KR960010834B1

KR960010834B1 - 변성독소의 신규한 제조방법

Info

Publication number: KR960010834B1
Application number: KR1019880700186A
Authority: KR
Inventors: 디이 세쿠러 로널드
Original assignee: 디이 세쿠러 로널드
Priority date: 1986-06-16
Filing date: 1987-06-04
Publication date: 1996-08-09
Also published as: WO1987007507A1; CN1033003C; ZA874064B; DE3785157D1; EP0269729A1; US4762710A; EP0269729A4; EP0269729B1; GR870917B; ATE87486T1; AU604497B2; IL82825A; CN87104279A; IL82825A0; AU7804787A; KR880701109A; JP2617500B2; JPH01500354A; ES2006763A6; CA1302883C

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

변성독소의 신규한 제조방법

[도면의 간단한 설명]

본 발명의 이들 및 다른 목적들, 특징 및 여러 수반되는 이점들은 첨부 도면들과 연결지어 생각할때 다음의 상세한 설명을 읽고 더욱 잘 이해가 될 것이다.

제1도는 과산화수소로 인한 백일해 독소 불활성화의 역학을 나타내고 ;

제2도는 전구-변성독소 및 PTH-06 변성독소의 소디움 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 나타내고 ;

제3도는 백일해 변성독소의 안정성을 나타낸다.

[발명의 상세한 설명]

[발명의 배경 ]

[기술분야]

본 발명은 변성독소 제조에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 독소를 특히 H₂O₂로 화학적으로 불활성화시키는 것 및 그로부터 비세포, 비독성화 왁진을 제조하는 신규한 방법에 관한 것이다.

[기술상태]

백일해(역해)는 유기체 볼더텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)에 의해 걸리는 전염성 질병이다. 이 질병의 발생은 면역법에 의해 효과적으로 조절될 수 있다. 현재 국가 및 세계 보건 기구에서는 유아는 백일해의 발생과 유포를 막기 위해서 면역시킬 것을 장려하였다.

볼더텔라 퍼투시스에 대한 면역을 위해 세가지 유형의 왁진이 사용되어 왔다. 가장 널리 사용된 왁진은 더이상 살아있지 않은 전체 볼더텔라 퍼투시스 유기체로 구성된다. 이 왁진은 질병을 막는데 효과적인 반면에 그와 관련된 여러가지 문제점들을 가지고 있다 :

1) 투여하면 국부 홍반을 일으킨다. 2) 사용과 더불어 체온 상승 및 일반적으로 초조함 및 불쾌감이 유도된다. 3) 어떤 경우에, 투여에 따라 심한 신경학적 후유증이 야기될 수 있다고 주장되어 왔다.

다른 왁진에서 백일해 성분은 요소 추출물로 제조되었다. 이 제품은 약 1969-1974년에 사용되었으나 지금은 시장에서 회수되었다. 일본에서 새로운 백일해 왁진이 볼더텔라 퍼투시스의 배양물 상등액으로부터 제조되어 사용되고 있다. 이 물질은 모든 배양물 상등액 단백질을 포함하며 유기체 배양시의 변화때문에 최종 조성물이 변할 수 있다. 더우기, 글루테르알데히드 또는 포름알데히드를 불활성화제로 사용하면 때때로 활성독소로 전환되어질 수 있는 응집된 물질을 야기할 수 있다. 이 알데히드들은 화학적으로 불안정한 시프 염기를 형성하여 활성 독소로 전환될 수 있는 변성독소가 되게 한다고 믿어진다. 파상풍, 디프테리아, 및 콜레라 독소와 같은 다른 독소들의 이전의 공지 방법들에 의한 제조물은 유사한 결점들로 인해 고통 받는다. 따라서 바람직하지 못한 성분들 및 효과가 본질적으로 없는 안전하고 안정된 비세포 독소를 제조하는 개선된 방법에 대한 필요성이 매우 자명하다.

[본 발명의 요약]

그러므로 본 발명의 목적은 독소가 화학적 수단에 의해 비가역적으로 불활성화된 변성독소를 제조하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 보통 좋지않은 부작용을 일으키는 내독소 및 다른 독성 물질들과 같은 불순물들이 없는 백일해 왁진을 제조하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 숙주에 본 발명에 따라 제조된 항원의 면역원적 양을 투여함으로 백일해에 걸리기 쉬운 숙주를 보호하는 방법을 제공하는 것이다.

