JP2617500B2 - トキソイドを製造する方法 - Google Patents
トキソイドを製造する方法Info
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- A61P31/04—Antibacterial agents
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明はトキソイドの製造に関する。更に特定的に
は、本発明は、特にH2O2でのトキシンの化学的不活性化
のための新規方法、およびそれからの無細胞性の脱毒素
化されたワクチンの製造に関する。
は、本発明は、特にH2O2でのトキシンの化学的不活性化
のための新規方法、およびそれからの無細胞性の脱毒素
化されたワクチンの製造に関する。
技術の状態 百日咳〔Whooping Cough（pertussis）〕は、微生物
ボルデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）によ
り生じる感染性疾病である。この疾病の発生率は、免疫
により有効に制御できる。現在、国立および世界保健機
構は、幼児が百日咳の発生および蔓延を防止するために
免疫されることを推奨している。
ボルデテラ・パーツシス（Bordetella pertussis）によ
り生じる感染性疾病である。この疾病の発生率は、免疫
により有効に制御できる。現在、国立および世界保健機
構は、幼児が百日咳の発生および蔓延を防止するために
免疫されることを推奨している。
３つの型のワクチンが、ボルデテラ・パーツシスに対
する免疫のために使用されてきた。最も広く使用された
ワクチンは、もはや生きていない全ボルデテラ・パーツ
シス微生物からなるものである。このワクチンは、疾病
の予防には有効であるけれども、それと結び付いたいく
つかの問題を有している:1）投与は局所紅斑を導き、
２）使用は高められた温度、一般的ないらだちおよび不
安の誘発と結びついており、そして３）ある場合には、
投与は重篤な神経性続発症を導くことが論争されてき
た。他のワクチンにおいては、パーツシス成分が尿素抽
出物として製造された。この生成物はほぼ1969から1974
年にかけて使用されたが、現在は市場から取り去られて
いる。日本において、新らしいパーツシスワクチンが、
ボルデテラ・パーツシスの培養上清から製造されて、使
用されている。この物質はすべての培養上清蛋白質を含
有し、そして微生物の培養の可変性の故に、最終組成物
が様々でありうる。加えて、不活性化剤としてグルテル
アルデヒドまたはホルムアルデヒドの使用は、活性トキ
シンへの逆戻りを受ける凝集した物質をしばしば導きう
る。それらアルデヒド類は、化学的に不安定であり、か
くしてトキソイド類が活性トキシンへの逆戻りを受ける
ようにするシツフ塩基の形成を生じるものと信じられ
る。従来知られている方法による他のトキシン、たとえ
ば破傷風、ジフテリアおよびコレラトキシンの製造は、
同様の欠点を有している。それ故、望ましくない成分を
よび効果が実質的に有しない安全なそして安定な無細胞
トキシン類を製造する改善された方法の必要性は、極め
て明らかである。
する免疫のために使用されてきた。最も広く使用された
ワクチンは、もはや生きていない全ボルデテラ・パーツ
シス微生物からなるものである。このワクチンは、疾病
の予防には有効であるけれども、それと結び付いたいく
つかの問題を有している:1）投与は局所紅斑を導き、
２）使用は高められた温度、一般的ないらだちおよび不
安の誘発と結びついており、そして３）ある場合には、
投与は重篤な神経性続発症を導くことが論争されてき
た。他のワクチンにおいては、パーツシス成分が尿素抽
出物として製造された。この生成物はほぼ1969から1974
年にかけて使用されたが、現在は市場から取り去られて
いる。日本において、新らしいパーツシスワクチンが、
ボルデテラ・パーツシスの培養上清から製造されて、使
用されている。この物質はすべての培養上清蛋白質を含
有し、そして微生物の培養の可変性の故に、最終組成物
が様々でありうる。加えて、不活性化剤としてグルテル
アルデヒドまたはホルムアルデヒドの使用は、活性トキ
シンへの逆戻りを受ける凝集した物質をしばしば導きう
る。それらアルデヒド類は、化学的に不安定であり、か
くしてトキソイド類が活性トキシンへの逆戻りを受ける
ようにするシツフ塩基の形成を生じるものと信じられ
る。従来知られている方法による他のトキシン、たとえ
ば破傷風、ジフテリアおよびコレラトキシンの製造は、
同様の欠点を有している。それ故、望ましくない成分を
よび効果が実質的に有しない安全なそして安定な無細胞
トキシン類を製造する改善された方法の必要性は、極め
て明らかである。
発明の概要 従つて、本発明の目的は、通常悪い副作用を生じる不
純物、たとえばエンドトキシンおよび他の毒性物質を有
しない百日咳ワクチンを製造することにある。
