JPH02196727A - 肝保護作用物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、薬用ニンジンまたはその組織培養物から単離
し得る肝保護作用物質の製造法に関する。

（従来の技術） 薬用ニンジン、例えば、オタネニンジン（Ｐａｎａｘｄ
土ｌ■Ｃ，Ａ、　Ｍｅｙｅｒ）の根は有用漢方薬として
珍重され広く利用されている。薬用ニンジンの薬効とし
ては、古くから強壮、長生などが言われ、現在では抗疲
労作用、抗ストレス作用、整腸作用、利尿作用、新陳代
謝亢進作用などが知られている。

この他に肝保護作用についての知見も得られている。

薬用ニンジンの有効成分としては、サポニン。

サボゲニン、ビタミンＢ群などが知られており。

このうちサポニンは、四塩化炭素、ガラクトサミン、チ
オアセタミドなどの化学物質により引き起こされる肝炎
に有効であることが報告されている。

このように、薬用人参が肝保護作用を有することは知ら
れているが、サポニン以外の物質で肝保護作用を有する
有効成分については全く知られていない。

薬用ニンジンを肝炎に有効な漢方製剤に配合した例とし
ては、特公昭５７−２００３１２号公報の報告がある。

この公報では薬用ニンジンをジオウ、ブクリヨウ、およ
びその他の生薬と共に混合して加熱し、肝炎に有効な漢
方製剤を製造する方法についての開示があるが、薬用ニ
ンジンの肝炎に対する作用は明確にされていない、さら
に、薬用ニンジンに含有される肝保護作用を有する成分
についても全く開示されていない。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の課題を解決するものであり。

その目的とするところは、薬用ニンジンに含有される非
サポニン性の肝保護作用物質を製造する方法を提供する
ことにある。

（課題を解決するための手段） 本発明の肝保護作用物質の製造法は、（ａ）薬用ニンジ
ンもしくはその組織培養物、またはそれらの乾燥物を水
性有機溶媒で抽出する工程；（ｂ）得られた抽出物を有
機溶媒による沈澱処理に供し、上清を採取する工程；お
よび（Ｃ）該上清を吸着クロマトグラフィー用担体を充
填したカラムクロマトグラフィーに供し、有機溶媒系の
溶離液にて溶出する工程；を包含し、そのことにより上
記目的が達成される。

本発明方法に使用される薬用ニンジンとしては。

オタネニンジン（Ｐａ眩Ｉ山ＭＭ　Ｃ，Ａ、間ｅｙｅｒ
）　。

トチバニンジン（ｈ且■ハ肛ｌ陵用Ｃ９＾、Ｍｅｙｅｒ
）　。

アメリカニンジン（Ｐａｎａｘ　　ｕｉｎ　ｕｅｆｏｌ
ｉｕｓ　Ｌ、　）　。

サンシチニンジン（Ｐａｎａｘ　肱助山μＭ（Ｂｕｒｋ
、）Ｆ、Ｈ，Ｃｈｅｎ）　、　　ヒマラヤニンジン（Ｐ
ａ且鯨邦μ瓜虹註■」Ｗａｌｌ、　５ｕｂｓｐ、　ｈｉ
ｍａｌａｉｃｕｓ　Ｈａｒａ）　、球子ニンジン（ｈ且
■、ム旦」１以住Ｃ，Ａ、Ｍｅｙｅｒ　ｖａｒ。

ｍａｊｏｒ　（Ｂｕｒｋ）　Ｃ，Ｙ、Ｗｕ　ｅｔ　Ｋ、
Ｍ、Ｆｅｎｇ）　、　美状三七（Ｐａｎａｘ　ｚｉｎ　
１ｂｅｒｅｎｅｓｉｓ　Ｃ，Ｙ、Ｗｕ　ｅｔ　Ｋ、Ｍ、
Ｆｅｎｇ）　。

屏辺三七（打■ｓｔ’　ｕｌｅａ　ａｔｕｓ　Ｔｓａｉ
　ｅｔ　Ｆｅｎｇ）狭葉竹節９　（Ｐａｎａｘ　ム狸皿
匡皿Ｃ，＾、Ｍｅｙｅｒ　ｖａｒ。

ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓ　（Ｂｕｒｋ）　Ｃｈｅｎ
ｇ　ｅｔ　Ｃｈｕ）などが挙げられる。

