JPH02200198A - Ｉｌ―２受容体に対するモノクローナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明はヒトインターロイキン２受容体（以下ＩＬ−２
受容体を略す）の構成成分のうち重鎖と結合する七ツク
ローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生ずるハイ
ツリドーマに関する。本発明のモノクローナル抗体はＩ
Ｌ−２受容体発現細胞の同定もしくは除去等に用いられ
る。

〈従来の技術〉 ヒト！Ｌ−２受容体はヒ、トリン／４球上に発現されて
いるが、最近この受容体が２つの成分からなることが明
らかとなりた（　Ｐｒｏｃ＠ｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈ
ｅＮａｔｌｏｎａｌ　　Ａｅａｄ＊ｒｎｙ　　ｏｆ　　
８ｅｉ＠ｎｃ＠ｍ　　ｏｆ　　ｔｈ＠　ＩＪｎｉｔ＠ｄ
Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｖ＠ｒｉｅａ　８３巻、９６９
４負、１９８６年）。

このうち＠鎖は分子魚釣５５，０００でおり重鎖は分子
量的７５，０００でめる＠　Ｉ　Ｌ　−２との結合の解
離定数は軽鎖単独で１０−８Ｍであり１重鎖単独では１
０”’Ｍであるが、画鋲が接し次場合には解離定数１０
−１２の高親和性ＩＬ−２受容体が構成されろことが知
られている。一方軽鎖単独を発現しているａｍではヒト
インターロイキン２（以下ＩＬ−２と略する）のが結合
しても何らの刺激が生起しないＯＫ対し、重鎖単独もし
くは軽鎖と重鎖の両方を発現している細胞では！Ｌ−２
の結合にともないその細胞の増殖、分化が誘導されるこ
とが知られている（実験医学、６巻；６０６ページ、１
９８８年）。従って、ＫＬ−２の生理的機能が発揮嘔れ
るためには重鎖の存在が１！喪である。

さて、これまで！Ｌ−２受容体の研究は２つの守 方法を用いて行なわれて来た。ひとつは放射性同位元素
を用いて標識し九ＩＬ−２の結合実験であシ、これによ
って、！Ｌ−２受容体が高親和性のものと低親和性のも
のが存在することが分つ九が（ＲｏｂｂらＰｒｏｅ＠＠
ｃ！ｌｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｌａｎａｌ　Ａｅ
ａｄ＊ｍｙｏｆ　　ｇａｌｅｎａ＠　ｏｆ　　ｔｈ＠　
Ｕｎｉｔｅｄ　　５ｔａｔ＠ｓ　　ｏｆ　　Ａｍｅｒｉ
ｃａ数が求められるだけであり、個々の細胞について高
親和性、低親和性のＩＬ−２受容体の数を知ることは不
可能でありた。またこの方法ではＩ　Ｌ−２受容体発現
細胞の他の性質、例えばＩＬ−２受容体以外の細胞表面
分子の発現等の情報を同時に得ることは不可能である。

−万、もうひとつの方法として抗ＩＬ−２受容体モノク
ローナル抗体と呼ばれる抗体を用いる方法がある（　Ｕ
＠ｈｉｙａｍａら。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｒｏｌｏｇｙ　ｅ　１
２６巻、１３９３ペ一ジ１９８１年）。しかしながらこ
の抗ＩＩ、−２受容体モノクローナル抗体はＩＬ−２受
容体の軽鎖に対する結合性を有するのみでめシ、従って
軽鎖を発現している細胞を同定もしくは除去できるが、
重鎖の存在はこの抗体によりては全く知ることができな
い、ようて、ＩＬ−２の生理的機能によシ重要である、
と思われる重鎖を発現している細胞の同定及び除去には
全く用いることができない。

もし、ＩＬ−２受容体の重鎖を対応抗原とするモノクロ
ーナル抗体を得るととができればＩＬ−２受容体の発現
細胞の同定、除去に有利に用いることができる。

〈発明が解決しようとする課題〉 従りて、本発明の目的は、ＩＬ−２受容体重鎖を対応抗
原とするモノクローナル抗体およびそれを産生するハイ
ツリドーマを提供することである。

