JPH0150714B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は式Ｉ 〔式中、R₁およびR₂は同じであるかまたは異な
つていて、各々は式 で表わされる糖残基Roa（Ｌ−ロードサミン）ま
たは式 で表わされる糖組み合せ−Roa−dF＝CinB（dF
＝２−デオキシ−Ｌ−フコース、CinB＝Ｌ−シ
ネルロースＢ）である〕のアントラサイクリン誘
導体に関する。

さらに、本発明は微生物菌株Ｙ−11472
（「Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen」において受託番号DSM2658
で1983年５月24日に寄託された）の発酵により西
独特許出願第3323025.0号（特願昭59−127644号、
特開昭60−36437号）明細書の記載にしたがつて
製造されたその菌糸体およびその培養液を有機
溶媒で抽出することによつて得られる残渣を薄い
強酸または中程度の強酸で処理することからなる
前記式Ｉの化合物の製法にも関する。

かくして製造された化合物は強力な細胞増殖抑
制作用を有する点に特徴がある。

前記独国特許出願によればストレプトミセスＹ
−11472菌株は約24〜40℃の温度、6.5〜8.5のPH
および好気性条件を維持しつつ常法で栄養培地中
において発酵せしめられる。本発明のアントラサ
イクリン化合物はたとえばPH3.5におけるアセト
ン水溶液での抽出により菌糸体から抽出され、そ
のアセトンは除去しそして水性相をPH7.5におい
て酢酸エチルで抽出する。その培養液体をPH7.5
において好ましくは酢酸エチルで抽出する。菌糸
体および培養液からの酢酸エチル抽出物を一緒
にし、ついで蒸発乾固させて粗残留物を得る。こ
うして得られた残留物は本発明にしたがつて酸処
理に付されることができる。しかしながら、残留
物は前記西独特許出願に記載されているようにさ
らに後処理するのが好ましい。

したがつて、粗残留物をトルエンに溶解しそし
てその溶液をアセテートバツフアー（PH3.5）で
抽出してトルエン相および水性相を得る。この水
性相は以下の方法でさらに後処理される。すなわ
ちPHを7.5に調整した後に水性相を再び酢酸エチ
ルで抽出しそしてその酢酸エチル相を濃縮してい
わゆる粗サイトロジン混合物を得る。

前記西独特許出願によれば細胞増殖抑制作用を
有するアントラサイクリン誘導体はクロマトグラ
フイー法によりこの粗混合物から得ることができ
る。

今や、驚くべきことに、本発明によれば細胞増
殖抑制作用をも有する新規なアントラサイクリン
類は前記の粗残留物またはいわゆる粗サイトロジ
ン混合物が薄い強酸または中程度の強酸で処理さ
れる場合に得られることが見出された。適当であ
るならばたとえばメタノールまたはアセトンのよ
うに水混和性有機溶媒の添加後に加えてもよい
が、適当な酸の例としてはたとえば薄い塩酸、硫
酸、りん酸、ぎ酸、酢酸およびトリフルオロ酢酸
およびその他の酸があげられる。また、この酸処
理はたとえばダウエツクス（Dowex）50x8〔H⁺〕
のようなＨ型の強酸イオン交換体を用いても実施
されうる。この場合、所望の生成物はたとえば塩
溶液を用いてイオン交換体からの溶出により得ら
れる。

この酸処理は室温かまたはわずかに高められた
温度好ましくは37℃において実施される。反応時
間は0.5時間〜数時間であることができる。酸が
結合された後に所望の化合物は反応媒体から抽出
により単離されついで好ましくはシリカゲル上で
カラムクロマトグラフイーにより分離される。

たとえば以下の化合物が本発明方法により得ら
れる。

サイトロジンＳ： 赤色、無定形物質。メタノール、酢酸エチル、
クロロホルムおよびトルエンに容易に可溶、水お
よびヘキサンに不溶。

薄層クロマトグラフイー：シリカゲル60F₂₅₄
「メルク」、溶媒系Ｂ（クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸／水＝70：20：10：２）使用による
R_f＝0.67。

UV_nax：236、252（シヨルダー）、293、497およ
び563nm（メタノール／10％1N HCl中におい
て）。

NMRスペクトル：第１図参照 C₄₈H₆₄N₂O₁₇、分子量（計算値）940（FAB−
MSで確認された）。

サイトロジンＳはR₁が−Roaを意味しそして
R₂が−Roa−dF＝CinBを意味する式Ｉを有す
る。

サイトロジンＴ： 赤色、無定形物質。メタノール、酢酸エチル、
クロロホルムおよびトルエンに容易に可溶。水お
よびヘキサンに不溶。

薄層クロマトグラフイー：シリカゲル60F₂₅₄
「メルク」、溶媒系Ｂ（クロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸／水＝70：20：10：２）使用による
R_f＝0.53。