다른 목적 및 이점들은 본 발명의 상세한 설명이 진행됨에 따라 자명해질 것이다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명의 상기 및 다른 목적들과 이점들은 적어도 부분적으로 정제되거나 분리된 독소를 독소의 면역원적 성질을 유지시키면서 독소를 화학적으로 불활성화 하기에 충분한 양의 산화제로 처리한 후 온전한 변성독소 또는 그 일부분을 회수하여 변성독소를 제조하고 그로부터 왁진을 제조하는 방법에 의해 성취할 수 있다.

여기서 사용된 용어 산화제는 시스테인, 시스틴, 메티오닌, 트립토판 및/또는 티로신과 같은 아미노산 잔기들이 있는 펩티드 사슬내의 어떤 특정 위치에서 독소를 산화시키는 임의의 시약을 의미한다. 그러한 산화제들은 또한 유기 또는 금속성일 수 있다. 그러한 산화제들의 바람직한 예에는 과산화수소, 과산화나트륨, N-클로로-4-메틸-벤젠설폰아미드 나트륨염(클로라민-T), 과포름산, 디옥산퍼옥사이드, 과요오드산, Na-과망간산염, 차아염소산 나트륨 및 이 기술 분야에 잘 알려진 유사한 것이 있다. 그러한 산화제들중에서, H₂O₂는 다루기 쉽고 가격이 저렴하고 구하기 쉽기 때문에 특히 바람직하다.

특별히 다르게 정의하지 않는 한, 여기서 사용된 모든 과학적 또는 기술적 용어들은 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 아래에 기술된 모든 참고문헌들은 참고로 여기에 포함시킨다. 여기에 기술된 임의의 유사한 또는 등가적 방법들 및 물질들은 본 발명 수행에 또는 아래에 언급된 시험에 사용될 수 있고, 이제 바람직한 방법 및 물질을 기술한다.

여기서 사용된 용어 본질적으로 정제된 또는 분리된 은 변성독소가 숙주에 투여될때 역 반응을 야기하는 입자 또는 용해성 세균 오염물 또는 불순물들이 없는 정도로 적어도 독소를 분리하고/거나 정제한 것을 의미한다.

출발물질이 정제된 세균 제조물일 필요는 없다는 것을 주지한다. 단지 부분적으로 분리되거나 정제된 제조물이 여기에 기술된 공정에 잘 이용될 수 있다. 산화제로 처리하는 것을 제외한 공정의 근본적인 단계들은 참고로 여기에 포함시킨 세쿠라 일행의 Biol. Chem. 잡지 258 : 14647-14651, 1983에 기술된 것과 유사하고 이제 예시적 실시예로 백일해 독소를 사용하여 개괄한다.

물질 및 방법

물질-Affi-겔 블루우(100-200메쉬)는 바이오래드로부터 얻고, 시아노겐 브로마이드-활성화 세파로스 4B는 팔마시아로부터 구입하고 스피로법에 의해 제조된 페투인은 깁코로부터 얻는다. 균주 토하마로부터의 섬유성 혈구응집소 및 백일해 독소와 이 단백질들에 대한 항체들은 코웰 일행의 전염성 질병 쎄미나 Vol. Ⅳ : 세균왁진, 4 : 371-379(1982)에 기술된 바와 같이 제조된다. B. 퍼투시스 균주들은 MD, 베데스타, 생물사무소, 퍼투시스과에 있는 수집소로부터 얻는다. 이 연구에 사용된 다른 물질들은 시약 품질의 것이고 보통의 공급자로부터 얻는다.

페투인 친화성 수지는 제조업자의 추천 공정에 따라 페투인 200mg을 시아노겐 브로마이드-활성화 세파로스 4B 250g과 커플링시킴으로 제조한다.

유기체의 배양-B 퍼투시스(생물학 사무소, 균주 165)의 동결건조 배양물들을 개구하고 37℃의 보뎃-겐고우 혈액 한천 평판상에 2번 통과시킨다. 두 평판 각각으로부터의 성장물을 출발 배양물(500ml 플래스크내의 스테이너 -솔테 배지(헤레트 일행의 J. Bacteriol 127 : 890-898, 1976) 200m1)에 접종하고 이를 진탕하면서 37℃에서 밤새 배양한다. 스테이너-솔레 배지 1.3ℓ를 포함하는 펜백 플라스크(2.8ℓ)에 출발 배양물질로부터의 성장물을 초기 A650 0.05-0.1까지 주입한다. 세균을 36℃, 120rpm의 회전교반기 상에서 약 40-60시간동안 A650 2.5-2.8까지 배양한다. 물론 세균은 이 기술분야에 잘 알려진 다른 조건들하에서 성장할 수 있고 부피는 필요에 따라 적절히 조절할 수 있다. 더우기 B. 퍼투시스의 다른 균주들도 사용할 수 있다.