純物、たとえばエンドトキシンおよび他の毒性物質を有
しない百日咳ワクチンを製造することにある。
本発明の更に他の目的は、百日咳に対し感受性の宿主
を、該宿主に本発明に従い製造された抗原の免疫原量を
投与することにより保護する方法を提供することにあ
る。
を、該宿主に本発明に従い製造された抗原の免疫原量を
投与することにより保護する方法を提供することにあ
る。
他の目的および利点は、本発明の詳細な説明が進行す
るにつれて明らかとなろう。
るにつれて明らかとなろう。
図面の簡単な説明 本発明のそれらおよび他の目的、特徴および多くの随
伴する利点は、以下の詳細な説明を読み、添付の図面に
関連して考えるとき、よりよく理解されるであろう、そ
こで： 第１図は、百日咳トキシンの過酸化水素不活性化のカイ
ネテイツクを示し； 第２図は、プレートキソイドおよびPTH-06トキソイドの
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（PAGE）を示し；そして、 第３図は、百日咳トキソイド類の安定性を示す。
伴する利点は、以下の詳細な説明を読み、添付の図面に
関連して考えるとき、よりよく理解されるであろう、そ
こで： 第１図は、百日咳トキシンの過酸化水素不活性化のカイ
ネテイツクを示し； 第２図は、プレートキソイドおよびPTH-06トキソイドの
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（PAGE）を示し；そして、 第３図は、百日咳トキソイド類の安定性を示す。
発明の詳細な説明 本発明の上記および他の目的、ならびに利点は、少く
とも部分的に精製されまたは単離されたトキシンを、該
トキシンの免疫原性質を維持しながら該トキシンを化学
的に不活性化するのに充分な量における酸化剤で処理
し、その後完全なトキソイドまたはその部分を回収し、
そしてそれからワクチンを製造することによるトキソイ
ドの製造法によつて達成される。
とも部分的に精製されまたは単離されたトキシンを、該
トキシンの免疫原性質を維持しながら該トキシンを化学
的に不活性化するのに充分な量における酸化剤で処理
し、その後完全なトキソイドまたはその部分を回収し、
そしてそれからワクチンを製造することによるトキソイ
ドの製造法によつて達成される。
ここで使用される用語“酸化剤”は、たとえばシステ
イン、シスチン、メチオニル、トリプトフアンおよび
（または）チロシンのようなアミノ酸残基が存在するペ
プチド鎖中のある特異位置においてトキシンを酸化する
任意の薬剤を意味する。そのような酸化剤はまた、有機
性または金属性でありうる。そのような酸化剤の好まし
い例は、この技術分野においてよく知られている過酸化
水素、過酸化ナトリウム、Ｎ−クロロ−４−メチル−ベ
ンゼンスルホンアミドナトリウム塩（クロラミン−
Ｔ）、過ギ酸、ジオキサンパーオキサイド、過ヨウ素
酸、過マンガン酸ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウム等
である。そのような酸化剤の中で、H2O2は、その取扱い
の容易さ、費用要素および容易入手性の故に特に好まし
い。
イン、シスチン、メチオニル、トリプトフアンおよび
（または）チロシンのようなアミノ酸残基が存在するペ
プチド鎖中のある特異位置においてトキシンを酸化する
任意の薬剤を意味する。そのような酸化剤はまた、有機
性または金属性でありうる。そのような酸化剤の好まし
い例は、この技術分野においてよく知られている過酸化
水素、過酸化ナトリウム、Ｎ−クロロ−４−メチル−ベ
ンゼンスルホンアミドナトリウム塩（クロラミン−
Ｔ）、過ギ酸、ジオキサンパーオキサイド、過ヨウ素
酸、過マンガン酸ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウム等
である。そのような酸化剤の中で、H2O2は、その取扱い
の容易さ、費用要素および容易入手性の故に特に好まし
い。
他に特定的に特定しない限り、ここに使用される科学
的および技術的用語は、本発明が属している技術分野に
おいて通常の熟練度の者により一般に理解されると同じ
意味を有する。ここに引用されるすべての文献は、引用
によりここに合体される。ここに記載するものと任意の
同様のまたは均等の方法および物質は、本発明の実施の
ためにまたはここに示す試験のために使用できるけれど
も、好ましい方法および物質をここに記載する。
的および技術的用語は、本発明が属している技術分野に
おいて通常の熟練度の者により一般に理解されると同じ
意味を有する。ここに引用されるすべての文献は、引用
によりここに合体される。ここに記載するものと任意の
同様のまたは均等の方法および物質は、本発明の実施の
ためにまたはここに示す試験のために使用できるけれど
も、好ましい方法および物質をここに記載する。
ここで使用する用語“実質的に”精製されたまたは単
離されたは、トキソイドが宿主に投与されるとき、少く
