JPH0211591A

JPH0211591A - 新規含リン化合物の製造法

Info

Publication number: JPH0211591A
Application number: JP16101288A
Authority: JP
Inventors: Haruo Seto; 治男瀬戸; Tomomi Hidaka; 日高　智美; Satoshi Imai; 敏今井; Atsushi Baba; 淳馬場; Kazuyo Kakinuma; 柿沼　和代; Yasuaki Ogawa; 小川　安昭; Shunzo Fukatsu; 深津　俊三
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1988-06-30
Filing date: 1988-06-30
Publication date: 1990-01-16
Anticipated expiration: 2012-09-03
Also published as: JP2650725B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用範囲）本発明は生理活性、特に抗ウィルス活性を有する新規含
リン化合物及びその製造法に関する。更に詳しくは、本
発明は抗ウィルス活性を有する新規な含リン化合物とし
てのカルボキシホスホノエノールピルビン酸又はその塩
に関する。また、本発明はストレプトミセス属に属する
該化合物生産菌を好気的条件下において培養することか
ら成るカルボキシホスホノエノールピルビン酸又はその
塩の製造法に関する。

（従来の技術と解決しようとする課題）ｃ−ｐ結合を有
する含リン化合物は、その特異なｃ−ｐ結合構造のため
、その化合物の生成メカニズムや機能について幅広く研
究されており、除草活性、抗菌活性、抗ウィルス活性な
どの生理活性を有する物質が数多く報告されている（ｒ
Ｃ−Ｐ化合物の生化学」堀、堀ロ編二東京化学同人）。

これらｃ−ｐ結合を有して生理活性な含り／化合物を製
造する方法は、化学的合成による方法と、微生物の培養
物より採取する方法とに分けることが出来る。化学合成
でｃ−ｐ結合を得るためには過酷な反応条件が必要であ
り、また生理活性物質には光学活性を有する化合物が多
いため、光学活性を有する物質の化学合成法の場合には
不斉化工程又は光学分割工程を必要とする。そこで、合
成法を用いて生理活性な含リン化合物を製造した例とし
ては、各種アミノ酸の−Ｐ０２Ｈ２アナログ化合物の製
造法（Ｄｉｎｇｗａｌｌ等、　「Ｊ、　ＣＨＥＭ、　Ｓ
ＯＣ，ＪＰＥＲＫＩＮ＋、　２ｇｈｓ（＋ｑｇｈ＞）の
他には余り報告例が無い。−方、微生物の培養法でｃ−
ｐ結合を有する生理活性な含リン化合物を得る場合には
、使用微生物の菌種に応じてその微生物に特異な主要生
産物の種類が決まっているのが普通であるから、数多く
の種類の生理活性な含リン化合物を得るためには、多く
の微生物をスクリＩＪングして選択する必要があった。

一方、本発明者らは、ｃ−ｐ−ｃ結合を有する含リン化
合物であって、除草剤として有用であるＳＦ　−１２９
３物質（ビアラホスともいう。特公昭５１−６３９　号
公報）の生合成の研究の過程で、ＳＦ−１２９３物質の
生産菌を用いたＳＦ　−１２９３物質の生産培養時に、
ＳＦ　−１２９３物質の産生に必須であるコバルトを培
地に添加しないと、Ｃ−ＰＯ２Ｈ２構造部分を有するア
ミノ酸であるＭＰ−１０１物質を生産すること（特開昭
５８−２１９１９１号公報）、並びにアコニターゼ阻害
剤であるモノフルオロ酢酸を培地に添加すると、クエン
酸の−ＰＯ□Ｈ２アナログである２−ホスフィノメチル
リンゴ酸を蓄積すること（％開昭６１−２１０９０　号
公報）を報告している。これらの化合物は、いずれも光
学活性な含リン化合物であり、また除草剤として有用な
ＳＦ　−１２９３物質やＬ−２−アミノ−４−（ヒドロ
キシメチルホスフィニル）−・酪酸（Ｌ　−ＡＭＰＢ　
　と称するがΣｊ（スフイノトリシンともいう）の製造
法の改良に用いられる有用な物質である。

同様に、本発明者らはＳＦ−１２９３物質の生産菌を変
異処理して得られるＳＦ　−１２９３非生産株がその培
養液中に、アスパラギン酸の−ＰＯ□Ｈ２アナログであ
るＭＰ−１０３物質（特開昭５８−１４６５９１号公報
）並びにホスホノ蟻酸（特開昭５９−２１６５９２号公
報）などのｃ−ｐ結合を有する含リン化合物を蓄積する
ことを報告している。このように、ＳＦ’−１２９３物
質生産菌を用いてその培養条件を変更したり、あるいは
変異処理して得られる５Ｆ−１２９３物質非生産株を用
いることにより、数多くの新規台リン化合物を生産する
ことが可能である。得られた含リン化合物のうち、ホス
ホノ蟻酸、野−１０３物質は抗ウィルス活性を有し、抗
ウィルス剤として開発が検討されている。上述したよう
に、ＳＦ　−１２９３＠質生産菌を用いて生理活性を有
する新規な含リン化合物を提供することができた。他方
、有用な生理活性を有する新規な化合物を提供すること
は常に要望されている。

