JPH02167088A - バキユロウイルス転移ベクター - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
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- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N2710/00011—Details
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-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はバキュロウィルス転移ベクターおよびその使用
に関する。
に関する。
バキュロウィルスベクター系は、原核生物および真核生
物、両遺伝子の発現に使用されてきた。
物、両遺伝子の発現に使用されてきた。
これらの遺伝子の発現は、バキュロウィルス、とくにＮ
山庭肛匡ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ （夜蛾科昆虫の１種
）核多角体ウィルス（ＡｃＮＰＶ ）のポリへドリンプ
ロモーターによって制限される。異種遺伝子はそれを導
入した組換えバキュロウィルスを感染させた培養昆虫細
胞内で発現される。
山庭肛匡ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ （夜蛾科昆虫の１種
）核多角体ウィルス（ＡｃＮＰＶ ）のポリへドリンプ
ロモーターによって制限される。異種遺伝子はそれを導
入した組換えバキュロウィルスを感染させた培養昆虫細
胞内で発現される。
組換えバキュロウィルスを得るには、バキュロウィルス
転移ベクターが使用される。このベクターはポリへドリ
ンプロモーターを包含する。ポリヘドリン遺伝子に隣接
するバキュロウィルスＤＮＡが配置される。ベクターの
残部は通常、バクテリアプラスミドからのＤＮＡで構成
する。異種遺伝子は、転移ベクターのポリへドリンプロ
モーターの下流に、その発現がこのプロモーターで制御
されるように挿入される。
転移ベクターが使用される。このベクターはポリへドリ
ンプロモーターを包含する。ポリヘドリン遺伝子に隣接
するバキュロウィルスＤＮＡが配置される。ベクターの
残部は通常、バクテリアプラスミドからのＤＮＡで構成
する。異種遺伝子は、転移ベクターのポリへドリンプロ
モーターの下流に、その発現がこのプロモーターで制御
されるように挿入される。
異種遺伝子を含有する転移ベクターとバキュロウィルス
をついで、バキュロウィルスに感染しやすい昆虫細胞に
コトランスフエクションさせる。
をついで、バキュロウィルスに感染しやすい昆虫細胞に
コトランスフエクションさせる。
通常は鍮頭■必胆色玉虫叫垣培養細胞が用いられる。こ
れにより、異種遺伝子の上流および下流に転移ベクター
内１クイルスＤＮＡおよび相当するバキュロウィルスの
ＤＮＡを含む同種組換えが起こる。
れにより、異種遺伝子の上流および下流に転移ベクター
内１クイルスＤＮＡおよび相当するバキュロウィルスの
ＤＮＡを含む同種組換えが起こる。
したがって、異種遺伝子とそのポリへドリンプロモータ
ーがバキュロウィルスに移される。組換えバキュロウィ
ルスを培養すると異種遺伝子が発現する。
ーがバキュロウィルスに移される。組換えバキュロウィ
ルスを培養すると異種遺伝子が発現する。
バキュロウィルス転移ベクターには２種類のタイプがあ
る。第１の転移ベクターでは、異種遺伝子は、ポリヘド
リンの翻訳開始ＡＴＧコドンの下流に設けられた制限部
位にクローン化される。このような転移ベクターでは、
異種遺伝子の生成物がポリへドリンベプチドのＮ末端部
分に融合した融合蛋白質が得られる。
る。第１の転移ベクターでは、異種遺伝子は、ポリヘド
リンの翻訳開始ＡＴＧコドンの下流に設けられた制限部
位にクローン化される。このような転移ベクターでは、
異種遺伝子の生成物がポリへドリンベプチドのＮ末端部
分に融合した融合蛋白質が得られる。
第２の転移ベクターは、ポリヘドリン遺伝子の５′非翻
訳リーダーがポリヘドリンの天然Ａ’ｌ’Ｇ 翻訳コド
ンの前にあって、次に制限部位が設けられている。この
ような転移ベクターには、５′非翻訳Ｊ−ダーが天然ポ
リヘドリンＡＴＧの８塩基上流で終わるｐＡｃ ３７３
がある。制限部位にクローン化された遺伝子は、それが
ＡＴＧを含み、ついで所望の生成物をコードする読み取
り枠に連結していれば、成熟蛋白質として発現する。
訳リーダーがポリヘドリンの天然Ａ’ｌ’Ｇ 翻訳コド
ンの前にあって、次に制限部位が設けられている。この
ような転移ベクターには、５′非翻訳Ｊ−ダーが天然ポ
リヘドリンＡＴＧの８塩基上流で終わるｐＡｃ ３７３
がある。制限部位にクローン化された遺伝子は、それが
ＡＴＧを含み、ついで所望の生成物をコードする読み取
り枠に連結していれば、成熟蛋白質として発現する。
本発明は、異種遺伝子をクローン化できる制限部位をポ
リヘドリンＮ末端部暗号配列の短距離下流に設け、ポリ
ヘドリン遺伝子の天然ＡＴＧ翻訳開始コドンは設けず、
制限部位の前部のＮ末端ポリヘドリン暗号配列は残して
も翻訳されないようにしたバキュロウィルス転移ベクタ
ーを提供するものである。
リヘドリンＮ末端部暗号配列の短距離下流に設け、ポリ
ヘドリン遺伝子の天然ＡＴＧ翻訳開始コドンは設けず、
制限部位の前部のＮ末端ポリヘドリン暗号配列は残して
も翻訳されないようにしたバキュロウィルス転移ベクタ
ーを提供するものである。
すなわち、本発明のバキュロウィルス転移ベクターには
、ポリヘドリンの天然ＡＴＧ翻訳コドンの位置に非暗号
配列を設ける。ポリヘドリン暗号配列のＮ末端部は翻訳
されないで、リーダー配列の延長としての役割を果たす
ことになる。これにより、成熟蛋白質の発現に有益な、
ポリヘドリンのＮ末端部暗号配列に帰因するＤＮＡ配列
情報を残している、有用な新しいバキュロウィルス転移
ベクターが得られる。本発明は、ＡＴＧ開始コドンをも
つ異種遺伝子をこの転移ベクターの制限部位にクローン
化すると、その異種遺伝子を高収率に発現できることを
発見し、完成されたものである。発現生成物は、残った
Ｎ末端ポリへドリンアミノ酸が導入された融合蛋白質の
形ではない。
、ポリヘドリンの天然ＡＴＧ翻訳コドンの位置に非暗号
配列を設ける。ポリヘドリン暗号配列のＮ末端部は翻訳
されないで、リーダー配列の延長としての役割を果たす
ことになる。これにより、成熟蛋白質の発現に有益な、
ポリヘドリンのＮ末端部暗号配列に帰因するＤＮＡ配列
情報を残している、有用な新しいバキュロウィルス転移
ベクターが得られる。本発明は、ＡＴＧ開始コドンをも
つ異種遺伝子をこの転移ベクターの制限部位にクローン
化すると、その異種遺伝子を高収率に発現できることを
発見し、完成されたものである。発現生成物は、残った
Ｎ末端ポリへドリンアミノ酸が導入された融合蛋白質の
形ではない。
制限部位は、ポリヘドリンのＮ末端部暗号配列の下流、
短距離内のバキュロウィルス転移ベクター中に設けられ
る。制限部位は、ポリヘドリンのＮ末端領域暗号配列の
最初の２４〜５ｏ塩基の後に、たとえば最初の２７〜３
９塩基の後に設けることができる。さらに特定すると、
この部位は最初の約３３塩基の後に設けられる。たとえ
ばＢａｍＨＩリンカ−が挿入される。
短距離内のバキュロウィルス転移ベクター中に設けられ
る。制限部位は、ポリヘドリンのＮ末端領域暗号配列の
最初の２４〜５ｏ塩基の後に、たとえば最初の２７〜３
９塩基の後に設けることができる。さらに特定すると、
この部位は最初の約３３塩基の後に設けられる。たとえ
ばＢａｍＨＩリンカ−が挿入される。
天然ＡＴＧポリヘドリン翻訳開始コドンは非暗号情報に
変えられる。開始コドンを任意の他の３ヌクレオチド連
鎖で置き換えることができる。好ましくは、天然ＡＴＧ
コドン中の１個の塩基を変更する。さらに好ましくは、
