JPH02116743A - 血液のリポタンパク質成分の測定方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、血漿または血清中のリポタンパク質レベル、
−層詳細には、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）　、高
密度リポタンパク質（ＨＤ　Ｌ　）および橿低密度リポ
タンパク質（ＶＬＤＬ）の測定方法および装置に関する
。これらのリポタンパク質は血液中に見い出されるコレ
ステロールの大多数を明らかにするものである。

〔従来の技術〕

血液中のコレステロールレベルの正確な測定の重要性は
よく知られている。アメリカ合衆国連邦政府は、２０以
上の保健機構と共同して、血液中の高いコレステロール
レベルの危険を医師および一般大衆に知らせるべく国家
コレステロール教育プログラムを通じて積極的なキャン
ペーンを開始した。すべての人々はコレステロールレベ
ルを検査するように勧告され、また特別な処置が精密に
測定されたコレステロールレベルに基づいて勧告される
。加えて、処置は全コレステロールレベルのみに基づい
ておらず、ＬＤＬコレステロールのレベルに基づいてい
る。ＨＤＬコレステロールはコレステロール沈澱の除去
を助けるのに反して、ＬＤＬコレステロールは動脈閉塞
の主要な原因である０分離しまた、また−府警用のかか
る検査がＬＤＬコレステロールを測定するのに必要とさ
れ、またそれは、測定された全コレステロールレベルが
ボーダーラインまたは高危険レベルにあるのでなければ
、通常は行われない。

ＩＬ／ステロールレベルを測定するための現在の方法は
評判が悪く不正確であり、標準的実践は、高いレベルが
最初の測定で検出される時には測定を多数回繰り返すこ
とである。５％またはそれ以上の不正確さが実験室によ
り行われる測定のほぼ５０％に見い出されており、また
測定の１５％は１０％以上の不正確さを示した。これら
の不正確さは、血液のかなりの取扱とその成分比に関す
る確かな推定とを必要とする現在の測定方法に内在的な
ものである。

リポタンパク質コレステロールの直接的測定は通常、超
遠心、電気泳動または選択的沈澱により分離されている
個々のリポタンパク質の酵素検定により達成される。精
度、便利さおよび費用に関して利用可能な分離技術の間
には大きな相違がある。一般に、最も正確な方法は超遠
心を含んでいる方法であるが、それらは非常に時間およ
び費用がかかり、従って大規模な集団研究には適当でな
い、最も広く用いられている代替方法はフリーデワルド
（Ｗ、Ｔ、Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ）、レヴイ（Ｒ，１，
Ｌｅｖｙ）およびフレドリクソン（Ｄ、Ｓ、Ｆｒｅｄｒ
ｉｃｋｓｏｎ）により刊行物「事前に超遠心を行わない
血漿中の低密度リポタンパク賞コレステロールの濃度の
推定Ｊ　（’Ｒ床化学（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅｍ、）」１８
．４９９〜５０２頁１９７２年）に紹介された間接的方
法である。この手順では、血漿トリグリセリド（ＴＧ）
および全コレステロール（ＴＣ）が酵素検定により測定
される。血漿のアリコートを分離するべく、選択的に沈
澱するいくつかの試薬ＶＬＤＬおよびＬＤＩ、の１つが
加えられる。遠心により沈澱物を除去した後、上澄みが
ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬＣ）の尺度を得るべくコ
レステロールの代わりに検定される０次いでＶＬＤＬコ
レステロール（■ＬＤＬ−Ｃ）の推定が、血漿トリグリ
セリドレベルを５で割ることによりなされる。次いでＬ
ＤＬコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）濃度が差により計算
される。ＬＤＬ−Ｃ＝ＴＣ−（ＨＤＬ−Ｃ＋ＶＬＤＬ−
Ｃ）、この方法は比較的迅速であり、また費用も少なく
てすむが、特に沈澱過程で実験誤差が導入され得るいく
つかの過程がある。加えて、分析の精度が、ＶＬＤＬ−
Ｃが血漿トリグリセリドの濃度の１／１５として確実に
推定され得るという仮定に依存している。絶食試料が使
用される時、この仮定は一般に真であるが、他の式も、
デイ−・エム・プロング（Ｄ、　Ｍ、　ＤｅＬｏｎｇ）
、イー・アール・プロング（Ｅ、Ｒ，ＤｅＬｏｎｇ）、
ウッド（Ｐ、Ｄ、Ｗｏｏｄ）、リンベル（Ｋ、Ｌｉｐｐ
ｅｌ）およびリフキンド（Ｂ、Ｍ、Ｒ４ｆｋｉｎｄ）に
より刊行物「血漿の低密度および極低密度リポタンパク
譬コレステロールの推定のため方法の比較」（「米国医
学協会雑誌（Ｊ、Ａｍ、Ｍｅｄ、Ａｓ５ＯＣ，）Ｊ）に
記載されているように一層正確な値を与えるべく示唆さ
れてきた。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）技術を使用して血液の
リポタンパク質成分を測定するための方法に関するもの
である。−層詳細には、本方法は血漿または血清の試料
から陽子ＮＭＲデータを取得する過程と、化学シフトス
ペクトルを発生するべく取得されたデータを処理する過
程と、４つのリポタンパク質成分の各々の濃度を与える
べく４つの４１１リポタンパク譬成分スペクトルに関し
てスペクトルをデコンボリュートする過程とを含んでい
る。スペクトルが、血液が分別され得る４つの成分のス
ペクトルの線形組合わせにより正確に表されることが発
見されている。これらの４つの成分はＶＬＤＬ、ＬＤＬ
、ＨＤＬおよびタンパク譬であり、またそれらのＮＭＲ
スペクトルの性質は人によって実際上不変であることが
見い出されている。従って、ＮＭＲスペクトルの差は完
全に成分スペクトルの振幅の差に起因し、成分スベク）
・ルの振幅は血液中のそれらの成分の濃度に起因する。

