン又は類似物であってよい。アミノ化合物Ｒ２
Ｒ３ＮＨは特にエタノールアミン又はグルコサミンが有
利である。

【００３９】基Ｚ１で置換されたカップリング試薬は、
例えば、相応するアミノカルボン酸Ｈ２Ｎ−Ｒ−ＣＯ２
Ｈの代りに置換されたアミノ酸Ｈ２Ｎ−Ｒ−ＣＯＺ１を
ホスゲンもしくはチオホスゲンと反応させることにより
得られる。

【００４０】ビオゲンアミンを用いる誘導体化のために
、親水性基と結合したカップリング試薬を使用すると、
誘導体化反応の後に、反応性カップリング生成物を製造
するために、有利な親水性基Ｚ１を脱離させることが必
要になりうる。この際、酸アミド−もしくはエステル結
合の加水分解は、当業者に公知の慣用法で行なうことが
できるが、ビオゲンアミンとカップリング試薬との間の
尿素−もしくはチオ尿素結合を破壊しないような反応条
件を選択することに注意すべきである。

【００４１】加水分解は、エステル結合の場合には、例
えばこの化合物をメタノール性苛性カリ中での数時間撹
拌によるか又はアミド結合の場合には例えば１Ｎ塩酸中
での数時間撹拌により行なうことができる。

【００４２】基Ｒ１が遊離のカルボン酸基（例えばグリ
シン又は他のアミノ酸を化合物Ｒ２Ｒ３ＮＨとして使用
する場合）を含有すると、遊離のカルボン酸が直接的に
（後記のように）反応性の基に変じることができるので
、Ｚ１の脱離は必ずしも必要ではない。

【００４３】有利な親水性基Ｚ１の生成の後に、カップ
リング試薬の基Ｚはカルボン酸又はカルボキシル基とし
て存在し、これは、引続き、反応性エステル−、酸クロ
リド−又は酸アンヒドリド基に変じられる。このことは
、全ての当業者に公知の方法で行なうことができる。 例えば、有利に、カルボン酸基を塩化チオニルとの反応
により反応性の酸クロリド基に変じることができる。

【００４４】カップリング生成物のカルボン酸基ＹをＮ
−ヒドロキシスクシンイミド及びジシクロヘキシルカル
ボジイミドとの反応により反応性のＮ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル基に変じるのが有利である。このこ
とは、例えば、ほぼ当モル量の反応成分をジオキサン中
に添加し、２０℃で数時間撹拌することにより行なうこ
とができる。

【００４５】引続き、活性化されたカップリング生成物
を担体物質に結合させると、免疫原としての作用をする
担体結合カップリング生成物が得られる。担体物質とし
ては、この目的にとって当業者に公知の全ての物質例え
ば蛋白質例えば免疫グロブリン又は牛血清アルブミン又
は固体担体物質を使用することができる。担体物質とし
て蛋白質を使用するのが有利である。特に、担体物質と
して、β−ガラクトシダーゼ又はそのフラグメントを使
用するのが有利である。

【００４６】次の工程は抗体の製造である。これは、免
疫原による実験動物の免疫化により行なう。本発明方法
によりこの工程は、通例当業者に公知の慣用法で行なう
ことができる。この免疫原を、アジュバントと組み合せ
て実験動物に適用するのが有利である。特に、アジュバ
ントとして、フロインドのアジュバント又は水酸化アル
ミニウムを百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　　ｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓ）と共に使用するのが有利である。免疫化
は、有利に数ケ月にわたり、４〜６週間隔での少なくと
も４回免疫化により行なう。免疫原の注射は有利に腹腔
内で行なう。

【００４７】このように免疫化された動物から、Ｂ−リ
ンパ球を得、これを永久骨髄腫セルラインと融合させる
。この融合は、ケーラー及びミルスタイン（Ｋｏｅｈｌ
ｅｒｕｎｄ　　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）の公知方法（Ｎａｔ
ｕｒｅ２５６、１９７５、４９５〜４９７）により行な
う。この場合に生じたハイブリッド細胞の１次培養物を
、常法で、例えば市販のセルソーターを用いて又は制限
稀釈（ｌｉｍｉｔｅｄｄｉｌｕｔｉｏｎ）によりクロー
ニングする。それぞれ、適当な試験法で例えば酵素−免
疫−検定（ＥＬＩＳＡ−法）でビオゲンアミンとカップ
リング試薬（例えばヒスタミン−ＩＴＣＢ）とからのカ
ップリング生成物に対して陽性で、他の使用血清成分（
例えばヒスチジン、リジン、メチルヒスタミン、アセチ
ルヒスタミン等）に対して陰性もしくは僅かにのみ陽性
であり、それらのＩＴＣＢ−誘導体と反応する培養液を
更に加工する。こうして、本発明によるモノクローナル
抗体を産生する多数のハイブリドーマ−セルラインが得
られる。公知方法でこのセルラインを培養し、それから
産生されるモノクローナル抗体を単離することができる
。

【００４８】本発明の方法のためのビオゲンアミンとし
て、有利に、ヒスタミン又はアドレナリン、ノルアドレ
ナリン及びドーパミンから選択されたカテコールアミン
を使用する。ビオゲンアミンとカップリング試薬との反
応の際に、反応速度は、水性媒体中でも、数分以内で殆
んど完全な反応が達成される程度に高い。この反応は、
単一にかつ安定な生成物（尿素もしくはチオ尿素）を生
じるように進行する。この反応は、１級アミン例えばド
ーパミン及びヒスタミンにおいて、２級アミン例えばア
ドレナリンにおけると同様に円滑に進行する。

【００４９】本発明のもう１つの目的物は、１級又は２
級のビオゲンアミンＨＮＲ４Ｒ５とカップリング試薬と
からの生成物であり、このカップリング生成物は、次の
一般的構造を有する：

【００５０】

【化７】

【００５１】［式中Ｒ４及びＲ５は、それぞれのビオゲ
ンアミンに相応する基を表わし、ＸはＯ又はＳを表わし
、Ｒは非置換の又は置換された芳香族、ヘテロ芳香族又
はシクロアルキル基であり、Ｙは一般式：

【００５２】

【化８】

【００５３】のカルボキシル基を表わし、ここでＺは（
ａ）ＯＨ又はＯ−又は（ｂ）カップリング反応の条件下
にアミノ官能基と反応しないが、反応性エステル−、酸
クロリド−又は酸アンヒドリド基に変換可能である基Ｚ
１である］。

【００５４】このビオゲンアミンＨＮＲ４Ｒ５は、ヒス
タミン又はアドレナリン、ノルアドレナリン及びドーパ
ミンから選択されたカテコールアミンが有利である。カ
ップリング試薬は、イソチオシアナト安息香酸（ＩＴＣ
Ｂ）、その塩又は誘導体が有利である。

【００５５】ハプテンとして用いられたビオゲンアミン
のＩＴＣＢによる誘導体化により、新規の免疫学的方法
及び試薬が準備でき、これを用いて、ビオゲンアミンは
、多数の交叉反応物質の存在で、生理学的に非常に低い
濃度（０〜１ｎｇ／ｍｌ）でも、血液中で特異的に把握
することができる。この課題は、本発明による免疫学的
方法及び試薬で解決され、ここでは、ビオゲンアミンと
カップリング試薬とからのカップリング生成物に対して
特異的に対向していて、血清中の重要な物質とは０．１
％以下で交叉反応するモノクローナル抗体少なくとも１
種を使用する。

【００５６】本発明の本質は、カップリング試薬による
ビオゲンアミンの誘導体化及び引続くカップリング生成
物での免疫化により、カップリング生成物に特異的に対
向していて、従ってその都度の誘導体化されたアミンの
特異的測定を可能にするモノクローナル抗体を調製する
ことが意外にも成巧したことが認められることである。