本発明方法により非サポニン性の肝保護作用物質を得る
には１例えば、上記薬用ニンジンの根部もしくはその乾
燥物（例えば、白参、紅参などの漢方薬として入手され
得る）が用いられる。薬用ニンジンの組織培養物を使用
することも有効であり、その場合には、該組織培養物は
１通常の方法により調製される１例えば、上記薬用ニン
ジンの組織の一部を、植物ホルモンを含む固体培地上で
無菌的に培養してカルスを発生させ、このカルスを液体
もしくは固体培地上で培養することにより調製される。

特にオタネニンジンの組織培養物が好適に使用される。

本発明方法により肝保護作用物質が、上記薬用ニンジン
またはその組織培養物から１例えば１次の方法により単
離される。まず、薬用ニンジンまたはその組織培養物を
必要に応じて乾燥する。これを水性有機溶媒で抽出する
。水性有機溶媒としてはエタノール、メタノール、アセ
トンなどの水溶性有機溶媒の少なくとも一種を含有する
水溶液が用いられる。水性有機溶媒中の該水溶性有機溶
媒の濃度は、ＪＪＸ料の種類などによって異なるが。

約５０％から約９０％とされる。抽出時に加温したり。

被抽出物である薬用ニンジンやその組織培養物を粉砕す
ると抽出が促進されるため好ましい、抽出時の加温は、
８０℃を越えない温度範囲内で行うのが好ましい。

次いで、上記抽出液をデ過し、減圧濃縮する。

この濃縮液を水に懸濁した後に有機溶媒を加えて沈澱処
理し、上清液を採取する。この沈澱処理により、多糖類
、ポリペプチドなどの高分子化合物が沈澱し、除去され
る。この沈澱処理に用いられる有機溶媒としては、エタ
ノール、メタノール。

アセトンなどの水溶性有機溶媒が挙げられる。上清液は
必要に応じて一過し、減圧濃縮し、これを吸着クロマト
グラフィー用担体を充填したカラムにかけて分画する。

吸着クロマトグラフィー用担体としては１例えば、セラ
イト、シリカゲルなどが用いられる。溶離液としては、
クロロホルム。

ヘキサンおよびベンゼンでなる群から選択される少なく
とも一種と、メタノール、酢酸エチルおよびアセトンで
なる群から選択される少なくとも一種との混液である混
合系有機溶媒が用いられる。

例えば、ヘキサン、クロロホルム、クロロホルム−メタ
ノール（４：　１）混液およびメタノールを順次用いて
溶出することにより、肝保護作用物質がクロロホルム−
メタノール（４：　１）画分に溶出される。この画分を
減圧濃縮し、薄層クロマトグラフィーにより確認すると
、サポニンとは異なる位置にスポットが認められ、非サ
ポニン性の物質であることが確認される。

このようにして得られた非サポニン性物質は。

後述の実施例に示すように、肝保護作用についての検定
を行うと優れた肝保護作用を有することが判明した。−
最に、薬用ニンジンを単に水性有機溶媒で抽出したエキ
スには、低極性画分中に細胞毒性を示す物質が含有され
ているということが知られているが、上記クロマトグラ
フィーにより該物質はヘキサン画分に溶出され、除去さ
れる。そのため、単に水性溶媒で抽出したエキスに比べ
て。

より効果的に肝保護作用を示す物質が得られる。

従って、この非サポニン性物質を用いて、効果的な肝保
護作用を有する薬剤組成物が提供される。

このような薬剤組成物は内服薬としても注射剤としても
投与が可能である。

（実施例） 本発明を以下の実施例につき説明する。

夾旌■］ （Ａ）肝保護作用を有する非サポニン成分の単離オタネ
ニンジン（Ｐａｎａｘ　Ｃ■１ＭＣ，Ａ、　Ｍｅｙｅｒ
　）の根から得た組織の一部を、植物ホルモンを含む寒
天培地で無菌的に培養してカルスを発生させ。

このカルスの液体培養を行なった。得られたカルス（組
織培養物）を乾燥し、　４０ｋｇの乾燥カルスを得た。

この乾燥カルスに５０％エタノール水溶液７２０　　を
加え、７０℃にて１時間加熱・抽出し、抽出液を一過し
た。濾過残滓にさらに５０％エタノール水溶液７２０　
　を加え、上記と同様の加熱・抽出および濾過操作を繰
り返した。得られたＰ液を先のｒ液と合わせ、減圧濃縮
して７４８０　ｇの抽出物を得た。この抽出物９３５ｇ
を５倍量の水に懸濁し、この懸濁液の５倍量のエタノー
ルを加えて一晩放置した。析出した沈澱物を濾過により
除去し、上清液を減圧濃縮した。得られた減圧濃縮物を
、その重量の１．５倍量のセライトに吸着させ、該セラ
イトの１０倍量のセライトとともにカラムに充填し、カ
ラムクロマトグラフィーを行った。溶離液としてカラム
充填物容量の３倍量のヘキサン、クロロホルムおよびク
ロロホルム−メタノール（４：　１）に次いで、５倍量
のメタノールを順次カラムに流すことにより、溶出を行
った。このうち、クロロホルム−メタノール（４：　１
）により溶出された両分を減圧濃縮し、５７ｇの濃縮物
を得た。この濃縮物は下記の検定により、肝保護作用を
有することが明らかとなった。さらに、この濃縮物を薄
層クロマトグラフィーにより確認すると、サポニンとは
異なる位置にスポットが認められ、非サポニン性の物質
であることが判明した。

