JPH02160722A

JPH02160722A - リポソーム製剤の製造法

Info

Publication number: JPH02160722A
Application number: JP63315080A
Authority: JP
Inventors: Hidehiko Hibino; 日比野　英彦; Nobuo Fukuda; 信雄福田; Kenichi Asahi; 旭　健一; Shigeru Sakurai; 桜井　成; Nobutaka Takahashi; 信孝高橋
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research; Nippon Oil and Fats Co Ltd
Current assignee: NOF Corp; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1988-12-15
Filing date: 1988-12-15
Publication date: 1990-06-20
Anticipated expiration: 2013-05-20
Also published as: JP2753719B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、新規なリボソーム製剤に関するものであり、
更に詳しくは、リン脂質を用いて製造されるリボソーム
にフラボノイドを配合してなる安定性に優れたリボソー
ム製剤およびその製造法に関する。

（従来の技術）フラボノイドは植物の２次代謝産物の花色素で多くはグ
ルコースが結合した配糖体であり、フラボン類、イソフ
ラボン類、フラバノン類、カテキン類、アントシアン類
、カルコン類、フラボノール類などの化合物群を含む。

このフラボノイドの遊離型やグルコシド型は血小板凝集
抑制、血管拡張、抗ヒスタミン、抗炎症、鎮痙、エスト
ロン様、遊離ラジカルのスキャベンジャ−などの薬理的
性質を有する。また、脂質系酵素のホスホジェステラー
ゼ、リポオキシゲナーゼ、シクロオキシゲナーゼ、およ
びプロティンキナーゼなどに対する制御性が生化学的に
知られている。このように広汎な生理活性を有するフラ
ボノイドは、天然物中に存在し、日常の食事中にも微量
存在している安全な化合物である点から、特定な治療目
的に用いることが考案されてきた（特開昭６０−１９９
８１７号）。

リボソーム素材として使われるリン脂質およびコレステ
ロールは、生物を構成する基本単位である生体膜の構成
成分である。特にリン脂質は動物性、植物性の天然物の
他に、合成されたものもあるが、主としてホスファチジ
ン酸にコリン、エタノールアミン、セリンの残基が結合
したものが使われている。以上のように生体にとって有
用であり且つ毒性のない素材を組み合わせた薬剤の開発
が望まれていた（特開昭６２−９５１３４号）。

（発明が解決しようとする！ｉ、１り前述した如く、フラボノイドは多くはグルコースと結合
した配糖体として天然に存在するが、その生理活性は、
加水分解を受けた遊離型のものに一層強くその効果があ
る。

配糖体は水への親和性を少し有しているが遊離型は非常
に融点が高（、水への溶解度が著しく低下するため、水
溶液として用いることが難しい。

遊離型は熱水、熱メタノール、熱エタノール、熱含水ア
ルコール、熱アセトンなどで溶解度が向上することが判
明しているが、冷却されると直ちに結晶が析出してくる
ので、医薬品の溶媒としては不適である。有機溶媒では
アプロチック溶剤、高極性非プロトン系溶剤、塩素系溶
剤などの一部に溶解するがこれらの溶剤を医薬品の溶媒
として生体内に使用することは毒性の観点から難しい。

また遊離型のフラボノイドは数個の芳香族系の水酸基を
有しているので、これをアセチル化、グルコシド化、メ
チルエーテル化などの修飾が出来るが、これらの修飾に
よっても水に対する溶解度は大きくは改善されない。

上記の理由によりフラボノイドの生理活性は、例えば便
宜上ピリジン溶液で検定されたり（特開昭６０−１９９
８１７号）、非常に微量しか可溶化出来ないが蛋白質可
溶化剤に可溶化して検定されたり、不均一に微量しか分
散出来ない増粘剤で懸濁させて検定されたりしてきたが
、これらの方法は生体に及ばす毒性、必要量の確保、医
薬品製剤の均質性、および医薬品と、しての取り扱いな
どから直ちには適用出来ない。また、フラボノイドが固
体である点から、タブレット、カプセル、顆粒および座
薬などへの加工は容易であるが、液剤、シロップ剤など
の水性の分散物としては、界面活性剤を用いて乳化して
も、加工し難い点から、これらの問題点を解決した剤型
加工法の出現が望まれていた。

（課題を解決するための手段）本発明は、フラボノイドを含有することを特徴とするリ
ボソーム製剤であり、好ましくは、さらにコレステロー
ルを配合してなるリボソーム製剤である。また、本発明
のリボソーム製剤の製造法は、フラボノイドを９１１１
０以上のアルカリ溶液で処理した後、リボソーム化する
ことを特徴とする。