【００５７】従って、本発明のもう１つの目的物は、ビ
オゲンアミンとイソ（チオ）シアネート−カップリング
試薬（例えばヒスタミン−ＩＴＢＣ）とからの本発明に
よるカップリング生成物に対するモノクローナル抗体で
ある。

【００５８】本発明の方法により、０．１％より低い重
要物質との交叉活性を有するモノクローナル抗体を得る
ことができる。ここで、重要物質（Ｋｒｉｔｉｓｃｈｅ
　　Ｓｕｂｓｔａｎｚｅｎ）とは、類似構造を有する他
のビオゲンアミン並びにそのカップリング生成物と解す
べきである。

【００５９】本発明のモノクローナル抗体は、有利に、
これが本発明のカップリング生成物に対して非常に高い
親和性を有することによっても優れている。特に有利な
モノクローナル抗体は、他の１級又は２級のアミン例え
ばヒスチジン、リジン、セロトニン及びそのカップリン
グ生成物（例えばＩＴＣＢ−誘導体）に比べて０．０１
％より低い交叉反応性を有する。相対的親和性及び重要
物質との交叉反応の測定のために、当業者に公知の慣用
法を提供する。

【００６０】本発明によるモノクローナル抗体は、従っ
て、試料例えば血清又は血漿中で、他の構造類似の物質
の存在下で、カップリング生成物（例えばヒスタミン−
ＩＴＣＢ）を特異的に測定するために極めて好適である
。この測定法のために、モノクローナル抗体そのもの又
は相応する免疫学的特性を有するそのフラグメント（Ｆ
ａｂ−フラグメント）を使用することができる。従って
、モノクローナル抗体とは、完全な抗体ともそのフラグ
メントとも解される。

【００６１】本発明のモノクローナル抗体の例は、ヒス
タミン及びイソチオシアナト安息香酸からのカップリン
グ生成物に対向していて、ハイブリドーマ−セルライン
１．４７．７４（ＥＣＡＣＣ　　９００７１９０２）も
しくは１．１７．４４（ＥＣＡＣＣ　　９００７１９０
１）から産生される抗体である。

【００６２】更に、本発明の目的は、試料溶液中の１級
又は２級のビオゲンアミンの測定法であり、これは、（
１）　試料溶液中のビオゲンアミンを、そのアミノ官能
基を介して、一般構造式：Ｘ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ−Ｙ［式中Ｘ
はＯ又はＳであり、Ｒは非置換の又は置換された芳香族
、ヘテロ芳香族又はシクロアルキル基であり、Ｙは一般
式：

【００６３】

【化９】

【００６４】のカルボキシル基を表わし、ここでＺは（
ａ）ＯＨ又はＯ−又は（ｂ）カップリングの条件下にア
ミノ官能基と反応しないが、反応性エステル−、酸クロ
リド−又は酸アンヒドリド基に変換可能である基Ｚ１で
ある］を有するカップリング試薬に結合させ、（２）　
この試料溶液を、工程（１）で生じるビオゲンアミンと
カップリング試薬とからのカップリング生成物に対する
モノクローナル抗体１種以上と共にインキュベートし、
（３）　常法による抗体／抗原−反応の定量により、試
料中のビオゲンアミンの濃度を測定することより成る。

【００６５】カップリング試薬として、イソチオシアナ
ト安息香酸、その塩又は誘導体を使用するのが有利であ
る。測定すべきビオゲンアミンは、有利に、ヒスタミン
又はアドレナリン、ノルアドレナリン及びドーパミンか
ら選択されたカテコールアミンである。

【００６６】試料溶液中のビオゲンアミンの測定のため
の第１工程で、カップリング試薬との反応により、本発
明の抗体がそれに対向している本発明のカップリング生
成物を得るべきである。このために、過剰のカップリン
グ試薬を試料溶液に加え、この混合物を高められた温度
有利に３０〜７０℃特に有利に５０〜６０℃でインキュ
ベートすることが好適であると判明した。こうして、試
料溶液中に、測定すべきビオゲンアミンと、カップリン
グ試薬とからの本発明によるカップリング生成物が生じ
る。

【００６７】引続き、試料溶液中の過剰のカップリング
試薬を把握すべきである。このことは、有利に、適当な
アミノ化合物の添加により行なうことができる。このた
めに好適なアミノ化合物は、アンモニア、１級又は２級
のアミンであってよい。ここで、捕捉アミノ化合物とカ
ップリング試薬とからの付加生成物はカップリング試薬
に対する抗体（後に使用される）及び測定すべきビオゲ
ンアミンと交叉反応しないことに注目すべきである。こ
の目的にとって、アンモニア及びトリス（Ｔｒｉｓ）が
特に好適であると立証された。このように準備された試
料は、直接、本発明の抗体を用いるカップリング生成物
として誘導体化されて存在するビオゲンアミンの濃度測
定のために使用することができる。

【００６８】測定すべきカップリング生成物と共に、試
料中には、しばしば、なお他の誘導体化された化学的関
連性のビオゲンアミンが存在する。ヒスタミン−ＩＴＣ
Ｂの測定のための試験の際に、ここで例えば殊にヒスチ
ジンとリジンとのＩＴＣＢ−カップリング生成物は重要
である。意外にも、ここで、８個の検査モノクローナル
ヒスタミン−ＩＴＣＢ−抗体のリジン−ＩＴＣＢ（０％
）及びヒスチジン−ＩＴＣＢ（０〜０．０１％）に対す
る極く僅かな交叉反応性が認められた。このことから、
本発明の抗体は、カップリング生成物及び特定のビオゲ
ンアミンに対して、試料溶液中のビオゲンアミンの僅少
量（＜１ｎｇ／ｍｌ）の測定のために充分である程度に
高い特異性を有することが明らかである。

【００６９】免疫反応の正確な条件及び抗体／抗原−反
応の定量による試料中の誘導体化されたビオゲンアミン
の濃度の測定は、当業者に公知の慣用の方法で行なうこ
とができる。抗原／抗体−反応を競争ＥＬＩＳＡ−テス
トにより定量するのが有利である。しかしながら、抗原
／抗体−反応の免疫学的測定のための他のすべての公知
方法も好適である（例えば、Ｏｅｌｌｅｒｉｃｈ、Ｊ．
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２
（１９８４）、８９５〜９０４又はＫａｇｅ及びＫｏｅ
ｔｔｅｎのＭＴＡ３（１９８８）、７９７〜８０４参照
）。

【００７０】

【実施例】次の実施例につき、反応式１、２及び３と関
連させて本発明を説明する。

【００７１】反応式１は、カップリング試薬として３−
イソチオシアナト安息香酸を用いるヒスタミンからの誘
導体化及び免疫原製造を示している。

【００７２】反応式２は、カップリング試薬として３−
イソチオシアナト安息香酸を用いるドーパミン及びアド
レナリンからの誘導体化及び免疫原製造を示している。

【００７３】反応式３は、カップリング試薬として５−
イソチオシアナト−２−ニトロ安息香酸を用いるアドレ
ナリンからの誘導体化及び免疫原製造を示している。

【００７４】

【化１０】

【００７５】

【化１１】

【００７６】

【化１２】

【００７７】例１ＩＴＣＢ誘導体化ヒスタミンの製造（
免疫原合成）免疫原製造の原則は、反応式１に示されて
おりかつ３−イソチオシアナト−安息香酸１（ＩＴＣＢ
）でのヒスタミン２の誘導体化に基づく。ＩＴＣＢは、
ヒスタミンのような１級及び２級のアミンと、水溶液中
で数分間以内で殆んど完全に反応して、相応するチオ尿
素−誘導体３になる。この誘導体もしくはカップリング
生成物を単離しかつヒドロキシ−スクシンイミドエステ
ル４に変換させる。そうして得られる活性化ハプテンを
担体蛋白質としてのβ−ガラクトシダーゼにカップリン
グさせる。