UV_nax：236、252（シヨルダー）、293、496およ
び563nm（メタノール／10％1N HCl中におい
て）。

NMRスペクトル：第２図参照 C₄₈H₆₄N₂O₁₇、分子量940（FAB−MSで確認さ
れた）。

サイトロジンＴはR₁が−Roa−dF＝CinBを意
味しそしてR₂が−Roaを意味する式Ｉを有する。

上記の新規なサイトロジンの外に既に既知であ
るβ−ロドマイシン〔ロドマイシンＡ、
「Naturwiss.」第37巻第492頁（1950）および同
第42巻第154頁（1955）参照〕も生成される（式
Ｉ、式中R₁およびR₂は各々−Roaを意味する）。

本発明によるサイトロジン類は強力な細胞増殖
抑制作用を有する点に特徴がありそして細胞増殖
試験においてL1210白血病細胞に以下の作用を与
えた。

IC₅₀（μg／ml） サイトロジンＳ ３×10^-4 サイトロジンＴ ２×10^-3 上記の細胞増殖抑制作用は以下のようにして測
定される。

指数生長相（RPMI1640中×５×10³／ml）に
おけるL1210細胞を72時間微量滴定プレート中で
種々の濃度の試験物質について培養させる（37
℃、CO₂5％、相対大気湿度95％）。対照物は単の
新培地で培養される細胞からなる。すべての測定
は４回繰り返しの測定として実施される。65時間
後に細胞のDNAを放射性でラベルするために
50μのC14−チミジン（1.5μC／ml）を加える。
７時間培養後に細胞を吸引別し、DNAを５％
強度トリクロロ酢酸で沈殿させそして水ついでメ
タノールで順次洗浄する。50℃での乾燥後に５ml
のシンチレーシヨン液体を加えてDNA中に混入
された放射能を測定する。結果は未処理対照物％
における試験物質での培養後のシンチレーシヨン
指数に関して示される。こうして得られた測定値
から投与量有効曲線が得られ、そしてIC₅₀すなわ
ち試験条件下で放射性チミジンの混入を対照物に
比して50％までに減少させる濃度が決定される。

本発明化合物の毒性は下記のとおりである。

急性毒性： マウスにおけるLD₅₀（静脈内投与による）： 雄 1.15（1.01〜1.31）mg／Kg 雌 1.33（1.16〜1.53）mg／Kg ラツトにおけるLD₅₀（静脈内投与による）： 雄 0.84（0.7〜0.99）mg／Kg 雌 0.92mg／Kg 主な剖検所見は水胸症、腹水症、脾萎縮、薄い
心膜、淡色の心臓および腎臓並びに肝障害であつ
た。

病変は各動物の腎臓、脾臓および心臓に見出す
ことができた。死は１週間後にやつてきた。

マウスのLD₁₀は0.87mg／Kgであることが分かつ
た。

以下に本発明による化合物の製法を実施例によ
り記載する。

実施例 １ 4.5gの粗サイトロジン錯体を250mlの0.2NHCl
に溶解し、この溶液を１時間37℃に加温する。そ
れを冷却した1NNaOHでPH7.5にしついでそれぞ
れ300mlのクロロホルムで４回抽出する。このク
ロロホルム抽出物を真空中で蒸発乾固させる。残
留物（2.1g）を30mlのクロロホルム／メタノー
ル／氷酢酸／水（50：50：５：２）（系Ａ）混合
物中に溶解しそして系Ａに懸濁させた200mlのシ
リカゲル60「メルク」40〜63μのカラムに適用し
ついで同一系Ａで溶離させる。100mlの初留分の
後に10mlのフラクシヨンを集めついで薄層クロマ
トグラフイーにより分析する〔シリカゲル60F₂₅₄
「メルク」、系Ｂ：クロロホルム／メタノール／氷
酢酸／水（70：20：10：２）〕活性物質は以下の
フラクシヨンで現れる。

18〜31：サイトロジンＳおよびサイトロジンＴ 45〜67：β−ロドマイシン フラクシヨン18〜31を一緒にし、クロロホルム
相が分離するまで５％強度のNa₂HPO₄水溶液を
加え、そのクロロホルム相をそれぞれ１容量の
Na₂HPO₄溶液および水で洗浄し、無水硫酸ナト
リウム上で乾燥させついで真空中で濃縮しそして
残留物をヘキサンで沈殿させる。

サイトロジンＳ成分およびサイトロジンＴ成分
からなる混合物の収量540mg。

実施例 ２ 実施例１にしたがつて得られたサイトロジンＳ
およびＴの混合物300mgを20mlの系Ｂ溶媒（実施
例１参照）に溶解し、その溶液を同一系に懸濁さ
せた100mlのシリカゲル60「メルク」15〜40μのカ
ラムに適用しそして系Ｂ溶媒で溶離させる。100
mlの初留物の後に各５mlの活性フラクシヨンを集
める。

21〜32：サイトロジンＳ 160mg 41〜80：サイトロジンＳ＋少量サイトロジンＴ
35mg 81〜100：サイトロジンＴ 40mg 上記各フラクシヨンを一緒にし、これに５％強
度のNa₂HPO₄水溶液をクロロホルム相が分離す
るまで加え、このクロロホルム相をそれぞれ１容
量のNa₂HPO₄溶液および水で洗浄し、無水硫酸
ナトリウム上で乾燥させついで真空中で濃縮して
残留物をヘキサンで沈殿させる。