本発明に用いられるフラボノイドには下記の基本骨格を
有する化合物を挙げることが出来る。

（１）　　　　　　　　（ＩＩ）　　　　　　　　（Ｉ
ＩＩ）（式中のｐｈはフェニル基を示す。）その具体例としては、次の化合物を挙げることができる
。

（１）はフラボン類であり、クリシン、トリンキン、ア
ビゲニン、コスモシインなどがある。

（ｎ）はフラバノン類であり、ピノセンプリン、ナリン
ゲニン、セリプルピンなどがあり、３位に水酸基を有す
るフラボノール類にはケンフェロール、アストラガリン
、クエルセチンなどがあり、さらに水酸基が増したジハ
イドロフラバノール類にはピノバンクシン、アスチルピ
ル、フスチンなどがある。

（］ＩＩ）はイソフラボン類でありダイゼイン、ゲニス
タイン、ゲニスチンなどがある。

天然フラボノイドは前述の如きフラボノイド骨格の主と
して７位に、まれに５位、３位に単糖および多糖が結合
した配糖体として存在することが知られているが、本発
明においては、これらの配り１体をエマルションで酵素
的に加水分解したり、硫酸との煮沸やメタノール性塩酸
との煮沸で化学的に加水分解した遊離型のフラボノイド
が好ましい。

従来報告されているフラボノイドの分化誘導活性に関し
、構造既知なフラボノイド配糖体の活性は、糖を含まな
いフラボノイド化合物のそれより低いことが証明されて
いる（キノシタ・ティ、サンカワ・ニー、タカク・ティ
、アサヒ・ケイ、Ｊ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏ−Ｄｙｎ　８：　５−６４＋　
１９８５）　＊また、遊離型のフラボン類の代表例であ
るアビゲニンは、ダリアやフジモドキの花、高梁の包葉
、種子、茎に含まれており、これらの天然産の遊離型の
フラボノイドも利用できるが、遊離型のイソフラボン類
の代表的であるゲニスタインはゼンプレンらによって合
成法が確立されており（＾ｃｔａ　Ｃｈｉｍ、　Ａｃａ
ｄ。

Ｓｃｉ、　Ｈｕｎｇ、　１９．２７７、１９５９）　、
その他多くの遊離型のフラボノイドが多数の化学合成研
究者から合成法が報告されており、これらの化学合成品
の遊離型のフラボノイドも利用できる。さらに市販の遊
離型フラボノイドも利用できる。

そこで、本発明者らは遊離型フラボノイドの均一溶液を
得るため各種溶剤に対する遊離型フラボノイドの溶解能
を検討した。そして、本発明者は遊離型フラボノイドに
は、２〜６個の芳香族系水酸基があることに着目した。

何故なら遊離型フラボノイド類の水への不溶化はこの芳
香族系水酸基によると推定されるからである。そのため
、各種アルカリに対する遊離型フラボノイド類の溶解能
を検討した。各種アルカリの０．１Ｍ溶液におけるｐＨ
値と溶解能を例示すると、酪酸ナトリウムは１０．９で
一部溶解し、炭酸カリは１１．６、炭酸ナトリウムは１
２．０、水酸化カリは１３．６、水酸化ナトリウムは１
３．７でそれぞれ溶解する。

ρ旧Ｏ未満ではフラボノイドを溶解することができない
が、ｐＨ値が１０以上を示すアルカリ溶液は溶解能を示
すことが判明した。

しかし、このアルカリ溶液による生体への直接投与は消
化器官中に存在する生体成分との結合体の形成や生体内
分解酵素による早急な分解により、有効な治療効果を発
揮する遊離型フラボノイドの濃度を達成することは難し
い。そのため、その脂溶性と二分子膜構造により生体成
分との結合防止、分解酵素からの分解および細胞などと
相互作用しやすい点から薬効増強が期待できるリボソー
ム製剤を検討した。

そこで本発明者らはリボソーム素材であるリン脂質やコ
レステロールが遊離型フラボノイドを溶解するアプロチ
ック溶剤に溶解することに着目し、逆相蒸発法によるリ
ボソームの調製を行った。しかし、アプロチック溶剤中
で均一に溶解して脱溶剤後に得られた混合物に高速撹拌
や超音波方法を用いて均質化を行い水中の分散物に加工
したが、この分散物は放置後、分散物の分離が認められ
、またリボソーム形成時に使用されるエクストルーダー
のフィルターに遊離型フラボノイドと思われる結晶が認
められ、リボソームが形成されなかった。

