JPH01500354A - トキソイドを製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 トキソイドを製造する参椿方法 本発明はトキンイ−の製造に関する。更に特定的には、本発明は、特にＨ２Ｏ２ でのトキシンの化学的不活性化のための新規方法、およびそれからの無細胞性の 脱毒素化されたワクチンの製造に関する。

技術の状態 百日咳（ＷｈｏｏｐｉｎｇＣｏｕｇｈ　（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　）　）は、微生 物ボルデテラ・パーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕａｓｉａ）によ り生じる感染性疾病である。この疾病の発生率は、免疫により有効に制御できる 。現在、国立および世界保健機構は、幼児が百日咳の発生および蔓延を防止する ために免疫されることを推奨している。

３つの型のワクチンが、ボルデテラ拳パーツシスに対する免疫のために使用され てきた。最も広く使用されたワクチンは、もはや生きていない全ボルデテラｅパ ーツシス微生物からなるものである。このワクチンは、疾病の予防には有効であ るけれども、それと結び付いたいくつかの問題を有している：１）投与は局所紅 斑を導き、２）使用は高められた温度、一般的なりらだちおよび不安の続発と結 びついており、そして３）ある場合には、投与は重篤な神経性続発症を導くこと が論争されてきた。他のワクチンにおりては、パーツシス成分が尿素抽出物とし て製造された。この生成物はほぼ１９６９から１９７４年にかけて使用されたが 、現在は市場から取り去られている。日本において、新物質はすべての培養上清 蛋白質を含有し、そして微生物の培養の可変性の故に、最終組成物が様々であり うる。加えて、不活性化剤としてグルテルアルデヒ「またはホルムアルデヒドの 使用は、活性トキシンへの逆戻りを受ける凝集した物質をしばしば導きうる。そ れらアルデヒド類は、化学的に不安定であり、かくしてトキソイド類が活性トキ シンへの逆戻りを受けるようにするシック塩基の形成を生じるものと信じられる 。

従来知られて−る方法による他のトキシン、たとえば破傷風、ジフテリアおよび コレラトキシンの製造は、同様の欠点を有している。それ故、望ましくない成分 をよび効果が実質的に有しなり安全なそして安定な無細胞トキシン類を製造する 改善された方法の必要性は、極めて明らかである。

発明の概要 従って、本発明の目的は、通常悪い副作用を生じる不純物、たとえはエンドトキ シンおよび他の毒性物質を有しない百日咳ワクチンを製造することにある。

本発明の更に他の目的は、百日咳に対し感受性の宿主を、該宿主に本発明に従い 製造された抗原の免疫原量を投与することにより保護する方法を提供することに ある。

他の目的および利点は、本発明の詳細な説明が進行するにつれて明らかとなろう 。

図面の簡単な説明 本発明のそれらおよび他の目的、特徴および多くの随伴する利点は、以下の詳細 な説明を読み、添付の図面に関連して考えるとき、よりよく理解きれるであろう 、そこで： 第１図は、百日咳トキシンの過酸化水素不活性化のカイネテイツクを示し； 第２図は、プレートキソイドおよびＰＴＨ−０６１，キソイドのドデシル硫酸ナ トリウム（ＳＤＳ　）ポリアクリルアミドデル電気泳動（ＦＡ、ＧＥ　）を示し ：そして、第３図は、百日咳トキソイド類の安定性を示す。

発明の詳細な説明 本発明の上記および他の目的、ならびに利点は、少くとも部分的に精製されまた は単離されたトキシンを、該トキシンの免疫原性質を維持しながら該トキシンを 化学的に不活性化するのに充分な量における酸化剤で処理し、その後完全なトキ ソイドまたはその部分を回収し、そしてそれからワクチンヲ製造することＫよる トキソイｒの製造法によって達成される。

ここで使用される用語１酸化剤′は、たとえばシスティン、シスチン、メチオニ ル、トリプトファンおよび（または）チロシンのようなアミノ酸残基が生じるペ プチｒ鎖中のある特異位置においてトキシンを酸化する任意の薬剤を意味する。

そのような酸化剤はまた、有機性または金属性でありうる。そのような酸化剤の 好ましい例は、この技術分野においてよく知られている過酸化水素、過酸化ナト リウム、Ｎ−クロロ−４−メチル−ベンゼンスルホンアミドナトリウム塩（クロ ラミン−Ｔ）、過ギ酸、ジオキサンパーオキサイド、過ヨウ素酸、過マンガン酸 ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウム等である。そのような酸化剤の中で、Ｈ２Ｏ 。