コドンの３番目の塩基を変更する。すなわち、ＡＴＧを
ＡＴＡ 、 Ａｆｒ 、またはとくにＡＴＣに変える。
変えられる。開始コドンを任意の他の３ヌクレオチド連
鎖で置き換えることができる。好ましくは、天然ＡＴＧ
コドン中の１個の塩基を変更する。さらに好ましくは、
コドンの３番目の塩基を変更する。すなわち、ＡＴＧを
ＡＴＡ 、 Ａｆｒ 、またはとくにＡＴＣに変える。
その結果、ポリヘドリンのＮ末端部暗号配列の発現は起
こらず、制限部位に挿入された配列内で遭遇する最初の
ＡＴＧで発現が開始される。この場合、ポリヘドリンの
Ｎ末端部暗号配列内にあるＤＮＡ配列情報自体は、異種
遺伝子の高い発現に寄与するものと考えられる。
こらず、制限部位に挿入された配列内で遭遇する最初の
ＡＴＧで発現が開始される。この場合、ポリヘドリンの
Ｎ末端部暗号配列内にあるＤＮＡ配列情報自体は、異種
遺伝子の高い発現に寄与するものと考えられる。
好ましい転移ベクターはｐＡｃ ３６ Ｃである。これ
は、転移ベクターｐＡｃ ３６０（Ｓｕｍｍｅｒｓ ＆
Ｓｍ１ｔｈ。
は、転移ベクターｐＡｃ ３６０（Ｓｕｍｍｅｒｓ ＆
Ｓｍ１ｔｈ。
１９８７ ”Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒ ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｓ ａ
ｎｄ Ｉｎ５ｅｃｔ Ｃｅ１ｌ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｐｒ
ｏｃｅｄｕｒｅ” ）から、ｐＡｃ ３６０内のポリヘ
ドリンのＡＴＧ翻訳コドンをＡＴＣに変換する特定部位
の突然変異によって構築された。
ｆｏｒ ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｓ ａ
ｎｄ Ｉｎ５ｅｃｔ Ｃｅ１ｌ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｐｒ
ｏｃｅｄｕｒｅ” ）から、ｐＡｃ ３６０内のポリヘ
ドリンのＡＴＧ翻訳コドンをＡＴＣに変換する特定部位
の突然変異によって構築された。
ポリヘドリンのＮ末端部暗号配列が翻訳される本発明の
バキュロウィルス転移ベクターは、異種遺伝子をクロー
ン化できる制限部位がポリヘドリンのＮ末端部の暗号配
列の短距離下流に設けられたバキュロウィルス転移ベク
ターのポリへドロンの天然ＡＴＧ翻訳開始コドンを非暗
号配列に変異させることによって構築することができる
。この変異は通常、特定部位の突然変異によって達成さ
れる。突然変異、好ましくは点変異は、所望の配列から
なる合成オリゴヌクレオチドを用いて導入することがで
きる。
バキュロウィルス転移ベクターは、異種遺伝子をクロー
ン化できる制限部位がポリヘドリンのＮ末端部の暗号配
列の短距離下流に設けられたバキュロウィルス転移ベク
ターのポリへドロンの天然ＡＴＧ翻訳開始コドンを非暗
号配列に変異させることによって構築することができる
。この変異は通常、特定部位の突然変異によって達成さ
れる。突然変異、好ましくは点変異は、所望の配列から
なる合成オリゴヌクレオチドを用いて導入することがで
きる。
異種遺伝子が導入された組換えバキュロウィルスは、上
記転移ベクターから （ａ） 翻訳開始コドンを有する異種遺伝子をバキュ
ロウィルス転移ベクターの制限部位にクローニングし、 （ｂ） 工程（ａ）で得られた組換えバキュロウィル
ス転移ベクターと無傷の野生型バキュロウィルスＤＮＡ
で、バキュロウィルスに感染されやすい昆虫の細胞をコ
トランスフエクシヨンする、ことによって誘導される。
記転移ベクターから （ａ） 翻訳開始コドンを有する異種遺伝子をバキュ
ロウィルス転移ベクターの制限部位にクローニングし、 （ｂ） 工程（ａ）で得られた組換えバキュロウィル
ス転移ベクターと無傷の野生型バキュロウィルスＤＮＡ
で、バキュロウィルスに感染されやすい昆虫の細胞をコ
トランスフエクシヨンする、ことによって誘導される。
異種遺伝子は、工程（ａ）において、ポリへドリンプロ
モーターの転写制御下にあるようにバキュロウィルス転
移ベクターにクローニングされる。工程（ｂ）において
は、通常、顕面■煙胆世胆虫四垣昆虫細胞系の細胞をコ
トランスフエクシヨンする。
モーターの転写制御下にあるようにバキュロウィルス転
移ベクターにクローニングされる。工程（ｂ）において
は、通常、顕面■煙胆世胆虫四垣昆虫細胞系の細胞をコ
トランスフエクシヨンする。
同種組換えにより、異種遺伝子とウィルスＤＮＡの隣接
部分がバキュロウィルスＡｃＮＰＶに転移される。組換
えバキュロウィルスは、たとえばプラークアッセイによ
ってスクリーニングし、精製する。
部分がバキュロウィルスＡｃＮＰＶに転移される。組換
えバキュロウィルスは、たとえばプラークアッセイによ
ってスクリーニングし、精製する。
異種遺伝子によってコードされた生成物を得るためには
、バキュロウィルスの感染を受けやすい細胞を組換えバ
キュロウィルスで感染させ、培養する。この場合も、通
常珈堕ｍ胆色面匹胆昆虫細胞系の細胞が利用される。異
種遺伝子はポリへドリンプロモーターの転写制御下にあ
るので、高収量の遺伝子生成物が得られる。
、バキュロウィルスの感染を受けやすい細胞を組換えバ
キュロウィルスで感染させ、培養する。この場合も、通
常珈堕ｍ胆色面匹胆昆虫細胞系の細胞が利用される。異
種遺伝子はポリへドリンプロモーターの転写制御下にあ
るので、高収量の遺伝子生成物が得られる。
この方法で、原核生物でも真核生物でも、任意の遺伝子
を発現できる。たとえば、ヒトγ−インターフェロンや
サイトメガロウィルス合成前蛋白質の細胞内成熟型を発
現させることができる。本発明者らはまた、主として、
（ｉ）ケメラ（ｃｈａｅｍｅｒｉｃ ）蛋白質のＮ末端
にＰ、 ｆａｌｃｉ ａｒｕｍの主要メロゾイト表面抗
原への前駆体（ＰＭＭＳＡ）のシグナル配列、（ｉｉ）
所望により、Ｐ、 ｆａｌｃｉ ａｒｕｍのサーカムス
ボロゾイト蛋白質（Ｃ８Ｐ ）の少なくとも１個のエピ
トープ、および（ｉｉｉ） Ｐ、 ｆａｌｃｉ ａｒｕ
ｍのＰＭＭＳＡのＣ末端フラグメント（Ｃ末端アンカー
配列を含んでも含まなくてもよい）からなるケメラ蛋白
質を発現させることに成功した。
を発現できる。たとえば、ヒトγ−インターフェロンや
サイトメガロウィルス合成前蛋白質の細胞内成熟型を発
現させることができる。本発明者らはまた、主として、
（ｉ）ケメラ（ｃｈａｅｍｅｒｉｃ ）蛋白質のＮ末端
にＰ、 ｆａｌｃｉ ａｒｕｍの主要メロゾイト表面抗
原への前駆体（ＰＭＭＳＡ）のシグナル配列、（ｉｉ）
所望により、Ｐ、 ｆａｌｃｉ ａｒｕｍのサーカムス
ボロゾイト蛋白質（Ｃ８Ｐ ）の少なくとも１個のエピ
トープ、および（ｉｉｉ） Ｐ、 ｆａｌｃｉ ａｒｕ
ｍのＰＭＭＳＡのＣ末端フラグメント（Ｃ末端アンカー
配列を含んでも含まなくてもよい）からなるケメラ蛋白
質を発現させることに成功した。
これらの成分間にはアミノ酸残基３０個までの短い連結
配列があってもよい。これらのワクチンとして有用なケ
メラ蛋白質は、正しいコンホーメーションで発明された
。Ｃ８Ｐエピトープ（ｉｉ）は、テトラペプチド配列Ａ
ｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏの３〜５０個、たとえば
１６〜３０個のリピートからなることが好ましい。
配列があってもよい。これらのワクチンとして有用なケ
メラ蛋白質は、正しいコンホーメーションで発明された
。Ｃ８Ｐエピトープ（ｉｉ）は、テトラペプチド配列Ａ
ｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏの３〜５０個、たとえば
１６〜３０個のリピートからなることが好ましい。
以下に本発明を実施例によって説明する。第１図は、実
施例においてその部分を使用したＰＭＭＳＡおよびＣ８
Ｐ遺伝子、ならびに実施例で使用した合成リンカ−を示