〈課題を解決するための手段〉 本発明者らは上記課題を解決する九めに、ＩＬ−２受容
体重鎖を発現しているヒト細胞を免疫原として用いるこ
とにより、ＩＬ−２受容体重鎖を対応抗原とするモノク
ローナル抗体を取得することができ、本発明を完成する
に至らしめ友、即ち本発明は！Ｌ−２受容体の構成成分
のうちｔＳを対応抗原として得られるモノクローナル抗
体である。本発明に従えばヒ）ＩＬ−２受容体重鎖を対
応抗原とするモノクローナル抗体を産生ずるハイツリド
ーｉクローン、及び該クローンが産生ずる性状の均一な
モノクローナル抗体が提供される。

本発明のバイブリド−マク四−ンは、（−骨髄腫細胞す
なわち、骨髄の初期腫瘍からの悪性化細胞と、（ｂ）ヒ
トＩＬ−２受容体重鎖を発現しているヒト細胞で免疫さ
れた動物の血液、肺臓ｔたは、リン１４節の細胞中に存
在する抗体産生細胞とのハイプリドー−ｖｔ−ケーラー
とミルシ、り、インの常法に従りて作成し、このハイツ
リドーマを培養及びクローン化して、ヒ）ＩＬ−２受容
体重鎖を発現する細胞とのみ反応する活性を示す抗体を
産生ずるり四−ンとして選択されるものである。

目的とするモノクローナル抗体は、このようなりμｍン
を培養した培養上清から、塩析、イオン交換り四マドグ
ラフィー等の精製操作により回収できるが、必要に応じ
て全培讐上清を用いることもできる。’！九大量に取得
する場合には、該ノ１イプリドーーｒｆ組織適合性動物
胸腺欠損ヌードマクス等の腹腔内に移植し増殖させ、該
動物の腹水中に産生された蚊モノクローナル抗体をｎｔ
製１回収すれば良い。

以下に、この！Ｌ−２受容体重鎖と結合する活性を示す
モノクローナル抗体の調製法を記す。

ハイツリドーマは骨髄腫細胞と抗体産生細胞を融合させ
るととくよって製造される。抗体産生細胞としては、Ｉ
Ｌ−２受容体重鎖発現細胞であるにト成人Ｔ細胞白血病
９イルス感ＱＴ細胞株例えばＴＬ−Ｍａｒ細胞で免疫さ
れ几マワス、ラットなどの動物からの血液牌ＩＪＩまた
はリンノぐ筋細胞を用いるとよい。尚、ＴＬ−Ｍｏｒ細
胞に限らず、！Ｌ−２受容体重鎖を発現していゐ細胞で
あれば何を免疫原にしてもかまわない。

骨髄腫細胞と抗体産生細胞の由来する動物の種は、両細
施が融合可能な限りにおいて異りてもよいが、通常同一
種の細胞を用いた方がよい結果が得られる。

本発明実施のための一つの好ましいハイツリドーマは、
ヒト成人Ｔ細胞白血病つィルス感染Ｔ細胞株ＴＬ−Ｍｏ
ｒ細胞で免疫したマウスの血液細鬼、肺臓細ｍまたは、
リンノ譬節細胞とマクス骨髄腫細胞との間のハイツリド
ーマである。例えば生理食塩水に＠濁し九ＴＬ−Ｍｏｒ
細胞で免疫したＢＡＬＢ／　Ｃ−ｒクスの抗体産生肺臓
細胞と、ＢＡＬＢ／Ｃマクスの骨髄腫細胞５Ｐ２１０−
Ａｔ　１４との間のハイツリドーマで後記の実施例に示
す様に優れた結果が得られた。

骨髄腫細胞としては、ＢＰＶＯ−Ａｔ　１４のほかにＰ
３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ　、　Ｐ３−Ｘ６３−Ａｒ８
　、　Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−６５３゜Ｐ３−ＮＳ告Ｉ
／１−Ａｇ４−１　、　ＭＰＣＩＩ−４５，６，７Ｇ、
１．７　（以上マクス）　、　２１０．　ＲＣＹ−Ａｇ
リネ（ラッｔ　）　、　８ＫＯ−００７゜ＧＨ１５００
６ＴＧ−Ａ１２　（以上ヒト）等の　８アゾグアニン耐
性の細胞株を用いてもよい。

ハイツリドーマの作成と、それからのヒトＩＬ−２受容
体重鎖に結合する活性を示すモノクローナル抗体産生ク
ローンの選択は、例えば、次の様にして行なえる。ポリ
エチレンクリコールまたは、センダイワイルスを用いて
抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させる。生じ九ハイ
ツリドーマは、ヒーキサンチン、アミノプテリン、チミ
ジンを含む培地（以下ＨＡＴ培地と略する）中で生育す
る。