とも悪い反応を生じるようなそれら粒子または可溶性細
菌夾雑物または不純物を有しない程度にトキシンが分離
されおよび（または）精製されたことを意味する。
離されたは、トキソイドが宿主に投与されるとき、少く
とも悪い反応を生じるようなそれら粒子または可溶性細
菌夾雑物または不純物を有しない程度にトキシンが分離
されおよび（または）精製されたことを意味する。
出発物質は、精製された細菌製剤である必要のないこ
とが認められる。部分的にのみ分離されまたは精製され
た製剤は、ここに記載した方法に丁度良く役立ちうる。
酸化剤での処理を除き、本方法の基本の工程は、引用に
よりここに合体されるセクラ（Sekura）等によつてジヤ
ーナル・オブ・バイオル・ケム（Journal of Biol.Che
m.）、258:14647〜14651（1983）中に記載されたのと同
様であり、そしてここに説明のための例として百日咳ワ
クチンを使用して略述する。
とが認められる。部分的にのみ分離されまたは精製され
た製剤は、ここに記載した方法に丁度良く役立ちうる。
酸化剤での処理を除き、本方法の基本の工程は、引用に
よりここに合体されるセクラ（Sekura）等によつてジヤ
ーナル・オブ・バイオル・ケム（Journal of Biol.Che
m.）、258:14647〜14651（1983）中に記載されたのと同
様であり、そしてここに説明のための例として百日咳ワ
クチンを使用して略述する。
物質および方法 物質−アフイ−ゲル・ブルー（Affi-Gel blue）（100
〜200メツシユ）はバイオラド（BioRad）からえ、臭化
シアン−活性化セフアローズ4Bはフアルマシア（Pharma
cia）から購入し、そしてスピロ法により製造されたフ
エツイン（fetuin）はギブコ（Gibco）から得た。トハ
マ株（strain Tohama）からの繊条へムアグルチニンお
よび百日咳トキシンはコーウエル（Cowell）等によりセ
ミナーズ・イン・インフエクシアス・デジーゼズ（Semi
nars in infectious Diseases）、IV巻：バクテリアル
・バクシンズ（Bacterial Vaccines）、4:371〜379（19
82）中に記載された如く製造した。ビー・パーツシス
（B.Pertussis）の株は、パーツシス・ブランチ（Pertu
ssis Branch）、オフイス・オブ・バイオロジツクス（O
ffice of Biologics）、ベセスダ（Bethesda）、メリー
ランド（MD）で維持されているコレクシヨンからのもの
であつた。この研究に使用した他の物質は、試薬品質の
ものであり、そして普通の供給者から得た。
〜200メツシユ）はバイオラド（BioRad）からえ、臭化
シアン−活性化セフアローズ4Bはフアルマシア（Pharma
cia）から購入し、そしてスピロ法により製造されたフ
エツイン（fetuin）はギブコ（Gibco）から得た。トハ
マ株（strain Tohama）からの繊条へムアグルチニンお
よび百日咳トキシンはコーウエル（Cowell）等によりセ
ミナーズ・イン・インフエクシアス・デジーゼズ（Semi
nars in infectious Diseases）、IV巻：バクテリアル
・バクシンズ（Bacterial Vaccines）、4:371〜379（19
82）中に記載された如く製造した。ビー・パーツシス
（B.Pertussis）の株は、パーツシス・ブランチ（Pertu
ssis Branch）、オフイス・オブ・バイオロジツクス（O
ffice of Biologics）、ベセスダ（Bethesda）、メリー
ランド（MD）で維持されているコレクシヨンからのもの
であつた。この研究に使用した他の物質は、試薬品質の
ものであり、そして普通の供給者から得た。
フエツインアフイニテイ樹脂は、製造業者の推奨する
方法に従い、フエツイン200mgを臭化シアン−活性化セ
フアローズ4B25gとカツプリングさせることにより製造
した。
方法に従い、フエツイン200mgを臭化シアン−活性化セ
フアローズ4B25gとカツプリングさせることにより製造
した。
微生物の培養−ビー・パーツシス（オフイス・オブ・バ
イオロジツクス、165株）の凍結乾燥培養物を開封し、
そしてボルデツト−ジエンゴ−（Bordet-Gengou）血液
寒天プレート上、37℃で２回通過させた。２つのプレー
トの各々からの生育物を、ついで発端培養物を接種する
のに使用し〔500ml容フラスコ中、ステイナー−シヨル
テ培地（Stainer-Scholte media）200ml〔ヒユーレツト
（Hewlett）等、ジエー・バクテリオル（J.Bacterio
l.）、127:890〜898、1976〕〕、それを37℃で振盪しつ
つ１夜インキユベートした。ステイナー−シヨルテ培地
1.3lを含有するフエルンバツク（Fernback）フラスコ
に、発端培養からの生育物を0.05および0.1の間の初期A
