JPH02195871A - ジオキシゲナーゼおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、新規な微生物、具体的にはシュードモナス（
Ｐ　５ｅｕｄｏ＋ｍｏｎａｓ）属に属する新規な細菌菌
株、スチレン誘導体中のベンゼン環に共役したエチレン
結合に選択的に作用しアルデヒド類に転換せしめる作用
を有するジオキシゲナーゼ及び該ジオキシゲナーゼの製
造方法に関する。

〈従来技術〉 従来、スチレン誘導体中のベンゼン環に共役したエチレ
ン結合に選択的に作用し、アルデヒド類に転換せしめる
作用を有し且つシュードモナス属に属する菌株が産生じ
たジオキシゲナーゼ酵素は知られていないし、またかか
るシュードモナス菌株もまた知られていない。

〈発明が解決しようとする課題〉 本発明の目的は、スチレン誘導体中のベンゼン環に共役
したエチレン結合を選択的に作用し、アルデヒド類に転
換せしめる作用を有するジオキシゲナーゼを提供するこ
とにある。

本発明の他の目的は、シュードモナス（Ｐ　５ｅｕｄ。

ｍｏｎａｓ）属に属する菌株が産生じ且つ上記ジオキシ
ゲナーゼ活性を有する新規な酵素を提供することにある
。

本発明のさらに他の目的は、上記ジオキシゲナーゼ活性
を有する酵素の製造方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、上記ジオキシゲナーゼ活性
を有する酵素を産生ずるシュードモナス属に属する菌株
を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、以下の説明から一層明白と
なるであろう。

〈発明の構成〉 本発明者の研究によれば、上記本発明の目的は、シュー
ドモナス属に属する細菌菌株ＴＭＹ　１００９株および
以下の理化学的性質を有するシュードモナス属に属する
細菌より産生され且つスチレン誘導体中のベンゼン環に
共役したエチレン結合の切断作用を有するジオキシゲナ
ーゼによって達成されることがわかった。

（ａ）　　作用および基質特異性； 本ジオキシゲナーゼは下記一般式［Ｉ］で表わされるス
チレン誘導体中のベンゼン環に共役したエチレン結合に
選択的に作用しアルデヒド類に転換せしめる作用を有す
る。

式中Ｒ，は炭素数１−１０の直鎖もしくは分岐状アルキ
ル基、炭素数６〜ｌＯのアリール基、炭素数５〜１５の
シクロアルキル基、基−ＣＯＯＲ’（ここでＲ１は水素
原子または炭素数１−１０のアルキル基）、ホルミル基
ま但し、上記アルキル基、シクロアルキル基およびアリ
ール基は置換基を有していてもよい、Ｒ８、Ｒ１、Ｒ４
、Ｒ，およびＲ６は、互いに同一もしくは異なり、水素
原子、水酸基もしくはその配糖体、炭素数１〜１０の直
鎖もしくは分岐状アルキル基または炭素数１−１０のア
ルコキシ基を示すか或いはこれら互いに隣接する２つの
基は、　（ＣＨ＊）ｎ−−０（ＣＨ！＋　ｎまたは一〇
　−（ＣＨｔ）　ｎ　Ｏ−であってもよい（ここでｎは
１〜４の整数を示す）。

（ｂ）　　至適ｐＨおよび安定ｐＨの範囲；至適ｐＨ６
〜ｌＯ 安定ｐＨの範囲　６．５〜９，５ （ｃ）　　作用適温の範囲； ｐＨ８，０で２０〜５０℃ （ｄ）　　失活条件； ｐＨ：５以下或いは１２以上 温度二６０℃以上 （ｅ）　　力価の測定 後述する実施例２のａに記載 ＜ｆ）分子量； ５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって 測定された分子量は約５２．０００で あった。またゲル濾過で求められた分 子量は約９４，０００であった。従っ て本ジオキシゲナーゼは分子量が約５ ２．０００の同一サブユニットからな る２量体の酵素であると考えられる。

（ｇ）　　精製方法； 粗酵素液をヒドロキシルアパタイト 処理し、イオン交換クロマトグラフィ ー（ＤＥＡＥ、　　トヨバール）および疎水クロマトグ
ラフィー（ブチルトヨバ ール）を組合せることにより精製され る。