（Ｂ）肝保護作用の検定 肝保護作用の検定は、マウス初代培養細胞を用いた補体
介在性肝障害試験（木曽良信ら、　ＰｌａｎｔａＭｅｄ
、、　２４１．１９８７）に準じて、以下のようにして
行った。

■肝特異的抗原（ｔｓｐ　）の調製 肝特異的抗原（ＬＳＰ）の調製は、　ＭｃＦａｒｌａｎ
ｅらの方法（ＣＩｉｎ、　Ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
、　’ｌｊ−，３８Ｈ１９７７））に従って行った。ま
ず、　　Ｃ５７ＢＬ１６マウスを脱血した後に肝臓を摘
出し、水冷しな０．２５Ｍシュークロース液（ＰＨ８，
０）を加えてホモジナイズすることにより５０％ホモジ
ネートを調製した。これを４℃にて１０５，０００ｇ、
　６０分間遠心分離し、得られた上滑２０ｍ１を　５ｅ
ｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００カラム（９００ｍｍ内径Ｘ２
５＋＋＋ｍ）にかけた、　ｌｄ　ＥＤＴＡを含有する０
、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０＞で溶出し、１０
１ずつ分取して波長２８０ｒｖ４こおける吸光度を測定
した。最初の吸光度ピーク画分（タンパク画分）をＡｍ
１ｃｏｎ　ｐＨ−３０膜を用いて２０１に濃縮し、　５
ｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂカラム（９００ｍｍ内径Ｘ２５
ｍｎ＋）にかけた、上記と同様のトリス塩酸緩衝液を用
いて１０ｓｌずつ分画し、　２８０ｎｍにおける最初の
吸光度ピーク画分（タンパク画分）をＬＳＰ画分とした
。

■抗旦」【ｌａ皿ｌ 上記０項で調製したＬＳＰ画分５Ｂを等量のフロイント
完全アジュバント（ＦＣ＾）に懸濁した。この懸濁液を
ＮＺＷ系ウサギの背部に皮下投与して初回免疫し、その
３〜４週間後にＬＳＰ画分のみ５ｍｇを皮下投与して追
加免疫した。その後、免疫二重拡散法により血中の抗Ｌ
ＳＰ抗体を測定し、該抗体が検出されるまでＬＳＰ画分
で適宜追加免疫を行った。血中に抗ＬＳＰ抗体が検出さ
れたウサギについては頚動脈から全採血を行い、この血
液を０℃にて一晩放置した後に３．０００ｒｐｍ、　２
０分間遠心分離し、抗ＬＳＰ血清を得た。抗ＬＳＰ血清
の力価を酵素抗体法により測定すると約６．４００倍（
６，４００倍希釈まで検出可能）であった、この抗ＬＳ
Ｐ血清を５６℃にて３０分間インキュベートし、血清中
の補体を不活性化した非働化抗ＬＳＰ血清を調製した。

■標的細胞の調製 Ｃ５７ＢＬ１６マウスの肝細胞をＳｅｇｌｅｎらの方法
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　ｕ、　２
９　（１９７６））に準じて単離した。これを１０％ウ
シ胎児血清を含有するＥａｇｌｅＭＥＮ培地に５　Ｘ　
１０膜個細胞／■ｌの濃度で浮遊させ。

９６ウエルのマイクロタイタープレートに６５μｌずつ
播いて３７℃にて３時間培養した。このマウス初代培養
肝細胞を標的細胞として以下の実験に用いた。

■肝細胞障害抑制作用の測定 上記０項で調製した標的細胞を、上記０項で調製した非
働化抗ＬＳＰ血清０．５％およびモルモットの補体２０
％を含有する培地１００ｍ１に移して３７℃にて２時間
培養し、該細胞に細胞障害反応を惹起させた。細胞障害
の度合の測定は、標的細胞である肝細胞中に存在する酵
素ＧＰＴの培地への漏出活性を。