【００７８】ａ）　　Ｎ−（３−カルボキシフェニル）
−Ｎ′−［２−（４−イミダゾリル）エチル］チオ尿素
（ヒスタミン−ＩＴＣＢ）３３−イソチオシアナト安息
香酸１（１．７９ｇ）１０ｍモル及びヒスタミン２（１
．１１ｇ）１０ｍモルをＴＨＦ／水２／１（ｖ／ｖ）１
５０ｍｌ中に溶かしかつ２０℃で２４時間撹拌する。引
続き溶液を水流真空で蒸発させ、残分をメタノール約２
０ｍｌ中に溶かしかつ粗生成物を珪酸ゲルカラム（８．
５×３０ｃｍ）のクロマトグラフィにより精製する。溶
離剤としてメタノール／酢酸エステル１／１（Ｖ／Ｖ）
を使用する。相応するフラクションを合一し、溶剤を回
転蒸発器で除去しかつ残分を高圧真空ポンプで乾燥させ
る。

【００７９】収量：粘性のやや帯褐色の油状物　　２．
０５ｇ（理論値の７１％）。

【００８０】ＤＣ：珪酸ゲル、メタノール／酢酸エステ
ル／氷酢酸４９／４９／２（ｖ／ｖ／ｖ）；Ｒｆ＝０．
２４。

【００８１】ｂ）　　Ｎ−［２−（４−イミダゾリル）
エチル］−Ｎ′−［３−（Ｎ−スクシンイミジルオキシ
カルボニルフェニル）］チオ尿素４（ヒスタミン−ＩＴ
ＣＢ−ＮＨＳ）ヒスタミン−ＩＴＣＢ３（２９０ｍｇ）
１ｍモルを無水ジオキサン／ＤＭＦ５／１（ｖ／ｖ）５
０ｍｌ中に溶かしかつＮ−ヒドロキシスクシンイミド１
３８ｍｇ（１．２ｍモル）及びＮ，Ｎ′−ジシクロヘキ
シルカルボジイミド２４７ｍｇ（１．２ｍモル）を加え
る。溶液を２０℃で１８時間撹拌し、次いで溶剤を高圧
真空中で除去しかつ残分をジオキサン／メタノール５／
１（ｖ／ｖ）５０ｍｌ中に入れる。溶けずに残った尿素
を濾別し、再び蒸発乾固させかつＤＭＦ約３ｍｌ中に溶
かす。撹拌下でジオキサンを、僅かな混濁が生じるまで
混合する。次いで１時間４℃で放置し、濾過しかつ濾液
にジイソプロピルエーテル約５０ｍｌを滴加することに
より生成物４が沈殿する。吸引濾過器を介して吸引しか
つエステルを高圧真空ポンプで乾燥させる。

【００８２】収量：白色粉末　　１６５ｍｇ（理論値の
４３％）。

【００８３】ＤＣ：珪酸ゲル、メタノール／酢酸エステ
ル／氷酢酸　　４９／４９／２（ｖ／ｖ／ｖ）；Ｒｆ＝
０．５３。

【００８４】ｃ）　　ヒスタミン−ＩＴＣＢ−β−ガラ
クトシダーゼ−免疫原５ヒスタミン−ＩＴＣＢ−ＮＨＳ
４（１００ｍｇ）をＤＭＦ５ｍｌ中に溶かしかつ０．１
Ｎ燐酸カリウム緩衝液ｐＨ８．５（５００ｍｌ）中のβ
−ガラクトシダーゼ１ｇの溶液に加える。２０℃で２０
時間撹拌し、水に対して透析させかつ凍結乾燥させる。 出来上った免疫原を−２０℃で貯蔵しかつ免疫化のため
に０．１Ｎ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０＋０．９％
ＮａＣｌ中に溶かす。

【００８５】ｄ）　　Ｎ−（３−カルボキシフェニル）
−Ｎ′−［２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）エチ
ル］チオ尿素（ド−パミン−ＩＴＣＢ）７ａド−パミン
−塩酸塩６ａ（反応式２）１．９０ｇ（１０ｍモル）を
３−イソチオシアナト安息香酸１（１．７９）１０ｍモ
ルと一緒にＴＨＦ１０ｍｌ中に懸濁させかつトリエチル
アミン１ｍｌを加える。２０℃で１８時間撹拌し、次い
で混濁溶液を珪酸ゲルカラム（８．５×３０ｃｍ）上に
加えかつ酢酸エステル／メタノール１／１（ｖ／ｖ）で
溶離させる。相応するフラクションを合一し、１時間活
性炭０．５ｇで処理しかつ次いで濾過する。溶剤を水流
真空中で除去しかつ残分を高圧真空ポンプで乾燥させる
。

【００８６】収量：やや帯褐色の粘性油状物　　２．３
５ｇ（理論値の７１％）。

【００８７】ＤＣ：珪酸ゲル、酢酸エステル／氷酢酸　
　１９／１（ｖ／ｖ）；Ｒｆ＝０．７３。

【００８８】ｅ）　　Ｎ−［２−（３，４−ジヒドロキ
シフェニル）エチル］−Ｎ′−［３−（Ｎ−スクシンイ
ミジルオキシカルボニルフェニル）］チオ尿素８ａ（ド
−パミン−ＩＴＣＢ−ＮＨＳ）ド−パミン−ＩＴＣＢ７
ａ（反応式２）３３２ｍｇ（１ｍモル）をジオキサン１
０ｍｌ中に溶かしかつＮ−ヒドロキシスクシンイミド１
２７ｍｇ（１．１ｍモル）及びジシクロヘキシル尿素２
２７ｍｇ（１．１ｍモル）を加える。溶液を１８時間２
０℃で撹拌し、次いで沈殿したジシクロヘキシル尿素を
濾別し、溶剤を水流真空中で除去しかつ残分を酢酸エス
テル２０ｍｌ中に入れる。新たに濾過し、溶液を濃縮し
て約５ｍｌにし、これを５ｃｍ厚さの珪酸ゲル層（吸引
濾過器、直径約５ｃｍ）上に加える。酢酸エステル５０
ｍｌで後洗浄しかつ溶離液を濃縮して約１０ｍｌにする
。 撹拌下に溶液にジイソプロピルエーテル５０ｍｌを添加
することによって、生成物８ａ（反応式２）を沈殿させ
、吸引濾過しかつ乾燥器中で五酸化燐上で乾燥させる。

【００８９】収量：殆んど無色の粉末　　２０５ｍｇ（
理論値の４８％）。

【００９０】ＤＣ：珪酸ゲル、酢酸エステル／氷酢酸　
　９９／１（ｖ／ｖ）；Ｒｆ＝０．５０。

【００９１】ｆ）　　ド−パミン−ＩＴＣＢ−β−ガラ
クトシダーゼ−免疫原９ａ製造（反応式２）は例１ｃ）
と同様にして行なう。

【００９２】ｇ）　　Ｎ′−（３−カルボキシフェニル
）−Ｎ−［２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−２
−ヒドロキシエチル］−Ｎ−メチル尿素７ｂ（アドレナ
リン−ＩＴＣＢ）製造（反応式２）はトリエチルアミン
の添加無しで例１ｄ）と同様にして行なう。

【００９３】アドレナリン６ｂの使用量１．８３ｇ（１
０ｍモル）。

【００９４】収量：殆んど無色の粘性油状物　　２．８
５ｇ（理論値の７９％）。

【００９５】ＤＣ：珪酸ゲル、酢酸エステル／氷酢酸１
９／１（ｖ／ｖ）；Ｒｆ＝０．６２。

【００９６】ｈ）　　Ｎ−［２−（３，４−ジヒドロキ
シフェニル）−２−ヒドロキシエチル］−Ｎ−メチル−
Ｎ′−［３−（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル
フェニル）］チオ尿素８ｂ（アドレナリン−ＩＴＣＢ−
ＮＨＳ）製造（反応式２）は例１ｅ）と同様に行なう。