백일해 독소의 분석-이 기술분야에 잘 알려진 여러 기술도 독성 평가에 사용할 수 있다. 정제 과정중 사용되는 일반적인 빠른 분석으로, 퍼투시스 독소의 혈구응집 활성은 아이론스 일행의 Biochim, Biophys Acta 580 : 175-185(1979)에 기술된 바와 같이 거위 적혈 세포들을 사용하여 수행한다. 임파구 증가-촉진 활성은 사토 일행의 Infect, Immun. 6 : 899-904(1972)에 기술된 바와 같이 분석한다. 임파구 증가-촉진 활성 1단위는 주사후 3일에 백혈구 10,000/상기 대조물 ℓ의 증가를 야기하는 물질의 양으로 정의된다. 백일해 독소의 잘 정제된 제조물은 혈구응집 및 임파구 증가-촉진 활성이 각각 mg당 약 150,000 및 30,000단위이다. 또한 독소는 통상적인 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 결정한다. 정제된 염소 항-백일해 독소는 부동상을 피복하는데 사용한다. 항원-함유 제조물과 반응시킨 후, 부동상을 항체-알카리성 포스파타제 부가물과 반응시키고 백일해 독소를 표준 공정에 따라 형성된 알카리성 포스타제 활성으로 평가한다. 유사한 기술을 사용하여 섬유성 혈구응집소를 평가한다.

다른 방법들-라이스필드 일행의 Nature 195 : 281-283(1962)의 방법에 따라 산겔 시스템에서 전기영동을 수행한다. SDS겔 전기영동은 래므리의 Nat. New Biol. 227 : 680-685(1970)에 기술된 바와 같이 수행한다. SDS-겔 전기영동용 샘플을 최종 부피 00μℓ내의 단백질 10-50μg을 SDS %로 처리하여 제조하고 2% β-메르캅토에탄올 존재 또는 부재하 100℃에서 약 2분간 가열한다. 2-차원 전기영동에 대해서는, 래므리 겔을 사용하여 비-환원 샘플들을 먼저 작동시킨다. 이 겔들로부터 스트립을 잘라내고 1% β-메르캅토에탄올을 함유하는 작업 완충액에 1시간동안 침지시킨다. 작업 완충액으로 완전히 씻은 후, 작업 겔을 스트립주위에 주입하고 2차원적으로 전기영동을 수행한다. 겔들을 구마시 블루우(옥크레이 일행의 Anal Biochem. 105 : 361-363, 1980)로 염색한다. 코닥 KAR-2필름을 32p-표지 단백질의 자동방사능사진에 사용한다. 밀도측정은 바이오메트 밀도측정기로 633nm에서 행한다.

아미노산 분석은 올리베이라 일행의 J. Biol. Chem. 254 : 489-502(1979)에 기술된 바와 같이 수행한다. 카르복시메틸 시스테인은 환원 및 비환원 샘플들(SDS복합체에 대해 상기한 바와 같이 제조됨)을 표준 아이오도 아세트아미드 반응으로 반응시킨 후 결정한다.

단백질은 표준물로서 소혈장 알부민을 사용하여 로우리 일행의 J. Biol. Chem. 193 : 265-275(1951)의 방법을 사용하여 결정한다. 많은 샘플들이 이 분석을 방해하는 물질들을 함유하기 때문에 5% 트리클로로아세트산으로 단백질 샘플을 처리한 후 얻어진 침전물을 사용하여 결정한다.

백일해 독소의 정제-균주 165의 배양물로 부터의 상등액은 4℃ 6000xg에서 30분간 원심분리하여 제조한다. 상등액을 HCI로 pH 6.0으로 맞추고 Affi-겔 블루우(상등액 ℓ당 패킹된 수지 10m1)를 첨가한다. 형성된 슬러리를 4℃에서 48시간 동안 교반한다. 수지를 약 2시간동안 가라앉히고 상등 용액을 빨아낸다. 계속적인 정제단계들은 약 25℃에서 수행한다. 수지를 컬럼(6×7cm)내에 패킹시키고, 유동속도 약 250m1/h로 pH 6.0의 0.25M 인산나트륨 450m1, pH 7.4의 0.05M 트리스-HCl(완충액 A) 450m1 및 0.75M의 염화마그네슘을 포함하는 완충액 A 450m1를 용출시킨다. 활성을 나타내는 분류물들을 한데 모으고, 동일 부피의 물로 희석하고, 페투인-아가로스 컬럼(2.5×7cm)에 적용하고, 다음과 같이 약 40ml/h의 유동 속도로 용출시킨다 :