す。以下の制限部位：Ａ−ＡｌｕＩ。
施例においてその部分を使用したＰＭＭＳＡおよびＣ８
Ｐ遺伝子、ならびに実施例で使用した合成リンカ−を示
す。以下の制限部位：Ａ−ＡｌｕＩ。
Ｂ−ＢａｍＨＩ 、 Ｈ−Ｈｉｎｄｌｌｌ 、 Ｐ−Ｐ
ｓｔ Ｉ 、 Ｔ−ＴｔｈｌＩＩおよびＸ −Ｘｈｏ
ＩＩを表示する。Ａはアンカー配列、Ｓはシグナル配列
である。
ｓｔ Ｉ 、 Ｔ−ＴｔｈｌＩＩおよびＸ −Ｘｈｏ
ＩＩを表示する。Ａはアンカー配列、Ｓはシグナル配列
である。
第２図は、組換え転移ベクターならびに例２および３の
各組換えバキュロウィルスを得るのに用いた溝造遺伝子
を示す。
各組換えバキュロウィルスを得るのに用いた溝造遺伝子
を示す。
第３図は、例５において３５３−メチオニン標識によっ
て得られたオートラジオグラフである。
て得られたオートラジオグラフである。
第４図は、例５におけるクーマツシーブルー染色の結果
である。
である。
第５図は、例６におけるクーマツシープルー染色の結果
である。
である。
例１：転移ベクター Ａｃ３６Ｃの構築中云移ベクター
ｐＡｃ ３６ ＣはｐＡｃ ３６０ （Ｓｕｍｍｅｒｓ
＆Ｓｍ１ｔｈ、 １９８７． ”Ａ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｌ３ａｃｕｌｏｖｉｒ
ｕｓＶｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎ５ｅｃｔ Ｃｅ１ｌ
Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ”）から、Ａｎ
ｇｌｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ａｎｄ Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより人手したキットを
用いた特定部位の突然変異によって８秀導された。ヒト
γ−インターフェロンの８５２ｂｐ ｃＤＮＡをＢａｍ
ＨＩフラグメントとしてｐＡｃ ３６０のＢａｍＨＩに
ザブクローニングした。これから、ポリヘドリンＡＴＧ
翻訳コドンの上流約７００ｂｐよりγ−インターフェロ
ンＣＤＮＡ挿入体の５′末端の内側３００ ｂｐまでの
１ｋＤドラールフラグメントをＭ １３ Ｋ １９ （
Ａｎｇｌｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ）のＳｍａＩ部位に
サブクローニングした。構築体のＲＦ型を用いてリゲー
ションを確認し、−本鎖鋳型を誘導し、１９マー： Ｇ
ＡＡＴＡＡＴＣＣＧＧＧＡＴＡＴＴＴＡで変異を起こさ
せた。
ｐＡｃ ３６ ＣはｐＡｃ ３６０ （Ｓｕｍｍｅｒｓ
＆Ｓｍ１ｔｈ、 １９８７． ”Ａ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｌ３ａｃｕｌｏｖｉｒ
ｕｓＶｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎ５ｅｃｔ Ｃｅ１ｌ
Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ”）から、Ａｎ
ｇｌｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ａｎｄ Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより人手したキットを
用いた特定部位の突然変異によって８秀導された。ヒト
γ−インターフェロンの８５２ｂｐ ｃＤＮＡをＢａｍ
ＨＩフラグメントとしてｐＡｃ ３６０のＢａｍＨＩに
ザブクローニングした。これから、ポリヘドリンＡＴＧ
翻訳コドンの上流約７００ｂｐよりγ−インターフェロ
ンＣＤＮＡ挿入体の５′末端の内側３００ ｂｐまでの
１ｋＤドラールフラグメントをＭ １３ Ｋ １９ （
Ａｎｇｌｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ）のＳｍａＩ部位に
サブクローニングした。構築体のＲＦ型を用いてリゲー
ションを確認し、−本鎖鋳型を誘導し、１９マー： Ｇ
ＡＡＴＡＡＴＣＣＧＧＧＡＴＡＴＴＴＡで変異を起こさ
せた。
下線を施したＧはポリヘドリン翻訳コドンのＡＴＧをＡ
ＴＣに変換する作用を有する。突然変異はＤＮＡ配列決
定で確認し、突然変異を包含する１３６ｂｐ ＥｃｏＲ
Ｖ −ＢａｍＨＩフラグメントを用いてｐＡｃ３６０中
の同じフラグメントを突然変異フラグメントに置換し、
ｐＡｃ ３６ Ｃを誘導した。
ＴＣに変換する作用を有する。突然変異はＤＮＡ配列決
定で確認し、突然変異を包含する１３６ｂｐ ＥｃｏＲ
Ｖ −ＢａｍＨＩフラグメントを用いてｐＡｃ３６０中
の同じフラグメントを突然変異フラグメントに置換し、
ｐＡｃ ３６ Ｃを誘導した。
例２：Ａｃ３６Ｃから誘導される組換え転移ベクターの
溝築 組換え転移ベクターｐｓ ４２を３工程で構築した。
溝築 組換え転移ベクターｐｓ ４２を３工程で構築した。
第１に、ｐＰｆｃ １０２８ （Ｈｏ１ｄｅｒほか：
Ｎａｔｕｒｅ、 ３１７ ：２７０〜２７３．１９８５
）の１．４ｋｂ ＸｈｏＩＩ ／ＢｇｌＩＩフラグメン
トをｐＡｃ ３６ ＣのＢａｍＨＩ部位にクローニング
して、ｐＡｃ ３６ Ｃ４２を調製した。第２に、ＰＭ
ＭＳＡのＮ末端から１２０塩基対フラグメントを、ｐＰ
ｆｃ １０１７（Ｈｏ１ｄｅｒほか、１９８５ ）から
、ＨｉｎｄｌＩＩとＡｌｕ Ｉ消化によって切り出した
。このフラグメントは、短い１２塩基対リーダー、翻訳
開始コドン、１８アミノ酸残基ＰＭＭＳＡシグナルペプ
チド、およびＰＭＭＳＡのＮ末端からの１５個の付加的
アミノ酸を含有する。
Ｎａｔｕｒｅ、 ３１７ ：２７０〜２７３．１９８５
）の１．４ｋｂ ＸｈｏＩＩ ／ＢｇｌＩＩフラグメン
トをｐＡｃ ３６ ＣのＢａｍＨＩ部位にクローニング
して、ｐＡｃ ３６ Ｃ４２を調製した。第２に、ＰＭ
ＭＳＡのＮ末端から１２０塩基対フラグメントを、ｐＰ
ｆｃ １０１７（Ｈｏ１ｄｅｒほか、１９８５ ）から
、ＨｉｎｄｌＩＩとＡｌｕ Ｉ消化によって切り出した
。このフラグメントは、短い１２塩基対リーダー、翻訳
開始コドン、１８アミノ酸残基ＰＭＭＳＡシグナルペプ
チド、およびＰＭＭＳＡのＮ末端からの１５個の付加的
アミノ酸を含有する。
これをＨｉｎｄｌｌＩとＨｉｎｄ ＩＩで消化したｐＵ
Ｃ９中にサブクローニングし、ついでＨｉｎｄｌＩＩ
／ ＢａｍＨＩフラグメントとして切り出した。Ｂａｍ
ＨＩ部位はｐＵＣ９ポリリンカーによって与えられたも
のである。最終クローニング工程では、この１２０塩基
対ＢａｍＨＩ ／ ＨｉｎｄｌｌＩフラグメントを、同
じく融合体中に正しい読み取り枠で存在する合成１０塩
基月Ｈｉｎｄｌｌｌ ／ ＢａｍＨＩリンカ−とともに
、ｐ３６−Ｃ４２の唯一のＢａｍＨＩ部位にクローニン
グした。このノンカーは第１図に示す。ポリへドリンプ
ロモーターの制御下にｐｓ ４２に導入された遺伝子を
第之図に示す。
Ｃ９中にサブクローニングし、ついでＨｉｎｄｌＩＩ
／ ＢａｍＨＩフラグメントとして切り出した。Ｂａｍ
ＨＩ部位はｐＵＣ９ポリリンカーによって与えられたも
のである。最終クローニング工程では、この１２０塩基
対ＢａｍＨＩ ／ ＨｉｎｄｌｌＩフラグメントを、同
じく融合体中に正しい読み取り枠で存在する合成１０塩
基月Ｈｉｎｄｌｌｌ ／ ＢａｍＨＩリンカ−とともに
、ｐ３６−Ｃ４２の唯一のＢａｍＨＩ部位にクローニン
グした。このノンカーは第１図に示す。ポリへドリンプ
ロモーターの制御下にｐｓ ４２に導入された遺伝子を
第之図に示す。
第２の組換え転移ベクターｐＳ０２６４２は３種のフラ
グメント、すなわちｐＰＣ２６４２の構築に使用した１
、１５ ｋｂ ＢａｍＨＩ ／ Ｐｓｔ Ｉフラグメン
ト、２．２ｋｂ Ｘｈｏ Ｉ／ＢａｍＨＩフラグメント
、ならびにＰｓｔ ＩとＸｈｏ Ｉ消化およびＢａｍＨ
Ｉ部分消化でｐｓ ４２がら切り出した７ ｋｂ Ｘｈ