（ｈ）　　阻害、活性化および安定化；酵素反応液に下
記各阻害剤を加えて 酵素活性に与える影響を調べた。酵素 反応条件はｐＨ８，０，５０℃で１０ 分間。阻害剤を加えない場合を１００ とした相対活性で阻害評価した。

阻害剤　　　　濃度（ｎ＋Ｍ）　　　相対酵素活性（％
）ＫＣＮ　　　　　　　　Ｉ　　　　　　　　９３Ｎａ
−ａｚｉｄａ　　　　　１　　　　　　　９７Ｄｉｐｙ
ｒｉｄｉｌｅ　　　　１　　　　　　　９７Ａｓｃｏｒ
ｂａｔｅ　　　　　８　　　　　　　７７さらに本発明
によれば、上記ジオキシゲナーゼを、前記したシュード
モナス属に属する菌株から製造する方法も提供される。

本発明における前記ジオキシゲナーゼは、前記式［Ｉ］
のスチレン誘導体中のベンゼン環に共役したエチレン結
合に選択的に作用し、アルデヒド類に転換せしめる作用
を有している。

かかるエチレン結合の選択的分解によるアルデヒド類の
転換反応を模式的に反応式で表わすと下記の通りとなる
。

ＣＨ−ＣＨ−ヘーハ→−一−−ＣＨＯ＋ＯＨＣ／＼ノー
かくして本発明において、ジオキシゲナーゼ活性とは、
スチレン誘導体中に含まれるエチレン結合が、上記反応
式の如く選択的に酸素添加反応によって分解され２つの
ホルミル基に転換される作用を意味する。

本発明者が知る限り、スチレン誘導体におけるエチレン
結合が、シュードモナス属の成る菌株の産生ずる酵素に
よって上記ジオキシゲナーゼ活性を受けることは全く新
しい知見である。

本発明において、上記ジオキシゲナーゼは、上記活性を
有し且つシュードモナス属に属する菌株より産生される
が、特に好ましくは、シュードモナス属に属する細菌Ｔ
ＭＹ　１００９株が産生ずる酵素である。

このシュードモナス属の細菌ＴＭＹ１００９株は、微工
研へ微工研菌寄第１０３６２号として寄託されている。

かかる細菌ＴＭＹ　１００９株は、新規であり下記蘭学
的性質を有している。

（Ｌと」１朋 １、細胞の形と大きさ：桿菌、０．８Ｘ１．１μ■２、
運動性の有無と鞭毛の着生状態　有り、極鞭毛　１本 ３、ダラム染色法：陰性 各種培地における生育状態 ■　ＬＢ培地平板培養 円形でなめらかなコロニー形成、黄褐色■　肉汁液体培
養 コロニーは円形、表面はスムーズ、色はうすい黄色、光
沢あり ■　肉汁寒天斜面培養 表面はスムーズ、色はうすい黄色、光沢あり、色素拡散
は見られなかった。

■　肉汁液体培養 液表面での生育は認められなかった。液全体かやへ濁っ
ていた。底・部に菌体が沈降していた。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養 全体に小さな画境、ゼラチン液化は認められなかった。