融合しなかりた抗体産生細胞と骨髄腫細胞は、該培地中
では共に死滅し、ハイブリドーマだけが個個のクローン
から増残してくる。生育したハイツリドーマから目的と
する抗体を産生ずるクローンが選択される。全てのハイ
ツリドーマクローンが抗体を産生ずるわけではない。ま
た１個々のクローンによって産生される抗体は特異性が
異なり、全てのクローンが目的とする抗体ｆ：Ａ２生す
るのではない。従って、目的とするＩＬ−２受容体重鎖
に結合する活性を示す抗体を産生ずるクローンを選択し
なければならない。その選択は例えば以下の様にして行
える。即わち、ゲルト／・ハンター法（Ｂｉｏｃｈ＊ｍ
１ｅａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　１３３巻、５２９頁。

１９７３年）クロラミン−Ｔ法（Ｎａｔｕｒｅ　１９４
巻、４９５１．１９６２年）ま念は、ラクトノーオキシ
ダーゼ法（Ｎａｔｔｓｒｖ　２６９巻、３０９）Ｉｆ、
１９７７年）ニヨリ、”Ｎｉ１ｌ？：）ＩＬ−２（以下
１２＄１−ＩＬ−２と略する）を作成し、バイブリド−
！クローン培養上清中の、”’Ｉ　−Ｉ　Ｌ　−２とＴ
Ｌ−Ｍａｒ細胞との結合阻害活性を測定する。次にこの
結合阻害活性の高いハイツリドーマ培養上清のうちＩＬ
−２受容体軽鎖のみを発現するヒト成人Ｔ細胞白血病フ
ィルス感染細胞ＭＴ−１と１２５１−　ＩＬ−２の結合
を阻害したいものを選択する。このように、ＩＬ−２受
容体軽鎖および重鎖を発現しているＴＬ−Ｍａｒ細施に
対する”５１−　Ｉｎ、−２の結合１１害し、かつ軽鎖
のみを発現するＭＴ−１細胞に対する１２５１−ＩＬ−
２の結合を阻害しない抗体を産生するバイブリド−ｉが
目的とするモノクローナル抗体産生り四−ンとなる。

こうして得られ次ハイツリドーマクローンとして１例え
ハＴＵ２７（ＦＥＲＭ４１０ｒ０９　）　ト呼バレル細
胞がある。

た培養上清よりま九は組織適合性動物もしくは、胸腺欠
損ヌードマワス中において生育させたのち、その腹水中
より、イオン交換体などを用いて、分離精製することに
より回収される。さて、得られたモノクローナル抗体は
以下の様な性質を有する体（以后モノクローナル抗体Ｔ
Ｕ２７とするン（＆）免疫グロブリンの種類：　ｒｇｃ
ｌ（ｂ）分子量　　　　　　　　：１５０．ＯＯＯダル
トン（−）分子吸光係数　　　　　　：　Ｅ２８０ｎｍ
−１４，０（ｄ）　ＴＬ−Ｍｏｒ細胞に結合するが、Ｍ
Ｔ−１細胞には結合しない。

（・）ＩＬ−２受容体重鎖を免疫沈降させる（ｆ）”’
１−　ＫＬ−２の高親和性結合のみを抑制し、低親和性
結合は抑制しない 〈発明の効果〉 本発明によるモノクローナル抗体を用いればヒ）　ＩＬ
−２受容体重鎖を発現している細胞の同定。

除去が可能となる。すなわち、成人性白血病や巨大顆粒
白血球性白血病の診断や治療さらには臓器移植の際の拒
絶反応の抑制などが可能となる。

以下実施例に従い、更に詳細に本発明を説明するが、こ
の発明は下記実施例に限定されるものではない・ 〈実施例１．ハイツリドーマのｖ８製〉６〜８週令の雌
ＢＡＬＢ／Ｃマｆ７　スにＴＬ　−Ｍｏ　ｒ　ｍ　＠１
ｒ：生理食塩水に懸濁し、−匹あたシＩ　Ｘ　１０７個
を腹腔内注射し免疫し次。７日后に同様の操作にて追加
免疫した。更にその后約１０日間の間隔で同様の操作を
繰り返し、その過程で各免疫媒作后３日后に眼窩より採
血した血清について、后述の参考例に示す測定法に従っ
て１２５１−　ＩＬ−２のＴＬ−Ｍａｒに対する結合の
阻害活性を測定し抗体価の上昇を追跡した。