ｏ Ｉ ／ Ｐｓｔ Ｉフラグメントのリゲーションで
構築された。ｐＰＣ２６４２は次のようにして構築され
た。（ｉ）組換え転移ベクターｐｐ ４２は、Ｈｉｎｄ
ｌＩＩ消化によるｐＰｆｃ １０２８のＨｉｎｄｌ１１
部位のＢｇｌＩＩ部位への変換、タレノウポリメラーゼ
によるプラント末端化、およびＢｇｌＩＩリンカ−のリ
ゲーションによって構築された。Ｘｈｏ ＩＩで消化す
ると１．４６ｋｂ ＸｈｏＩＩ／ＢｇｌＩＩフラグメン
トが得られ、これをｐＡｃ ３６０の唯一のＢａｍＨＩ
部位にクローニングすると、ポリヘドリンの最初の１０
個のアミノ酸とＰＭＭＳＡのＣ末端２９３個のアミノ酸
のインフレーム融合が起こった。ｐｐ ４２に導入され
た遺伝子を第２図に示す。この遺伝子はポリへドリンプ
ロモーターの制御下にある。（ｉｉ） ｐＰＣ２６４２
の構築には、ｐｐ ４２のＢａｍＨＩ ／Ｐｓｔ Ｉ小
フラグメントを、バクテリア発現ベクターｐ７５０ ／
Ｃ８Ｐａ／ Ｐ１９５ （ＥＰ−Ａ−０２５０２６１
）のＰｓｔ Ｉ消化およびＢａｍＨＩ部分消化によって
得られた１、１５ ｋｂフラグメントで置換することに
より、ｐＰ ４２のポリヘドリン／ＰＭＭＳＡ接合部に
クローン化した。
グメント、すなわちｐＰＣ２６４２の構築に使用した１
、１５ ｋｂ ＢａｍＨＩ ／ Ｐｓｔ Ｉフラグメン
ト、２．２ｋｂ Ｘｈｏ Ｉ／ＢａｍＨＩフラグメント
、ならびにＰｓｔ ＩとＸｈｏ Ｉ消化およびＢａｍＨ
Ｉ部分消化でｐｓ ４２がら切り出した７ ｋｂ Ｘｈ
ｏ Ｉ ／ Ｐｓｔ Ｉフラグメントのリゲーションで
構築された。ｐＰＣ２６４２は次のようにして構築され
た。（ｉ）組換え転移ベクターｐｐ ４２は、Ｈｉｎｄ
ｌＩＩ消化によるｐＰｆｃ １０２８のＨｉｎｄｌ１１
部位のＢｇｌＩＩ部位への変換、タレノウポリメラーゼ
によるプラント末端化、およびＢｇｌＩＩリンカ−のリ
ゲーションによって構築された。Ｘｈｏ ＩＩで消化す
ると１．４６ｋｂ ＸｈｏＩＩ／ＢｇｌＩＩフラグメン
トが得られ、これをｐＡｃ ３６０の唯一のＢａｍＨＩ
部位にクローニングすると、ポリヘドリンの最初の１０
個のアミノ酸とＰＭＭＳＡのＣ末端２９３個のアミノ酸
のインフレーム融合が起こった。ｐｐ ４２に導入され
た遺伝子を第２図に示す。この遺伝子はポリへドリンプ
ロモーターの制御下にある。（ｉｉ） ｐＰＣ２６４２
の構築には、ｐｐ ４２のＢａｍＨＩ ／Ｐｓｔ Ｉ小
フラグメントを、バクテリア発現ベクターｐ７５０ ／
Ｃ８Ｐａ／ Ｐ１９５ （ＥＰ−Ａ−０２５０２６１
）のＰｓｔ Ｉ消化およびＢａｍＨＩ部分消化によって
得られた１、１５ ｋｂフラグメントで置換することに
より、ｐＰ ４２のポリヘドリン／ＰＭＭＳＡ接合部に
クローン化した。
ＰＭＭＳＡのＣ末端アンカー配列の発現を防止するため
、合成オリゴヌクレオチドで、さらに２種の組換え転移
ベクターを構築した。これらのアンカー配列欠失構築体
ｐｓ ４２ΔＡおよびｐＳＣ２６４２ΔＡは、すべての
読み取り枠で両方向性翻訳停止コドンを含有する合成２
６塩基対Ｐｓｔ Ｉリンカ−の構築により作成した。こ
のリンカ−は第１図に示す。このリンカ−を、ｐｓ ４
２およびｐＳＣ２６４２両者の推定膜アンカー配列のす
ぐ上流の唯一のＰｓｔ Ｉ部位にクローン化した。ｐｓ
４２ΔＡおよびｐＳＣ２６４２ΔＡのポリへビリンプ
ロモーター制御下にある遺伝子は第２図に示す。
、合成オリゴヌクレオチドで、さらに２種の組換え転移
ベクターを構築した。これらのアンカー配列欠失構築体
ｐｓ ４２ΔＡおよびｐＳＣ２６４２ΔＡは、すべての
読み取り枠で両方向性翻訳停止コドンを含有する合成２
６塩基対Ｐｓｔ Ｉリンカ−の構築により作成した。こ
のリンカ−は第１図に示す。このリンカ−を、ｐｓ ４
２およびｐＳＣ２６４２両者の推定膜アンカー配列のす
ぐ上流の唯一のＰｓｔ Ｉ部位にクローン化した。ｐｓ
４２ΔＡおよびｐＳＣ２６４２ΔＡのポリへビリンプ
ロモーター制御下にある遺伝子は第２図に示す。
クローニング工程はすべて標準操作（Ｍａｎｉａｔｉｓ
ほか：“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”。
ほか：“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”。
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ： Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 １９８２ ）を用
いて実施した。フラグメントの正しい連結および方向は
精密制限酵素マツピングによって解析した。トランスフ
ェクションに使用したプラスミドは、バクテリア培養液
から、塩化セシウム勾配遠心分離によって精製した。
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 １９８２ ）を用
いて実施した。フラグメントの正しい連結および方向は
精密制限酵素マツピングによって解析した。トランスフ
ェクションに使用したプラスミドは、バクテリア培養液
から、塩化セシウム勾配遠心分離によって精製した。
例３：組換えつ°イルスの生成
Ｓ ｏｄｏ ｔｅｒａ ｆｒｕ ｉ ｅｒｄａ（Ｓｆ）
ＨＩ胞（ＩＰＬＢ ５ｆ２１）（Ｖａｕｇｈｎほか：
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ、 １３ ： ２１３〜２１７．１９
７７）を１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ ）を補充し
たＴＣ１００メジウム（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｓ）中、２２
°Ｃまたは２７°Ｃで懸濁培養して生育させた。懸濁培
養液中２７°Ｃで生育させたＳｆ細胞にＡｃＮＰＶ （
株Ｅ２）を繁殖させた。第２図に示したＰ、 ｆａｌｃ
ｉ正匹工遺伝子配列を含有する組換えウィルスは、例２
において調製した組換え転移ベクターと、細胞外ウィル
ス（ＥＣＶ）培養から精製したＡｃＮＰＶ ＤＮＡを２
０：１のモル比でＳｆ細胞にコトランスフエクションし
て生成させた。ＡｃＮＰＶＤＮＡの精製方法は、培養液
を細胞あたり１ ｐｆｕで感染させ、６日後に収穫し、
蔗糖勾配工程を省略したほかは、すでに報告されている
方法（Ｓｕｍｍｅｒｓ＆ Ｓｍ１ｔｈ、 １９８７ ）
と同様とした。コトランスフエクションも報告のとおり
に実施した（ Ｓｕｍｍｅｒｓ ＆Ｓｍ１ｔｈ、 １９
８７．方法１）。
ＨＩ胞（ＩＰＬＢ ５ｆ２１）（Ｖａｕｇｈｎほか：
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ、 １３ ： ２１３〜２１７．１９
７７）を１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ ）を補充し
たＴＣ１００メジウム（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｓ）中、２２
°Ｃまたは２７°Ｃで懸濁培養して生育させた。懸濁培
養液中２７°Ｃで生育させたＳｆ細胞にＡｃＮＰＶ （
株Ｅ２）を繁殖させた。第２図に示したＰ、 ｆａｌｃ
ｉ正匹工遺伝子配列を含有する組換えウィルスは、例２
において調製した組換え転移ベクターと、細胞外ウィル
ス（ＥＣＶ）培養から精製したＡｃＮＰＶ ＤＮＡを２
０：１のモル比でＳｆ細胞にコトランスフエクションし
て生成させた。ＡｃＮＰＶＤＮＡの精製方法は、培養液
を細胞あたり１ ｐｆｕで感染させ、６日後に収穫し、
蔗糖勾配工程を省略したほかは、すでに報告されている
方法（Ｓｕｍｍｅｒｓ＆ Ｓｍ１ｔｈ、 １９８７ ）
と同様とした。コトランスフエクションも報告のとおり
に実施した（ Ｓｕｍｍｅｒｓ ＆Ｓｍ１ｔｈ、 １９
８７．方法１）。