【００９７】アドレナリン−ＩＴＣＢ７ｂの使用量３．
６２ｇ（１ｍモル）。

【００９８】収量：無色の粉末２５０ｍｇ（理論値の５
４％）。

【００９９】ＤＣ：珪酸ゲル、酢酸エステル／氷酢酸９
９／１（ｖ／ｖ）；Ｒｆ＝０．４８。

【０１００】ｉ）　　アドレナリン−ＩＴＣＢ−β−ガ
ラクトシダーゼ−免疫原９ｂ製造（反応式２）は例１ｃ
）と同様に行なう。 例２ヒスタミン−ＩＴＣＢに対するモノクローナル抗体
の取得　　免疫化生後８〜１２週間のＢａｌｂ／ｃ−マ
ウスを、フロインド（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓｃｈｅｍ）アジ
ュバント中に乳化させたヒスタミン−ＩＴＣＢ−β−ガ
ラクトシダーゼ（例１ｃによる製造）１００μｇで、腹
腔内で免疫化させる。６週間後にもう３回の免疫化を４
週間の間隔で実施する。その際、不完全フロインドアジ
ュバント中に乳化させた免疫原各１００μｇを腹腔内投
与する。

【０１０１】融合最初の免疫化の約４ケ月間後に融合さ
せる。融合前の最後の３日間に各々更に、ＰＢＳ（ホス
フェート・緩衝食塩水；ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　　ｂｕｆ
ｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）中のヒスタミンＩＴＣＢ−β
−ガラクトシダーゼ１００μで１回及び５０μｇで２回
静脈内で免疫化する。

【０１０２】融合のために、ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）
、メソーズ・イン・エンツィモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ
　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、７３巻（１９８
１年）、３頁に記載の方法依り、免疫化マウスの脾臓細
胞１０８を骨髄腫細胞（Ｐ３×６３Ａｇ８−６５３、Ａ
ＴＣＣ−ＣＲＬ　　８３７５）２×１０７と混合しかつ
引続いて１０分間遠心分離する（３００ｇ、４℃）。細
胞をもう１回ＢＳＳ（＝バランスド・ソルト・ソルーシ
ョン（Ｂａｌａｎｃｅｄ　　Ｓａｌｔ　　Ｓｏｌｕｔｉ
ｏｎ））で洗浄しかつ４００ｇで遠心分離する。上澄み
を捨てる。細胞沈殿物にＰＢＳ（ＭＧ４０００、メルク
（Ｍｅｒｃｋ））中のＰＥＧ５０％ｗ／ｖ−溶液１ｍｌ
を加える。次いで室温で、胎児の子牛血清（ＦＫＳ）無
しのＲＰＭＩ　　１６４０（５ｍｌ）、引続きもう１度
１０％ＦＫＳを有するＲＰＭＩ１６４０（５ｍｌ）を徐
々に滴加し、媒体で５０ｍｌに満たしかつ１０分間４０
０ｇで遠心分離する。沈殿した細胞を新たに１０％ＦＫ
Ｓを有するＲＰＭＩ１６４０−媒体中に入れる。脾臓細
胞１×１０５もしくは５×１０４ずつを２４個のウエル
（ｗｅｌｌ）−細胞培養プレート（ヌンク社（Ｆｉｒｍ
ａ　　Ｎｕｎｃ））上に播種する。ヒポキサンチン−ア
ザセリン−選択培地（ヒポキサンチン１００ｍモル、ア
ザセリン１μｇ／ｍｌ）に、インターロイキン６（ＩＬ
６）５Ｕ／ｍｌを増殖因子として添加する。約７〜１０
日間後にすでに多くのクローンが可視である。一次培養
物の上澄みを例３に記載したＥＬＩＳＡ−方法により試
験する。抗原−特異性抗体を含有する一次培養物を螢光
活性セルソルター（Ｚｅｌｌｓｏｒｔｅｒ）により９６
個のウエル−細胞培養プレート（ヌンク社）上で更にク
ローン化する。培地に増殖因子としてＩＬ６（５Ｕ／ｍ
ｌ）を添加する。

【０１０３】この方法で例えば、寄託機関ＥＣＡＣＣ（
＝ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル
・カルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　　Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎｏｆ　　Ａｎｉｍａｌ　　Ｃｅｌｌ　　Ｃｕｌｔ
ｒｅｓ））で寄託番号１．４７．７４　　ＥＣＡＣＣ　
　９００７１９０２１．１７．４４　　ＥＣＡＣＣ　　
９００７１９０１で寄託されている２種のハイブリドー
マーセルラインクローン１．４７．７４及びクローン１
．１７．４４を単離することができた。

【０１０４】腹水取得腹水を得るために、前もってプリ
スタン０．５ｍｌで１〜２回予備処理をしておいたマウ
スにハイブリッド細胞５×１０６を腹腔内注射する。そ
の１〜３週間後に、マウスから腹水液を得ることができ
る。これからＨＰＣＬ又はＦＰＬＣにより抗体を単離す
ることができる。このモノクローナル抗体はヒスタミン
−ＩＴＣＢに特異的に適合しかつ他の１級及び２級のア
ミンとの交叉反応性を示さないもしくは僅かしか示さな
い。

【０１０５】相対的親和性を調べるために、相同抗原と
の競争曲線を調べかつ評価する。このために必要な測定
は例４と同様に実施される。

【０１０６】例３ヒスタミン−ＩＴＣＢに対する抗体に
ついてのスクリーニング試験免疫化マウスの血清中又は
ハイブリッド細胞の培養上澄中又は腹水中のヒスタミン
−ＩＴＣＢに対する抗体の存在及び特異性を決定するた
めに、競争的ＥＬＩＳＡ（＝エンチーム・リンクド・イ
ムノソルベント・アセイ（ｅｎｚｙｍ　　ｌｉｎｋｅｄ
　　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　　ａｓｓａｙ））を
実施する。

【０１０７】ヒスタミン−ＩＴＣＢ−ＤＡＤＯＯ−ビチ
オン１の製造ヒスタミン−ＩＴＣＢ−ＮＨＳ４（反応式
２）９７ｍｇ（０．２５ｍモル）をジオキサン／ＤＭＦ
　　５／２（ｖ／ｖ）１０ｍｌ中に溶かしかつＮ−ビオ
チニル−１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン
（ビオチン−ＤＡＤＯＯ、ベーリンガー・マンハイム社
）（Ｆａ．Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ
）、Ｎｏ．１１１２０７４）９４ｍｇ（０．２５ｍモル
）を加える。１６時間２０℃で撹拌し、次いで溶剤を真
空中で除去しかつ油状残分を酢酸エステル／メタノール
５０／５０（ｖ／ｖ）約５ｍｌ中に溶かす。溶液を珪酸
ゲルカラム（２．５×４０ｃｍ）上に加えかつ酢酸エス
テル／メタノール／氷酢酸５０／５０／１（ｖ／ｖ／ｖ
）で溶離させる。生成物よりも早く溶出する不純物が溶
離した後に、展開剤を酢酸エステル／メタノール／アン
モニア５０／５０／１（ｖ／ｖ／ｖ）に変える。生成物
をカラムで洗浄しかつ相応するフラクションを合一する
。残分を真空中で蒸発濃縮させ、残った粘性油状の生成
物を水２０ｍｌ中に溶かしかつ凍結乾燥させる。