완충액 A 40ml ; IM의 염화나트륨을 포함하는 완충액 A 40ml ; 4M의 염화마그네슘을 포함하는 완충액 A 40ml. 백일해 독소를 포함하는 분류물들을 한데 모으고, 0.5M의 염화나트륨을 포함하는 완충액 A로 평형시킨 세파덱스 G-25(2.5×35cm) 컬럼에 통과시킨다(30m1/h의 속도로). 다음에 고형 황산암모늄(0.65g/ml)을 첨가하고 4℃에서 밤새 교반하여 단백질을 침전시킨다. 4℃ 20,000xg에서 30분간 원심분리하여 수집한 침전물을 고형 황산암모늄(0.6g/ml)이 첨가된 완충액 A에 재현탁시킨다. 4℃의 이 완충액에 저장된 독소는 여러달동안 안정하다.

상기 공정에 의해 제조된 백일해 독소는 15% SDS겔에서 전기 영동으로 결정하여 분자량이 약 31,000, 26,000, 25,000 및 11,500인 동일하지 않은 부단위들로 구성된 단일한 단백질이다.

과산화수소로 백일해 독소를 불활성화시킴

과산화수소와의 반응을 위한 제조물에서, 상기한 바와 같이 제조된 백일해 독소를 약 0.1-0.5mg/ml의 단백질 농도로 적당한 완충액내에 옮긴다. 붕산염, 탄산염, 트리스, 인산염, 과염소산염 및 이 기술분야에 잘 알려진 유사한 것과 같은 완충액들이 적당하고 반응 pH는 약 3.5-8.5 또는 그 이상으로 변할 수 있고, 반응 pH 그 자체가 중요한 인자가 아니라는 것을 주지한다. 불활성화가 8.5의 바람직한 pH에서 수행될 경우, 바람직한 반응 혼합물은 pH 8.5의 붕산 나트륨 0.1M ; pH 8.5의 EDTA나트륨 0.001M ; 황산제이철 또는 염화제이철과 같은 다른 금속염, 황산 제일철 또는 제이철 및 염화코발트, 염화크롬과 같은 다른 금속염 및 이와 유사한 것 0.0001M ; 과산화수소 1.2% ; 및 포화 황산암모늄 10%까지를 포함한다. 반응 속도는 과산화수소, 황산제이철 및 EDTA의 농도에 의존한다. 불활성화가 EDTA(에틸렌디아민테트라아세테이트)와 같은 킬레이트화제에 의해 차단되거나 조절될 수 있기 때문에 제이철 이온 또는 다른 미량 금속염, 또는 상기한 것들과 같은 이온들은 필수적이다. 이 반응은 일반적으로 약 37℃에서 수행되고 반응정도는 트랜스두신(transducin)의 백일해 독소 촉매화 ADP-리보실화 및 상기 거위 적혈구의 백일해 독소 매개 응집을 분석함으로 감시한다. 과산화수소로 불활성화하는데 대한 시간 의존도는 제1도에 나타냈다. 더우기 자료는 생성된 변성독소의 반응성을 백일해 독소 특이적 ELISA내의 항원으로 나타냈다. 백일해 왁진으로 사용하기에 적당한 백일해 변성독소 제조물은 반응시간 약 2시간으로 이 방법에 의해 얻는다. 과산화수소와의 반응은 EDTA 또는 다른 킬레이트화제를 첨가함으로 또는 촉매를 첨가함으로 및/또는 세파덱스 G-25 또는 이와 유사한 것과 같은 매체상에서 겔 여과함으로 정지시킬 수 있다.

백일해 변성독소의 특성화

상기 방법에 의해 제조된 변성독소 제조물을 표 1 및 제 1도에 요약된 바와 같이 여러가지 생물학적 활성에 대해 감시한다. 용어 PTH 04, PTH 05, 및 PTH 06은 제조된 특정 로트를 말한다. 용어 변성독소 및 전구-변성독소는 각각 산화제로 처리하기 후와 전의 독소 제조물을 말한다. 이 자료는 과산화수소로 백일해 독소를 처리하면 비-독성이지만 자연 독소에 특이적인 항체와 교체 반응을 하는 면역원적 결정체를 갖고, 이로써 H₂O₂처리된 독소에 의해 잠재적 항원 성질을 나타내는 제조물을 초래한다는 것을 나타낸다.

a 단위/단백질 mg으로 나타낸 혈구응집.

b 혈구중가-촉진 활성-단위/단백질 mg.

c 히스타민 감지 활성-LD₅₀에 필요한 mg.

d 활성 백일해 독소 ng/단백질 mg으로 나타낸 트랜스두신 활성의 ADP-리보실화.

e 세포 집락화 유도에 필요한 단백질의 최종 농도.