得られたＥＣＶについて、トランスフェクションから３
日後に、プラークアッセイによって組換え体をスクリー
ニングした。プラークアッセイは、トランスフェクショ
ン培養液の上清の希釈系列を用い、報告されている方法
（Ｂｒｏｗｎ ＆ Ｆａｕｌｋｅｎｅｒ ： Ｊ。
日後に、プラークアッセイによって組換え体をスクリー
ニングした。プラークアッセイは、トランスフェクショ
ン培養液の上清の希釈系列を用い、報告されている方法
（Ｂｒｏｗｎ ＆ Ｆａｕｌｋｅｎｅｒ ： Ｊ。
Ｇｅｎ、 Ｖｉｒｏｌ、、 ３６ ： ３６１−３６４
．１９７７ ）にほぼ従って実施した。中性赤色染色の
のち、組換え体と考えられるプラークをポリへドラの不
存在によって肉眼的に選択し、０．５ ｍｅの培養メジ
ウム中に採取し、プラークアッセイを反復して精製した
。組換えウィルスをプラークまたは単層培養からスケー
ルアップし、懸濁またはローラーボトル培養で大規模に
生育させた。得られた組換えウィルスを第２図に示す。
．１９７７ ）にほぼ従って実施した。中性赤色染色の
のち、組換え体と考えられるプラークをポリへドラの不
存在によって肉眼的に選択し、０．５ ｍｅの培養メジ
ウム中に採取し、プラークアッセイを反復して精製した
。組換えウィルスをプラークまたは単層培養からスケー
ルアップし、懸濁またはローラーボトル培養で大規模に
生育させた。得られた組換えウィルスを第２図に示す。
例４：組換えウィルスで感染させな細胞からの蛋白質の
分析 例３で得られた組換え体と考えられるウィルスを最初、
ドツトプロットアッセイにより、Ｐ。
分析 例３で得られた組換え体と考えられるウィルスを最初、
ドツトプロットアッセイにより、Ｐ。
ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ配列の発現について調べた。ポリ
ヘトノン陰性のプラークを培養メジウム０．５ ｍｅに
採取し、少なくとも１時間拡散させた。この１００１１
ｅを使用して、３５ｍｍペトリ皿上２ Ｘ １０５個の
細胞を感染させ、室温で１時間インキュベーションした
。次に、種を１ｍｔ’の培養メジウムで置換し、ついで
プレートを３〜４日間、２７°Ｃでインキュベーション
した。細胞をついで１回、リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ
）で洗浄し、遠心分離により収穫した。細胞ベレットを
１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で分解し、ド
ツトプロット装置を用いて真空下にニトロセルロース濾
紙に適用した。
ヘトノン陰性のプラークを培養メジウム０．５ ｍｅに
採取し、少なくとも１時間拡散させた。この１００１１
ｅを使用して、３５ｍｍペトリ皿上２ Ｘ １０５個の
細胞を感染させ、室温で１時間インキュベーションした
。次に、種を１ｍｔ’の培養メジウムで置換し、ついで
プレートを３〜４日間、２７°Ｃでインキュベーション
した。細胞をついで１回、リン酸緩衝食塩溶液（ＰＢＳ
）で洗浄し、遠心分離により収穫した。細胞ベレットを
１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で分解し、ド
ツトプロット装置を用いて真空下にニトロセルロース濾
紙に適用した。
分泌蛋白質の検出には、感染３日後にメジウムを０．５
ｍｅの血清を含まないメジウムで置換し、２７°Ｃで
２４時間インキュベーションしたのちニトロセルロース
に直接適用した。濾紙を、天然ＰＭＭＳＡに対して誘起
させたウサギポリクローナル抗血清、ついでアルカリホ
スファターゼ接合抗つサギＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）で
調べた。抗体結合は色原体基質によって検出した。
ｍｅの血清を含まないメジウムで置換し、２７°Ｃで
２４時間インキュベーションしたのちニトロセルロース
に直接適用した。濾紙を、天然ＰＭＭＳＡに対して誘起
させたウサギポリクローナル抗血清、ついでアルカリホ
スファターゼ接合抗つサギＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）で
調べた。抗体結合は色原体基質によって検出した。
序用胞分解物および培養上清のさらに詳細な解析には、
還元または非還元条件下においてＳＤＳ ／ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用い、ついでクー
マツシー染色または一連の特異的抗血清トモツクローナ
ル抗体を使用したウェスタンブロッティングを行った。
還元または非還元条件下においてＳＤＳ ／ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用い、ついでクー
マツシー染色または一連の特異的抗血清トモツクローナ
ル抗体を使用したウェスタンブロッティングを行った。
これらは、２種のポリクローナルウサギ抗血清、ひとつ
は天然ＰＭＭＳＡに対して誘起された抗血清（Ｐａｓ
ＰＭＭＳＡ）、もうひとつはＣ８Ｐのテトラペプチドリ
ピート（ＮＡＮＰ）に相当する合成ペプチドに対して誘
起され、ウシ血清アルブミンに連結した抗体、ならびに
天然ＰＭＭＳＡに対して誘起され、Ｃ末端における高次
構造還元感受性エピトープを認識する数種のモノクロナ
ール抗体である（Ｍａｂ １１１．４． Ｍａｂ １１
７．２およびＭａｂｌｌｌ、２）。
は天然ＰＭＭＳＡに対して誘起された抗血清（Ｐａｓ
ＰＭＭＳＡ）、もうひとつはＣ８Ｐのテトラペプチドリ
ピート（ＮＡＮＰ）に相当する合成ペプチドに対して誘
起され、ウシ血清アルブミンに連結した抗体、ならびに
天然ＰＭＭＳＡに対して誘起され、Ｃ末端における高次
構造還元感受性エピトープを認識する数種のモノクロナ
ール抗体である（Ｍａｂ １１１．４． Ｍａｂ １１
７．２およびＭａｂｌｌｌ、２）。
ドツトプロット解析の結果、Ｐａｓ ＰＭＭＳＡによっ
て認識された抗原性生成物は、感染Ｓｆ細胞中、組換え
ウィルスｖｓ ４２およびｖＳＣ２６４２の両者によっ
て発現されたことが明らかにされた。５Ｖ４２で感染さ
せた細胞は、クーマツシー染色ゲル上では見えないが、
ウェスタンプロットによって容易に検出され、非還元条
件下Ｐａｓ ＰＭＭＳＡにより、またさらに明瞭にＭａ
ｂ １１１．４により認識される３個の別個のバンドと
して現れる３６〜３８ ｋｄの新規な蛋白質が産生した
。ｖＳ０２６４２感染細胞も、約５０１ｃｄで、同じく
３個の空間的に接近したバンドとして移動する新規な蛋
白質を産生じた。５０ ｋｄ蛋白質は、ｖＰ ４２の生
成物について認められたと同程度の発現レベルにおいて
クーマツシー染色により明瞭に観察可能で、Ｐａｓ Ｐ
ＭＭＳＡ、 Ｐａｓ ＮＡＮＰ、 Ｍａｂ １１１．４
゜Ｍａｂ １１１．２およびＭａｂ １１７．２によっ
て強く認識された。モノクローナル抗体は期待されたよ
うに非還元条件下でのみ蛋白質を認識し、両者のＰａｓ
ＰＭＭＳＡによる認識は非還元蛋白質でより強力であっ
た。両組換え体生成物ともＮｏｎ１ｄｅｔ Ｐ ４０
（ＮＰ４０ ）、 Ｒｅｎｎｅｘ （ＲＸ ）およびデ
オキシコール酸（ＤＯＣ）に不溶であるが、セチルトリ
メチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ ）およびＳ
ＤＳに可溶であった。
て認識された抗原性生成物は、感染Ｓｆ細胞中、組換え
ウィルスｖｓ ４２およびｖＳＣ２６４２の両者によっ
て発現されたことが明らかにされた。５Ｖ４２で感染さ
せた細胞は、クーマツシー染色ゲル上では見えないが、
ウェスタンプロットによって容易に検出され、非還元条
件下Ｐａｓ ＰＭＭＳＡにより、またさらに明瞭にＭａ
ｂ １１１．４により認識される３個の別個のバンドと
して現れる３６〜３８ ｋｄの新規な蛋白質が産生した
。ｖＳ０２６４２感染細胞も、約５０１ｃｄで、同じく
３個の空間的に接近したバンドとして移動する新規な蛋