【０１０８】収量：白色凍結乾燥物　　６８ｍｇ（理論
値の４２％）。

【０１０９】ＤＣ：珪酸ゲル、酢酸エステル／メタノー
ル／アンモニア５０／５０／１（ｖ／ｖ／ｖ）；Ｒｆ＝
０．２８。

【０１１０】試験経過マイクロ滴定プレートを緩衝液ｐ
Ｈ９．６中のサーモ−ＳＡ−ストレプトアビジン（Ｔｈ
ｅｒｍｏ−ＳＡ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）（欧州特
許機構（ＥＰ−Ａ）第０２６９０９２号明細書により製
造）１０μｇ／ｍｌよりなる溶液１００μｌ（１ウエル
当り）で１時間室温で被覆する。皿を０．９％塩化ナト
リウム溶液で洗浄する。引続き、ＰＢＳ／１％ＲＳＡ（
＝１％子牛血清アルグミンを有する燐酸緩衝食塩水）中
のヒスタミン−ＩＴＣＢ−ＤＡＤＯＯ−ビチオン（製造
前記参照）５ｎｇ／ｍｌの溶液２００μｌ（１ウエル当
り）で１時間室温で被覆しかつ新たに０．９％塩化ナト
リウム溶液で洗浄する。その後にＰＢＳ中の試料１００
μｌを１時間室温でインキュベートしかつ新たに０．９
％塩化ナトリウム溶液で洗浄する。ＰＢＳ／０．５％Ｒ
ＳＡ中の羊−抗−マウス−ＩｇＧ−ペオキシダーゼ−接
合体（ベーリンガーマンハイム社、Ｂｅｓｔ．Ｎｏ．８
２１４８９）１５０ｍＵ／ｍｌの溶液１００μｌ／ウエ
ルと共にもう１回のインキュベーション（１時間室温で
）を行なう。０．９％塩化ナトリウム溶液でのもう１回
の洗浄過程後に、ペルオキシダーゼ活性を３０分間室温
でＡＢＴＳ−溶液（ＡＢＴＳ１００ｍｇ；過硼酸ナトリ
ウム３．２５ｍモル／ｌ；クエン酸３９．８ｍモル／ｌ
；燐酸ナトリウム６０ｍモル／ｌ；ｐＨ４．４〜４．５
）１００μｌ／ウエルの添加によりかつ引続いて４０５
ｎｍでの吸光測定により決定する。

【０１１１】 ─────────────────────────
──────────　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　測　　　　定　　　　値
（Ｅ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　免疫化マウスの血清───────────
────────────────────────　
　希釈　　　　　マウス番号 　　１：　　　　　　１　　　　　　　２　　　　　　
　３　　　　　　　３　　　　　　　５　　　　　　　
６　　　　　　　７────────────────
───────────────────　　　１００
　　　　１．０９８　　　　１．２６２　　　　１．０
６４　　　　１．０２８　　　　１．３３３　　　　１
．１３６　　　　０．９０８　　１０００　　　　０．
７３６　　　　１．１３５　　　　０．８０１　　　　
０．９５５　　　　０．９７３　　　　０．８３５　　
　　０．８７４　１００００　　　　０．２５２　　　
　０．３５３　　　　０．２７３　　　　０．３９０　
　　　０．２５２　　　　０．２６２　　　　０．４８
７１０００００　　−０．０３７　　−０．０２７　　
−０．０３１　　−０．００２　　−０．０４２　　−
０．０３８　　−０．０３６────────────
───────────────────────この
際１：１００００の希釈では全７匹のマウスにおいて全
般に極めて高い測定値（明らかに０．０５０以上）が得
られ、要するに全マウスにおける滴定量が極めて高いこ
とが注目される。

【０１１２】従って、低分子量のハプテンのＩＴＣＢ−
誘導体に対する抗体を生産するという第一の目的は達成
される。

【０１１３】例４種々の本発明によるモノクロール抗体
と他の血清成分との相対的親和性及び交叉反応性の測定
例３に記載したように行なった。先ずヒスタミンＩＴＣ
Ｂに対する抗体の相対的親和性を測定した。

【０１１４】ヒスタミン−ＩＴＣＢに対する相対的親和
性を測定するために、抗体に分析質（Ａｎａｌｙｔ）ヒ
スタミン−ＩＴＣＢを増加性濃度で添加しかつ試料を例
３で記載したＥＬＩＳＡで使用した。

【０１１５】図１は、ヒスタミン−ＩＴＣＢに対する相
対的親和性を測定する試験原理を示す模式図である。

【０１１６】図２は、抗体の相対的親和性を、ＥＬＩＳ
Ａにおける５０％信号減少に必要なヒスタミン−ＩＴＣ
Ｂの量（ｎｇ／ｍｌ）として定義づけてこの信号減少を
５０％インターセプトとして表示した関係図である。

【０１１７】抗体の相対的親和性は、前記のＥＬＩＳＡ
で５０％の信号減少を得るために必要とするヒスタミン
−ＩＴＣＢの量（ｎｇ／ｍｌ）として定義される。この
信号減少は５０％インターセプト（５０％ＩＣ）として
示される。

【０１１８】ｍＥ（５０％ＩＣ）＝１／２Ｅｍａｘ−−
−→対応するヒスタミン−ＩＴＣＢ−濃度は、抗体の相
対的親和性に相応する。

【０１１９】この時各モノクロナール抗体に、交叉反応
性について試験すべき物質（ヒスチジン、リジン、セロ
トニン等）を増加濃度で各々添加した。

【０１２０】引続き交叉反応を次の式で計算した：Ｃ＝
最高信号の５０％の達成のために必要である各抗体の濃
度。

【０１２１】

【数１】

【０１２２】測定値を第１表にまとめる。

【０１２３】

【表１】

【０１２４】例５血漿中の分析質ヒスタミン−ＩＴＣＢ
の測定受容体溶液：クローン１．４７．７４の腹水、Ｐ
ＢＳ中で１：２０００００希釈。

【０１２５】試料：非希釈血漿（ＥＤＴＡ１ｍｇ／ｍｌ
）、−２０℃で貯蔵。

【０１２６】較正曲線：ヒスタミン−ＩＴＣＢ原液１ｍ
ｇ／メタノールｍｌ（血清又は血漿中の希釈列）Ａ）試
料準備供血者から大口径（ｇｒｏｓｓｌｕｍｉｇｅｎ）
カニューレで血液５０ｍｌをプラスチック注射器に取り
かつこれを直ちにＥＤＴＡ−被覆の小管に入れかつ１０
分間２６００ＵＰＭ及び＋４℃で遠心分離する。得られ
る血漿を０．５ｍｌ及び１ｍｌの部分に分けかつ−２０
℃で低温凍結する。

【０１２７】Ｂ）実験経過試料の誘導体化：先ずヒスタ
ミン−ＩＴＣＢ（血清又は血漿中）よりなる標準希釈列
を調整する。反応開始のために、重炭酸ナトリウム−緩
衝液（１モル／ｌ）、ｐＨ９．０、１４ｍｌをＩＴＣＢ
溶液（ＤＭＳＯ中ＩＴＣＢ６１ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌと混
合する。このＩＴＣＢ−緩衝液混合物２８０μｌ及び標
準もしくは試料８０μｌを各々３０秒間振動しかつ１時
間５６℃で水浴中でインキュベートする。反応を止める
ために、トリス（Ｔｒｉｓ）−緩衝液ｐＨ４．１（１．
８モル／ｌ）４０μｌをピペットで入れかつ再び振動す
る。

【０１２８】ＥＬＩＳＡ−試験における試料の使用：１
２−溝−ピペットで、希釈腹水（抗体）５０μｌ及び試
料５０μｌを、例２により被覆されたマイクロ滴定プレ
ートの各深部に各々入れかつ１時間室温で振動下でイン
キュベートする。０．９％塩化ナトリウム溶液での２回
の洗浄後に、羊−抗−マウス−ＰＯＤ−接合体（例３参
照）１００μｌを上に加えかつ１時間室温でインキュベ
ートする。洗浄緩衝液で３回の洗浄後に、ＡＢＴＳ−基
質溶液１００μｌを上に加えかつ３０分間呈色反応後に
、ＥＬＩＳＡ−リーダー（Ｒｅａｄｅｒ）（ダイナテッ
ク（Ｄｙｎａｔｅｃ））中で４０５ｎｍで吸光を測定す
る。