は、その取扱いの容易さ、費用要素および容易入手性の故に特に好ましい。

他に特定的に限定しなり限り、ここに使用される科学的および技術的用語は、本 発明が属している技術分野において通常の熟練度の者により一般に理解されると 同じ意味を有する。ここに引用されるすべての文献は、引用によりここに合体さ れる。ここに記載するものと任意の同様のまたは均等の方法および物質は、本発 明の実施のためにまたはここに示す試験のために使用できるけれども、好ましめ 方法および物質をここに記載する。

ここで使用する用語１実質的に′精製されたまたは単離されたは、トキンイＶが 宿主に投与されるとき、少くとも悪い反応を生じるようなそれら粒子または可溶 性細菌夾雑物または不純物を有しない程度にトキシンが分離されおよび（または ）！Ｍ製されたことを意味する。

出発物質は、精製された細菌製剤である必要のないことが認められる。部分的に のみ分離されまたは精製された製剤は、ここに記載した方法に丁度良く役立ちう る。酸化剤での処理を除き、本方法の基本の工程は、引用によりここに合体され るセクラ（８ｅｋｕｒａ　）等によってジャーナル・オプ・パイオル・ケム（Ｊ ｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂｉｏｌ、　Ｃ！ｈ、ａｍ、　）、２５８：１４６４７〜１ ４６５１（１９８３）中に記載されたのと同様であり、そしてここに説明のため の例として百日咳ワクチンを使用して略述する。

（１００〜２００メツシユ）はバイオラド（ＢｉｏＲａｄ）からえ、臭化シアン −活性化セファローズ４Ｂはファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）から購入し 、モしてスピロ法により製造されたフェツイン（ｆθｔｕｉｎ　）はギデコ（Ｇ ｉｂｃｏ　）から得た。トハマ株（５ｔｒａｉｎ　Ｔｏｈａｍａ　）からの繊条 ヘムアグルチニンおよび百日咳トキシンはコーラエル（Ｃ０Ｗ６１１１　）等に よりセミナーズ・イン会イン７エクシアス会デジーゼズ（Ｓｅｍ１ｎａｒｓ　１ ｎｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　）　、■巻：バクテリアル・パク シンズ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　）、４　：　３７１〜３７９ ランチ（Ｐｅｒｔｕａｓｉｓ　Ｂｒａｎｃｈ　）、オフィス・オデ１１　ハイオ ロジックス（０ｆｆｉｃｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ　）、ベセスダ（Ｂｅｔ ｈｅｓｄ、ａ　）　、メリーランド（ＭＤ）で維持されているコレクションから のものであった。この研究に使用した他の物質は、試薬品質のものであり、そし て普通の供給者から得た。

フエツインアフイニテイ樹脂は、製造業者の推奨する方法に従い、フェツイン２ ００〜を臭化シアン−活性化セファローズ４Ｂ２５．９とカップリングさせるこ とにより製造した。

微生物の培養−ビー・パーツシス（オフィス・オフーバイオロジックス、１６５ 株）の凍結乾燥培養物を開封し、そしてポルプツト−ジエンゴー（Ｂｏｒｄａｔ −ＧｅｎｇＯｕ　）血液寒天プレート上、３７℃で２回通過させた。２つのプレ ートの各々からの生育物を、ついで発端培養物を接種するのに使用しく５００１ １／容フラスコ中、ステイナー−ショルテ培地（Ｓｔａｉｎｅｒ−８ｃｈｏｌｔ ｅｍｅｄｉａ　）　２００　Ｎ　（ヒユーレット（ＨｅＷｌｅｔｔ　）等、ジエ ー・バクチリオル（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）、１２７：８９０〜８９８ ．１９７６）：ｌ、それを３７°Ｃで振盪しつつ１夜インキユベートした。ステ イナー−ショルテ培地１．３１を含有する７エルンバツク（Ｆｅｒｎｂａｃｋ　 ）フラスコに、発端培養からの生育物を０．０５および０．１の間の初期Ａ６５ ０に接種した。細菌をついで、ジャイロ回転振盪機上、６６℃において、約４０ から６０時間、２．５および２．８の間のＡｌ５５゜に培養した。

細菌は、もちろん、この技術分野においてよく知られた他の条件下に生育しえ、 そして容量は所望により適当に調節しうる。加えて、ビー・パーツシスの他の株 もまた使用しうる。