本発明の一つの課題は、血液のリポタンパク質成分の正
確かつ確実な測定を可能にすることである。全血漿試料
の観察されたスペクトルがその４つのリポタンパク質成
分のＮＭＲスペクトルの適当に重み付けされた和により
精密にシミュレートされるので、試料スペクトルと計算
されたスペクトルとの間の最良適合を与える重み付は係
数を計算することにより試料中のこれらの成分の濃度を
抽出することが可能である。試料の取扱および処理は従
来の方法にくらべて比較的簡単であり、また誤りを生ず
る機会が少ない。試料は単にＮＭＲ測定のために調製さ
れ、また測定は制御された温度および制御された磁界強
度で行われる。

本発明の他の課題は、経済的な費用でかつ大量に血液の
リポタンパク質成分を測定するための方法を提供するこ
とである。試料の調製は平凡な仕事であり、また実際の
ＮＭＲ測定は７分間またはそれ以内にＮＭＲスペクトロ
メータにより自動的に行われる。デコンボリューション
計算も、リポタンパク質成分の濃度を示す報告書をプリ
ントアウトする計算機により自動的に行われる。

本発明の別の課題は、非リポタンパク質成分を明らかに
することによりデコンボリューシタン処理の精度を改善
することである。乳酸塩、バリンおよびヒドロキシブチ
ル酸のような代謝物質に対する標準的なＮＭＲ参照スペ
クトルが作成され、またこれらがリポタンパク質成分に
対するＮ　Ｍ　Ｒ参照スペクトルとならんで試料ＮＭＲ
スペクトルをデコンボリュートするのに使用される。

〔課題を解決するための手段〕

これらの課題は本発明により特許請求の範囲の請求項１
および１０にあげた手段により解決される。

〔実施例〕

人間の血漿のＩＨＮＭＲスペクトルは近似的に１．２お
よび０．８ｐｐｍ（化学シフト標準ＴＳＰに対して相対
的に）を中心とする２つの突出したピークを含んでいる
。これらのピークはそれぞれ血漿脂質のメチレン（ＣＨ
，）およびメチル（ＣＨ，）陽子から生ずる。これらの
ピークの各々は性質が非常に異種であり、血漿中に存在
する脂質のいくつかの化学的に異なった種類、トリグリ
セリド、コレステロール、コレステロール・エステルお
よびリン脂質の陽子からの重なる共鳴から成っている。

これらの脂質は、含有する脂質の割合が異なるリポタン
パク質粒子の３つの主要な形式のなかへ一括されている
。またこれらのリポタンパク質粒子は密度が異なってお
り、その密度にそれらの名称である極低密度リポタンパ
ク質（ＶＬＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）お
よび高密度リポタンパク質（ＨＤ！、）が由来している
。

これらのリポタンパク質粒子中の脂質のうち、（秩序的
な液晶状態と対照的なものとして）流動的な可動状態に
ある一部分のみがＮＭＲ血漿共鳴に寄与する。これらの
信号の異種は、各々がその固有の特徴的に異なるＮＭＲ
スペクトル特性を有する種々のリポタンパク譬粒子の血
漿濃度の変動に起因して人によって異なるそれらの複雑
な線形状により反映される。

本発明の方法は、血漿試料の３つのすべてのリポタンパ
ク質粒子（ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）の濃度がその’
）ＩＮＭＲスペクトルからそのメチルおよびメチレン信
号の線形状の計算機解析により抽出されることを可能に
する。本方法は、観測された血漿スペクトルのこの傾城
が、血漿が差浮動超遠心により分別され得る４つの成分
のスペクトルの簡単な線形組合わせにより正確に表され
るという発見を利用している。４つの成分はそれらの密
度に基づいて区別されており、またＶ　Ｌ　Ｄ■、（密
度＜１．００６）、ＬＤＬ　（密度−１，ｌ）　０６な
いし１．０６３）、ＨＤＬ　（密度−１，０６３ないし
１．２１）および“タンパク質′”　（密度＞１．２１
）を含んでいる。後者の成分はリポタンパク質の浮動後
に残される最もタンパク質を含有している底部留分であ
る。

これらの成分のＮＭＲスペクトル特性は人によって実際
上不変であることが見い出されている。

これは、ライスコンシン・ミルウオーキー大学およびラ
イスコンシン医科大学で行われた研究の結果である第１
表中に示されている。

】」」及 血漿の分離されたリポタンパク質成分の５００ＭＨｚ　
　ＮＭＲパラメータ パラメータ　　　　　　　王圭Ｉロト以ＶＬＤＬ　　　
　　　　　　（ｎ＝１１７）ＣＨ，化学シフト（ｐｐｍ
）　　１．２３３±０．００２ＣＨ，化学シフト（ｐｐ
ｍ）　　０．８３９±０．００２ＣＨ，線幅（Ｈｚ）　
　　　　　２０．８　　±１．９ＣＨ，線幅（Ｈ２）　
　　　　　１６．３　　±０．８ＣＨ，／ＣＨ，強度比
　　３．７６　　主０゜２９Ｌ　Ｄ　Ｌ　　　　　　　
　　（ｎ　＝６６）ＣＨ，化学シフト（ｐｐｍ）　　１
．２１９±０．００５ＣＨ、化学シフト（ｐｐｍ）　　
０．８２２±０．００２ＣＨ２線幅（Ｈｚ）　　　　　
　３４．０　　±２．９ＣＨ，線幅０１ｚ）　　　　　
　２１．１　　主１゜０ＣＨ２／ＣＨ３強度比　　１．
２７　　主０゜１３ＨＤＬ　　　　　　　　　（ｎ＝７
０）ＣＨ，化学シフト（ｐｐｍ）　　１．１８６±０．
００４ＣＨ，化学シフト（ｐｐｍ）　　０．７９６±０
．００３ＣＨ，線幅（Ｈｚ）　　　　　　３４．４　　
±２．９ＣＨ，線幅（Ｈｚ）　　　　　　２０．０　　
±０．８ＣＨ，／ＣＨ，強度比　　１．５８　　±０．
】３１２２８行策（ｎ　＝　１１１　） ＣＨ□／ＣＨ，強度比　　０．３７　　主０゜１０こう
して、個人の血漿からのＮＭＲ信号の間の差は、血漿中
の濃度に比例している４つの成分からの脂質レスポンス
の振幅の差に起因している。