【０１２９】測定範囲：ヒスタミン７５０ｐｇ〜１００
ｎｇ／ｍｌの試料試料希釈（１：１０）試験の感度：７
５ｐｇ〜ｎｇ／ｍｌ。

【０１３０】例６好塩基性白血球（Ｂａｓｏｐｈｉｌｅ
ｎ　　Ｌｅｕｋｏｚｙｔｅｎ）からのヒスタミン−遊離
光度測定によるアレルギー−脱顆粒試験（Ａｌｌｅｒｇ
ｉｅ−Ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎｓｔｅｓｔ）（ＰＡ
Ｄ−Ｔｅｓｔ：ベーリング−マンハイム社、Ｂｅｓｔ．
Ｎｏ．８５４５０６）に記載された方法により、完全血
液から白血球を富化しかつアレルゲンと共にインキュベ
ートする。抗原−／抗体反応で遊離されるヒスタミン量
を後記の方法により（ＩＴＣＢでの誘導体化→競争的Ｅ
ＬＩＳＡ）上澄み中で測定する。

【０１３１】白血球取得：静脈完全血液２０ｍｌを大口
径カニューレでＥＤＴＡ−被覆小管（ＥＤＴＡ−溶液２
ｍｌ）に取りかつ次の物質：ブドウ糖溶液（６％）４ｍ
ｌ（溶液８）デキストラン（６％）４ｍｌ（溶液２）ゼ
ラチン（２％）０．８ｍｌ（溶液７）よりなる混合物が
前もって装入されているザルステット（Ｓａｒｓｔｅｄ
ｔ）血清−血漿−濾過器（Ｂｅｓｔ．Ｎｏ．５３４２２
；２５ｍｌ）中に加える。

【０１３２】慎重な混合の後に、赤血球の沈降を６０〜
９０分間以内に室温で行なう。血漿上澄み（約１０ｍｌ
）をできるだけ完全に取りかつ２本のプラスチック−遠
心分離小管（ザルステット５５４６８；１３ｍｌ）に均
一に分配する。小管にＴＲＩＳ−緩衝液（溶液９）を各
々添加しかつ引続き１５分間４００〜５００ｇで遠心分
離する。上澄みをデカンテーション除去し、細胞をＴＲ
ＩＳ−緩衝液１０ｍｌで洗浄しかつ再び１５分間遠心分
離する。

【０１３３】上澄みのデカンテーション除去後に細胞を
氷冷ＴＲＩＳ−緩衝液／ブドウ糖（溶液１０）合計１２
ｍｌ（２×６ｍｌ）中に再懸濁させ、かつ脱顆粒のため
に使用する。

【０１３４】細胞数の測定のために、細胞懸濁液５０μ
ｌを３％の酢酸４５０μｌで希釈しかつトーマ（Ｔｈｏ
ｍａ）−計数室で数える。

【０１３５】抗原とのインキュベーション（脱顆粒）エ
ッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）−反応容器にピペ
ットで入れる： 　　　　　　　　　　緩　　衝　　液　　　　　　　　
　　　　　試料空値　　試　　料　抗−ＩｇＥ／アレル
ゲン　　空　値　　空　値 ＴＲＩＳ−緩衝液／ブドウ糖（３７℃）（１０）　　１
３０μｌ　　　１３０μｌ　　　１３０μｌ　　　１３
０μｌ白血球−懸濁液　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　３００μｌ　　　３００μｌ　　　　−　　
　　　　　−ＴＲＩＳ−緩衝液／ブドウ糖（３７℃）（
１０）　　　−　　　　　　　−　　　　　　３００μ
ｌ　　　３００μｌ３７℃で５分間インキュベート アレルゲン溶液（１２）　　　　　　　　　　　　　　
　　　−　　　　　　　３０μｌ　　　　３０μｌ　　
　　−ＴＲＩＳ−緩衝液／ブドウ糖（１０）　　　　　
　　　　３０μｌ　　　　−　　　　　　　−　　　　
　　　３０μｌ３７℃で１分間インキュベート 開始剤−溶液（ＣａＣｌ２）（４）　　　　　　　　　
　　　　３０μｌ　　　　３０μｌ　　　　３０μｌ　
　　　３０μｌ慎重に混合、３７℃で６０分間インキュ
ベート停止剤−溶液（氷冷）（３）　　　　　　　　　
　　１７０μｌ　　　１７０μｌ　　　１７０μｌ　　
　１７０μｌ 　　試料を、ヒスタミン−遊離後に、５分間エッペンド
ルフ−遠心分離器中で９００ｇ及び４℃で遠心分離した
。 上澄みを１５分間以内で細胞残渣から分離しかつ４℃又
は低温凍結（−２０℃）でヒスタミン測定まで貯蔵した
。

【０１３６】溶液 Ａ．原液（１）ＴＲＩＳ−濃縮物（２２５ｍモル／ｌ）
ＴＲＩＳ　　２７．２ｇ、ＮａＣ　　ｌ６９．０ｇ及び
ＫＣ　　ｌ３．７ｇを再蒸留水（Ａｑｕａ　　ｂｉｄｅ
ｓｔ．）１ｌ中に溶かしかつ濃ＨＣｌでｐＨ９．６に調
整する。

【０１３７】（２）デキストランデキストラン溶液：デ
キストラン（ＭＷ７５０００）６０ｇを０．９％ＮａＣ
ｌ　　１ｌ中に溶かす。

【０１３８】（３）ＥＤＴＡ（１００ｍモル／ｌ）ＥＤ
ＴＡ３．７２ｇを０．９％ＮａＣｌ　　１００ｍｌ中に
溶かしかつＮａＯＨでｐＨ７．６に調整する。

【０１３９】（４）開始−溶液（ＣａＣｌ２）：ＣａＣ
ｌ×２Ｈ２Ｏ１．８２ｇを０．９％ＮａＣｌ　　１００
ｍｌ中に溶かす。

【０１４０】（５）ＴＲＩＳ／ＨＣｌ−緩衝液ＴＮ（０
．０７５モル／ｌ；ｐＨ７．６）。

【０１４１】原液ａ：ＴＲＩＳ３６．３５４ｇを再蒸留
水１ｌに溶かす。

【０１４２】原液ｂ： ＨＣｌ　　０．１モル／ｌ 緩衝液：原液ａ２５ｍｌ ＋原液ｂ５８．９５ｍｌ （６）ＮａＣｌ（０．９％） Ｂ．使用溶液 （７）ゼラチン（２％） ゼラチン２．０ｇを０．９％ＮａＣｌ　　１００ｍｌ中
に加熱下（最高５０℃）で溶かす。

【０１４３】（８）ブドウ糖（６％）α−Ｄ−ブドウ糖
（無水）　６．０ｇを０．９％ＮａＣｌ　　１００ｍｌ
中に溶かす。

【０１４４】（９）ＴＲＩＳ−緩衝液（２２．５ｍモル
／ｌ） ＴＲＩＳ−濃縮物（溶液１）５０ｍｌ 再蒸留Ｈ２Ｏ　　４００ｍｌ ゼラチン溶液（溶液７）１２．４ｍｌ ＥＤＴＡ−溶液（溶液３）５．０ｍｌ 再蒸留水で５００ｍｌに満たし、ｐＨ（７．６）を検査
しかつ場合により調整する。