■　リドマスミルク 底部に菌体沈降、ミルクの凝固、液化、ｐＨの変化なし
。

（■ （出　生理学的性質 （１）　　硝酸塩の還元：陰性 （２）色素の生成：カロチノイド　極大吸収４７９．４
５０（４２５）ｎｍ （３）オキシダーゼ：陽性 （４）カタラーゼ：陽性 （５）酸素に対する態度：好気的 （６）０−Ｆテスト：酸化的条件で有機酸生成（７）脱
窒反応：陰性 （８）ＭＲテスト：陰性 （９）ｖｐテスト：陰性 （ｌＯ）インドールの生成：陰性 （１１）　　硫化水素の生成：陰性 （１２）デンプンの加水分塀：陽性 （１３）　　クエン酸の利用 Ｋｏｓｅｒの培地；陰性 Ｃｈｖｉｓｔａｎｓｅｎの培地：陽性 （１４）無機窒素源の利用 硝酸塩：陰性 アンモニウム塩：陽性 Ｌ−アラビノース Ｄ−キ゛レロース Ｄ−グルコース Ｄ−マンノース Ｄ−フラクトース Ｄ−ガラクトース 麦芽糖 ショ糖 乳糖 トレハロース Ｄ−ソルビット Ｄ−マンニット イノジット グリセリン デンプン その他の特徴 グルコン酸の酸化：陰性 ガス生成 ■　アルギニンの分解：陰性 ■　リジンの脱炭酸反応：陰性 ■　オルニチンの脱炭酸反応：陰性 ■　プロトカテキン酸の分解：メタ開裂（１８）その他 Ｔｗｅｅｎの分解 Ｔｗｅｅｎ４０　：　１ｉｆｌ性 丁ｗｅｅｎ６０　：陰性 Ｔｗｅｅｎ８０二陰性 ＤＮａｓｅ　：陽性 ３−ケト乳酸の生ａ：陰性 Ωｍ土豊里１ 温度　　２０−３３℃ ｐＨ５，５〜ｌＯ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ　Ｔｉ＋ａｅ　２７℃ＬＢ培地ＣｐＨ
７−４＞で２　、５　ｈｒｓ （Ｖ炭素化合物の資化性 カテコール ベンゼン 安息香酸 ７エルラ酸　十 ｐ−フマル酸　十 プロトカテキン酸　十 バラハイドロキシ安息香酸　十 バニリン酸　十 グルタミン酸ナトリウム　＋ 本発明におけるシュードモナス属に属する菌株が産生じ
且つ前記したジオキシゲナーゼ活性を有する酵素は、前
記したようにスチレン誘導体中のベンゼンに共役したエ
チレン結合を切断する作用を有しているので、例えば下
記に示した各種スチレン誘導体を分解し、下記アルデヒ
ド類が得られる。その反応例のいくつかを下記に示す。

［バニリン］ ［バニリン１ 素を用いて分解することができる前記スチレン誘導体の
具体例としては下記のものを例示することができる。

なお下記式においてＭｅはメチル基、基０Ｇ１ｕはグル
コシル基を表わすものとする。

［イソオイゲノール］ イソカビコール アネトール Ｃバニリン１ なお上記反応例（２）に示されているように、原料スチ
レン誘導体中に基−Ｑ　−Ｇ　ｌｕが含まれている場合
、生成したアルデヒド頭巾の基−０−Ｇｌｕは、菌株の
培養生成物から分離された酵素中にグリコシダーゼが含
まれていると、この基はその作用に起因すると思われる
水酸基に転換された形として得られる場合がある。

以下本発明のジオキシゲナーゼ活性を有する酵ｐ−クマ
リルアルコール イソオイゲノール コニ７エリルアルコール イソサフロール インラボテン シナビルアルコール アサロン インニレミシン シリンゲン インミリスチシン インアビオール ジルアビオール スチルベン 本発明におけるシュードモナス属に属し且つ前記ジオキ
シゲナーゼ活性を有する酵素を産生し得る菌株、殊に菌
株ＴＭＹ　Ｉ　ＯＯ９株から、目的とする前記酵素を得
るには、それ自体公知のシュードモナス属の菌株が生育
する培地中で菌体を培養し、得られた培地から酵素を分
離すればよい。

以下上記菌株を生育するために使用しうる培地の組成に
ついて説明するが、これは単に説明のためであって、本
発明はこの組成の培地に限定されるわけではない。

炭素源としては、たとえばグルコース、７ラクトースな
どの炭水化物、エタノールのごとき有機化合物、コハク
酸などのごとき有機酸があげられ、これらは本発明の菌
株が利用できる１種または２種以上の炭素化合物を任意
に炭素源として利用できる。

また、窒素源としては、特に限定されないが例えば、硫
酸アンモニウム、硝酸アンモ５ウムなどの無機窒素化合
物、およびペプトンなどの有機窒素源が利用できる。

また、無機塩類としては、各種のリン酸塩、硫酸マグネ
シウムなどが使用できる。さらに、微量の金属（鉄塩、
カルシウム塩など）を培地に含有させてもよい。

培養方法セしては、振とう培養法、深部通気撹拌培養法
などの方法により行なうことができる。

培養温度は、例えば、２０°〜３３℃、ｐＨは６〜ｌＯ
程度の範囲が好ましくあげられる。また培養口数は特に
限定されないがたとえば、通常は１〜７日の範囲で行な
われる。