パーツシストキシンの検定−この技術分野においてよく知られたいくつかの技術 が、トキシンの評価のために使用しうる。精製の通程で使用される定常的急速検 定のためには、百日咳トキシンの血球凝集活性は、アイロンズ（工ｒｏｎｓ　） 等によりビオキム―ビオフイズ―アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、、　Ｂｉｏｐｈｙａ 、　Ａｃｔａ　）　５　Ｆ３　Ｑ　：　１７５〜１８５（１９７９）に記載され た如くガチョウ赤血球を使用してめた。リンパ琢増加−促進活性は、サト−（５ ａｔＯ）等によりインフエクト番イミューン（工ｎｆｅｃｔ、工ｍｍｕｎ、　） 　６　：　８９９〜９０４　（１９７２）に記載された如くに検定した。リンパ 球増加−促進活性の１単位は、注射後６８目に１０．０００白面球／ｌ上記背景 の増加を生じる物質の童と定義される。百日咳トキシイの高度にｎｗ−ａれた製 剤で、血球凝集およびリンパ球増加−促進活性は、それぞれｍｇ当り約１５０． ０００および３０．０００単位である。トキシンはまた通常の酵素−結合免疫吸 収検定（ＥＬ工ＳＡ、　）により測定される。精製されたヤギ抗−百日咳トキシ ンが、静止層を被接するために使用された。抗原−含有製剤との反応の後に、静 止層を抗体−アルカリホスファターゼ付加物と反応させ、そして百日咳トキシン を標準方法に従い生成したアルカリホスファターゼ活性により評価した。同様な 技術を繊条ヘムアグルチニンを評価するために使用した。

他の方法−酸ゲル系中での電気泳動は、ライスフィールド（Ｒｅｒｓｆｉｅｌｄ 　）等、ネーチュア（Ｎａｔｕｒｅ　）１９５：２８１〜２８３（１９６２）の 方法に従い遂行した。ＳＤＳ　ｌｆル電気泳動は、レム＋）　（Ｌａ０ｍｍ１ｉ 　）によりナラ・ニュー・ピオル（Ｎａｔ、　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ、　）２２７： ６８０〜６８５（１９７０）に記載された如くに遂行した。検体を、ＥＩＤＳ− ゲル電気泳動のために、００μｊの最終容量中の蛋白質１０〜５０μｇを％ＳＤ Ｓで処理することにより製造し、そして２％β−メルカプトエタノールの存在ま たは不存在におりて、１００°Ｃで約２分間加熱した。二次元電気泳動のために 、非還元検体を、先ずレムリプルを使用して操作した。それらのゲルから細片を 切り取り、そして１％β−メルカプトエタノールを含有する流動バッファー中に １時間浸漬した。流動バッファーで充分に洗滌ｌ−た後、流動ゲルを細片の囲り にかけ、そして電気泳動を第２の面で行った。ゲルをクマシーープル−（Ｏｏｏ ｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ　）で染色した〔オークレイ（０ａｋｌｅｙ　）等、アナ ルーパイオケム（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　１０５　：　３６　’１ 〜３６３．１９８０）。コダック（Ｋｏｄａｋ　）　ＫＡＲ，−２フイルムを、 ３２Ｐ−標識蛋白質のオートラジオグラフィのために使用した。密度計測を、パ イオメツド嗜デンシトメーター（Ｂｉｏｍｅｃｌ　ｃｌｅｎｓ’ｉｔｏｍｅｔｅ ｒ　）で、６３３　ｎｍにおいて遂行した。

アミノ酸分析は、オリベイラ（０１ｉｖｅｉｒａ　）等によりジエ・パイオルｅ ケム（Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　）　２５４：４８９〜５０２（１９７９） に記載された如くに行った。カルボキシメチルシスティンは、標準ヨウドアセト アミド反応での還元および非還元検体（ＳＤＳ複合体につき上に記載した如く製 造した）の反応の後に測定した。