650に接種した。細菌をついで、ジヤイロ回転振盪機
上、36℃において、約40から60時間、2.5および2.8の間
のA650に培養した。細菌は、もちろん、この技術分野に
おいてよく知られた他の条件下に生育しえ、そして容量
は所望により適当に調節しうる。加えて、ビー・パーツ
シスの他の株もまた使用しうる。
イオロジツクス、165株）の凍結乾燥培養物を開封し、
そしてボルデツト−ジエンゴ−（Bordet-Gengou）血液
寒天プレート上、37℃で２回通過させた。２つのプレー
トの各々からの生育物を、ついで発端培養物を接種する
のに使用し〔500ml容フラスコ中、ステイナー−シヨル
テ培地（Stainer-Scholte media）200ml〔ヒユーレツト
（Hewlett）等、ジエー・バクテリオル（J.Bacterio
l.）、127:890〜898、1976〕〕、それを37℃で振盪しつ
つ１夜インキユベートした。ステイナー−シヨルテ培地
1.3lを含有するフエルンバツク（Fernback）フラスコ
に、発端培養からの生育物を0.05および0.1の間の初期A
650に接種した。細菌をついで、ジヤイロ回転振盪機
上、36℃において、約40から60時間、2.5および2.8の間
のA650に培養した。細菌は、もちろん、この技術分野に
おいてよく知られた他の条件下に生育しえ、そして容量
は所望により適当に調節しうる。加えて、ビー・パーツ
シスの他の株もまた使用しうる。
パーツシストキシンの検定−この技術分野においてよく
知られたいくつかの技術が、トキシンの評価のために使
用しうる。精製の過程で使用される定常的急速検定のた
めには、百日咳トキシンの血球凝集活性は、アイロンズ
（Irons）等によりビオキム・ビオフイズ・アクタ（Bio
chim.Biophys.Acta）580:175〜185（1979）に記載され
た如くガチヨウ赤血球を使用して求めた。リンパ球増加
−促進活性は、サトー（Sato）等によりインフエクト・
イミユーン（Infect.Immun.）6:899〜904（1972）に記
載された如くに検定した。リンパ球増加−促進活性の１
単位は、注射後３日目に10,000白血球/l上記背景の増加
を生じる物質の量と定義される。百日咳トキシンの高度
に精製された製剤で、血球凝集およびリンパ球増加−促
進活性は、それぞれmg当り約150,000および30,000単位
である。トキシンはまた通常の酵素−結合免疫吸収検定
（ELISA）により測定される。精製されたヤギ抗−百日
咳トキシンが、静止層を被覆するために使用された。抗
原−含有製剤との反応の後に、静止層を抗体−アルカリ
ホスフアターゼ付加物と反応させ、そして百日咳トキシ
ンを標準方法に従い生成したアルカリホスフアターゼ活
性により評価した。同様な技術を繊条ヘムアグルチニン
を評価するために使用した。
知られたいくつかの技術が、トキシンの評価のために使
用しうる。精製の過程で使用される定常的急速検定のた
めには、百日咳トキシンの血球凝集活性は、アイロンズ
（Irons）等によりビオキム・ビオフイズ・アクタ（Bio
chim.Biophys.Acta）580:175〜185（1979）に記載され
た如くガチヨウ赤血球を使用して求めた。リンパ球増加
−促進活性は、サトー（Sato）等によりインフエクト・
イミユーン（Infect.Immun.）6:899〜904（1972）に記
載された如くに検定した。リンパ球増加−促進活性の１
単位は、注射後３日目に10,000白血球/l上記背景の増加
を生じる物質の量と定義される。百日咳トキシンの高度
に精製された製剤で、血球凝集およびリンパ球増加−促
進活性は、それぞれmg当り約150,000および30,000単位
である。トキシンはまた通常の酵素−結合免疫吸収検定
（ELISA）により測定される。精製されたヤギ抗−百日
咳トキシンが、静止層を被覆するために使用された。抗
原−含有製剤との反応の後に、静止層を抗体−アルカリ
ホスフアターゼ付加物と反応させ、そして百日咳トキシ
ンを標準方法に従い生成したアルカリホスフアターゼ活
性により評価した。同様な技術を繊条ヘムアグルチニン
を評価するために使用した。
他の方法−酸ゲル系中での電気泳動は、ライスフイール
ド（Rersfield）等、ネーチユア（Nature）195:281〜28
3（1962）の方法に従い遂行した。SDSゲル電気泳動は、
レムリ（Laemmli）によりナツ・ニユー・ビオル（Nat.N
ew Biol.）227:680〜685（1970）に記載された如くに遂
行した。検体を、SDS−ゲル電気泳動のために、00μｌ
の最終容量中の蛋白質10〜50μｇを％SDSで処理するこ
とにより製造し、そして２％β−メルカプトエタノール
の存在または不存在において、100℃で約２分間加熱し
た。二次元電気泳動のために、非還元検体を、先ずレム
リゲルを使用して操作した。それらのゲルから細片を切