抗体価の十分に上昇したマウスより最終免疫の３日后に
肺臓を摘出し、本肺臓細胞とＳＰ２１０−Ａｇ。

１４骨髄弧細胞とｔ−５０％ポリエチレングリコール＄
４０００　（牛丼化学製）存在下にて細胞数で１０＝１
の割合で混合し、細胞融合させた。融合側ＭをｌＯ％タ
シ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培地（ギグコ社製）
１−当りに５Ｘ１０’個となるように懸濁し、１ワエル
当り５Ｘ１０５個のフィーダー細胞を含有する９６穴マ
イクロタイターグレート（コー二／グ社製）に５　Ｘ　
１０’個ずつ分注した。１゜２．３．６日後に培地の半
量（１００μｔ）をＩ（ＡＴ培地と交換し、以後３日ご
とに同様の操作を繰り返した。融合より、およそ２週間
後、ハイブリドーマの生育してきたフェルの培養上清に
ついて後述する参考例に示す様な方法にて１２’Ｉ　−
ＩＬ−２とＴＬ−Ｍａｒ　＋１８ｊＩ！との結合阻害活
性を測定した。

生育し九ハイプリドーマ７５，０００クローンのうちＴ
υ２７　　と命名し九ハイプリドーマの上清中に１ｚｓ
ｌ−Ｉｔ−２とＴＬ−Ｍ６　ｙ細胞との結合を阻害し、
ＭＴ−１細胞との結合を阻害しない活性のあることか見
出された。

あらかじめ１ａ間前に１匹当ｐＱ、５＋ｊのプリスタン
を腹腔内注射しておいたＢＡＬＢ／Ｃマクス（♀。

８〜１０週令）に、それぞれ１匹当りｌＸｌ０’個ずつ
腹腔内注射し九。およそ１０日後、マウス腹腔内よシ増
殖した細胞を含む腹水を採取し、遠心操作にて、細胞を
除去した。細胞を除去した腹水を、０．４飽和硫安にて
塩析を行い、５　ｍＭ　リン酸塩緩衝液（ｐＨ６，２）
に対して透析し念。生じた沈殿を０、２　Ｍ　Ｎｍ（’
ｔｔ？含む０．１　Ｍ　）リスｍｌ！ｌ！塩緩衝液（声
７．５）に溶屏し、更に５０ｍＭリン酸塩緩衝液（−１
７，５）に対して透析を行−）た。次に、あらかじめ５
０　ｍＭ　リン酸塩緩衝液（−７，５）に、て十分平衡
化しておい；ｌｌ？、ＤＥＡＥ−セルロースＤＩ−５２
カラム（ワットマン社製）にのせ、５０〜２５０ｍＭリ
ン酸塩緩衝液（Ｆｋｉ７．５　）の濃度直線勾配にて、
溶出を行い。

抗体画分を得た。得られた抗体でのと）　ＩＬ−２と乳
−Ｍａｒ　ｉ５Ｊ胞との結合に対する阻害効果を参考例
の方法に従ワて行った。第１図に示すように精製抗体に
おいて、　ＴＬ−Ｍａｒ細胞に対する高親和性ＩＩ、−
２結合すなわちＩＬ−２受容体軽鎖および重鎖の複合体
に対するルー２の結合のみが抑刑され、低親和性、ＩＬ
−２結合すなわち、　　ＩＩ、−２受容体軽鎖に対する
ＩＩ、−２の結合は抑制されなか−）た。

〈実施例３精製ＴＵ−２７抗゛体の各種都胞への結合〉
０．３俤のクシ血清アルブミンを含むＲＰＭＩ　１６４
０培地１ｄ当り、　　ｌＸｌ０’個となるようＫＭ濁し
たＴＬ−Ｍａｒ。

）ＬＵＴ−１０２，ＭＴ−２，ＭＴ−Ｉ　　ＭＬＡ１４
４．ＴＬ−Ｈｌｒ、？、（ＯＬ、Ｔ−４゜Ｊｕｒｋａｔ
および）ｌＬ６０細ｍ、ａｍ液それぞれ５０μｔに対し
、同培地１００μｔあるいは１２５Ｉ揮識クロａ三ン千 ＴＵ２７抗体（゛　　　法により標Ｒ）溶液１００μｔ
を加え４℃にて２時間放置し之。