蛋白質は、ロー！ｊ　（Ｌｏｗｒｙ　）等のジエ・パイオル・ケＡ（、ｒ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）　１９５　：　２６５〜２７５（１９５１）の方法に より、ウシ血清アルブミンを標準として使用して測定した。多くの検体はこの検 定を妨害する物質を含有するので、測定は５％トリクロロ酢酸での蛋白質の処理 後に得られた沈澱を使用して行を、４℃において６０００Ｘ、！ｉ＋で６０分間 の遠心分離により製造した。上清Ｉ　ＨＯＩでｐ）１６．０に論節し、そしてア フイーデルφブルー（Ａｆｆｉ−Ｇｅｍ　ｂｌｕ、ｅ　）　（上清ｌ当り充填し た樹脂１０１／）を加えた。生成した泥状物を、４℃で４８時間攪拌した。樹脂 を約２時間沈積させ、そして上澄液を吸引した。引続く精製の工程は、約２５℃ で遂行した。樹脂をついでカラム（６Ｘ７ｃｊｌＬ）に充填し、・そして０．２ ５　Ｍリン酸ナトリウム（ｐ）１６．０）４５　Ｑｍ、ｏ、ｏ　５Ｍ　）リス− ＥＣ１（ｐｌ（７，４）　（バッファーＡ）４５０１！／、および０．７５　Ｍ 塩化ナトリウムを含有するバッファーＡ　４５０　ｍｌで、約２５０１１６７時 間の流速において溶出した。活性を示す画分を貯え、等容量の水で希釈し、そし てフェツイン−アガロースカラム（２，５ｘ　７儂）に適用し、そして約４０Ｒ １／時間の流速で次の如く溶出した：バツファーＡ４　（）　ｍｌ　；１Ｍ塩化 ナトリウムを含有するバッファーＡ４０　”　＊および４Ｍ塩化マグネシウムを 含有するバッファ−Ａ４０ｍ１ｏ百日咳トキシンを含有する画分を貯え、そして ０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有するバッファー人で平衡化したセファデックスＧ −２５（２，５Ｘ３５ｃｍ）カラムに通過（３０１／／時間うさせた。蛋白質を ついで、固体５Ｒ酸アンモニウム（０，６５１１／Ｉｌｌ　）を加え、そして４ °Ｃで１夜攪拌することにより沈澱させた。

２０．０００　Ｘ　、９および４℃における３０分間の遠心分離により採取され た沈＃をバッファーＡに再懸濁し、それに固体硫酸アンモニウム（０−６５ｇ７ ｍｌ　）を加えた。このバッファー中に４℃で貯蔵して、トキシンは数ケ月安定 である。

上記方法により製造した百日咳トキシンは、１５％ＳＤＳゲル上電気泳動により 決定して、分子量約３１．０００．２６，０００．２５．０００および１１５． ０００の未同定サブユニットから構成される単一蛋白質である。

過酸化水素との反応のための製造において、上記の如く製造した百日咳トキシン を、適当なバッファー中に、約０．１から０．５′１１ｇ／ｄまでの蛋白濃度に おいて移す。この技術分野においてよく知られているたとえばボレート、カーボ ネート、トリス、ホスフェート、バークロレート等のようなバッファーが適当で あり、そして反応…は約３．５から８．５またはそれ以上までで可変であり、反 応ｐｉ（それ自体は臨界的要素でないことが理解される。不活性化を好ましいｐ Ｈ８，５で行うとき、好ましい反応混合物は、０．１Ｍホウ酸ナトリウム、−８ ゜５；０゜００１ＭナトリウムＢＤＴＡ　、　ＰＨ８，５；０．０００１　Ｍ硫 酸第二鉄または他の金属塩、たとえば塩化第二鉄、硫酸第一または第二鉄、およ び他の金属塩、たとえば塩化コバルト、塩化クロム等；１．２％過駿化水素：お よび１０％までの飽和硫酸アンモニウム。

反応速度は、過酸化水素、硫酸銅、二鉄およびＫＤＴＡの濃度に依存する。上記 の如き第二鉄イオンあるいは他の微量金属塩またはイオンは、不活性化がキＩ／ 　−）化剤たとえはＥＤＴＡ　（エチレンジアミンテトラアセテート）により妨 害または制御されうるので必須である。

反応は一般に約３７℃で遂行され、そして反応の程度はトランスデュシンの百日 咳トキシン触媒ＡＤＰ−リボシル化および上記のガチョウ赤血球の百日咳トキシ ン仲介凝集を検定することにより追跡する。過酸化水素での不活性化の時間依存 性を第１図に示す。加えて、データーは、百日咳トキシン特異ＥＬ工ＳＡにおい て、抗原としての生成トキソイドの反応性を示す。百日咳ワクチンとしての使用 に適当な百日咳トキソイドの製剤は、この方法により、約２時間の反応時間を使 用して得られる。過酸化水素との反応は、ＫＤＴＡまたは他のキレート化剤の添 加により、またはカタラーゼの添加により、および（または）媒質たとえばセフ ァデックスＧ−２５等上のゲルｉｖｉにより停止しうる。