황산제이철 존재하에서 과산화 수소 처리로 제조된 백일해 변성독소 제조물을 아미노산 분석하면 조성에 여러개의 상당한 변경이 있음이 나타난다. 황산제이철로 처리하면 표 Ⅱ에 나타난 바와 같이 시스테인, 메티오닌 및 티로신이 환원된다. 시스테인산 또는 메티오닌 설폭사이드 또는 설폰들과 같은 아미노산을 초기에 용출시킨 형태는 메티오닌 및 시스테인 잔기의 산화와 일치한다. 미량 금속 존재하에서 과산화수소 처리로 화학적 성질을 변경시킨 것은 쉽게 역전되지 않으며, 이는 활성독소로의 역전에 대해 생산된 변성독소의 안정성을 표시하는 것이다.

미량의 금속이 반응 촉매화에 바람직하지만, 이들이 본 발명 범위내로 생각되는 여러 독소들의 산화제 처리에 필수적인 것은 아니다.

아미노산 성분은 알라닌에 대한 몰비로 표시한다.

시스테인산 및 메티오닌(O)에 할당된 닌히드린 색소 값은 알라닌과 메티오닌 값의 평균이다.

과산화수소로 불활성화시킨 백일해 독소를 SDS-겔 전기영동하면 처리되지 않은 독소에 비해 여러가지 변화를 야기한다(제2도). S1부단위(Mr=31,000)가 더욱 큰 분자량으로 뚜렷이 이동하였고 단백질 띠가 더욱 확산되었다. S2(Mr=26,000) 및 S3(Mr=25,000) 부단위들의 분해는 처리되지 않은 독소에 비해 감소되었다. 미량의 염색성 물질은 분자량 범위가 11,000-25,000으로 나타났다. 변성독소 및 백일해 독소의 S4, 5(Mr=11,000)성분들은 유사하다. 이 변화들은 과산화수소에 의한 단백질의 화학적 변화와 일치한다. 어떤 이론에 제한됨이 없이, S3 및 S4, 5띠들사이에서 관찰된 확산 물질은 아마도 이 폴리펩티드들의 제한된 절단의 결과인 것으로 가정된다.

흡착 백일해 변성독소의 제조

백일해 왁진으로 사용하기 위해, 백일해 변성독소를 알루미늄 보조제와 같은 적당한 보조제에 흡착시킨다. 이를 위해, Al히드로겔(슈퍼포스 케미 a/s)을 사용하여 왔으나 인산 알루미늄 또는 수산화 알루미늄, 또는 새로이 생성된 염과 같은 다른 흡착제들도 동일하게 잘 사용할 수 있다. 알루미늄 mg당 백일해 변성독소 20-200μg을 흡착시켜서 최종 단백질 농도 20-200μg/m1를 얻는다. 일반적으로 흡착은 24-48시간동안 진탕하면서 4℃, pH 7.4의 통상적인 인산염 완충 염수에서 수행한다. 변성독소 흡착직전에, 용액들을 0.22 미크론 필터를 통과시켜 여과함으로 안정화시키고 티머솔(1 : 10,000 ; W : V)을 방부제로 첨가한다. 물론 이 기술분야에 잘 알려진 다른 흡착제, 보조제 방부제 또는 첨가제들도 사용할 수 있다. 더우기 백일해 변성독소 그 자체가 면역원성이다.

백일해 변성독소에 대한 혈청 반응

흡착 백일해 변성독소에 의한 생쥐의 면역화는 ELISA에 의해 측정된 바와 같이 복용량 및 시간에 의존하는 면역 반응을 일으킨다(표 Ⅲ, 제 3도). 복용량에 관한 반응은 3-75μg범위로 백일해 변성독소가 투여될때 나타나며 75μg의 복용량은 2 및 4주에 가장 높은 반응을 나타낸다. 변성독소의 모든 복용량에서 생산된 항체의 수준은 면역시킨 후 2주보다는 4주에 더욱 높다. CHO-세포상에서 활성 백일해 독소의 효과를 중화시키는 혈장 항체의 능력을 감시함으로 혈청반응을 측정하면 유사한 특징이 나타난다(표 Ⅳ, 제 3도). 반응은 복용량과 시간에 의존한다. 면역화후 2주에는, 백일해 독소 중화 항체의 상당한 수준이 관찰되지 않았으나 4주에는 중화 적정량이 75μg 복용에 나타난 최대 반응으로 증가되었다.

a 생쥐를 덩어리 로트 PTH-06-75로 면역시킴.

b 생쥐를 덩어리 로트 PTH-06-50으로 면역시킴.

c 생쥐를 덩어리 로트 PTH-06-10으로 면역시킴.