このようにして酵素が生産蓄積された培養物中の菌体を
超音波処理により破壊して得られる無細胞抽出液を分離
し、得られた無細胞抽出液中の低分子物を除くためにリ
ン酸ナトリウム緩衝液で透析処理することにより酵素液
が得られる。

かくして本発明において前記酵素自体或いはその酵素液
から精製された酵素は前記したジオキシゲナーゼ活性を
有しているので、前記したスチレン誘導体の酸化分解に
利用することができる。

酸化分解は、前記一般式［Ｈのスチレン誘導体と、前述
のジオキシゲナーゼ活性を有する酵素とを媒体中で酵素
が活性を有し得る条件下で接触せしめればよい。

以下実施例を掲げて本発明を詳述する。

実施例（１）　　酵素液の調製 ＩＱの栄養培地（Ｌ　Ｂ）でＴＭＹ　Ｉ　ＯＯ９株を約
２２時間好気的に２７℃で振とう培養することにより湿
菌体約３．５ｇが得られた。菌体を集菌、洗浄後１５ｍ
Ｑの５０１１μＭリン酸ナトリウム緩衝液に懸濁した後
、超音波処理することにより菌体を破壊し、遠心分離処
理した（１０．０００刈ｇ１２０ｗｉｎ）。得られた無
細胞抽出液中の低分子物を除くために２０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７，５）で透析を行ない粗酵素液
とした（タンパク濃度：　ｌ　５　、４　ｍｇ／　ｍ＋
２）。

実施例（２）バニリンの製法 ａ、インオイゲノールｌｐｍｏｆｆを含む４５０／７１
２の緩衝液（ｐＨ７，５）に酵素液（１５，４ｍｇ／ｍ
ｆｆ）を５０μα加え２６℃で３０分間インキュベート
する。５０μａのＩＮ　　ＨＣＱを加え酸性にしたのち
、５００μｇの酢酸エチルで抽出する。抽出液をＨＰＬ
Ｃで定量分析した結果、０．１６μｍｏＲのバニリンを
認めた。

ＨＰＬＣの測定条件 機　種；Ｓｈｉｍａｄｚｕ　　ＬＣ−６Ａカラム；Ｌｉ
Ｃｈｒｏｓｏｒｂ　　ＲＰ−１８（４，６Ｘ２５０　ｍ
ｍ） 溶　出、０．０５％リン酸水（Ａ）／アセトニトリル（
Ｂ）　−７０／３０−−−　（５分間）　−−−（Ａ）
　／　（Ｂ）　−７０／３０−−一（ｉｎｃｒｅａｓｉ
ｎｇ５％（Ｂ）ｐｅｒ　ｍ１ｒ）−−−（Ａ）　／　（
Ｂ）　−０／１００ 上記におけるバニリンの保持時間は６．１分す、実施例
ａと同じ条件下に基質としてイソラボテア１ｐｎ＋ｏ（
２を用イテ行った結果、０．１６μｎ＋ｏＱのバニリン
を認めた。また３、５−ジヒドロキシベンズアルデヒド
も認められた。

実施例（３）バニリンの製法 ａ　、５−　［２’−（４”−ヒドロキシ−３′−メト
キシフェニル）ビニル］７エルラ酸１．２μｌｌ１ＯＱ
ヲ含ム９５０μαのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，
５）に酵素液（１５，４ｍｇ／＋＋＋Ｑ）５０　μｍ２
加え２７°Ｃで３０分間インキュベートしｔ；。酸素１
μ＋ｎｏ（２が消費された時点で反応を止めた。この反
応生成物を１０００μｇの酢酸エチルで抽出し、ＨＰＬ
Ｃで定量分析した結果、１ｐｆｆｌＯＱのバニリンと１
μｍｏｆｆの５−ホルミルフェルラ酸を認めＩ；。ＨＰ
ＬＣの測定条件は、実施例（２）のａと同条件で測定。

ｂ、実施例（２）のａと同じ条件下に１．２−ビス−（
４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）エチレン１μ
ｒａｏＱを用いて反応し、酸素０．５４μｍｏＱが消費
された時点で反応を止めた。この反応生成物を１０００
μＱの酢酸エチルで抽出し、ＨＰＬＣで定量分析した結
果、ｌ　−１ｐ　ｒｌｌｏｎのバニリンを認めｔこ　。