これは２つの実質的に異なる血漿試料のＮＭＲ化学シフ
トスペクトルが示されている第１図および第２図に示さ
れている。本発明の目的では、メチレン（ＣＨ，）およ
びメチル（ＣＨ３）陽子により発生するスペクトルピー
クが必要とされ、またそれらは水平軸に沿って示されて
いる１、３３ないし０．７０　ｐ　ｐ　ｍの化学シフト
領域に現れる。各スペクトルビークは血漿成分ＶＬＤＬ
、ＬＤＬ。

ＨＤＬおよびタンパク質により発生される４つのＮＭＲ
信号の算術和により発生する。全血漿スペクトルの線形
状がその４つのリポタンパク質成分の相対的な量の変化
により実質的に変化していることが見られる。しかし、
４つのリポタンパク質成分の線形状は、それらの振幅が
血漿試料中のそれらの相対的４変により劇的に変化する
という事実にもかかわらず、実質的に同一にとどまる。

それは集団全体にわたる４つの血漿リポタンパク質成分
のＮＭＲスペクトルの不変の線形状であり、またこれら
の線形状が本発明の基礎である血漿試料の線形状を作成
するべく１γ術的に加えられ得るという事実である。

全血漿試料の観測されたＣＨ，およびＣＨ，ｆＩ形状は
その４つのリポタンパク質成分の脂質信号の適当に重み
付けされた和により精密にシミュレートされているので
、任意の試料中に存在するこれらの成分の濃度を抽出す
ることが可能である。

これは観測された血漿Ｎ　Ｍ　Ｒスペクトルと計算され
た血漿スペクトルとの間の最良適合を与える重み付は係
数を計算することにより実現される。こうしてＮＭＲリ
ポタンパク譬分析の過程は下記の過程から成っている。

１）４つの純粋な血漿成分（ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ
、タンパク質）の各々に対スるＮＭＲ“参照”スペクト
ルの取得。２）参照スペクトルを得るのに使用された測
定条件と同一の測定条件を使用しての全血漿ＮＭＲスペ
クトルの取得。３）対応するリポタンパク質参照の濃度
の倍数として表された各リポタンパク質成分の濃度を与
えるべく４つの成分に関しての血５ｙＮＭＲスペクトル
の計算機デコンボリューション。

血漿線形状解析は、観測された血漿ＮＭＲスペクトルと
４つの重み付けされた参照スペクトルを加えることによ
り計算されたスペクトルとの間に二乗偏差の和を最小化
する、４つの参照ＮＭＲスペクトルの各々に対する重み
付は係数を計算することにより実現される。

本発明はここでは血漿を分析するのに使用されるものと
して説明されているが、本発明は血清を分析するのにも
同じく存効に使用され得る。また分析の精度は、もし非
リポタンパク質成分が考慮に入れられるならば、改善さ
れ得る。将来の開発はこのような成分のリストを拡げる
であろうが、乳酸塩、バリンおよびヒドロキシブチル酸
のような代謝物質が有意義であり、また分析に含められ
るべきである。血漿のＮＭＲ信号へのこれらの成分の寄
与は第３図に示されており、また、それらはリポタンパ
ク質成分に比較して非常に小さいが、それらはデコンボ
リューシゴン過程の精度に影響する。

血液は１２〜１６時間にわたり絶食した提供者から集め
られる。これは、ＮＭＲスペクトルがＶＬＤＬに類似し
ており、また非絶食提供者には不定の量で存在するキロ
ミクラの量を減する。血液はエチレンジアミン四酢酸（
ＥＤＴＡ）を入れたバープルートツブド・バキュテイナ
ー管のなかへ引かれ、また次いで直ちに氷の上に置かれ
る。血液試料は、引かれた後に４時間以内に１，０００
×ｇで１０分間にねたり４°Ｃで遠心される。分離され
た血漿はプラスチック管のなかヘビペットで移され、ま
た０、　５　ｍ　ｌが５ｍｍ外径のＮＭＲ管へ移される
。血漿試料は次いで、それを集めてから４８時間以内に
行われるべきＮＭＲ分析が行われるまで、４°Ｃで冷蔵
される。

以上の手順は、本発明による分析と、４つの成分の参照
ＮＭＲスペクトルを確立するための分析との双方のため
に試料血漿を集めるのに用いられる。上記のように、参
照ＮＭＲスペクトルは本発明を実施するために必要とさ
れる。しかし、ＮＭＲ測定条件が一定にとどまるかぎり
、同一の参照ＮＭＲスペクトルをその後の血漿試料を分
析するのに使用続けることもできる。

参照ＮＭＲスペクトルは先ず血漿の４つの成分、すなわ
ちＶＬＤＬ、ＬＤＬＳＨＤＬおよびタンパク質の各々に
対して得られなければならない。血漿は上記のようにし
て得られ、またアジ化ナトリウム（ＮａＮｚ）が、０．
０５％（重量百分率）の濃度を与えるべく、３０ｍｌの
試料に加えられる。