생쥐에 3개의 백일해 변성독소 PTH-04, PTH-05, PTH-06 또는 미합중국 참고 세포 백일해 왁진 US-8 0.5ml를 복강내 주사한다. 생쥐를 2 또는 4주 후에 피를 뽑아서 ELISA에 의해 측정하여 이들의 백일해 독소 항체를 평균으로 나타낸다.

a 생쥐를 덩어리 로트 PTH-06-75로 면역시킴.

b 생쥐를 덩어리 로트 PTH-06-50으로 면역시킴.

c 생쥐를 덩어리 로트 PTH-06-10으로 면역시킴.

생쥐에 3개의 백일해 변성독소 PTH-04, PTH-05, PTH-06 또는 미합중국 참고 세포 백일해 왁진 US-8 0.5ml를 복강내 주사한다. 생쥐를 2 또는 4주 후에 피를 뽑아서 백일해 독소에 대한 혈장의 중화 활성을 메써즈 섹션에 나타낸 바와 같이 CHO 세포 분석으로 측정한다.

또한 흡착 백일해 변성독소는 리서스 원숭이에서 면역반응을 초래하는 것으로 나타났다(표 V 및 Ⅳ). ELISA에 의해 측정된 백일해 독소 특이적 항체는 동일한 참고 혈장을 사용하여, 환자들이 115의 평균 ELISA반응을 나타내는 백일해로 부터 회복된 환자로 부터 얻은 혈장에서 나타나는 것과 같은 반응을 초래한다. 또한 면역 반응은 CHO 세포 분석에 의해 백일해 독소를 중화시킬 수 있는 항체들을 생산한다고 나타났다. CHO 세포 분석에서 중화 적정량 및 ELISA반응이 둘다 복용량에 의존하며 두번째 복용량을 투여함으로 증가될 수 있는 것이 밝혀졌다.

어린 리서스 원숭이를 지시된 복용량으로 0, 21 및 71일에 흡착 백일해 변성독소, PTH-05로 면역시킨다. 이 샘플들의 백일해 독소 항체는 기하학적 평균으로 나타냈고 이들의 예비 -면역 수준에 대해 4배 또는 그 이상 상승한 원숭이들로 나타낸, 반응체의 수는 괄호안에 넣었다.

a 초기 CHO 세포 적정량 10이 관찰되기 때문에 이 군으로부터 리서스 원숭이 한마리를 제외시킨다.

어린 리서스 원숭이를 지시된 복용량으로 0, 21 및 71일에 흡착 백일해 변성독소, PTH-05로 면역시킨다. 이 결과들은 기하학적 평균 및 10 또는 그 이상의 중화 적정량을 보인 원숭이를 가리키는 반응체의 수(괄호안에 나타냄)로 제시되었다.

백일해 변성독소의 효능

백일해 변성독소를 B. 퍼투시스 유기체를 사용하여 뇌-내부로의 침투에 대해 쥐를 보호하는 능력에 대해 검사한다(표 Ⅶ 제3도). 시험할 백일해 변성독소의 세개의 로트에 대해, 2주후에 계산된 ED-50(단백질 μg)은 PTH-04가 44μg(8μg 자료점은 배제함). PTH-50가 51μg 및 PTH-06-75가 30μg이었다.

백일해 변성독소가 쥐를 뇌 공격으로부터 보호하는 능력을 나타내지만 그 효능은 FDA의 현 규정에 부합되는 데는 충분하지 못하다. 흡착 백일해 변성독소는 단백질 mg당 생쥐 보호 단위 10미만을 나타냈다. 10-75μg의 제안된 변성독소 투여량은 인간 한명 복용 당 0.4미만의 생쥐 보호 단위를 초래할 것이다.

백일해 독소 치사량을 쥐에 투여함으로 백일해 변성독소 왁진의 효능을 평가한다(표 Ⅷ).