（問題点を解決するための手段）更に本発明者らは、ＳＦ　−１２９３物質生産株より変
異処理して得られたＳＦ　−１２９３物質非生産株を培
養することにより、新規な含リン化合物を製造できる可
能性を研究するために１各種の５Ｆ−１２９３物質非生
産株の培養液中の成分を詳細に検討した。

そこで、ある種のＳＦ　−１２９３物質非生産株がその
培養液中に、有用な抗ウィルス活性を有する新規す含リ
ン化合物であるカルボキシホスホノエノールピルビン酸
を蓄積することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、第１の本発明によると、次式（１）％式％（
１）で示されるカルボキシホスホノエノールピルビン酸又は
その塩が提供される。また、第２の本発明によればスト
レプトミセス属に属するカルボキシホスホノエノールピ
ルビン酸生産菌を好気的条件下で培養し、その培養物か
らカルボキシホスホノエノールピルビン酸又はその塩を
採取することから成る該化合物の製造法が提供される。

本発明に用いられるストレプトミセス属に属する微生物
としては、その培養液中に採取するに充分な量のカルボ
キシホスホノエノールピルビン酸を産生できる生産能を
有するものであればどのようなものでもよい。このよう
なストレプトミセス属に属する菌株の一例としては、本
発明者らによってストレプトミセス・バイグロスコピカ
ス（ＦｇＲＭ　−ＢＰＩ３０；　ＡＴＣＣ−２１７０５
）　　のニトロソグアニジン処理によって得られたＳＦ
　−１２９３物質非生産株であるストレプトミセス・ノ
・イグロスコピカスＮＰ−２１３株をあげることができ
る。ストレプトミセス・バイグロスコピカスＮＰ−２＋
３株は微工研に昭和５８年４月１９日以降寄託され（微
工研菌寄第７０４４号）、その菌学的性状は胞子形成が
少ないことを除いて特公昭５１−６３９　号公報記載の
ストレプトミセス・バイグロスコピカスＳＦ　−１２９
３株（微工研条寄第１３０号）と同一である。

このＮＰ−２１３株は他のストレプトミセス属の菌株の
場合に見られるように、その性状が変化し易く、例えば
紫外線、エックス線、薬品等を用いる人工的変異手段で
変異しうるものであって、どのような変異株であっても
カルボキシホスホノエノールピルビン酸の生産能を有す
るストレプトミセス属の菌株はすべて本発明に使用する
ことが出来る。またＮＰ−２１３株では、本発明者らの
研究により、ＳＦ　−１２９３物質生合成上で欠損して
いる工程が明ちかにされており［Ｉｍａｉ等「Ｊ、　Ａ
ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓＪ３７、　＋５０５　（＋９８４
）　）、更に、ＮＰ−２１３株が欠損している酵素タン
ツク（３２Ｋ　−ｄａｌｔｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　）及
びその酵素タンパクを支配する遺伝子領域も明らかｋさ
れている。また、ＳＦ　−１２９３物質生産菌において
は、組み換え現象を利用して、ｉｎ　ｖｉｔｒ。

で変異させたプラスミド中のＳＦ　−１２９３物質生合
成遺伝子を５Ｆ−１２９３生産菌の生合成遺伝子に置換
することによってＳＦ　−１２９３物質非生産菌株を得
ることが可能であり（Ａｎｚａｉ等、　「Ｊ、　Ａｎｔ
ｉｂｉｏｔｉｃｓＪ４１、２２６　（１９８７）　）、
　このような方法によって得られた変異株であっても、
カルボキシホスホノエノールピルビン酸を生産する菌株
であればすべて本発明の方法に用いることが出来る。