り取り、そして１％β−メルカプトエタノールを含有す
る流動バツフアー中に１時間浸漬した。流動バツフアー
で充分に洗滌した後、流動ゲルを細片の囲りにかけ、そ
して電気泳動を第２の面で行つた。ゲルをクマシー・ブ
ルー（Coomassie blue）で染色した〔オークレイ（Oakl
ey）等、アナル・バイオケム（Anal.Biochem.）105:361
〜363、1980〕。コダツク（Kodak）KAR-2フイルムを、
32P−標識蛋白質のオートラジオグラフイのために使用
した。密度計測を、バイオメツド・デンシトメーター
（Biomed densitometer）で、633nmにおいて遂行した。
ド（Rersfield）等、ネーチユア（Nature）195:281〜28
3（1962）の方法に従い遂行した。SDSゲル電気泳動は、
レムリ（Laemmli）によりナツ・ニユー・ビオル（Nat.N
ew Biol.）227:680〜685（1970）に記載された如くに遂
行した。検体を、SDS−ゲル電気泳動のために、00μｌ
の最終容量中の蛋白質10〜50μｇを％SDSで処理するこ
とにより製造し、そして２％β−メルカプトエタノール
の存在または不存在において、100℃で約２分間加熱し
た。二次元電気泳動のために、非還元検体を、先ずレム
リゲルを使用して操作した。それらのゲルから細片を切
り取り、そして１％β−メルカプトエタノールを含有す
る流動バツフアー中に１時間浸漬した。流動バツフアー
で充分に洗滌した後、流動ゲルを細片の囲りにかけ、そ
して電気泳動を第２の面で行つた。ゲルをクマシー・ブ
ルー（Coomassie blue）で染色した〔オークレイ（Oakl
ey）等、アナル・バイオケム（Anal.Biochem.）105:361
〜363、1980〕。コダツク（Kodak）KAR-2フイルムを、
32P−標識蛋白質のオートラジオグラフイのために使用
した。密度計測を、バイオメツド・デンシトメーター
（Biomed densitometer）で、633nmにおいて遂行した。
アミノ酸分析は、オリベイラ（Oliveira）等によりジ
エ・バイオル・ケム（J.Biol.Chem.）254:489〜502（19
79）に記載された如くに行つた。カルボキシメチルシス
テインは、標準ヨウドアセトアミド反応での還元および
非還元検体（SDS複合体につき上に記載した如く製造し
た）の反応の後に測定した。
エ・バイオル・ケム（J.Biol.Chem.）254:489〜502（19
79）に記載された如くに行つた。カルボキシメチルシス
テインは、標準ヨウドアセトアミド反応での還元および
非還元検体（SDS複合体につき上に記載した如く製造し
た）の反応の後に測定した。
蛋白質は、ローリー（Lowry）等のジエ・バイオル・
ケム（J.Biol.Chem.）193:265〜275（1951）の方法によ
り、ウシ血清アルブミンを標準として使用して測定し
た。多くの検体はこの検定を妨害する物質を含有するの
で、測定は５％トリクロロ酢酸での蛋白質の処理後に得
られた沈澱を使用して行つた。
ケム（J.Biol.Chem.）193:265〜275（1951）の方法によ
り、ウシ血清アルブミンを標準として使用して測定し
た。多くの検体はこの検定を妨害する物質を含有するの
で、測定は５％トリクロロ酢酸での蛋白質の処理後に得
られた沈澱を使用して行つた。
百日咳トキシンの精製−165株の培養液からの上清を、
４℃において6000×ｇで30分間の遠心分離により製造し
た。上清をHClでpH6.0に調節し、そしてアフイ−ゲル・
ブルー（Affi-Gel blue）（上清ｌ当り充填した樹脂10m
l）を加えた。生成した泥状物を、４℃で48時間攪拌し
た。樹脂を約２時間沈積させ、そして上澄液を吸引し
た。引続く精製の工程は、約25℃で遂行した。樹脂をつ
いでカラム（６×7cm）に充填し、そして0.25Mリン酸ナ
トリウム（pH6.0）450ml、0.05Mトリス−HCl（pH7.4）
（バツフアーＡ）450ml、および0.75M塩化ナトリウムを
含有するバツフアーA450mlで、約250ml/時間の流速にお
いて溶出した。活性を示す画分を貯え、等容量の水で希
釈し、そしてフエツイン−アガロ−スカラム（2.5×7c
m）に適用し、そして約40ml/時間の流速で次の如く溶出
した：バツフアーA40ml;1M塩化ナトリウムを含有するバ
ツフアーA40ml;および4M塩化マグネシウムを含有するバ
ツフアーA40ml。百日咳トキシンを含有する画分を貯
え、そして0.5M塩化ナトリウムを含有するバツフアーＡ
で平衡化したセフアデツクスG-25（2.5×35cm）カラム
に通過（30ml/時間）させた。蛋白質をついで、固体硫
酸アンモニウム（0.65g/ml）を加え、そして４℃で１夜
攪拌することにより沈澱させた。20,000×ｇおよび４℃
における30分間の遠心分離により採取された沈澱をバツ
フアーＡに再懸濁し、それに固体硫酸アンモニウム（0.