【０１４５】（１０）ＴＲＩＳ−緩衝液／ブドウ糖ブド
ウ糖溶液（溶液８）２．７ｍｌをＴＲＩＳ−緩衝液（溶
液９）１５０ｍｌと混合する。

【０１４６】（１１）ヒト−ＩｇＥに対する抗血清（１
：５００） ベーリング社（Ｆａ．Ｂｅｈｒｉｎｇ）（ＯＴＮＰ０４
／０５）例えば４６４７４８ＩＵ／ｍｌ）抗血清１０μ
ｌをＴＲＩＳ−緩衝液／ブドウ糖（溶液１２）５０００
μｌで希釈する。

【０１４７】（１２）アレルゲン−抽出物０．１／１／
１０μｇ／ｍｌのアレルゲン濃度をＴＲＩＳ−緩衝液／
ブドウ糖（溶液１０）での希釈により製造する。

【０１４８】例７完全血液からのヒスタミン遊離シラガ
ニアン（Ｓｉｒａｇａｎｉａｎ）（マニュアル・オブ・
クリニカル・イムノロジイ（Ｍａｎｕａｌ　　ｏｆ　　
Ｃｌｉｎｉｃａｌ　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、１９７
６、チャプター（Ｃｈａｐｔｅｒ）８０、６０２）によ
って記載された方法により、完全血液を抗原と共にイン
キュベートしかつ引続き遠心分離する。抗原−／抗体反
応で遊離されるヒスタミン量を記載方法：ＩＴＣＢでの
誘導体化及び引続いて上澄み中の競争的ＥＬＩＳＡによ
り測定する。

【０１４９】試料取得静脈完全血液２０ｍｌをプラスチ
ック注射器で取りかつヘパリン（リクエミン・ナトリウ
ム（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ　　ｓｏｄｉｕｍ）１０、１ｍｌ
＝１，０００Ｕ；オルガノ社（Ｏｒｇａｎｏ　　Ｉｎｃ
．）、ウエスト・オレンジ（Ｗｅｓｔ　　Ｏｒａｎｇｅ
）、Ｎ．Ｊ．）０．５ｍｌを有するプラスチック小管（
ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ、５０ｍｌ）中に入れる。 試験に使用するまで血液を４℃で２４時間まで冷蔵庫中
に貯蔵してよい。血液をＰＩＰＥＳ　　ＡＣＭ（溶液７
）５ｍｌで希釈しかつ直接試験に使用する。

【０１５０】抗原とのインキュベーション（ヒスタミン
遊離反応）反応を７５ｍｍプラスチック小管（ファルコ
ン２０５２）中で実施する。

【０１５１】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　試料空値　　　　　　試　　料　　　　　　試料の総
ヒスタミン────────────────────
────────────────ＰＩＰＥＳ　　ＡＣ
Ｍ（７）　　　　５００μｌ　　　　　−　　　　　　
　　　　　　−　　　　　　氷浴中アレルゲン溶液（８
）　　　　　　　　−　　　　　　　　　　５００μｌ
　　　　　　　−─────────────────
───────────────────希釈完全血液
　　　　　　　　　　　　　　　　５００μｌ　　　　
　５００μｌ　　　　　　　５００μｌ１２％過塩素酸
（４）　　　　　　　　−　　　　　　　　　　−　　
　　　　　　　　　　５００μｌ小管を３７℃−水浴中
に移す １時間インキュベーション（１０分毎に振動）────
─────────────────────────
───────反応の停止：小管を氷浴に移す 遠心分離：３０分間２，５００ＵＰＭで（１，２００ｘ
ｇ）、４℃────────────────────
────────────────上澄みをヒスタミン
測定まで−２０℃で凍結させる。

【０１５２】溶液： Ａ．原液： （１）ＰＩＰＥＳ−緩衝液（１０倍に濃縮する）ＰＩＰ
ＥＳ　　　　　　　　　　７５．６０ｇＮａＣｌ　　　
　　　　　　　　　６９．２８ｇＫＣｌ　　　　　　　
　　　　　　　　　３．７２ｇ１０Ｎ　　ＮａＯＨ　　
　　４３ｍｌ を再蒸留水１ｌ中に溶かす（ｐＨ７．４８）。

【０１５３】（２）ヒト血清アルブミン−溶液（２５％
）（３）ＥＤＴＡ−溶液（０．１モル／ｌ）ＥＤＴＡ３
７．２３ｇを再蒸留水６００ｍｌ中に溶かしかつ５０％
ＮａＯＨでｐＨ７．１８〜７．２０に調整しかつ再蒸留
水で１ｌに満たす。

【０１５４】（４）過塩素酸（１２％）６０％ＨＣｌＯ
４　２００ｍｌを再蒸留水８００ｍｌで希釈する。

【０１５５】（５）Ｃａ２＋−溶液（０．１モル／ｌ）
（６）Ｍｇ２＋−溶液（０．１モル／ｌ）Ｂ．使用溶液
（７）ＰＩＰＥＳ　　ＡＣＭ−緩衝液（Ｃａ２＋　　１
ｍモル／ｌ、Ｍｇ２＋０．５ｍモル／ｌ）ＰＩＰＥＳ　
　Ａ−緩衝液： ＰＩＰＥＳ−原液（１０倍濃縮）１０ｍｌを二重蒸留水
で１００ｍｌに希釈しかつ２５％のヒト血清アルブミン
−溶液０．１２５ｍｌをそれに加える。

【０１５６】Ｃａ２＋　　０．１モル／ｌ−溶液　　１
ｍｌＭｇ２＋　　０．１モル／ｌ−溶液０．５ｍｌをＰ
ＩＰＥＳ　　Ａ−緩衝液で１００ｍｌに希釈する。

【０１５７】（８）アレルゲン溶液 ＰＩＰＥＳ　　ＡＣＭ−緩衝液中のアレルゲン希釈液を
調整しかつ分割して−２０℃で貯蔵する。

【０１５８】例８ ニトロ−ＩＴＣＢ誘導体化アドレナリンの合成（同様に
反応式３参照）ａ）　　５−イソチオシアナト−２−ニ
トロ安息香酸１２５−アミノ−２−ニトロ安息香酸１１
（１．８２ｇ）１０ｍモルを濃塩酸１０ｍｌ及び水８０
ｍｌよりなる混合物中に１００℃への加熱によって溶か
す。２０℃への溶液の冷却後に、チオホスゲン１．３７
ｇ（１２ｍモル）を滴加する。短時間の誘導相後に生成
する沈殿を６時間後に吸引濾過し、水で洗浄しかつ乾燥
器中で塩化カルシウムを介して乾燥させる。

【０１５９】収量：黄色粉末　　０．７８ｇ（理論値の
４４％）ＩＲ（ＫＢｒ）：ν＝１９８４、１９６４ｃｍ
−１ＤＣ：珪酸ゲル、酢酸エステル／氷酢酸　　９９／
１（ｖ／ｖ）；Ｒｆ＝０．５９。

【０１６０】ｂ）　　Ｎ′−（３−カルボキシ−４−ニ
トロフェニル）−Ｎ［２−（３，４−ジヒドロキシフェ
ニル）−２−ヒドロキシエチル］−Ｎ−メチルチオ尿素
１３Ｌ−アドレナリン６ｂ　　１．８３ｇ（１０ｍモル
）及び５−イソチオシアナト−２−ニトロ安息香酸１２
　　２．２４ｇ（１０ｍモル）を、無水ＴＨＦ５０ｍｌ
中に溶かしかつ２０時間２０℃で撹拌する。引続き溶剤
を水流真空中で除去し、残分をメタノール／酢酸エステ
ル１／１（ｖ／ｖ）２５ｍｌ中に入れかつ粗生成物を珪
酸ゲルカラム（５×５ｃｍ）のクロマトグラフィーによ
り精製する。溶離剤としてメタノール／酢酸エステル１
／１（ｖ／ｖ）を用いる。生成物１３を含有するフラク
ションを合しかつ１００ｍｌに濃縮する。次いで溶液に
活性炭２００ｍｇを加えかつ１６時間２０℃で撹拌する
。活性炭を濾別し、溶剤を水流真空中で除去しかつ残分
を高圧真空−ポンプで乾燥させる。