本発明の製造法においては、カルボキシホスホノエノー
ルピルビン酸生産菌株を通常の微生物培養に使用される
栄養物を含有する培地で培養する。

栄養源としては、通常の微生物の培養に利用されている
公知のものが使用される。例えば炭素源としては、グル
コース、　＃粉、　グリセリン。

シュークロス、　水飴、　糖蜜等があげられる。

これらは単独あるいは組み合わせて用いられる。

また窒素源としては、大豆粉、　小麦はい芽。

肉エキス、　はプトン、　乾燥酵母、　コーンステイー
プリカー　　硫酸アンモニア、　硝酸アンモニア等が単
独あるいは組み合わせて用いられる。

その他必要に応じて炭酸カルシウム、　食塩。

塩化カリウム、　燐酸塩等の無機塩類を添加することが
出来る。培養法としては液体培養法、特に深部培養法が
最も適している。培養は好気的条件下で行われ、培養に
適した温度は２５〜３５°Ｃであるが２Ｓ〜３１０Ｃが
更に好ましい。培養日数は２〜７日が適当であり、３〜
４日が更に好ましい。

培養ろ液よりカルボキシホスホノエノールピルビン酸を
単離精製するためには、微生物代謝産物をその培養液か
ら単離するために通常用いられる分離精製の方法を用い
ることが出来る。具体的にはカルボキシホスホノエノー
ルピルビン酸は水溶性の酸性物質であることから、その
精製にあたつてはアンバーライトＩＲＡ　−４００、ダ
ウエックス１ｘ　２　、　ＤＥＡＥ−セファデックス等
の陰イオン交換樹脂、もしくはアンバーライトＩＲ−１
２０，ダウエックス５０Ｗ、ＣＭ−セファロースなどの
陽イオン交換樹脂を用いる方法及びセファデックス。

セルロース、　シリカゲル、　カーボン等ヲ使用するク
ロマトグラフィーな適当に組み合わせて行うことが好ま
しい。またカルボキシホスホノエノールピルビン酸は酸
性又はアルカリ性条件下において比較的不安定な物質で
あり、精製工程中の−は中性付近に保つことが好適であ
る。例えばダウエックス１×２カラムに吸着し、食塩水
で溶離する方法はカルボキシホスホノエノールピルビン
酸の精製法として有効な手段である。

カルボキシホスホノエノールピルビン酸の精製にあたっ
ては、カルボキシホスホノエノールピルビン酸の検出の
ために生物検定法あるいは化学的分析法が用いられる。

すなわち生物検定法では、カルボキシホスホノエノール
ピルビン酸含有液ヲ、ＳＦ　−１２９３物質生産菌より
採取した３２に−ｄａｌｔｏｎｐｒｏｔｅｉｎの粗精製
物と反応させたのち、ＮＰ−２１３株を用いてＳＦ　−
１２９３物質に転換して定量する方法が用いられる。ま
た化学的分析法としては展開溶媒ｎ−ブタノール−酢酸
−水（２：Ｉ：ｌ）のセルロース薄層クロマトグラフィ
ーでＲｆ　Ｏ，３のスポットとして検出される（スルホ
サリチル酸。

塩化第二鉄呈色）。

上述した製造法により、本発明の新規な含リン化合物で
あるカルボキシホスホノエノールピルビン酸またはその
塩が得られる。その塩としてはいかなるものであっても
よいが、具体的には金属塩、好ましくはナトリウム、　
カリウムの如きアルカリ金属塩が例示される。

カルボキシホスホノエノールピルビン酸の生理活性につ
いて調べたところ、カルボキシホスホノエノールピルビ
ン酸はモロニーマウス白血病ウィルス（Ｍｏ１ｏｎｅｙ
　ＭＩＪＶ　）を用いて試験するとき、抗ウィルス活性
を有することが判明した。すなわちマウス繊維芽細胞（
ＳＣ−ｌ　ｃｅｌｌ　）にモロニー白血病ウィルス（Ｍ
ｏ１ｏｎｅｙ　ＭＬＶ　）とカルボキシホスホノエノー
ルピルビン酸を添加し一夜放置後、ウィルス検出用のラ
ット上皮細胞（ＸＣｃｅｌｌ　）を重層し、残存するウ
ィルスの作用で多核になった細胞の数を評定することに
よって抗ウィルス活性を判定する時、カルボキシホスホ
ノエノールピルビン酸は、抗ウィルス剤として知られて
いる前記のホスホノ蟻酸と同程度の抗ウィルス活性を有
することが判明した。

第　　１　　表以下に、カルボキシホスホノエノールピルビン酸ナトリ
ウム塩の理化学的性状を記載する。

（１１外観及び性状：無色の油状物（２）溶解性：水に溶けやすいが、エタノール、アセト
ン、酢酸エチル、エチルエーテル等の有機溶剤には溶け
Ｋくい。

（３）　　紫外部吸収スはクトル：末端吸収を示すのみ
である。

（４）　　薄層クロマトグラフィー：展開溶媒　ｎ−ブ
タノール−酢酸−水（２：　ｌ　：　ｌ）のセルロース
薄層クロマトグラフィーでＲｆ　　値０．３に単一のス
ポットを与える。