試料血漿は次いで、シューメーカー（Ｖ、Ｎ、Ｓｃｈｕ
ｍａｋｅｒ）およびプッピワン（Ｄ几、Ｐｕｐｐｉｏｎ
ｅ）により「順次浮動超遠心」（「酵素学の方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　Ｊ第１２
８巻、第１５５〜１７０頁、アカデミツクプレス、ニュ
ーヨーク、１９８６年）に記載されているように、１０
°Ｃでの順次浮動超遠心により異なる密度の４つの成分
に分別される。

４つの成分は下記のように定められている：ｖＬＤＬ　
（ｄ＜１．００６ｇ／ｍｊり、ＬＤＬ　（ｄ＝１゜００
６ないし１．０６３）、ＨＤＬ　（ｄ＝１．０６３ない
し１．２１）およびタンパク質（ｄ＞１．２１）。

−ｉ詳細には、血漿を２つのグループ＃１および＃２に
分割する。調節は＃　１　（ｄ　＝　１．　ＯＯ６）の
密度に対しては行われず、＃２の密度が適当な体積のホ
ウ化ナトリウム（ＮａＢｒ）の濃縮溶液の追加により１
．０６３ｇ／ｍｌに１Ｊｉ１節される。血漿の２つのグ
ループは１８時間にわたりベンクマン（Ｂｅｃ？ｗａｎ
）　　５０．３　Ｔ　ｉ超遠心ローターで５０．０００
ｒｐｍで２ｍｆｆ１プラスチツク管内で遠心される。純
粋なＶＬＤＬを含んでいる＃１の頂部留分は除去され、
また４°Ｃで貯蔵される。ＬＤＬ、ＨＤＬおよびタンパ
ク質を含んでいる＃ｌの底部留分の密度はｄ　＝　１．
０６３に調節され（＃３）、またＨＤＬおよびタンパク
質を含んでいる＃２の底部留分の密度はｄ−１，２１に
調節される（＃４）。

試料のこれらの２つのグループは２４時間にわたり５０
．０００ｒｐｍで再び遠心される。＃３の頂部留分は純
粋なＬＤＬを含んでおり、＃４の頂部留分はＨＤＬを含
んでおり、また＃４の頂部留分はタンパク質を含んでい
る。

この点で、４つの分離された血漿成分はまだ小さい分子
量の代謝物質を含んでおり、そのメチル陽子ＮＭＲ信号
が所望の脂質メチルおよびメチレン共鳴と同一のスペク
トル領域に現れる。線形状解析と干渉するこれらの化合
物はアミコン社（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、）により製
造されたセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）　　１０
マイクロコンセントレータ−で４　’Ｃで４成分リポタ
ンパク質溶液の超遠心を繰り返すことにより除去される
。各５回の濃縮過程の後に、リポタンパク質溶液はそれ
らの元の濃度に０．０８ＭのＮａＢｒ、０．０５　Ｍの
リン酸ナトリウム、０゜００５ＭのＥＤＴＡ、０．００
１ＭのＣａ　Ｃｌ　ｔ、ｐ　Ｈ７，４のモック（ｍｏｃ
ｋ＞血漿溶液により希釈される。各試料成分のアリコー
ト（０，５ｍｉ！、）が５ｍｍのＮＭＲ管内に置かれ、
また分析まで４°Ｃで貯蔵される。

これにより４つの参照リポタンパク質成分のＮＭＲスペ
クトルが取得される。それらは計算機メモリに記憶され
、またそれらのメチルおよびメチレイ脂質共鳴の線形状
および振幅が、血漿試料をデコンボリュートするのに用
いられる線形状適合過程で使用される参照としての役割
をする。ＮＭＲスペクトルの線形状および振幅はＮＭＲ
測定パラメータ、最も顕著には磁界強度および温度にか
なり敏感に依存するので、全血漿試料の測定時に用いら
れ測定条件と同一の測定条件のもとにリポタンパク質参
照スペクトルが取得されることは重要である。

好ましい実施例では、ＮＭＲ測定は市販のスペクトロメ
ータ、プルカー・インスツルメンツ（Ｂｒｕｋｅｒ　１
ｎｓｔｒｕ＋５ｅｎｔｓ　Ｉｎｃ、）社により製造され
たモデルＷＭ２５０を使用して２５０ＭＨｚで行われる
。

固定周波数５ｍｍ’　Ｈプローブが取付けられ、また温
度制御装置が２３°Ｃ（±０．５°Ｃ）に設定される０
時間均一性は、ＨＤＯＮＭＲ信号のスペクトル線幅が０
．６　Ｈｚ以内になるまで、９９．８％Ｄｔ０の試料へ
のシミングにより最適化される。９０’ＲＦ励起パルス
幅はり、０測定に対して５．５士０゜２μｓの値に設定
される。

特に第４図を参照すると、破線１０により示されている
スペクトロメータはディジタル計算機１１により制御さ
れる。計算機１１はｒＡｓＰＥｃＴ２０００Ｊの商品名
のもとに販売されており、また２４ビツトの語長および
８０に語の記憶装置を有する。それは高速フーリエ変換
を行うのに特によく適しており、またこの目的でハード
配線されたサインテーブルおよびハード配線された乗算
および除算回路を含んでいる。それはまた外部パーソナ
ルコンピュータ１３へのデータリンク１２と、ハードデ
ィスクユニット１５に接続するダイレクトメモリアクセ
スチャネル１４とを含んでいる。