一方、逆相蒸発法により薄膜状となったリン脂質および
リン脂質とコレステロールとの混合物に、可溶化された
遊離型フラボノイドのアルカリ溶液を添加して、超音波
方法を用いて均質化を行って水中の分散物に加工すると
安定性の良い乳化液が得られた。この乳化液はリボソー
ム形成時に使用されるエクストルーダー処理に際し、孔
径０．２　ｔａサイズのフィルター通過時に透明溶液に
変化し、さらに孔径０．０５Ｉ！ｍサイズのフィルター
通過後にリボソーム形成時に特有に観察される溶液の蛍
光が認められた。本リボソーム製剤は淡黄褐色を帯びた
透明溶液であり、粘性は水と同様であり、１ケ月以上の
冷蔵庫保存においても何らの変化は認められなかった。

本リボソーム製剤中には、１−当すリン脂質が２００■
まで可溶化できる。本発明に用いられるリン脂質は植物
起源、動物起源および合成から得られるものいずれでも
よい。その分子種に関し、アシル残基は同一および異種
でもよく、そのアシル残基の種類には、ラウリン酸、ミ
リ久チン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸
、リノール酸、リルン酸などが挙げられ、塩基ベースは
コリン、エタノールアミン、セリン、イノシトール、グ
リセロールなどが挙げられるが、特に、製造上は炭素数
１４〜１８のアシル残基を有するホスファチジルコリン
が好ましい。

本リボソーム製剤中には、１−当り遊離型フラボノイド
が１００■まで可溶化できる。遊離型フラボノイドの可
溶化量は使用するアルカリの使用量とｐＨ値に依存し、
塩基性の強いアルカリはど一定量で可溶化できる′ｆ１
ｉｉ！Ｉ型フラボノイド量は増加するが、その種類の選
択は目的によって決められる。

本発明に用いられる遊離型フラボノイドのリン脂質に対
する使用量は、リボソームの製造のしやすさや生理活性
の発現から１〜５０重量％が好ましく、この際に使用さ
れるアルカリの濃度は０．０１〜１モルが好ましい。１
重量％未満ではフラボノイドの生理効果が得にくくなり
、５０重量％を超えると安定なリボソームが得られない
。

本リボソーム製剤の安定性、血中消失速度の遅延および
肝・肺臓への分布抑制などから、コレステロールをさら
に添加してもよく、用いられるコレステロールのリン脂
質に対する使用量はモル比として１／２、重量比として
０．３以下が好ましく、これ以上の添加は製造上好まし
くない。

なお、本リボソーム製剤は３ケ月間冷蔵庫保存しても性
状の変化が認められず、実験動物へ腹腔投与しても何ら
の毒性の発現が認められなかった。

（発明の効果）本発明の方法によれば、水に不溶性でアプロチック溶剤
にしか溶解しなかった生理活性を有するフラボノイドを
リボソーム製剤に加工することが出来るので水溶性液剤
となる。

また、本発明によって提供されるリボソーム製剤はフラ
ボノイドを含むリボソームを経静脈、経腹腔によって補
給ができるので、生体中に高濃度にフラボノイドを保持
し治療を目的とした剤型に利用できる。特に生理活性を
有する遊離型フラボノイドを含むので、血小板凝集抑制
、血管拡張、抗ヒスタミン、抗炎症、鎮痙、エストロン
様、遊離ラジカルのスキャベンジャ−等に有効であり、
従来水不溶性であるが為にその使用に制限のあった分野
にリボソーム剤として利用することができる。

（実施例）以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。

実施例１窒素気流下、ガラスピーズを多数回れた２００　ｄのナ
スフラスコにジステアロイルホスファチジルＤ　ＩＪ　
７２００■ヲ量りとり、エチルアルコール５〇−を添加
して加熱撹拌しながらで溶解した。エバポレーターで窒
素気流下、溶媒を留去し、この残留物に０．０２モルの
水酸化カリウム（ｐＨ１３，６）で可溶化されたゲニス
タイン（イソフラボンＭ）８０＋ｗを含む水溶液２０ｄ
を加え、ポルテックスミキサーで８０℃、２０分間、超
音波乳化を行っ゛た。

得られた牛乳様のサスペンションを３．０．２．０．１
．０．０．８．０．６．０．４．０．２．０．１．０．
０５−のボアーサイズのフィルターを装着したリボソー
ム調整用の押出成形機（エクストルーダー）を用い、各
ボアーサイズのフィルターごとに５回通過させた。