65g/ml）を加えた。このバツフアー中に４℃で貯蔵し
て、トキシンは数ケ月安定である。
４℃において6000×ｇで30分間の遠心分離により製造し
た。上清をHClでpH6.0に調節し、そしてアフイ−ゲル・
ブルー（Affi-Gel blue）（上清ｌ当り充填した樹脂10m
l）を加えた。生成した泥状物を、４℃で48時間攪拌し
た。樹脂を約２時間沈積させ、そして上澄液を吸引し
た。引続く精製の工程は、約25℃で遂行した。樹脂をつ
いでカラム（６×7cm）に充填し、そして0.25Mリン酸ナ
トリウム（pH6.0）450ml、0.05Mトリス−HCl（pH7.4）
（バツフアーＡ）450ml、および0.75M塩化ナトリウムを
含有するバツフアーA450mlで、約250ml/時間の流速にお
いて溶出した。活性を示す画分を貯え、等容量の水で希
釈し、そしてフエツイン−アガロ−スカラム（2.5×7c
m）に適用し、そして約40ml/時間の流速で次の如く溶出
した：バツフアーA40ml;1M塩化ナトリウムを含有するバ
ツフアーA40ml;および4M塩化マグネシウムを含有するバ
ツフアーA40ml。百日咳トキシンを含有する画分を貯
え、そして0.5M塩化ナトリウムを含有するバツフアーＡ
で平衡化したセフアデツクスG-25（2.5×35cm）カラム
に通過（30ml/時間）させた。蛋白質をついで、固体硫
酸アンモニウム（0.65g/ml）を加え、そして４℃で１夜
攪拌することにより沈澱させた。20,000×ｇおよび４℃
における30分間の遠心分離により採取された沈澱をバツ
フアーＡに再懸濁し、それに固体硫酸アンモニウム（0.
65g/ml）を加えた。このバツフアー中に４℃で貯蔵し
て、トキシンは数ケ月安定である。
上記方法により製造した百日咳トキシンは、15％SDS
ゲル上電気泳動により決定して、分子量約31,000、26,0
00、25,000および115,000の未同定サブユニツトから構
成される単一蛋白質である。
ゲル上電気泳動により決定して、分子量約31,000、26,0
00、25,000および115,000の未同定サブユニツトから構
成される単一蛋白質である。
百日咳トキシンの過酸化水素不活性化 過酸化水素との反応のための製造において、上記の如
く製造した百日咳トキシンを、適当なバツフアー中に、
約0.1から0.5mg/mlまでの蛋白濃度において移す。この
技術分野においてよく知られているたとえばボレート、
カーボネート、トリス、ホスフエート、パークロレート
等のようなバツフアーが適当であり、そして反応pHは約
3.5から8.5またはそれ以上までで可変であり、反応pHそ
れ自体は臨界的要素でないことが理解される。不活性化
を好ましいpH8.5で行うとき、好ましい反応混合物は、
0.1Mホウ酸ナトリウム、pH8.5;0.001MナトリウムEDTA、
pH8.5;0.0001M硫酸第二鉄または他の金属塩、たとえば
塩化第二鉄、硫酸第一または第二鉄、および他の金属
塩、たとえば塩化コバルト、塩化クロム等;1.2％過酸化
水素；および10％までの飽和硫酸アンモニウム。反応速
度は、過酸化水素、硫酸第二鉄およびEDTAの濃度に依存
する。上記の如き第二鉄イオンあるいは他の微量金属塩
またはイオンは、不活性化がキレート化剤たとえばEDTA
（エチレンジアミンテトラアセテート）により妨害また
は制御されうるので必須である。反応は一般に約37℃で
遂行され、そして反応の程度はトランスデユシンの百日
咳トキシン触媒ADP−リボシル化および上記のガチヨウ
赤血球の百日咳トキシン仲介凝集を検定することにより
追跡する。過酸化水素での不活性化の時間依存性を第１
図に示す。加えて、データーは、百日咳トキシン特異EL
ISAにおいて、抗原としての生成トキソイドの反応性を
示す。百日咳ワクチンとしての使用に適当な百日咳トキ
ソイドの製剤は、この方法により、約２時間の反応時間
を使用して得られる。過酸化水素との反応は、EDTAまた
は他のキレート化剤の添加により、またはカタラーゼの
添加により、および（または）媒質たとえばセフアデツ
クスG-25等上のゲル濾過により停止しうる。
く製造した百日咳トキシンを、適当なバツフアー中に、
約0.1から0.5mg/mlまでの蛋白濃度において移す。この
技術分野においてよく知られているたとえばボレート、
カーボネート、トリス、ホスフエート、パークロレート
等のようなバツフアーが適当であり、そして反応pHは約
3.5から8.5またはそれ以上までで可変であり、反応pHそ
れ自体は臨界的要素でないことが理解される。不活性化
を好ましいpH8.5で行うとき、好ましい反応混合物は、