百日咳トキソイｒの特徴づけ 上記方法により製造したトキソイド製剤は、第１表および第１図に要約する如き 各種生物学活性につき追跡した。用語ＰＴＨＱ　４、ＰＴＨ−Ｑ　５およびｐＴ ｕ　−０６は、製造された特定ロットを示す。用語１　トキソイＰ′および１プ レートキソイド′は、それぞれ酸化剤での処理の前および後のトキシンの製剤を 示す。それらのデーターは、過酸化水素での百日咳トキシンの処理力ζ無毒性で あるが、天然のトキシンを特異的に指向する抗体と交叉反応し、それによってＨ ２Ｏ２処理トキシンにより保持される強力な抗原品質を実証する免疫学的決定因 子をなお有している製剤を生成する。

硫酸第二鉄の存在において、過酸化水素処理により製造された百日咳トキンイＰ のアミノ酸分析は、組成におけるいくつかの顕著な変化を実証する。硫酸第二鉄 での処理は、第２表に示す如くシスティン、メチオニンおよびチロシンの還元を 生じる。メチオニンおよびシスティン残基の酸化と一致して、システィン酸ある いはメチオニンスルホキサイドまたはスルホンに相当しうる早期溶出アミノ酸の 発現がある。微量金属の存在において過酸化水素処理により達成される化学変形 の性質は容易には逆戻りせず、そして活性トキシンへの逆戻りに対するかく製造 されたトキソイドの安定性を表示する。

微量の金属が反応をキレート化するために好ましいけれども、それらは本発明の 範囲内であることが意図される各徨トキシン類の酸化処理のために必要というの ではない。

第２表 ＰＴＨ−０４およびそのプレートキンイドの選択されたアミノ酸組成 アミノ酸　プレートキソイＰ　トキソイドシスティΔ翫およびメチオニン（０） 　＜　０．０１　０．１８システイン　０．１３　＜　０．０６ メチオニン　０．１５　＜　０．０２ チロシン　０．７２　０．３１ アミノ酸含量は、アラニンに対するモル比として表わしである。

システィン酸およびメチオニン（りに指定される二ンヒｒリン発色値は、アラニ ンおよびメチオニンの値の平均である。

過酸化水素不活性化百日咳トキシンの５ＤＳ−デル電気泳動は、未処理トキシン に対するいくつかの変化を生じる（第２図）ｏｓｉサデユニット（Ｍｒ−３１， ０００）のより高分子量への移動におけるシフトがあり、そして蛋白質バンドは より拡散する。Ｓ　２　（Ｍｒ−２６，０００）およびｓ　３　（Ｍｒ　−２５ ，０００）サブユニットの分解は、未処理トキシンに対し減少する。微量の染色 可能物質が、１１．０００および２５，０００分子量領域の間にみられる。トキ ソイドおよび百日咳トキシンのｓ　４ｐ５（Ｍｒ−１１，０００）成分は等しい 。それらの変化は、過酸化水素による蛋白質の化学的変形と一致する。

どのような理論とも結び付くことなしに、Ｓ５およびＳ４，５パンｒの間に観察 される拡散物質は、多分それらポリペプチドの限定された開裂の結果であると仮 定される。

吸着された百日咳トキソイドの製造 百日咳ワクチンとしての使用のために、百日咳トキソイｒを、適当なアジュバン トたとえばアルミニウムアジュバントに吸着する。

この目的のために、アルヒドロデル〔スーパー７オス・ケミ（５ｕｐｅｒｆｏｓ 　Ｋｅｍｉ　）　ａ／ｓ　〕が使用されたが、リン酸アルミニウムまたは水酸化 アルミニウム、あるいは新たに生成した塩が同等によく使用される。２０および ２００μｌの間の百日咳トキソイｒが、アルミニウム■当りで吸着されて、１当 り２０および２００μｙの間の最終蛋白濃度を与える。一般に、吸着は、通常の ホス７エーＩ・緩衝化塩、ｐＨ７，４中、４°Ｃで振盪しつつ２４〜４８時間で 遂行される。吸着の直前に、トキソイド溶液を０．２２ミクロン濾過器に通す濾 過により滅菌し、そしてチメロサール（１：　１０．［１００；Ｗ／Ｗ）を防腐 剤として加える。くちろん、この技術分野においてよく知られている他の吸着剤 、アジュバント、防腐剤または添加剤がまた使用できる。加えて、百日咳トキソ イドそれ自体が免疫原性である。