ディジタル計算機１１はまたアナログ−ディジタル変換
器と、ディジタル−アナログ変換器と、パルス制御およ
びインタフェース回路１６を介してスペクトロメータの
走査要素に接続する低速デバイスＩ１０ボートとの組を
含んでいる。これらの要素はディジタル計算機１１によ
り指令された継続時間、周波数および振幅のＲＦ励起パ
ルスを発生するＲＦ送信機１７と、パルスを増幅し、ま
たそれを試料管２０の周りのＲＦ送信コイル１９に結合
するＲＦ電力増幅器１８とを含んでいる。

超伝導磁石２１により発生する５、　８７５テスラの分
極磁界の存在下に励起された試料により発生するＮＭＲ
信号はコイル２２により受信され、またＲＦ受信機２３
に与えられる。増幅かつフィルタされたＮＭＲ信号は復
調器２４で復調され、その結果としての直角信号がイン
タフェース回路１６に与えられ、そこでディジタル化さ
れ、またディジタル計算機１１を通じてディスク記憶装
置１５内のファイルへ入力される。

ＮＭＲデータが管２０内の試料から取得された後、それ
はディスク記憶装２１５に記憶されている他のファイル
を作成するべく計算ａｌｌにより処理される。この第２
のファイルは化学シフトスペクトルのディジタル表現で
あり、またそれはパーソナルコンピュータ１３にそのデ
ィスク記憶装置２５への記憶のために続いて続出される
。そのメモリ内に記憶されているプログラムの指令のも
とに、パーソナルコンピュータ１３はプリンタ２６への
出力である報告書を印刷するべく本発明の開示に従って
化学シフトスペクトルを処理する。

パーソナルコンピュータ１３およびおよびその分離した
ディスク記憶装置２５により実行される機能がスペクト
ロメータのディジタル計算機１１により実行される機能
に組み入れられていてもよいことは当業者に明らかであ
ろう、このような場合、プリンタ２６は直接にディジタ
ル計算機１１に接続されている。

それらの測定に先立って、０．５　ｍ　ｌの参照試料が
冷凍器から取り出され、１０分から２時間までの周期中
に２３°Ｃの温度に上昇するのを許される。

磁界周波数ロックおよび血漿従って振幅の正規化のため
に使用される外部標準を入れたシールされた同軸のイン
サート（ウィルマド（Ｗｉｌｍａｄ）、カタログ＃ＷＧ
Ｓ−８８Ｌ）が、スペクトルがランされる以前に、各血
漿ＮＭＲ試料管内へ置かれる。

この標準インサートの組成は０．００８　ＭのＴＳＰ〔
ナトリウム３−トリメチル（２，２，３，３−！Ｈ４〕
プロピオン酸）、０．６ｍＭのＭ　ｎ　Ｓ　Ｏａ、９９
．８％のり、Ｏである。Ｄ、０は磁界周波数ロック信号
を与え、またＴＳＰ共鳴の積分された面積は、スペクト
ロメータ検出感震の変動を補正するべく、血漿脂質共鳴
の振幅を正規化するのに使用される。溶液は、ＴＳＰ共
鳴の積分された面積を磁界均一性の小さい差に敏感でな
くするべく、またそのＴ１暖相持間を血漿脂質共鳴の緩
和時間（２００ないし５００ｍ５）に比較可能な値に短
くするべく、通常は鋭いＴＳＰ共鳴を常磁性的に広げる
ため、Ｍｎ”でドープされている。同軸インサートを入
れた参照試料は試料管内の定められた深さに置かれ、ま
たスペクトロメータ内に置かれる。試料は２０Ｈｚの速
度でスピンされる。同軸インサートからのＤｚＯ信号に
ロックオンした後、２およびｚＺグラジェント制御の短
いシミングが血漿水のＮＭＲ信号を使用して行われる。

次いで参照スペクトルが、強いＨ，Ｏ共鳴の１秒の選択
性デカンプラー予飽和パルスにより先行される標準１パ
ルスシーケンスを使用して取得される。空間的選択性複
合９０°観測パルス（９０、−９０，−９０−、−９０
−、）が、パックス（Ａ、Ｂａｘ）により「空間的選択
性複合９０°無線周波数パルス」（「磁気共鳴雑誌（Ｊ
、Ｍａｇｒ＋、Ｒｅ５ｏｎ、）　Ｊ旦ｌ。

１４２〜１４５頁１９８５年）に記載されているように
、水抑制アーチファクトを最小化するのに使用されるが
、通常の９０°パルスも満足な結果を与える。下記の取
得パラメータが用いられる：２４０トランジェント（４
ダミースキヤン）、４にデータサイズ、直角検出、２８
００Ｈｚスペクトル幅（９，９ないし−１，２ｐｐｍ）
　、０．７３ｓ取得時間、Ｈ，０周波数における１、Ｏ
Ｓデカップラー予飽和パルス（０，２ＷＬ２２μｓ複合
９０”パルス、およびすべてのスペクトルに対する一定
の受信機ゲイン、４つのリポタンパク質参照試料の時間
領域スペクトル（ＦＩＤｓ）がディジタル化され、また
計算機ディスク上に記憶される。

参照試料ＦＩＤｓは血漿線形状適合解析のために使用さ
れる周波数領域スペクトルを与えるべく同一に処理され
る。フーリエ変換、整相およびベースライン補正の処理
操作はＮＭＲスペクトロメータの標準的な市販のソフト
ウェア（プルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）　　”　Ｄ　Ｉ　Ｓ
　Ｎ　Ｍ　Ｒ”プログラム）を使用して達成される。Ｆ
　ＪＤｓは］、　ＯＨｚ線法げ指数乗算関数の応用後に
１６にデータ点を使用してフーリエ変換される。すべて
のスペクトルは同一にスケーリングされる。スペクトル
は次いで、純粋な吸収モード信号を与えるべく位相補正
される。