계산된 ED-50에 대한 단백질의 양은 PTH-04가 5.2μg, PTH-05가 41μg가 PTH-06-50이 4.9μg이었다. 이 분석에서 PTH-05의 낮은 효능은 표준 CHO-세포 중화 분석시 중화 항체들을 초래하는 이 로트의 왁진의 낮은 효능을 반영하는 것이다(표 Ⅳ).

a 생쥐를 덩어리 로트 PTH-06-75으로 면역시킴.

b 생쥐를 덩어리 로트 PTH-06-50으로 면역시킴.

c 생쥐를 덩어리 로트 PTH-06-10으로 면역시킴.

생쥐에 3개의 백일해 변성독소 PTH-04, PTH-05, PTH-06 또는 U.S 참고 세포 백일해 왁진 US-8 각각 0.5ml를 복강내 주사한 후 메써드 섹션에 기술된 바와 같이 B. 퍼투시스 유기체를 뇌내부에 2 또는 4주후에 투여한다. 생존수를 연방 규약(111)에 규정된 바와 같이 투여후 14일에 기록한다.

a US-8표준 왁진을 백일해 변성독소 50, 10 및 2μg의 투여량으로 0.05μℓ, 0.01μℓ 또는 0.002μℓ 투여한다.

생쥐에 백일해 변성독소 각각 또는 U.S 참고 백일해 왁진, US-8 0.5μℓ를 주사하고 PTH-04를 주사한 쥐에는 백일해 독소 5.2×LD₅₀을 투여하고 PTH-05, PTH-06 및 US-8을 주사한 쥐에는 15.4×LD₅₀을 투여한다. PTH-04의 ED₅₀은 5.2μg이고 PTH-05의 ED₅₀은 41.0μg이며 PTH-06의 ED₅₀은 4.9μg이었다.

활성 백일해 독소의 효과

쥐에 흡착 백일해 변성독소로 면역시키기 1시간전에 활성 백일해 독소 비-치사적 비-면역원적 투여량을 투여하면, 생쥐의 뇌-내부 침투 모델에 의해 판단되는 바와 같이 효능에 현자한 변화가 나타난다(표 Ⅸ). 활성 백일해 독소는 ED-50을 51μg-12.5μg으로 감소시킨다. 왁진 효능의 이러한 증가는 ELISA 또는 CHO-세포 중화 적정량에 의해 알 수 있는 바와 같이 면역 반응의 증진을 초래하는 것으로 보이지는 않는다. 이것은 전체 세포 백일해 왁진을 표준화 하는데 현재 사용되는 시험으로 알아두어야 한다.

활성 백일해 독소가 역 반응을 가능하게 할 수 있기 때문에, 비세포 백일해 왁진을 생산하기 위해 여기서 사용된 공정은 활성 백일해 독소를 최저 수준으로 감소시키도록 고안되었다.

생쥐를 흡착 PTH-05만으로 면역시키거나 면역전 1시간에 백일해 독소 0.lμg도 정맥 주사함으로 면역시킨다. 생쥐에서 피를 뽑아 혈장을 얻고 다음날, 본문에 개괄된 바와 같이 B. 퍼투시스 유기체를 뇌안에 주사한다. ELISA에 의해 결정된 백일해 독소 항체들은 평균±표준 편차로 나타냈다. CHO 세포 분석에 의해 결정된 백일해 독소 항체들은 기하 평균으로 나타냈다.

백일해 변성독소 효능에 대한 보조제 함량 효과

백일해 변성독소 로트 PTH-06을 다른 보조제/단백질 비로 배합시킨 후(표 X) ELISA(표 Ⅲ), CHO-세포 중화 적정량(표 Ⅳ) 및 생쥐 효능(표 Ⅶ)에 의해 효능을 감시한다. 단백질에 대한 알루미늄비의 증가는, 상기 기준 각각에 의해 평가되는 바와 같이, 더욱 효과적인 왁진을 초래한다. 로트 PTH-06-10내의 변성독소 10μg에 의해 유도된 반응은 로트 PTH-06-75내의 변성독소 50μg으로 나타난 반응과 동일하다.

변성독소들을 살며시 흔들어 주면서 4℃에서 48시간동안 알루미늄 히드로겔에 흡착시킨다. PTH-06 덩어리 변성독소 병을 각각 2.2ml 함유하도록 5.0ml 유리병에 유도하기 위한 제약 부분, C C NIH에 옮긴다.