0.1Mホウ酸ナトリウム、pH8.5;0.001MナトリウムEDTA、
pH8.5;0.0001M硫酸第二鉄または他の金属塩、たとえば
塩化第二鉄、硫酸第一または第二鉄、および他の金属
塩、たとえば塩化コバルト、塩化クロム等;1.2％過酸化
水素；および10％までの飽和硫酸アンモニウム。反応速
度は、過酸化水素、硫酸第二鉄およびEDTAの濃度に依存
する。上記の如き第二鉄イオンあるいは他の微量金属塩
またはイオンは、不活性化がキレート化剤たとえばEDTA
（エチレンジアミンテトラアセテート）により妨害また
は制御されうるので必須である。反応は一般に約37℃で
遂行され、そして反応の程度はトランスデユシンの百日
咳トキシン触媒ADP−リボシル化および上記のガチヨウ
赤血球の百日咳トキシン仲介凝集を検定することにより
追跡する。過酸化水素での不活性化の時間依存性を第１
図に示す。加えて、データーは、百日咳トキシン特異EL
ISAにおいて、抗原としての生成トキソイドの反応性を
示す。百日咳ワクチンとしての使用に適当な百日咳トキ
ソイドの製剤は、この方法により、約２時間の反応時間
を使用して得られる。過酸化水素との反応は、EDTAまた
は他のキレート化剤の添加により、またはカタラーゼの
添加により、および（または）媒質たとえばセフアデツ
クスG-25等上のゲル濾過により停止しうる。
百日咳トキソイドの特徴づけ 上記方法により製造したトキソイド製剤は、第１表お
よび第１図に要約する如き各種生物学活性につき追跡し
た。用語PTH04、PTH-05およびPTH-06は、製造された特
定ロツトを示す。用語“トキソイド”および“プレート
キソイド”は、それぞれ酸化剤での処理の前および後の
トキシンの製剤を示す。それらのデーターは、過酸化水
素での百日咳トキシンの処理が、無毒性であるが、天然
のトキシンを特異的に指向する抗体と交叉反応し、それ
によつてH2O2処理トキシンにより保持される強力な抗原
品質を実証する免疫学的決定因子をなお有している製剤
を生成する。
よび第１図に要約する如き各種生物学活性につき追跡し
た。用語PTH04、PTH-05およびPTH-06は、製造された特
定ロツトを示す。用語“トキソイド”および“プレート
キソイド”は、それぞれ酸化剤での処理の前および後の
トキシンの製剤を示す。それらのデーターは、過酸化水
素での百日咳トキシンの処理が、無毒性であるが、天然
のトキシンを特異的に指向する抗体と交叉反応し、それ
によつてH2O2処理トキシンにより保持される強力な抗原
品質を実証する免疫学的決定因子をなお有している製剤
を生成する。
硫酸第二鉄の存在において、過酸化水素処理により製
造された百日咳トキソイドのアミノ酸分析は、組成にお
けるいくつかの顕著な変化を実証する。硫酸第二鉄での
処理は、第２表に示す如くシステイン、メチオニンおよ
びチロシンの還元を生じる。メチオニンおよびシステイ
ン残基の酸化と一致して、システイン酸あるいはメチオ
ニンスルホキサイドまたはスルホンに相当しうる早期溶
出アミノ酸の発現がある。微量金属の存在において過酸
化水素処理により達成される化学変形の性質は容易には
逆戻りせず、そして活性トキシンへの逆戻りに対するか
く製造されたトキソイドの安定性を表示する。
造された百日咳トキソイドのアミノ酸分析は、組成にお
けるいくつかの顕著な変化を実証する。硫酸第二鉄での
処理は、第２表に示す如くシステイン、メチオニンおよ
びチロシンの還元を生じる。メチオニンおよびシステイ
ン残基の酸化と一致して、システイン酸あるいはメチオ
ニンスルホキサイドまたはスルホンに相当しうる早期溶
出アミノ酸の発現がある。微量金属の存在において過酸
化水素処理により達成される化学変形の性質は容易には
逆戻りせず、そして活性トキシンへの逆戻りに対するか
く製造されたトキソイドの安定性を表示する。
微量の金属が反応をキレート化するために好ましいけ
れども、それらは本発明の範囲内であることが意図され
る各種トキシン類の酸化処理のために必要というのでは
ない。
れども、それらは本発明の範囲内であることが意図され
る各種トキシン類の酸化処理のために必要というのでは
ない。
アミノ酸含量は、アラニンに対するモル比として表わ
してある。
してある。
システイン酸およびメチオニン（Ｏ）に指定されるニ
ンヒドリン発色値は、アラニンおよびメチオニンの値の
平均である。
ンヒドリン発色値は、アラニンおよびメチオニンの値の
平均である。
過酸化水素不活性化百日咳トキシンのSDS−ゲル電気
泳動は、未処理トキシンに対するいくつかの変化を生じ