４つのリポタンパク質参照スペクトルの化学シフトスケ
ールはＣａ−ＥＤＴＡ共鳴に参照され得ない。なぜなら
ば、これらの参照試料のイオン組成は（超遠心過程に起
因して）血漿と異なっているからである。リポタンパク
賞のメチルおよびメチレン共鳴およびＣａ−ＥＤＴＡの
それはイオン強度により異なって影響されることが示さ
れており、またこの影響の大きさの体系的な測定は、全
血漿中のリポタンパク質成分のメチルおよびメチレン共
鳴の“実°°化学シフトが決定されることを可能にして
きた。これらの化学シフトは下記のとおりであり、４つ
のリポタンパク質参照スペクトルのシフトスケールを参
照するのに使用される。

犯ユＬ　胆「　」　　久Ｚべ久１ Ｃ１ｌｚシフト（ｐｐｍ）　１．２３３　１．２２０　
１．１８Ｇ　　１．２３５　１．１７５ＣＨ，シフト＜
ｐｐ摺）　０．８３９　０．８２３　０．７９６　０．
８９５　０．８４３直線ベースライン補正が次いで、１
．８　ｐ　ｐ　ｍと−０，２ｐｐｍとの間のベースライ
ンを平らにするべく施され、またフーリエ変換され、整
相され、かつベースライン補正されたスペクトルが、１
８Ｍ社により製造されたパーソナルコンピュータ・モデ
ルＰＣ−ＡＴに転送され、またそのディスク上に記憶さ
れる。

これによりシステムは血漿試料を測定する準備ができる
。手順は参照試料の測定に対して以上に説明した手順と
事実上同一である。同一のＮＭＲスペクトルが使用され
、またそれはリポタンパク賞参照スペクトルを取得する
のに用いられた仕方と同一の仕方で作動するように設定
される。血漿試料の時間領域スペクトル（ＦＥＤ）が参
照スペクトルと同一の仕方で取得され、またそれはパー
ソナルコンピュータのディスク内に血漿試料のディジタ
ル化された表現を発生させるべ（はぼ同一の仕方で処理
される。この処理の唯一の違いは、全血漿スペクトルが
、試料中に存在しているＥＤＴＡのカルシウム複合体に
より発生される鋭いＮＭＲ共鳴ピークに正確に参照され
得ることである。

全スペクトルは、このピークを水平スケール上の１．５
１９ｐｐｍに整列させるのに必要なようにシフトされる
。

パーソナルコンピュータは４つのリポタンパク質参照ス
ペクトルの重み付けされた線形組合わせにより試料血漿
の線形状に適合するプログラムを記憶する。スペクトル
の実部および虚部の双方が、試料血漿スペクトルとリポ
タンパク質参照スペクトルとの間の不可避の小さい相対
的位相差を補正するために適合を行うのに使用される。

正確な線形状解析は試料血漿スペクトルのメチルおよび
メチレン領域と４つの参照スペクトル（その互いの相対
的整列は固定されている）の同一のスペクトル領域との
正しい整列にも依存している。少し異なるイオン組成の
血漿試料の間の小さい化学シフト差は、実際に測定され
たスペクトルと計算された血漿スペクトルとの間の最小
二乗平均平方根偏差を見い出すべく試料血漿および参照
スペクトルを互いに相対的に同時に１つのデータ点だけ
体系的に動かすことによりプログラム中で補償される。

線形状適合過程で用いられる数学（すなわち既知の関数
の重み付けされた和に関しての未知の関数の最小二乗適
合）はよく知られており、またヒルデブランド（Ｆ、Ｂ
、Ｈ４１ｄｅｂｒａｎｄ）　’数値解析入門（Ｉｎｔｒ
ｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ　Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ）　Ｊ第２版、第３１４〜３２６．５３９〜
５６７頁、マグロ−ヒル、１９７５年のような数値解析
の多くのテキストブックに記載されている。ＰＣ・ＡＴ
コンピュータ上でこの関数を実行するためのプログラム
はこの明細書の末尾のＡＰＰＥＮＤＩＸに開示されてい
る。

適合すべきスペクトル領域（通常は１．３３〜０．７０
ｐｐｍ）を含んでいる試料血漿スペクトルの実部のデー
タ点はアレイのなかへ入れられる。この血漿アレイはＰ
ｉ’　　（ｉ＝１．２．・・・ｍ）で示されているｍ個
の離散的なデータ点から成っている。

同一のスペクトル領域に対する４つのリポタンパク質参
照スペクトルの実部および虚部の双方のデータ点が別々
のアレイのなかへ入れられる。これらのアレイのデータ
点はそれぞれ実部および虚部に対してＶ　Ｊ、Ｒおよび
Ｖ　ｊ　ｆｘで示されている。ここで、ｉ＝１．２．・
・・ｍはデータ点、またｊ＝１゜２、・・・ｎは成分（
もし４つのリポタンパク質成分が適合に用いられるなら
ばｎ＝４、またもし第３回の３つの非リポタンパク質成
分が解析に加えられるならばｎ＝７）である。

測定された試料血漿スペクトルＰｉ０をｎ個の成分スペ
クトルの線形組合わせと適合させるための方法は、観測
されたスペクトルへの成分ｊの実寄与および虚寄与に対
応する係数ｃ、ｌおよびＣｊｌの組が各データ点に対し
て ＝Ｐ、ｃ　（計算された血漿スペクトル）というように
存在するという前提に基づいている。

最良適合は、二乗平均平方根誤差 ここで、ε、＝ｐ、ｏ　　ｐｌｃ が最小化される時に達成される。

これは、Σε８′を最小化するこれらの係数を見い出す
ことにより、すなわち （ｎの実寄与プラスｎの虚寄与）である時に実現される
。微分すると、２ｎの同時線形式％式％ とおくと、 Σ　Ｃｉ　　ａ　１ｌＪ−Ｓ　ｋｋ　＝１．２．−２ｎ
の形態の２０の同時線形式が存在する。