百日咳トキソイドに対する血清学的応答吸着された百日咳トキソイドでのマウス の免疫は、ＥＬ工ＳＡにより測定して免疫応答を導き、それは用量および時間依 存性である（第６表、Ｍ６図）。用量応答は３から７５μｇの範囲を超えて投与 される百日咳ワクチンでみられて、７５μｇ用量は２および４週の両方において 最高応答を与える。トキソイＰのすべての用量において誘導される抗体の水準は 、免疫後２週におけるよりも４迦においてより高い。ＣＨ〇−細胞に対する活性 百日咳トキシンの効果を中和する血清抗体の能力を追跡することによる血清学的 応答の測定は、同様の特徴を示す（第４表、第３図）。応答は、用量および時間 依存性である。免疫後２週において、百日咳トキシン中和抗体の顕著な水準は観 察されないが、４週において、最大応答での中和力価増加は７５μＩ用量にお匹 てみられる。

ヘλ 吸着された百日咳トキソイドはまた、アカデデル（ｒｈｅｓｕｓ　ｍｏｎｋｅｙ ｓ　）において免疫応答を導くことが示された（第５表および第６表）。！！１ ＬＩ１３Ａにより測定される百日咳トキシン特異抗体は、同じ参照血清を使用し て患者が１１５の平均ＥＬＩＳＡ応答を与える百日咳から回復した患者から得た 血清にみられると比較しうる応答を生じる。免疫応答はまた、ａＩｌｏ細胞検定 において百日咳トキシンを中和しうる抗体の産生を生じる。

ＣＨＯ細胞検定におけるＥＬ工ＳＡ応答および中和力価の両方は、用量依存性で あると認められ、そしてブースター用量を投与することにより増加する。

第５表 吸着された百日咳トキソイド（ＰＴＨ−０５）を注射した幼若アカデデルのＥＬ ＩＳＡによって測定した百日咳トキシン抗体 １００　９　１．８４２（７）　９５（９）　５８（９）　２９（７）　８５（ ９）５０　９　２．２２；’（６）　６５（９）　２７（６）　２５（８）　５ ９（８）１０　９　２．４１１（３）　２８Ｃ７）　１８（６）　２０（５）　 汐（７）ＰＢＳ　３　２゜３２．３（０）　２．６（０）　３．３（０）　５． ４（０）　２．８（０）幼若アカデデルを、０．２１および７１日に、吸着され た百日咳トキソイドＰＴＭ　−０５で、指示した用量において免疫した。それら 検体の百日咳トキシン抗体を地理的平均として示し、そしてそれらの免疫前水準 の４倍もしくはそれ以上の上昇を有するサルとして指定されたリスボンダーの数 をかっこ内に示す。

吸着された百日咳トキソイド（ＰＴＨ−０５）を注射した幼若アカデデルの百日 咳トキシン中和抗体（ＣＨＯ細胞検定） １００　９　＜５（９）　１６（７）　２３（９）　４４（９）　６（４）　２ ０（８）５０　９　＜５（０）　７（６）　１７（９）　２２（６）　＜５（０ ）　１０（７）１０　９　＜５（０）　１２（３）　１７（７）　１４（６）　 ６（３）　９（６）ＰＢＳａ　２　＜５（０）　＜５（０）　＜５（０）　＜５ （０）　＜５（０）　＜５（０）ａアカデデルの１頭は、１０の初期ＣＨＯ細胞 力価が観察されたのでこの群から除いた。

幼若アカ／Ｆ′″デルを、口、２１および７１日に、吸着された百日咳トキソイ ドＰＴＨ−０５で、指示された用量において免疫した。結果を、地理的平均とし て、および１０もしくはそれ以上の中和力価を有するサルと指定されたリスボン ダーの数（かっこ内に示す）を示す。

百日咳トキソイドの効力 百日咳トキソイドを、ｅ二＠パーツシス微生物での脳内攻撃に対しマウスを保護 するそれらの能力について試験した（第７表、第６図）。試験した３０ツトの百 日咳トキソイドワクチンで、２週におして計算したｌＣＤ−５０（μｌ蛋白）は 、ＰＴＨ−０４で４４μｇ（８μｓデーターポイントは除いた）、ＰＴＨ−０５ で５１μｓ１そしてＰＴＨ−０６−７５で６０μμであった。

百日咳トキソイドは脳内攻撃に対しマウスを保護する能力を発揮するけれども、 効力は現在のＩＦＤＡの規制を満たすには不充分である。吸着された百日咳トキ ソイドは、蛋白■当り１０マウス保護単位以下を与える。