実施例（４）　ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドの製造 実施例（２）のａと同じ条件下に基質としてピッイドｌ
ＩＩｍｏｆｆを用いて行った。ＨＰＬＣで定量分析した
結果、０．１６μｍｏ１２のｐ−ヒドロキシベンズアル
デヒドを認めた。

ＨＰＬＣの測定条件は、実施例（２）のａと同じ条件で
行った。

実施例（５）　ジヒドロキシベンズアルデヒドの製造 実施例（２）のａと同じ条件下に基質としてアストリジ
ン１μｍｏ１２を用いて行った。ＨＰＬＣで定量分析し
た結果、０．０２６μｍｏ１２のジヒドロキシベンズア
ルデヒドを認めた。ＨＰＬＣの測定条件は、実施例（２
）のａと同じ条件で行った。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、シュードモナス属に属する細菌菌株ＴＭＹ１００９
   株。 ２、以下の理化学的性質を有するシュードモナス属に属
   する細菌より産生され且つスチレン誘導体中のベンゼン
   環に共役したエチレン結合の切断作用を有するジオキシ
   ゲナーゼ。 （ａ）作用および基質特異性； 本ジオキシゲナーゼは下記一般式［ I ］で表わされる
   スチレン誘導体中のベンゼン環に共役したエチレン結合
   に選択的に作用しアルデヒド類に転換せしめる作用を有
   する。 ▲数式、化学式、表等があります▼［ I ］ 式中Ｒ＿１は炭素数１〜１０の直鎖もしくは分岐状アル
   キル基、炭素数６〜１０のアリール基、炭素数５〜１５
   のシクロアルキル基、基−ＣＯＯＲ＾１（ここでＲ＾１
   は水素原子または炭素数１〜１０のアルキル基）、ホル
   ミル基または基▲数式、化学式、表等があります▼を示
   す。 但し、上記アルキル基、シクロアルキル基およびアリー
   ル基は置換基を有していてもよい、Ｒ＿２、Ｒ＿３、Ｒ
   ＿４、Ｒ＿５およびＲ＿６は、互いに同一もしくは異な
   り、水素原子、水酸基もしくはその配糖体、炭素数１〜
   １０の直鎖もしくは分岐状アルキル基または炭素数１〜
   １０のアルコキシ基を示すか或いはこれら互いに隣接す
   る２つの基は、−（ＣＨ＿２）＿ｎ−、▲数式、化学式
   、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があり
   ます▼であつ てもよい（ここでｎは１〜４の整数を示す）。 （ｂ）至適ｐＨおよび安定ｐＨの範囲； 至適ｐＨ６〜１０ 安定ｐＨの範囲６．５〜９．５ （ｃ）作用適温の範囲； ｐＨ８．０で２０〜５０℃ （ｄ）失活条件； ｐＨ：５以下或いは１２以上 温度：６０℃以上 （ｅ）力価の測定 後述する実施例２のａに記載 （ｆ）分子量： ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によつて 測定された分子量は約５２，０００で あつた。またゲル濾過で求められた分 子量は約９４，０００であつた。従つ て本ジオキシゲナーゼは分子量が約５ ２，０００の同一サブユニットからな る２量体の酵素であると考えられる。 （ｇ）精製方法： 粗酵素液をヒドロキシルアパタイト 処理し、イオン交換クロマトグラフィ −（ＤＥＡＥ、トヨパール）および疎 水クロマトグラフィー（ブチルトヨパ ール）を組合せることにより精製され る。 （ｈ）阻害、活性化および安定化； 酵素反応液に下記各阻害剤を加えて 酵素活性に与える影響を調べた。酵素 反応条件はｐＨ８．０、５０℃で１０ 分間。阻害剤を加えない場合を１００ とした相対活性で阻害評価した。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ３、シュードモナス属に属し且つスチレン誘導体中のベ
   ンゼン環に共役したエチレン結合の切断作用を有するジ
   オキシゲナーゼを生産する能力を有する菌株を、それが
   生育し得る培地中で培養し、得られた培養物より、該ジ
   オキシゲナーゼを採取することを特徴とする特許請求の
   範囲第２項記載のジオキシゲナーゼの製造方法。 ４、該菌株がシュードモナス属に属する細菌菌株ＴＭＹ
   １００９株である特許請求の範囲第２項記載のジオキシ
   ゲナーゼの製造方法。