２ｎＸ２ｎ行列（Ａ）−（ａｍ＝）、ｊ＝１．２゜・・
・２ｎを形成すると（Ａ）ｃ＝ｓ　　が得られる（ここ
でＣおよびＳは樅行ベクトル）。

最良適合を与える係数は逆行列を求めることにより計算
される。

ｃ＝ｃＡ）−’　　　ｓ 二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）は として計算される。

参照データアレイに対する試料血漿データアレイの正し
くない整列を補償するべく、試料血漿データセントは参
照データに関して両方向に一度に１つのデータ点だけ動
かされる。新しい係数および二乗平均平方根偏差が、最
良適合（最小ＲＭＳＤ）を見い出すべく各整列に対して
計算される。

各成分ｊに対してこうして実係数Ｃ４および虚係数Ｃ５
が計算されている。従って、各成分に対する正味重み付
は係数は Ｃｊ−ｉπ により与えられ、またその位相は ０、　＝ｔａｎ−’　（ｃ、’／ｃＪ”）により与えら
れる。

計算された血漿スペクトルの全位相シフトと測定すれた
血漿スペクトルのそれとの比はにより与えられる。

この線形状解析の結果として得られる成分係数は各血漿
試料中の４つのリポタンパク賞成分の濃度を与える。各
濃度は、参照として使用されるスペクトルを有するリポ
タンパク質の濃度に対して相対的に表される。最終濃度
は、ＮＭＲスペクトロメータの方向感度の変動を補正す
るべく、ＴＳＰ外部標準からの共鳴の積分された面積に
正規化される。

非常に迅速（分のオーダー）であり、またほとんど試料
操作を必要としない上記の手順から導き出された情報は
、超遠心（日のオーダー）により調製された４つの成分
の別々のスペクトルを取得し、またそれらの脂質ＮＭＲ
信号の積分を参照リポタンパク質試料のそれと比較する
ことにより得られる情報と等価である。この手順により
測定されているもの（リポタンパク質の各クラスのなか
の゛可動“脂質分子に端を発するＮＭＲ信号振幅）が現
在の臨床用の種々の化学的および免疫化学的検定により
導き出されるリポタンパク質脂質およびタンパク質濃度
に関係しているが、それとは基本的に異なることに注目
することは重要である。

従って、これらのＮＭＲから導き出されるリポタンパク
質レベルと標準血清コレステロールおよびトリグリセリ
ド分析から導き出されるリポタンパク質しベルとの間に
完全な相関が存在すると期待する理由はない。後者の測
定の正確さおよび精密さのよく記載されている制限にも
かかわらず、それらは冠心臓疾病および他の脂質関連疾
病状態を査定するのにＧＷ床用に広く普及している。Ｎ
ＭＲ線形状デコンボリューシヲン処理から導き出された
リポタンパク質レベルがより大きい診断効用を有し得る
ことは考えられるが、これは広範囲な臨床的相関研究が
行われるまでは知られないことであろう。

線形状デコンボリューション処理が血漿成分の濃度の正
確な指示を与えるかどうかの質問に対処するべく、本願
発明者は定められた量の４つのリポタンパク質成分を混
合することにより調製された一連の人工血漿試料を分析
した。下記の第２表に示されているように１．各試料中
の４つの成分の既知の濃度と計算機による線形状デコン
ボリューション処理により計算された濃度との間に良好
な一致が得られている。

１主表 ２５０ＭＨｚでの既知の血漿スペク トルのデコンボリューション ＶＬＤＬ　　　　　　　　　　ＬＤＬ ＨＤＬ　　　　　タンパク質 ＥＰＬＳ９　　　　．１６　　．１５　　　　．２８　
　　．２５血漿試料は、定められた体積の覆面された塩
溶液と何人かの提供者からのプールされた血漿の超遠心
により分離されたＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬおよびタン
パク質（底部留分）の濃縮された貯蔵溶液とを混合する
ことにより調製された。２５０ＭＨｚスペクトル（２４
０スキヤン、１砂子飽和）が２３°Ｃで既知の血漿試料
および虚像されたリポタンパク質溶液の双方からとられ
、またＩＨｚ線広線法関数で処理され、また１、　８　
ｐ　ｐ　ｍと−０゜２９Ｐｍとの間でベースラインを平
らにされた。

スペクトルをＰＣ−ＡＴ計算機に転送した後、線形状解
析が、参照標準としての役割をするスペクトル振幅を有
する貯蔵リポタンパク質溶液の濃度に対して相対的に表
された各血漿試料中に存在する４つのリポタンパク質成
分の信号の振幅に関して上記のように信号をデコンボリ
ュートすることにより、既知の血漿スペクトルのメチル
およびメチレン脂質信号を含んでいるスペクトルの領域
で行われた。第２表には、線形状解析により計算された
成分リポタンパク質濃度（Ｃａｌｃ）が種々の血漿試料
中の真の既知の濃度（Ｔｒｕｅ）に比較して示されてい
る。４つの参照リポタンパク質のトリグリセリド（ＴＧ
）および全コレステロール（Ｃｈｏｌ）含有量は直接に
検定され、また血漿試料の脂質含有量はそれらの既知の
成分に基づいて計算された。

前記のように、本方法の精度は分析に他の血漿成分を考
慮に入れることにより改善され得る。

層詳細には、代謝物質、すなわち乳酸塩、バリンおよび
ヒドロキシブチル酸は、第３図中に示されているように
、小さいけれども認め得る陽子ＮＭＲ信号を発生する。

４つのリポタンパク質成分の場合のように、これらの代
謝物質成分は分離され、また参照ＮＭＲスペクトルが各
々に対して発生され得る。これらの追加的成分は次いで
、試料血漿中のリポタンパク質成分の濃度を一層正確に
決定するべく、上記のようなデコンボリューション処理
に追加される。