白質を産生じた。５０ ｋｄ蛋白質は、ｖＰ ４２の生
成物について認められたと同程度の発現レベルにおいて
クーマツシー染色により明瞭に観察可能で、Ｐａｓ Ｐ
ＭＭＳＡ、 Ｐａｓ ＮＡＮＰ、 Ｍａｂ １１１．４
゜Ｍａｂ １１１．２およびＭａｂ １１７．２によっ
て強く認識された。モノクローナル抗体は期待されたよ
うに非還元条件下でのみ蛋白質を認識し、両者のＰａｓ
ＰＭＭＳＡによる認識は非還元蛋白質でより強力であっ
た。両組換え体生成物ともＮｏｎ１ｄｅｔ Ｐ ４０
（ＮＰ４０ ）、 Ｒｅｎｎｅｘ （ＲＸ ）およびデ
オキシコール酸（ＤＯＣ）に不溶であるが、セチルトリ
メチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ ）およびＳ
ＤＳに可溶であった。
この融合蛋白質の収量は、ｖｓ ４２およびｖＳＣ２６
４２についてそれぞれ＜ １ ｐｇ ／ ｍｅおよび１
０〜２０ ｐｇ ／ ｒｎｅであった。
４２についてそれぞれ＜ １ ｐｇ ／ ｍｅおよび１
０〜２０ ｐｇ ／ ｒｎｅであった。
両組換えウィルスｖｓ ４２ΔＡおよびｖＳＣ２６４２
ΔＡについて、ドツトプロット解析の結果は、感染培養
からの細胞および培養上清の両者がＰａｓＰＭＭＳＡに
よって認識される抗原性生成物を含有することを示した
。ＳＤＳ／ＰＡＧＥによる解析により、ｖｓ ４２ΔＡ
について３６〜３８ｋｄ、ｖＳＣ２６４２ΔＡについて
約５０ｋｄの新規な蛋白質が、感染４日後、細胞分解物
中（Ｉ Ｘ １０５個の細胞巾約１〜２ｐｇ）また培養
上清でも同程度のレベル、クーマツシーブルー染色ゲル
において容易に観察できるレベルで発現することが明ら
かにされた。
ΔＡについて、ドツトプロット解析の結果は、感染培養
からの細胞および培養上清の両者がＰａｓＰＭＭＳＡに
よって認識される抗原性生成物を含有することを示した
。ＳＤＳ／ＰＡＧＥによる解析により、ｖｓ ４２ΔＡ
について３６〜３８ｋｄ、ｖＳＣ２６４２ΔＡについて
約５０ｋｄの新規な蛋白質が、感染４日後、細胞分解物
中（Ｉ Ｘ １０５個の細胞巾約１〜２ｐｇ）また培養
上清でも同程度のレベル、クーマツシーブルー染色ゲル
において容易に観察できるレベルで発現することが明ら
かにされた。
組換え蛋白質は分泌型、非分泌型のいずれも、ｖｓ ４
２およびｖＳＣ２６４２によって発現された生成物につ
いてみられたように、ＰＡＧＥで多重バンドを示し、両
者はＰａｓ ＰＭＭＳＡ、 Ｍａｂ １１１．４． Ｍ
ａｂ １１１．２およびＭａｂ １１７．２で、また■
５Ｃ２６４２ΔＡの５０ ｋｄ生成物はＰａｓ ＮＡＮ
Ｐでも認識された。Ｍａｂによる認識は非還元条件下で
のみ認められ、Ｐａｓ ＰＭＭＳＡによる認識は非還元
状態で強化された。両組換え生成物とも細胞抽出物の可
溶性分画に認められ、分泌型は完全に可溶性であった。
２およびｖＳＣ２６４２によって発現された生成物につ
いてみられたように、ＰＡＧＥで多重バンドを示し、両
者はＰａｓ ＰＭＭＳＡ、 Ｍａｂ １１１．４． Ｍ
ａｂ １１１．２およびＭａｂ １１７．２で、また■
５Ｃ２６４２ΔＡの５０ ｋｄ生成物はＰａｓ ＮＡＮ
Ｐでも認識された。Ｍａｂによる認識は非還元条件下で
のみ認められ、Ｐａｓ ＰＭＭＳＡによる認識は非還元
状態で強化された。両組換え生成物とも細胞抽出物の可
溶性分画に認められ、分泌型は完全に可溶性であった。
融合蛋白質の収量は、ｖｓ ４２ΔＡおよびｖＳＣ２６
４２ΔＡについて、それぞれ７．５Ｐｇ／ｍｅおよび１
０ ｐｇ ／ ｍｅであった。
４２ΔＡについて、それぞれ７．５Ｐｇ／ｍｅおよび１
０ ｐｇ ／ ｍｅであった。
ＨＣＭＶのキラ合成前遺伝子は、４個のエキソンからな
り、ＳＤＳ −ＰＡＧＥで７２〜７６に分子量の蛋白質
を生成する１７３６ヌクレオチドのスプライシングされ
た分子をコードする。ｐＵＣ９中にクローン化された合
成前ｃＤＮＡ （Ａｋｒｉｇｇほか： Ｖｉｒｕｓ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ。
り、ＳＤＳ −ＰＡＧＥで７２〜７６に分子量の蛋白質
を生成する１７３６ヌクレオチドのスプライシングされ
た分子をコードする。ｐＵＣ９中にクローン化された合
成前ｃＤＮＡ （Ａｋｒｉｇｇほか： Ｖｉｒｕｓ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ。
２ ： １０７−１２１．１９８５ ）をＢａｍＨＩで
切断し、すべての暗号配列と１４５ ｂｐの５′非翻訳
リ一ダー配列および９０ ｂｐの３′非翻訳配列を含有
するフラグメントを遊離させた。このフラグメントをゲ
ル精製し、バキュロウィルス転移ベクターｐＡｃ ３７
３およびｐＡｃ ３６ ＣのＢａｍＨＩ消化、ホスファ
ターゼ処理ＤＮＡ中にクローン化した。
切断し、すべての暗号配列と１４５ ｂｐの５′非翻訳
リ一ダー配列および９０ ｂｐの３′非翻訳配列を含有
するフラグメントを遊離させた。このフラグメントをゲ
ル精製し、バキュロウィルス転移ベクターｐＡｃ ３７
３およびｐＡｃ ３６ ＣのＢａｍＨＩ消化、ホスファ
ターゼ処理ＤＮＡ中にクローン化した。
バキュロウィルス組換え体は、プラスミドと野生ＷＡｃ
ＮＰＶ ＤＮＡを５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐ
ｅｒｄａ細胞中にコトランスフエクションすることによ
り生成させた。同種組換えによって生じた組換えバキュ
ロウィルスを対人陰性プラークの肉眼的スクリーニング
によって単離し、ついで２回プラーク精製を行った。
ＮＰＶ ＤＮＡを５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐ
ｅｒｄａ細胞中にコトランスフエクションすることによ
り生成させた。同種組換えによって生じた組換えバキュ
ロウィルスを対人陰性プラークの肉眼的スクリーニング
によって単離し、ついで２回プラーク精製を行った。
比！’−ｆｆｉ的発現レベルは、３５３−メチオニン標
識５ＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンプロット、およびＥＬ
ＩＳＡによって解析した。
識５ＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンプロット、およびＥＬ
ＩＳＡによって解析した。
（ｉ）メチオニン標識
Ｓ ｏｄｏ ｔｅｒａ ｆｒｕ ｉ ｅｒｄａ細胞（２
Ｘ １０６個／３ｃｍ培養皿）を２ ｍ、 ｏ、 ｉ、
（感染多重度）で２８°Ｃにおいて感染させた。２４
時間後、細胞をＰＢＳ中で２回すすぎ、３５３−メチオ
ニン２０ ｐＣｉ ／ ｍｅ金含有メチオニンを含まな
いＴＣ１００中で１時間標識した。標識後、細胞をＰＢ
Ｓ中で３回洗浄し、全細胞分解物を５ＤＳ−ＰＡＧＥ
（１０６個細胞ｌトラック）およびオートラジオグラフ
で解析した。
Ｘ １０６個／３ｃｍ培養皿）を２ ｍ、 ｏ、 ｉ、
（感染多重度）で２８°Ｃにおいて感染させた。２４
時間後、細胞をＰＢＳ中で２回すすぎ、３５３−メチオ
ニン２０ ｐＣｉ ／ ｍｅ金含有メチオニンを含まな
いＴＣ１００中で１時間標識した。標識後、細胞をＰＢ
Ｓ中で３回洗浄し、全細胞分解物を５ＤＳ−ＰＡＧＥ
（１０６個細胞ｌトラック）およびオートラジオグラフ
で解析した。
結果は第３図に示す。第３図中、２４．＋４および＋２
４の時点は、３５３−メチオニンによる最初の２４時間
（７）パルス、ついで非標識メチオニンを投与シて４時
間および２４時間追跡した場合の結果である。時点４８
は３５３−メチオニンによる４８時間パルスを示す。Ｕ
は非感染細胞である。
４の時点は、３５３−メチオニンによる最初の２４時間
（７）パルス、ついで非標識メチオニンを投与シて４時
間および２４時間追跡した場合の結果である。時点４８
は３５３−メチオニンによる４８時間パルスを示す。Ｕ
は非感染細胞である。