（５）分子量：２４０（６）Ｈ−核磁気共鳴（ＮＭＲ）スはクトル：重水中で
測定したＨ−ＮＭＲスはクトルを第１図に示す（ＤＳＳ
内部標準）。

＋７１　　”Ｃ−核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル：ジ
オキサンを内部標準として用いて重水中で測定した”Ｃ
−ＮＭＲスはクトルを第２図に示す。

第１図のプロトン罵では５．２および５．５ｐｐｍにエ
キソメチレン基に由来する特徴的な２本のシグナルが観
測された。

また第２図の　カーボン蘭では＋７１．２゜１４９．７
．１０４．２　ｐｐｍ　にそれぞれ下記の構造式におけ
る１位、２位、３位の炭素に由来するシグナルが観測さ
れた。＋７７．４　ｐＩ）ｍのシグナルはＰＶＣ直接結
合しているカルボン酸に由来するもので、Ｐとの結合に
よる大きなカップリングが観測された（Ｊ　＝　２４０
．６　Ｈｚ　）。　また２位の炭素のシグナル。

３位の炭素のシグナルにもＰによるカップリングが観測
された（２位に炭素のカップリングＪ＝９．５　Ｈｚ　
）。

以上の結果より、カルボキシホスホノエノールピルビン
酸ナトリウム塩の構造は次式で示されることが判明した
。

Ｈ以下に本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１ストレプトミセス・バイグロスコピカスＮＰ　−２１３
株（微工研菌寄第７０４４号）を前培養培地（可溶性澱
粉２．０％、ポリはプトン１．０％、肉エキス０．３係
、燐酸水素二カリウム０．０５係：１）Ｉ（７，０）の
１０−に接種した。これを２８°Ｃで２４時間振とう培
養し、更に同培地１２０−に継代して２８０Ｃで２４時
間培養したものをジャーファーメンタ−の種母とした。

ジャーファーメンタ−ではグＡ／　ニア　−スフ、　０
％−大豆粉２．５％、サングレイン１．１％、小麦はい
芽１．１％、乾燥酵母１．１％、グルテンミール０．６
％、燐酸−カリウム０．４５％。

塩化コバルトｏ、ｏｏｏ＋％（…６１ｇ）の組成の生産
培地罠植菌し、２８℃で通気攪拌培養を行った。

６６時間培養後、培養液を遠心分離して菌体を除去し、
上溝液ＩＣｌ０％の割合で活性炭を添加攪拌した後、ろ
過し１．２ｔの培養ろ液を得た。

得られた培養ろ液を５００−のダウエックス１ｘ２（Ｃ
１型）を充填したカラムにかけ、水洗したのち０．３５
モルの食塩水で不純物を除去し、α５モルの食塩水で溶
離した。カルボキシホスホノエノールピルビン酸を含む
両分を濃縮した後、非イオン性多孔質樹脂ダイヤイオン
ＨＰ−２０の３００４を充填したカラムで水で展開して
クロマトグラフィーな行い過剰の食塩や不純物を除去し
た。カルボキシホスホノエノールピルビン酸を含む両分
を濃ルの食塩水でグラジェントクロマトグラフィーを実
施した。カルボキシホスホノエノールピルビン酸を含む
画分を濃縮後、セファデクスＧ−１０の３００−を充填
したカラムでクロマトグラフィーを行い、残存する食塩
を分離した。カルボキシホスホノエノールピルビン酸を
含む画分を濃縮することによりカルボキシホスホノエノ
ールピルビン酸ナトリウムの無色の油状物の約＋２１１
ｖを得た。

（発明の効果）以上述べたよ５に、本発明によれば、ストレプトミセス
属に属するＳＦ　−１２９３物質生産菌の変異株である
ＳＦ　−１２９３物質非生産菌株の培養により、ｃ−ｐ
結合構造をもち且つ抗ウィルス活性を有する新規な含リ
ン化合物であるカルボキシホスホノエノールピルビン酸
を製造できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はカルボキシホスホノエノールピルビン酸す）　
ＩＪウムの重水中で測定したＨ−ＮＭＲスはクトル図で
ある。第２図はカルボキシホスホノエノールピルビン酸
ナトリウムの重水中で測定した１３Ｃ−ＮＭＲスはクト
ル図である。

Claims

【特許請求の範囲】１、次式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）で示されるカルボキシホスホノエノールピルビン酸又は
その塩。２、ストレプトミセス属に属するカルボキシホスホノエ
ノールピルビン酸生産菌を培養し、得られた培養物より
カルボキシホスホノエノールピルビン酸又はその塩を採
取することを特徴とするカルボキシホスホノエノールピ
ルビン酸又はその塩の製造法。