흡착 백일해 변성독소들의 독성 및 안정성

흡착 백일해 변성독소를 4℃에서 저장하면 6개월까지는 ELISA에 의해 결정된 바와 같이 효능(제 3도), CHO 세포 분석시 백일해 독소 중화 항체들의 유도 및 생쥐 보호에 아무런 변화가 나타나지 않는다. 흡착 백일해 변성독소를 복강내 투여하면, 주사 후 3주동안 생쥐를 관찰했을때 백혈구 수와 히스타민에 대한 감지성으로 판단하여 아무런 독성이 관찰되지 않았다(표 ⅩI). 37℃에서 3주 이상 비흡착 백일해 변성독소를 저장해도 트랜두신의 ADP-리보실화에 의해 측정되는 활성 독소의 전환이 초래되지 않았다(표 XⅡ).

^*DIP-면역후의 날수

^*DPC-침투후의 날수

다섯마리 생쥐의 군들에 PTH-05 1.0ml, Al히드로겔로 알루미늄 0.75mg을 포함하는 PBS 1.0ml 또는 백일해 독소를 포함하는 PBS 1.0ml를 복강내 주사한다. 면역시킨 후 3, 7, 14 및 21일에 쥐에서 피를 뽑아 이들의 평균 WBC를 기록한다. 다음날 기술된 것보다 10배 큰 투여량인 히스타민 히드로클로라이드를 체중 1g당 10μℓ로 생쥐에 복강내 주사한다. 다섯마리 생쥐들의 각각의 군의 생존수를 나타냈다.

과산화수소로 불활성화된 백일해 독소 제조물을 지시된 날수동안 저장하고 수용체로서 트랜스두신 ADP-리보실트란스퍼라제 활성을 평가한다. 자료는 참고 백일해 독소 제조물을 기준으로 하여 계산된 mg당 독소 ng으로 표시했다.

상기한 바와 같이 과산화수소로 백일해 독소를 처리하면 선행기술 제조물에서 보통 부딪쳤던 역효과들 없이 안전한(비-독성인) 화학적으로 비가역적인 항원을 생산할 수 있다는 것이 여기에 나타낸 자료로부터 자명하다. 더우기, 이 제조물은 백일해 감염에 대해 안정하고 면역원적이고 보호적이다. 물론, 백일해 독소의 특정 예에 의해 여기에 기술된 신규한 방법은 단지 백일해 독소에만 국한되는 것이 아니다. 이는 일반적으로 적용될 수 있고 파상풍, 디프테리아, 콜레라 독소 및 이와 유사한 것과 같은 다른 독소들 제조에 유사하게 사용될 수 있다.

물론, 본 발명의 독소는 변성독소 면역원적 양과 살균한 생리적 식염수, 비독성 생리적 완충액 및 이 기술분야에 잘 알려진 이와 유사한 것과 같은 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약학적 조성물에도 사용될 수 있음이 자명하다. 또한 살균제, 첨가제 및 알루미늄 화합물과 이 기술분야에 잘 알려진 유사물과 같은 보조제도 그러한 제조물에 물론 존재할 수 있다.

여기에 기술된 실시예 및 구체예들은 단지 예시를 목적으로 하고 그 범위내에서 여러가지 변경 및 개조가 당업자에 의해 생각될 수 있으며 첨부된 청구범위의 범위와 본 출원의 정신 및 범위내에 포함된다는 것을 알아둔다.

Claims

적어도 부분적으로 분리된 독소를, 독소의 면역원적 성질을 유지하면서 독소를 화학적으로 불활성화시키는 미량의 금속 이온 및 일정량의 산화제로 처리한 후, 불활성화된 독소 또는 그 부분들을 회수하는 것으로 구성된 변성독소의 제조 방법으로서, 상기 산화제가 시스테인, 시스틴, 메티오닌, 트립토판 및 티로신으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 잔기들이 있는 독소의 펩티드 사슬내의 특정 위치들에서 독소를 산화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 산화제가 과산화수소, 과산화나트륨, N-클로로-4-메틸-벤젠설폰아미드 나트륨염(클로라민-T), 과포름산, 디옥산퍼옥사이드, 과요오드산, 과망간산나트륨, 차아염소산 나트륨 및 그 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
제2항에 있어서, 상기 산화제가 과산화수소인 방법.
제2항에 있어서, 상기 산화제가 클로라민-T인 방법.
제1항에 있어서, 상기 독소를 미량의 금속 존재하에서 처리하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 금속 이온이 제일철, 제이철, 코발트 및 크로뮴으로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
제1항에 있어서, 화학적 불활성화를 킬레이트화제를 첨가함으로 조절하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 킬레이트화제가 에틸렌디아민테트라아세테이트인 방법.
제1항에 있어서, 상기 독소가 세균 독소인 방법.
제9항에 있어서, 상기 독소가 백일해 독소인 방법.