多くの変形が本発明の上記の好ましい実施例から可能で
あることは当業者に明らかであろう。たとえば、分極磁
界強度は、ＮＭＲスペクトルをさらに広げるべく、また
それによりデコンボリューション処理の分解能を改善す
るべく太き（され得る。また、測定は他の温度でも行わ
れ得る。選ばれた磁界強度および測定温度にかかわりな
く、選ばれた値が参照スペクトルおよび試料スペクトル
の発生過程を通して一定にとどまることは重要である。

【図面の簡単な説明】

第１図は第１の血漿試料およびそのリポタンパク質成分
の化学シフトスペクトルを示スゲラフ、第２図は別の血
漿試料およびその対応するリポタンパク質成分の化学シ
フトスペクトルを示すグラフ、第３図は第３の血漿試料
およびその対応するリポタンパク質成分の化学シフトス
ペクトルを示すグラフ、第４図は本発明を実施するため
に利用される装置のブロック回路図である。 １０・・・スペクトロメータ １２・・・データリンク １４・・・ダイレクトメモリアクセスチャネルＩ９・・
・ＲＦ送信コイル ２０・・・試料管 ２２・・・ＲＦ受信コイル ）、、’４．’、’。 １．３０ １．２５ １．２０ １．１５ １．１０ メチレン メ　ヂノＶ １．３０ １．２５ １．２０ １．１５ １．１０ ０．９０ ０．８５ ０．８０ ０．７５ ０．７０ Ｉ６２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）各リポタンパク質成分のＮＭＲスペクトルをその成
   分に対する参照スペクトルとして記憶する過程と、 分析すべき血液の血漿または血清試料のＮＭＲスペクト
   ルを取得する過程と、 それぞれの成分係数により定められた大きさで各成分に
   対する参照スペクトルを加え合わせることにより、計算
   された線形状を作成する過程と、 試料のＮＭＲスペクトルに計算された線形状を適合させ
   るべく成分係数を調節する過程と、 少なくとも１つのリポタンパク質成分の濃度をその成分
   係数の値の関数として計算する過程と を含んでいることを特徴とする血液のリポタンパク質成
   分の測定方法。 ２）リポタンパク質成分がＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬお
   よびタンパク質であることを特徴とする請求項１記載の
   方法。 ３）ＮＭＲスペクトルがメチレンおよびメチル陽子によ
   り発生する少なくとも１つのピークを含んでいることを
   特徴とする請求項１記載の方法。 ４）ＮＭＲスペクトルが化学シフトスペクトルであり、
   また試料ＮＭＲスペクトルが、 ａ）ＮＭＲスペクトロメータ中で試料により形成された
   ＮＭＲ信号を取得すること、 ｂ）取得されたＮＭＲ信号にフーリエ変換を行うこと により取得されることを特徴とする請求項１記載の方法
   。 ５）各リポタンパク質成分のＮＭＲスペクトルが、 ａ）血液の試料からリポタンパク質成分を分離すること
   、 ｂ）ＮＭＲスペクトロメータ中で分離されたリポタンパ
   ク質成分により発生したＮＭＲ 信号を取得すること、 ｃ）リポタンパク質成分のＮＭＲスペクトルを作成する
   べく、取得されたＮＭＲ信号に フーリエ変換を行うこと により形成されることを特徴とする請求項４記載の方法
   。 ６）ｄ）試料スペクトル中の既知のピークをその既知の
   化学シフト値と整列させるべく、試料スペクトルをシフ
   トすることを含んでいることを特徴とする請求項４記載
   の方法。 ７）計算された線形状が、二乗平均平方根を最小化する
   ことにより試料のＮＭＲスペクトルに適合されることを
   特徴とする請求項１記載の方法。 ８）非リポタンパク質成分のＮＭＲスペクトルをその成
   分に対する参照スペクトルとして記憶すること、非リポ
   タンパク質成分に対する参照スペクトルを計算された線
   形状のなかに含めることを含んでいることを特徴とする
   請求項１記載の方法。 ９）各計算されたリポタンパク質成分の濃度を示す印刷
   された報告書を作成する過程を含んでいることを特徴と
   する請求項１記載の方法。 １０）血液の複数のリポタンパク質成分を測定するため
   の装置において、 前記複数のリポタンパク質成分の各１つのＮＭＲスペク
   トルをその成分に対する参照スペクトルとして記憶する
   ための手段と、 分析すべき血液の血漿または血清のＮＭＲスペクトルを
   取得するための手段と、 それぞれの成分係数により定められた大きさで各成分に
   対する参照スペクトルを加え合わせることにより、計算
   された線形状を作成するための手段と、 試料のＮＭＲスペクトルに計算された線形状を適合させ
   るべく成分係数を調節するための手段と、 前記複数のリポタンパク質成分の少なくとも１つの濃度
   をその成分係数の値の関数として計算するための手段と を含んでいることを特徴とする血液のリポタンパク質成
   分の測定装置。 １１）ＮＭＲスペクトルが化学シフトスペクトルであり
   、また試料ＮＭＲスペクトルが、ａ）ＮＭＲスペクトロ
   メータ中で試料により形成されたＮＭＲ信号を取得する
   こと、 ｂ）取得されたＮＭＲ信号にフーリエ変換を行うこと により取得されることを特徴とする請求項１０記載の装
   置。 １２）各計算されたリポタンパク質成分の濃度を示す報
   告書を作成するためのプリンタ手段を含んでいることを
   特徴とする請求項１０記載の装置。