反応終了后、オリーブ油とｎ−ブチルフタレートと金１
：４の割合で混合した液を入れたポリグロビレンチ、−
ツに反応懸濁液を重層し、ｉ、ｏｏ。

×ｌにて１０分間遠心して細胞のみを集め、細胞に結合
した１２’　Ｉ−ＴＵ２７抗体ｉ抗体−カクンターにて
測定した。表２に示す様にＴＵ２７抗体は！Ｌ−２受容
体重鎖を発現しているＴＬ−Ｍａｒ　、　ＨＵＴ１０２
．ＭＴ−２およびＭＬＡ−１４４細施などのいずれＫも
結合したが。

ＩＬ−２受容体軽鎖のみを発現しているＭＴ−１および
ＴＬ　−Ｍｌ　ｒ細胞には結合しなかりた。更に、ＩＬ
−２受容体を全く発現していないＭＯＬＴ　−４、Ｊｕ
ｒｋａｔ　。

ｕ６０にも結合しなかった、また、この結合は上記各細
胞を未標識ＴＵ２７抗体と混合し１時間放置したｐｉ　
１２’　Ｉ　−ＴＵ　２７抗体を加えた場合には失なわ
れることから特異的な結合であることが知られた。なお
表ＩＫおける細胞あたフの高親和性又は低親和性ＩＬ２
受与体数は　　Ｉ標１１１Ｌ−２（クロラミンＴ法によ
’）　Ｗ　Ｆ＆　１．５　Ｘ　１０’　ｄｐｍ／　ｐｍ
ｏｌ　）とｌＸｌ０’個の各細胞を１．５時間４℃で反
応させた後、上清と細胞を分け、それぞれの放射活性を
測定し、　５ｃａｔｃｈａｒｄ　Ｐｌｏｔ法で算出した
。

細胞株 ＩＬ−Ｍｅｒ ＭＴ−２ ＵＴ１０２ ＭＴ−Ｉ ＩＬ−Ｈｌｒ ＭＬＡ−１４４ ０ＬＴ−４ Ｊｕｒｋａｔ ＩＬ−６０ 表 ＩＬ−２Ｒ（個数／細胞）ＴＵ２７上２７モノクロナル
抗付合低轡和性　高親和性　　　（個数／細胞）１ａＯ
Ｏ０ ６２０，０００ ４５７，０００ ３７２，０００ ２０８，０００ １，６００ ＜１００ ＜１００ ＜１００ ａ　ｓｏ。

３．５００ ＜１００ ＜１００ ＜１００ 〈ヱ００ ＜１００ ＜　１００ ｓ、ｏｏ。

４．８００ １．９００ ＜１００ ＜１００ 〈１００ ＜Ｚｏ。

＜１００ く参考例、　１２５１ＩＬ−２のＩＩ、−２受容体発現
細胞への結合の阻害活性の測定法〉 ０、３％ウシ血清アルブミンを含むＲＰＭＩ　１６４０
培地ＩＭｌ当り％Ｉ　Ｘ　１０’個となるように懸濁し
たＴＩ、−Ｍａｒ細胞等の細胞Ｍ濁液５ｏμｌとサンプ
ル溶液１００μｌを混合し、４℃にて、１時間放置する
。

次にクロラミン−Ｔ法にて”’Ｉ　５ｆａＬ、たヒトエ
Ｌ−２溶液５０μｌを添加し、４℃にて、１時間放置す
る。更に、オリーブ油とｎ−ブチルフタレートとを１＝
４の割合で混合した液を入れたポリプロピレンチューブ
に反応細胞懸濁液を重層し１．００ｏＩＩ×１０分間遠
心して細胞のみを集め、細胞に結合したＩＨｌ、　−！
、２量をｒ−カウンターにて測定す図１ 図１はＴＵ２７モノクローナル抗体によりてＩＬ−２の
ＴＬ−Ｍｏｒ　Ｉｃ対する高親和性結合のみが抑制され
ることを示し九本のである。

■静妃輪人　官村　知友

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトインターロイキン２受容体の構成成分中の重
   鎖を対応抗原として得られるモノクロナール抗体。
2. （２）モノクローナル抗体がヒトインターロイキン２受
   容体重鎖を発現している細胞を免疫原として免疫した動
   物の抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合して得られた
   ハイブリドーマによって産生される請求項（１）記載の
   モノクローナル抗体。
3. （３）モノクローナル抗体がモノクローナル抗体ＴＵ２
   ７である請求項（１）記載のモノクローナル抗体。
4. （４）請求項（１）ないし（３）のいずれか１項に記載
   のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
5. （５）ハイブリドーマが微工研奇記番号がＦＥＲＭ−Ｐ
   １０５０９である請求項（４）記載のハイブリドーマ。