自動分析器を用いて測定することにより行った。

上記条件下において培地中に検出されるＧＰＴ活性を対
照とし、細胞障害１００％とした。

次いで、上記（Ａ）項で調製した非サポニン性画分の濃
縮物を用いて肝細胞障害抑制作用について調べた。比較
のために、既知の肝保護物質であるグリチルリチンにつ
いても同様に試験した。まず。

非サポニン性画分の濃縮物またはグリチルリチンを、ジ
メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に１１００Ｉ１／ｍｌ
の濃度となるように溶解し、上記と同様の非働化抗ＬＳ
Ｐ血清０．５％およびモルモットの補体２０％を含有す
る培地に１．０００μｇ／ｍｌとなるように添加した。

このようにして調製した培地１００μｌに上記０項で調
製した標的細胞を移し、３７℃にて２時間培養した後、
培地中のＧＰＴ活性を測定した。結果を以下の表１に示
す、対照のＧＰＴ活性と比較した結果は。

グリチルリチンで５１±３％、そして非サポニン性画分
の濃縮物で５５±２％であった。このことから。

非サポニン性画分の濃縮物はグリチルリチンと同程度に
、肝細胞が障害を受けるのを抑制する作用を有すること
が明らかである。

表！ 試　料　　　　　使用濃度　　　肝細胞障害（μｇ／璽
ｌ培地）　　　（％） 対照　　　　　　　　　　０１００±２非サポニン性 成分濃縮物　　　　１．０００　　　　　５５±２゜グ
リチルリチン　　　１．０００　　　　　５１±３゜（
発明の効果） 本発明によれば、このように、薬用ニンジンおよび／ま
たはその組織培養物から肝保護作用を有する新規の非サ
ポニン性成分を容易に単離する方法が提供される０本発
明方法により得られる肝保護作用物質は１例えば、肝炎
の予防薬または治療薬として広く利用され得る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）薬用エンジンもしくはその組織培養物、また
   はそれらの乾燥物を水性有機溶媒で抽出する工程； （ｂ）得られた抽出物を有機溶媒による沈澱処理に供し
   、上清を採取する工程；および （ｃ）該上清を吸着クロマトグラフィー用担体を充填し
   たカラムクロマトグラフィーに供し、有機溶媒系の溶離
   液にて溶出する工程； を包含する、肝保護作用物質の製造法。 ２、前記薬用エンジンがオタネニンジン（￥Ｐａｎａｘ
   ￥ｇｉｎｓｅｎｇ￥Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ）、トチバニン
   ジン（￥Ｐａｎａｘ￥￥ｊａｐｏｎｉｃｕｓ￥Ｃ．Ａ．
   Ｍｅｙｅｒ）、アメリカニンジン（￥Ｐａｎａｘ￥￥ｑ
   ｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍ￥Ｌ．）、サンシチニンジン
   （￥Ｐａｎａｘ￥￥ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ￥（Ｂｕｒ
   ｋ．）Ｆ．Ｈ．Ｃｈｅｎ）、ヒマラヤニンジン（￥Ｐａ
   ｎａｘ￥￥ｐｓｅｕｄｏ−ｇｉｎｓｅｎｇ￥Ｗａｌｌ．
   ｓｕｂｓｐ．ｈｉｍａｌａｉｃｕｓＨａｒａ）、珠子エ
   ンジン（￥Ｐａｎａｘ￥￥ｊａｐｏｎｉｃｕｓ￥Ｃ．Ａ
   ．Ｍｅｙｅｒｖａｒ．ｍａｊｏｒ（Ｂｕｒｋ）Ｃ．Ｙ．
   ＷｕｅｔＫ．Ｍ．Ｆｅｎｇ）、姜状三七（￥Ｐａｎａｘ
   ￥￥ｚｉｎｇｉｂｅｒｅ−￥￥ｎｅｓｉｓ￥Ｃ．Ｙ．Ｗ
   ｕｅｔＫ．Ｍ．Ｆｅｎｇ）、屏辺三七（￥Ｐａｎａｘ￥
   ￥ｓｔｉｐｕｌｅａｎａｔｕｓ￥ＴｓａｉｅｔＦｅｎｇ
   ）および狭葉竹節参（￥Ｐａｎａｘ￥￥ｊａｐｏｎｉｃ
   ｕｓ￥Ｃ．Ａ．Ｍｅｙｅｒｖａｒ．ａｎｇｕｓｔｉｆｏ
   ｌｉｕｓ（Ｂｕｒｋ）ＣｈｅｎｇｅｔＣｈｕ）でなる群
   から選択される、請求項１に記載の製造法。