１０および７５μｇの間の提案されたトキソイド用量は、１回人間用量当り０． ４マウス単位以下を生じる。

百日咳トキソイドワクチンの効力を、致死量の百日咳トキシンでマウスを攻撃す ることにより評価し、た（第８表）。ｘＤ−５０についての蛋白質の量は、ＰＴ Ｈ−０４について５．２μｙＸ：ｐＴａ−０５について４１μｇ１およびＰＴＨ −０６−５０について４．９μｇであると計算された。この検定におけるＰＴＨ −０５の低い効力は、標準ＣＨＯ−細胞中和検定において、中和抗体を誘導する ことにおけるこのロットのワクチンの低い効力を反映している（第４表）。

ヘ一　− 百日咳トキシンの効果 マウスに吸着された百日咳トキソイドで免疫する１時間前に非致死、非免疫原用 量の活性百日咳トキシンを与えたとき、著しい変化がマウス脳内攻撃モデルによ シ判定した効力においてみられる（第９表）。活性百日咳トキシンは、５１μｇ から１２．５μ９までのＥＤ−５０の減少をもたらす。ワクチン効力におけるこ の増加は、ＥＬＩＳＡによシ判定される高められた免疫応答またはＣＨＯ−細胞 中和力価から生じるようではない。

これは全細胞百日咳ワクチンを標準化するために現在使用されている方法である ことが認識されねばならない◎活性百日咳トキシンは悪い反応に強力に貢献しう るので、無細胞百日咳ワクチンを導く九めにここに使用する方法は、活性百日咳 トキシンを最小水準に減少させるように設計される。

アジュバント含量の効果 百日咳トキソイドの効力 ６日咳トキソイドロットＰＴＨ−０６’ｋｓ各種アジュバント／蛋白質比率（第 １０表）に２いて混合した後、ＥＬＩＳＡによる効力（第３表）、Ｃｌ０−細胞 中和力価（第４表シおよびマウス効力（第７表ンにつき追跡した。それら基準の 各々により判定して、蛋白質に対するアルミニウムの比率における増加は、よシ 強力なワクチン金主じた。ロツ）　ＰＴＨ−０６−１０において、１０μｓトキ ソイドにより誘導さｎる応答は、ロットＰＴＨ−０６−７５における５０μｙト キンイドでみられる応答と等価である。

第１０表 プレートキソイドおよびトキソイドロットおよびＰＴＨ−０６サデロツトの蛋白 質およびアルミニウム含量 蛋白質　アルヒドロゲル ロット　（ｔｔ、９／ｍｌ）　（ｍ９　Ａｌ→７’ｍＬ）ＰＴＨ−０４１９００ ，９５ ＰＴＨ−０５１４００，７５ ＰＴＨ−０６−７５１５０１，０ ＰＴＨ−０６−５０１００１，０ ＰＴＨ−［１６−１０２０１・Ｏ トキソイドは、アルヒドロデルに、緩和な振盪で、４６Ｃにお＾て４８時間吸着 させた。　ＰＴＨ−０６バルクトキソイドのビンを、ついで各々２．２１を含有 する５、Ｑ票／容バイヤル中への配送のためにノアーマシー、セクタｗ　ｙ　（ Ｐｈａｒｍａｃｙ　３ｅｃｔｉｏｎ　）　ＣＣ、ＮＩＢに移した。

吸着された百日咳トキソイドの安定性および毒性吸着された百日咳トキソイドは ｑ、　ＥＬ銘Ａ、Ｃ）ＩＯｉ胞検定における百日咳トキシン中和抗体の誘導およ びマウス保護により判定して、４℃で、効力における明らかな変化なしに、６ケ 月までの期間貯蔵され九（第６図〕。吸着された百日咳トキソイドを腹腔内に注 射し九とき、毒性は、白面才数およびヒスタミンに対する感作により判定して、 マウスを注射に引続き３ケ月まで観察したとき、観察されなかった〔第１１表〕 。非吸着６日咳トキノイドの６７℃における３週間を超える貯蔵は、トランスデ ュシンのＡＤＰ−リボシル化により測定して活性トキシ／への逆戻りを導かない （第１２表）。

第１２表 ３７℃で長期間貯蔵された百日咳トキソイド製剤におケルトランスデュシンＡＤ Ｒ−リボシル化活性ＡＤＰ−リボシル化活性 ６７℃にお　（＋ｊ当シの単位〕 ける日数　ＰＴＨ−Ｑ４　ＰＴＨ−０５０＜３０　２７０ ８　＜３０　＜３０ １４　＜３０　５２ ２５　＜３０　３７ 過酸化水素不活性化百日咳トキシンＣ製剤を指定した日数貯蔵し、ついで受容体 としてトランスデュシンでのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を検定し た。