デンシトメリーによる解析では、組換え生成物のメチオ
ニン導入のレベルは、ｐＡｃ ３７３ （３７３−ＩＥ
）の場合よりもｐＡｃ ３６Ｃ（３６Ｃ−ＩＥ）の方
が４〜５倍高かった。
ニン導入のレベルは、ｐＡｃ ３７３ （３７３−ＩＥ
）の場合よりもｐＡｃ ３６Ｃ（３６Ｃ−ＩＥ）の方
が４〜５倍高かった。
（ｉｉ） ＳＤＳ −ＰＡＧＥ ／クーマツシーブルー
染色（ｉ）からのゲルを総蛋白質についてクーマツシー
ブルーを用いて染色した。結果を第４図に示す。図から
明らかなように、ｐＡｃ ３６ Ｃトラック（３６Ｃ−
ＩＥ）の組換え蛋白質量は、ｐＡｃ３７３ トラック（
３７３−ＩＥ）の場合に比べてはるかに高かった。
染色（ｉ）からのゲルを総蛋白質についてクーマツシー
ブルーを用いて染色した。結果を第４図に示す。図から
明らかなように、ｐＡｃ ３６ Ｃトラック（３６Ｃ−
ＩＥ）の組換え蛋白質量は、ｐＡｃ３７３ トラック（
３７３−ＩＥ）の場合に比べてはるかに高かった。
例６：ヒト −インターフェロンの成熟細胞内型の発現
８５２ ｂｐ ＡｖａＩＩ −Ｎｅｏ Ｉフラグメント
をｐＩＦＮ ｒ −Ｇ４ （Ｎ１５ｈｉほか： Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ９７ ： １５３〜１５９．１９
８５ ）から切り出し、両端をＢａｍＨＩリンカ−で修
飾した。このフラグメントをｐＡｃ ３６ Ｃの唯一の
ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングしてｐＡｃ ３６
Ｃ−１１を生成させた。これから、全γ−インターフェ
ロンｃＤＮＡを２．７４ ｋｂ Ｓａｌ Ｉ −Ｈｉｎ
ｄＩＩＩフラグメントとして切り出しＲＦ Ｍ １３
ｍｐ １８のポリリンカー中の同種部位にクローニング
した。２．７４ｋｂ Ｓａｌ Ｉ −ＨｌｎｄＩＩＩの
部位は、ポリヘドリン遺伝子のＡＴＧからＡＴＣに突然
変異させた翻訳開始コドンの約８２０ ｂｐ上流のＳａ
ｌ Ｉ部位から、ポリヘドリン遺伝子の翻訳停止コドン
の約５００ ｂｐ上下流ＨｉｎｄＩ１１部位までに位置
した。組換えＭ１３クローンを用いて一本鎖鋳型を生成
させた。これをアニーリングして、配列ＴＡＣＡＴＡＴ
ＧＧＧＴＣＣＴＧＣＡＴＣＣＣＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＣ
Ｇを有する３３マーオリゴヌクレオチドを得た。このオ
リゴヌクレオチドを用いて、ｐＡｃ ３６ Ｃの５′
ボッヘトリン配列を、ヒトγ−インターフェロンの成熟
非分泌型の配列に続＜ＡＴＧ翻訳開始コドンに正確に融
合させた。これを以下に例示す。３３マー欠失オリゴヌ
クレオチドには下線を付した。
をｐＩＦＮ ｒ −Ｇ４ （Ｎ１５ｈｉほか： Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ９７ ： １５３〜１５９．１９
８５ ）から切り出し、両端をＢａｍＨＩリンカ−で修
飾した。このフラグメントをｐＡｃ ３６ Ｃの唯一の
ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングしてｐＡｃ ３６
Ｃ−１１を生成させた。これから、全γ−インターフェ
ロンｃＤＮＡを２．７４ ｋｂ Ｓａｌ Ｉ −Ｈｉｎ
ｄＩＩＩフラグメントとして切り出しＲＦ Ｍ １３
ｍｐ １８のポリリンカー中の同種部位にクローニング
した。２．７４ｋｂ Ｓａｌ Ｉ −ＨｌｎｄＩＩＩの
部位は、ポリヘドリン遺伝子のＡＴＧからＡＴＣに突然
変異させた翻訳開始コドンの約８２０ ｂｐ上流のＳａ
ｌ Ｉ部位から、ポリヘドリン遺伝子の翻訳停止コドン
の約５００ ｂｐ上下流ＨｉｎｄＩ１１部位までに位置
した。組換えＭ１３クローンを用いて一本鎖鋳型を生成
させた。これをアニーリングして、配列ＴＡＣＡＴＡＴ
ＧＧＧＴＣＣＴＧＣＡＴＣＣＣＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＣ
Ｇを有する３３マーオリゴヌクレオチドを得た。このオ
リゴヌクレオチドを用いて、ｐＡｃ ３６ Ｃの５′
ボッヘトリン配列を、ヒトγ−インターフェロンの成熟
非分泌型の配列に続＜ＡＴＧ翻訳開始コドンに正確に融
合させた。これを以下に例示す。３３マー欠失オリゴヌ
クレオチドには下線を付した。
欠失突然変異の実施にはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒ
−ｎａｔｉｏｎａｌによって市販されている突然変異
キットを用いた。組換えＭ１３プラークは、あらかじめ
［３２ｐ］−γ−ＡＴＰとキナーゼ処理した３３マーオ
リゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせて同定
した。陽性プラークを採取し、プラーク精製し、正しい
欠失が起こったことを確認するためのＤＮＡ配列決定用
−本鎖鋳型の生成に用いた。陽性クローンのＲＦ型は欠
失を包含する１３５ ｂｐ ＥｃｏＲＶ −ＮｄｅＩフ
ラグメントの切り出しに使用した。これはついで、ｐＡ
ｃ ３７３のＥｃｏＲＶ −ＢａｍＨＩ大フラグメント
、上述の１３５ ｂｐ ＥｃｏＲＶ −Ｎｄｅ Ｉフラ
グメント、およびγ−インターフェロン遺伝子の残部を
再構築する５８５ ｂｐ Ｎｄｅ Ｉ −ＢａｍＨＩフ
ラグメントからなる３個のフラグメントのリゲーション
に使用した。
−ｎａｔｉｏｎａｌによって市販されている突然変異
キットを用いた。組換えＭ１３プラークは、あらかじめ
［３２ｐ］−γ−ＡＴＰとキナーゼ処理した３３マーオ
リゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせて同定
した。陽性プラークを採取し、プラーク精製し、正しい
欠失が起こったことを確認するためのＤＮＡ配列決定用
−本鎖鋳型の生成に用いた。陽性クローンのＲＦ型は欠
失を包含する１３５ ｂｐ ＥｃｏＲＶ −ＮｄｅＩフ
ラグメントの切り出しに使用した。これはついで、ｐＡ
ｃ ３７３のＥｃｏＲＶ −ＢａｍＨＩ大フラグメント
、上述の１３５ ｂｐ ＥｃｏＲＶ −Ｎｄｅ Ｉフラ
グメント、およびγ−インターフェロン遺伝子の残部を
再構築する５８５ ｂｐ Ｎｄｅ Ｉ −ＢａｍＨＩフ
ラグメントからなる３個のフラグメントのリゲーション
に使用した。
このようにして得られた組換え転移ベクター（ｐ １８
１と呼ぶ）を用い、例３に既述したようにして組換えＡ
ｃＮＰＶを生成さぜた。Ｓｆ細胞を細胞あたり５ ｐｆ
ｕのｍ、 ｏ、 ｉ、で感染させ、感染４８時間後に細
胞を収穫し、ＰＢＳ緩衝液中で洗浄し、分解し、５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル上泳動に付し、ついでクーマ
ツシーブルーで染色した。染色したゲルトラックを第５
図に示す。図中、トラック１は非感染Ｒ田胞、トラック
２は野生型ＡｃＮＰＶを感染させた細胞、トラック３は
ｐ１８１がら誘導された組換えＡｃＮＰＶを感染させた
細胞、トラック４は蛋白質分子量マーカーである。デン
シトメトリー走査にょれば、これらのイ１１１胞中の総
細胞蛋白質の１４％が細胞内ヒトγ−インターフェロン
バンドであった。
１と呼ぶ）を用い、例３に既述したようにして組換えＡ
ｃＮＰＶを生成さぜた。Ｓｆ細胞を細胞あたり５ ｐｆ
ｕのｍ、 ｏ、 ｉ、で感染させ、感染４８時間後に細
胞を収穫し、ＰＢＳ緩衝液中で洗浄し、分解し、５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル上泳動に付し、ついでクーマ
ツシーブルーで染色した。染色したゲルトラックを第５
図に示す。図中、トラック１は非感染Ｒ田胞、トラック
２は野生型ＡｃＮＰＶを感染させた細胞、トラック３は
ｐ１８１がら誘導された組換えＡｃＮＰＶを感染させた
細胞、トラック４は蛋白質分子量マーカーである。デン
シトメトリー走査にょれば、これらのイ１１１胞中の総