純粋なサイトロジンＳの収量は160mgであり、
そして純粋なサイトロジンＴの収量は40mgであつ
た。

実施例 ３ 1.1gのサイトロジン錯体を60mlの0.2Nぎ酸に溶
解し、その溶液を24時間37℃に加温する。薄層ク
ロマトグラフイーによりわかるようにサイトロジ
ンＳおよびＴを含有している前記溶液を
1NNaOHでPH7.5にし、ついで実施例１のように
後処理する。

実施例 ４ 28mlのH₂O中における0.5gのサイトロジン錯体
の溶液に0.64mlのトリフルオロ酢酸を撹拌しなが
ら加え、ついでその混合物を４時間室温で放置す
る。この溶液を実施例１および２のように後処理
してサイトロジンＳおよびサイトロジンＴを得
る。

前記各実施例における各成分は下記の測定条件
を使用して同定された。

プロトン共鳴スペクトル（ ¹H−NMRスペク
トル）はHX−270ブルカーフエリエ変換核磁気
共鳴分光計を使用して270MHzにおいて記録され
た。製造の直後、各溶液は99.5％D₂O中にける５
％Na₂CO₃0.1mlと共に振盪され、分析のための各
濃度は99.8％CDCl₃0.5ml当り２〜４mgであつた。

添付図面中の星印＊により示される信号は10^-3
範囲の低分子量汚染からおよび残留溶媒から由来
している。

質量スペクトルはFAB（高速原子ボンバードメ
ント）イオン源を使用するMS−902 Ｓ（AEI）質
量分析計を用いて記録された。各物質は随時塩化
アンモニウムが添加されてイオン源中のチオグリ
セロールのマトリツクス中に挿入された。

以下に本発明による製剤例を示す。

処方例 静脈注射用の凍結乾燥組成物の調製 マンニトール80gおよび塩化ナトリウム5gを注
射用蒸留水800ml中に溶解する。次にサイトロジ
ンＳ（塩基）200mgを注射用蒸留水10ml中に超音波
を用いて懸濁させ次いでグルコン酸40〜100mgを
加えることによつて溶解させる。この溶液を撹拌
下に先のマンニトール−塩化ナトリウム溶液と一
緒にし、注射用蒸留水で満たして1000mlする。こ
の得られた還元剤を滅菌した滅菌膜（0.2μm）に
通して過し、その滅菌液を滅菌した５mlガラ
スびん中に集める。その後、溶液の入つたこれら
のびんを当業者に知られた方法（例えばK.E.
Avis氏等著「Pharmaceutical Dosage Forms」
第１巻、第245〜251頁、Marcel Dekker社発行、
1984年参照）によつて凍結乾燥する。各々のびん
はサイトロジンＳ−グルコネート１mgを含有し、
それを注射用蒸留水10ml中に溶解すると静脈注射
用のほぼ等張な溶液が得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図はそれぞれサイトロジンＳ
およびサイトロジンＴのNMRスペクトル曲線を
示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式Ｉ （式中、R₁およびR₂は異なりて各々は式 で表わされる−Roaまたは式 で表わされる−Roa−dF＝CinBであることがで
   きる） で表わされる化合物または薬学的に許容しうる酸
   付加塩。 ２ 式中、R₁が−Roaを意味しそしてR₂が−
   Roa−dF＝CinBを意味する前記特許請求の範囲
   第１項に記載の化合物。 ３ 式中、R₁が−Roa−dF＝CinBを意味しそし
   てR₂が−Roaを意味する前記特許請求の範囲第
   １項に記載の化合物。 ４ 菌株Ｙ−11472（DSM2658）を発酵させ、そ
   の菌糸および培養液を有機溶媒で抽出すること
   により得られる粗サイトロジン混合物を室温また
   はわずかに高められた温度において薄い強酸また
   は中程度の強酸で処理しついで所望生成物を抽出
   およびクロマトグラフイーにより単離させること
   からなる、式Ｉ （式中、R₁およびR₂は異なりて各々は式 で表わされる−Roaまたは式 で表わされる−Roa−dF＝CinBであることがで
   きる） で表わされる化合物の製法。 ５ 塩酸、硫酸、りん酸、ぎ酸、酢酸またはトリ
   フルオロ酢酸が酸として使用される前記特許請求
   の範囲第４項に記載の方法。 ６ 式中、R₁が糖残基−Roaを意味しそしてR₂
   が糖組み合せ−Roa−dF＝CinBを意味する式Ｉ
   の化合物が製造される前記特許請求の範囲第４項
   に記載の方法。 ７ 式中、R₁が糖組み合せ−Roa−dF＝CinBを
   意味しそしてR₂が糖残基−Roaを意味する式Ｉ
   の化合物が製造される前記特許請求の範囲第４項
   に記載の方法。 ８ 式Ｉ （式中、R₁およびR₂は異なりて各々は式 で表わされる−Roaまたは式 で表わされる−Roa−dF＝CinBであることがで
   きる） で表わされる化合物および薬学的に許容しうる担
   体を含有する細胞増殖抑制剤。