データーは、参照百日咳トキシン製剤を基礎として計算したｄ当シのトキシンの ナノグラムとして表わされている。

上記の如く過酸化水素での百日咳トキシンの処理は、先行技術製剤で普通に遭遇 する悪い効果がなくて安全である化学的に不可逆性の抗原を生成することは、こ こに提示したデーターから明らかである。更に製剤は、百日咳感染に対し、安定 で、免疫原性で、そして保護性でるる。もちろん、Ｕ８咳トキシンの特定の実施 例江よりここに説明した新規方法は、百日咳トキシンのみに限定されるものでは ない。それは一般的適用Ｏものであシ、そして他のトキシン類、たとえば破傷風 、ジフテリア、コレラトキシン等の製造のために同様に使用できる。

本発明のトキシンがまた、免疫原量のトキソイドおよびこの技術分野においてよ く知られている医薬的に受容しうる担体、たとえば滅菌された生理的塩水、無毒 性の生理的バッファー等からなる医薬組成物に使用しうろことは、もちろん明ら かである。もちろん、この技術分野においてよく知られている殺菌剤、添加剤お よびアジュバントたとえばアルミニウム化合物がまた、そのような製剤中に存在 しうる。

ここに記載した実施例および態様は説明目的のみのためのものであシ、そしてそ の光のもとて種々の変形および変化がこの技術分野において熟練している者に対 し示唆され、そしてこの出願の権限内および添付した請求の範囲の範囲内に包含 されることが理解される。

崎ｒ６１（分、） ＦＩＧ、２ 国際調査報告 一一一−＾’−−”’　ＰＣＴ／ＵＳ８７１０１２’７７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも部分的に単離されたトキシンを、該トキシンの免疫原性質を保持 しながら該トキシンを化学的に不活性化する量の酸化剤て処理し、そしてその後 不活性化されたトキシンまたはその１部分を採取することからなる、トキソイド を製造する方法。 ２．該酸化剤がトキシンを、システイン、シスチン、メチオニン、トリプトフア ンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基が生成するトキシンの べプチド鎖中の特定位置において酸化しうるものである、請求の範囲第１項の方 法。 ３．該酸化剤が、過酸化水素、過酸化ナトリウム、Ｎ−クロロ−４−メチル−ベ ンゼンスルホンアミドナトリウム塩（クロラミン−Ｔ）、過ギ酸、ジオキサンパ ーオキサイド、過ヨウ素酸、過マンガン酸ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウムお よびそれらの混合物からなる群から選択されるものである、請求の範囲第２項の 方法。 ４．該酸化剤が過酸化水素である、請求の範囲第３項の方法。 ５．該酸化剤がクロラミン−Ｔである、請求の範囲第３項の方法。 ６．該トキシンを微量の金属の存在において処理する、請求の範囲第１項に従う 方法。 ７．該金属イオンが第一鉄、第二鉄、コバルトおよびクロムからなる群から選択 されるものである、請求の範囲第６項の方法。 ８．化学的不活性化がキレート剤の添加により制御される、請求の範囲第１項の 方法。 ９．該キレート剤がエチレンジアミンテトラアセテートである、請求の範囲第８ 項の方法。 １０．該トキシンが細菌性トキシンである、請求の範囲第１項の方法。 １１．該トキシンが百日該トキシンである、請求の範囲第１０項の方法。 １２．請求の範囲第１項の方法により製造されたトキソイド。 １３．アルミニウム化合物でアジュバント化された、請求の範囲第１２項のトキ ソイド。 １４．寒冷保存された、請求の範囲第１３項のトキソイド。 １５．該トキソイドが宿主に対し免疫原量において投与されるとき、該宿主に保 護抗体を誘導しうる、請求の範囲第１２項のトキソイド。 １６．該トキソイドが百日該トキソイドてある、請求の範囲第１５項のトキソイ ド。 １７．免疫原量の請求の範囲第１２項のトキソイドおよび医薬的に受容しうる担 体からなる医薬組成物。 １８．該トキソイドが百日該トキソイドである、請求の範囲第１７項の医薬組成 物。 １９該トキソイドがアルミニウム塩でアジュバント化されている、請求の範囲第 １８項の医薬組成物。 ２０．感受性宿主に対し、免疫原量の請求の範囲第１項の方法により製造された 百日咳トキソイドを投与することからなる、ボルデテラ・パーツシスに対する保 護免疫を誘導する方法。