細胞蛋白質の１４％が細胞内ヒトγ−インターフェロン
バンドであった。
第１図は、本発明の実施に際して使用されるＰＭＭＳＡ
およびＣ８Ｐ遺伝子、ならびに合成リンカ−を示す。第
２図は、本発明の組換え転移ベクターならびに組換えバ
キュロウィルスを得るのに用いられる千１η造遺伝子を
示す。第３図は例５における３５３−メチオニン標識の
結果を示す写真である。 第４図および第５図は、それぞれ例５および例６で得ら
れた蛋白質をゲル泳動後クーマツシーブルー染色を行っ
た結果を示す写真である。
およびＣ８Ｐ遺伝子、ならびに合成リンカ−を示す。第
２図は、本発明の組換え転移ベクターならびに組換えバ
キュロウィルスを得るのに用いられる千１η造遺伝子を
示す。第３図は例５における３５３−メチオニン標識の
結果を示す写真である。 第４図および第５図は、それぞれ例５および例６で得ら
れた蛋白質をゲル泳動後クーマツシーブルー染色を行っ
た結果を示す写真である。
Claims (10)
- （１）異種遺伝子をクローニングできる制限部位がポリ
ヘドリン遺伝子体Ｎ末端の短距離下流に設けられたバキ
ユロウイルス転位ベクターにおいて、ポリヘドリン遺伝
子の天然ＡＴＧ翻訳開始コドンを欠き、制限部位に先立
つＮ末端ポリヘドリン暗号配列は残つているが翻訳され
ないようにした転移ベクター。 - （２）ポリヘドリン遺伝子のＮ末端領域の最初の２７〜
３６塩基の後に制限部位が設けられている特許請求の範
囲第１項に記載のベクター。 - （３）制限部位は最初の３３塩基の後に設けられている
特許請求の範囲第１項に記載のベクター。 - （４）制限部位はＢａｍＨＩ部位である特許請求の範囲
第１項から第３項までのいずれかに記載のベクター。 - （５）ポリヘドリン遺伝子の天然ＡＴＧ翻訳開始コドン
の３番目の塩基に単塩基変換がある特許請求の範囲第１
項から第４項までのいずれかに記載のベクター。 - （６）ＡＴＧコドンはＡＴＣに変換された特許請求の範
囲第５項に記載のベクター。 - （７）（ａ）翻訳開始コドンを有する異種遺伝子をバキ
ユロウイルス転移ベクターに、ポリヘドリン遺伝子体Ｎ
末端の短距離下流の制限部位において導入し、（ｂ）バ
キユロウイルスに感染しやすい昆虫細胞を、工程（ａ）
で形成された組換えバキユロウイルス転移ベクターと正
常な野生型バキユロウイルスＤＮＡでコトランスフエク
シヨンして異種遺伝子を導入した組換えバキユロウイル
スを調製する方法において、バキユロウイルス転移ベク
ターは特許請求の範囲第１項から第６項までのいずれか
に記載のベクターである方法。 - （８）異種遺伝子は原核生物遺伝子である特許請求の範
囲第７項に記載の方法。 - （９）異種遺伝子は真核生物遺伝子である特許請求の範
囲第７項に記載の方法。 - （１０）得られた組換えバキユロウイルスで感染させた
、バキユロウイルスに感染しやすい細胞を培養して、異
種遺伝子によつてコードされている生成物を発現させる
工程をさらに包含する特許請求の範囲第７項から第９項
までのいずれかに記載の方法。
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| GB888810808A GB8810808D0 (en) | 1988-05-06 | 1988-05-06 | Vectors |
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|---|---|
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| JPH0813275B2 JPH0813275B2 (ja) | 1996-02-14 |
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ID=10636494
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|---|---|---|---|
| JP63212328A Expired - Lifetime JPH0813275B2 (ja) | 1988-05-06 | 1988-08-26 | バキユロウイルス転移ベクター |
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| CA (1) | CA1331155C (ja) |
| DE (1) | DE3882522T2 (ja) |
| DK (1) | DK175433B1 (ja) |
| ES (1) | ES2058294T3 (ja) |
| GB (1) | GB8810808D0 (ja) |
| IE (1) | IE62490B1 (ja) |
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| AU1377395A (en) * | 1993-12-23 | 1995-07-10 | University Technologies International Inc. | Methods of expressing proteins in insect cells and methods of killing insects |
| US5545553A (en) * | 1994-09-26 | 1996-08-13 | The Rockefeller University | Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them |
| CA2257357C (en) * | 1996-06-07 | 2010-04-13 | Neorx Corporation | Humanized antibodies with modified glycosylation |
| DE19640817A1 (de) * | 1996-10-02 | 1998-05-14 | Hermann Prof Dr Bujard | Rekombinantes Herstellungsverfahren für ein vollständiges Malaria-Antigen gp190/MSP 1 |
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| US8008252B2 (en) * | 2001-10-10 | 2011-08-30 | Novo Nordisk A/S | Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII |
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| US7179617B2 (en) * | 2001-10-10 | 2007-02-20 | Neose Technologies, Inc. | Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX |
| US7696163B2 (en) * | 2001-10-10 | 2010-04-13 | Novo Nordisk A/S | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
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| CN101516388B (zh) * | 2006-07-21 | 2012-10-31 | 诺和诺德公司 | 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化 |
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-
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