【０１６１】収量：黄色固体　　３．４５ｇ（理論値の
８５％）ＤＣ：珪酸ゲル、酢酸エステル／氷酢酸　　９
９／１（ｖ／ｖ）；Ｒｆ＝０．２７。

【０１６２】ｃ）　　Ｎ−［２−（３，４−ジヒドロキ
シフェニル）−２−ヒドロキシエチル］−Ｎ−メチル−
Ｎ′−［４−ニトロ−３−（Ｎ−スクシンイミジルオキ
シカルボニル）フェニル］−チオ尿素１４（アドレナリ
ン−ニトロ−ＩＴＣＢ−ＮＨＳ）アドレナリン−ニトロ
−ＩＴＣＢ１３　　２．０３ｇ（５ｍモル）を無水ジオ
キサン５０ｍｌ中に溶かしかつ撹拌下でＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド０．６１ｇ（５．３ｍモル）及びジシク
ロヘキシルカルボジイミド１．２４ｇ（６ｍモル）を加
える。２０℃で２０時間撹拌後、生成したジシクロヘキ
シル尿素を濾別しかつ溶剤を水流真空中で５０℃で除去
する。残分をもう一度ジオキサン２０ｍｌ中に入れかつ
不溶物を濾別する。引続き蒸発乾固させかつ粗生成物を
珪酸ゲル（５×５ｃｍ）のカラムクロマトグラフィーに
より精製する。溶離剤として酢酸エステルを用いる。生
成物１４を含有するフラクションを１０ｍｌに濃縮しか
つ撹拌下でジイソプロピルエーテル１００ｍｌに徐々に
滴加する。生成する沈殿を分離しかつ高圧真空−ポンプ
で乾燥させる。

【０１６３】収量：黄色固体　　０．６ｇ（理論値の２
４％）ｄ）　　アドレナリン−ニトロ−ＩＴＣＢ−β−
ガラクトシダーゼ−免疫原１５製造は５と同様に行なう
（例１ｃ）。

【図面の簡単な説明】

【図１】　　ヒスタミンＩＴＣＢに対する抗体の相対的
親和性を測定するための、試験原理を示す模式図。

【図２】抗体の相対的親和性を、ＥＬＩＳＡにおける５
０％信号減少に必要なヒスタミン−ＩＴＣＢ量として定
義づけて、この信号減少を５０％インターセプトとして
表示した関係図。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　１級又は２級のビオゲンアミンに対す
   るモノクローナル抗体（この抗体はビオゲンアミンとカ
   ップリング試薬とからのカップリング生成物に対向して
   いる）を取得する場合に、（１）　１級又は２級ビオゲ
   ンアミンを、そのアミノ官能基を介して、一般的化学構
   造：Ｘ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ−Ｙ［式中ＸはＯ又はＳを表わし、
   Ｒは非置換の又は置換された芳香族、ヘテロ芳香族又は
   シクロアルキル基を表わし、Ｙは一般式： 【化１】 のカルボキシル基を表わし、ここでＺは（ａ）ＯＨ又は
   Ｏ−であるか又は（ｂ）カップリング反応の条件下にア
   ミノ官能基と反応しないが１以上の反応工程で反応性の
   エステル−、酸クロリド−又は酸アンヒドリド基に変換
   可能である基Ｚ１である］を有するカップリング試薬に
   結合させ、（２）　工程（１）で生じるカップリング生
   成物のカルボキシル基の残基Ｚを、反応性のエステル−
   、酸クロリド−又は酸アンヒドリド基に変え、（３）　
   工程（２）からの活性化されたカップリング生成物を担
   体物質に結合させて、免疫原としての作用をする担体結
   合カップリング生成物を得、（４）　工程（３）からの
   免疫原を用いて実験動物を免疫化し、（５）　この免疫
   化された実験動物から、公知方法で、ビオゲンアミンと
   カップリング試薬とからのカップリング生成物に対する
   モノクローナル抗体を取得することを特徴とする、１級
   又は２級のビオゲンアミンに対するモノクローナル抗体
   を取得する方法。
2. 【請求項２】　　３−イソチオシアナト安息香酸又はそ
   の塩又は誘導体をカップリング試薬として使用する、請
   求項１記載の方法。
3. 【請求項３】　　ビオゲンアミンとして、ヒスタミン又
   はアドレナリン、ノルアドレナリン及びドーパミンから
   選択されたカテコールアミンを使用する、請求項１又は
   ２記載の方法。
4. 【請求項４】　　１級又は２級のビオゲンアミンＨＮＲ
   ４Ｒ５とカップリング試薬とからの、次の一般的構造：
   【化２】 ［式中Ｒ４及びＲ５はその都度のビオゲンアミンに相応
   する基を表わし、ＸはＯ又はＳを表わし、Ｒは非置換の
   又は置換された芳香族、ヘテロ芳香族又はシクロアルキ
   ル基を表わし、Ｙは一般式： 【化３】 のカルボキシル基を表わし、ここでＺは（ａ）ＯＨ又は
   Ｏ−であるか又は（ｂ）他の、カップリング反応の条件
   下にアミノ官能基と反応しないが、反応性のエステル−
   、酸クロリド−又は酸アンヒドリド基に変換可能である
   基Ｚ１である］を有するカップリング生成物。
5. 【請求項５】　　１級又は２級のビオゲンアミンとカッ
   プリング試薬とからの請求項４記載のカップリング生成
   物に対するモノクローナル抗体。
6. 【請求項６】　　ハイブリドーマ−セルライン１．４７
   ．７４（ＥＣＡＣＣ９００７１９０２）から分泌された
   、ヒスタミンとイソチオシアナト安息香酸とからのカッ
   プリング生成物に対する、モノクローナル抗体。
7. 【請求項７】　　ハンブリドーマ−セルライン１．１７
   ．４４（ＥＣＡＣＣ９００７１９０１）から分泌された
   、ヒスタミンとイソチオシアナト安息香酸とからのカッ
   プリング生成物に対する、モノクローナル抗体。
8. 【請求項８】　　試料溶液中の１級又は２級のビオゲン
   アミンを測定する場合に、（１）　試料溶液中のビオゲ
   ンアミンをそのアミノ官能基を介して、一般的化学構造
   ：　　　　　　　　　　Ｘ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ−Ｙ［式中Ｘは
   Ｏ又はＳを表わし、Ｒは非置換の又は置換された芳香族
   、ヘテロ芳香族又はシクロアルキル基を表わし、Ｙは、
   一般式：【化４】 のカルボキシル基を表わし、ここで、Ｚは（ａ）ＯＨ又
   はＯ−であるか又は（ｂ）他の、カップリング反応の条
   件下にアミノ官能基と反応しないが反応性のエステル−
   、酸クロリド−又は酸アンヒドリド基に変換可能である
   基Ｚ１である］を有するカップリング試薬に結合させ、
   （２）　試料溶液を、工程（１）で生じたビオゲンアミ
   ンとカップリング試薬とからのカップリング生成物に対
   するモノクローナル抗体１種以上と共にインキュベート
   し、（３）　この抗体／抗原−反応を常法で定量するこ
   とにより試料中のビオゲンアミンの濃度を測定すること
   を特徴とする、試料溶液中の１級又は２級のビオゲンア
   ミンを測定する方法。
9. 【請求項９】　　カップリング試薬として、３−イソチ
   オシアナト安息香酸、その塩又は誘導体を使用する、請
   求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】　　測定すべきビオゲンアミンとして、
    ヒスタミン又はアドレナリン、ノルアドレナリン及びド
    ーパミンから選択されたカテコールアミンを使用する、
    請求項８又は９記載の方法。