この際、牛乳様のサスペンションは０．２　ｔｓのボア
ーサイズのフィルター通過後から透明溶液となり、０．
０５−のボアーサイズのフィルター通過後はリボソーム
形成時に特徴的に観察される蛍光が認められた。

得られたリボソーム製剤はｐＨＨＯ２９であり、淡黄色
透明で、水と同様の粘性を示し、１ケ月以上の冷蔵庫保
存においても何らの変化は認められなかった。

実施例２窒素気流下、ガラスピーズを多数回れた３００　ｍｌの
ナスフラスコにジオレイルホスファチジルコリン１，０
００■とコレステロール２６４■ヲｉｔリトリ、エチル
アルコール２５０−を添加して加熱攪拌しながら溶解し
た。エバポレーターで窒素気流下、溶媒を留去し、この
残留物に、０．１モルの炭酸ナトリウムｐ）１１２．０
で可溶化されたアビゲニン（フラボンＩ）２００■を含
む水溶液２０−を加え、その後、実施例１に従って調製
した。

得られたリボソーム製剤はｐｔｔ値９．７であり、淡黄
褐色透明で、その他は実施例１と同様であった。

実施例３窒素気流下、ガラスピーズを多数回れた２００艷のナス
フラスコにジパルミトイルホスファチジルコリン１５０
■と大豆ホスファチジルエタノールアミン（９７％）２
３■とコレステロール２７■を量りとり、エチルアルコ
ール６０ｍを添加して加熱攪拌しながら溶解した。エバ
ポレーターで窒素気流下、溶媒を留去し、この残留物に
０．５モルの酪酸ナトリウムｐＨ１０，９で可溶化させ
たケンフェロール（フラボノール類）２０■を含む水溶
液２０−を加え、その後、実施例１に従って調製した。

得られたリボソーム製剤はｐＨＨＯ２６であり、淡褐色
透明で、その他は実施例１と同様であった。

実施例４実施例１においてゲニスタインの代わりにゲニスチンを
用いた以外は同様に行った。

得られたリボソーム製剤はｐＨＨＯ２８であり、淡黄色
透明で、水と同様の粘性を示し、−ケ月以上の冷蔵庫保
存においても、何らの変化は認められなかった。

〔急性毒性（マウス）〕

体重２５〜３０ｇの４週令の雌雄のｒｃＲ系マウマウス
４匹実施例１で調製されたリボソーム製剤を、腹腔内に
２週間の期間に１回０．４−ずつ７回にわけて投与し、
さらに最終投与後７日間観察した。

最終投与直後やその１日後に皮膚症状や行動に一部異常
が認められたが、最終投与後３〜４日後に正常に復し、
それ以外は本則に基因すると思われる著明な急性毒性症
状を発現したものはなかった。

比較例１窒素気流下、ガラスピーズを多数人れた２００　ｍのナ
スフラスコにゲニスタイン８０■を量りとり、ジオキサ
ン／メタノール（７／３　ｖ／ｖ）混合液５０−を加え
て懸濁させ、さらにジステアロイルホスファチジルコリ
ン２００■を加え、完全に溶解するよう加熱還流した。

エバポレーターで窒素気流下、溶媒を留去し、この残留
物に精製水２ＯＮ＃１を加え、ポルテックスミキサーで
８０℃、２０分間、超音波乳化を行った。

得られた牛乳様のサスペンションを３．０−のボアーサ
イズのフィルターを装着したリボソーム調製用の押出成
形機（エクストルーダー）で処理したが、ゲニスタイン
はフィルター上に析出し、透明な濾液が滴下して来た。

比較例２ゲニスタイン１０曙を増粘剤のナトリウムカルボキシメ
チルセルロースの１％水溶液およびメチルセルソルブの
１％水溶液で、さらに膜タンパク質の可溶化に使われる
両親媒性界面活性剤の３＝〔（３−コラミドプロピル）
ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホネートの１
％水溶液で加熱して、別々に均一に懸濁させた。しかし
、これらの各溶液は室温放置後、１週間後にゲニスタイ
ンの沈澱が認められた。

比較例３実施例１において、水酸化カリウムのかわりに酢酸ナト
リウム（ｐＨ９，１）を用いた以外は同様にした。結果
はゲニスタインは可溶化せず、沈澱が生じてリボソーム
が形成されなかった。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）フラボノイドを含有することを特徴とするリボソ
ーム製剤。
（２）さらにコレステロールを配合してなる請求項１記
載のリボソーム製剤。
（３）フラボノイドをｐＨ１０以上のアルカリ溶液で処
理した後、リボソーム化することを特徴とするリボソー
ム製剤の製造法。