る（第２図）。S1サブユニツト（Mr＝31,000）のより高
分子量への移動におけるシフトがあり、そして蛋白質バ
ンドはより拡散する。S2（Mr＝26,000）およびS3（Mr＝
25,000）サブユニツトの分解は、未処理トキシンに対し
減少する。微量の染色可能物質が、11,000および25,000
分子量領域の間にみられる。トキソイドおよび百日咳ト
キシンのS4,5（Mr＝11,000）成分は等しい。それらの変
化は、過酸化水素による蛋白質の化学的変形と一致す
る。どのような理論とも結び付くことなしに、S3および
S4,5バンドの間に観察される拡散物質は、多分それらポ
リペプチドの限定された開裂の結果であると仮定され
る。
泳動は、未処理トキシンに対するいくつかの変化を生じ
る（第２図）。S1サブユニツト（Mr＝31,000）のより高
分子量への移動におけるシフトがあり、そして蛋白質バ
ンドはより拡散する。S2（Mr＝26,000）およびS3（Mr＝
25,000）サブユニツトの分解は、未処理トキシンに対し
減少する。微量の染色可能物質が、11,000および25,000
分子量領域の間にみられる。トキソイドおよび百日咳ト
キシンのS4,5（Mr＝11,000）成分は等しい。それらの変
化は、過酸化水素による蛋白質の化学的変形と一致す
る。どのような理論とも結び付くことなしに、S3および
S4,5バンドの間に観察される拡散物質は、多分それらポ
リペプチドの限定された開裂の結果であると仮定され
る。
吸着された百日咳トキソイドの製造 百日咳ワクチンとしての使用のために、百日咳トキソ
イドを、適当なアジユバントたとえばアルミニウムアジ
ユバントに吸着する。
イドを、適当なアジユバントたとえばアルミニウムアジ
ユバントに吸着する。
この目的のために、アルヒドロゲル〔スーパーフオス
・ケミ（Superfos Kemi）a/s〕が使用されたが、リン酸
アルミニウムまたは水酸化アルミニウム、あるいは新た
に生成した塩が同等によく使用される。20および200μ
ｇの間の百日咳トキソイドが、アルミニウムmg当りで吸
着されて、ml当り20および200μｇの間の最終蛋白濃度
を与える。一般に、吸着は、通常のホスフエート緩衝化
塩、pH7.4中、４℃で振盪しつつ24〜48時間で遂行され
る。吸着の直前に、トキソイド溶液を0.22ミクロン濾過
器に通す濾過により滅菌し、そしてチメロサール（1:1
0,000;w/w）を防腐剤として加える。もちろん、この技
術分野においてよく知られている他の吸着剤、アジユバ
ント、防腐剤または添加剤がまた使用できる。加えて、
百日咳トキソイドそれ自体が免疫原性である。
・ケミ（Superfos Kemi）a/s〕が使用されたが、リン酸
アルミニウムまたは水酸化アルミニウム、あるいは新た
に生成した塩が同等によく使用される。20および200μ
ｇの間の百日咳トキソイドが、アルミニウムmg当りで吸
着されて、ml当り20および200μｇの間の最終蛋白濃度
を与える。一般に、吸着は、通常のホスフエート緩衝化
塩、pH7.4中、４℃で振盪しつつ24〜48時間で遂行され
る。吸着の直前に、トキソイド溶液を0.22ミクロン濾過
器に通す濾過により滅菌し、そしてチメロサール（1:1
0,000;w/w）を防腐剤として加える。もちろん、この技
術分野においてよく知られている他の吸着剤、アジユバ
ント、防腐剤または添加剤がまた使用できる。加えて、
百日咳トキソイドそれ自体が免疫原性である。
百日咳トキソイドに対する血清学的応答 吸着された百日咳トキソイドでのマウスの免疫は、EL
ISAにより測定して免疫応答を導き、それは用量および
時間依存性である（第３表、第３図）。用量応答は３か
ら75μｇの範囲を超えて投与される百日咳ワクチンでみ
られて、75μｇ用量は２および４週の両方において最高
応答を与える。トキソイドのすべての用量において誘導
される抗体の水準は、免疫後２週におけるよりも４週に
おいてより高い。CHO−細胞に対する活性百日咳トキシ
ンの効果を中和する血清抗体の能力を追跡することによ
る血清学的応答の測定は、同様の特徴を示す（第４表、
第３図）。応答は、用量および時間依存性である。免疫
後２週において、百日咳トキシン中和抗体の顕著な水準
は観察されないが、４週において、最大応答での中和力
価増加は75μｇ用量においてみられる。
ISAにより測定して免疫応答を導き、それは用量および
時間依存性である（第３表、第３図）。用量応答は３か
ら75μｇの範囲を超えて投与される百日咳ワクチンでみ
られて、75μｇ用量は２および４週の両方において最高
応答を与える。トキソイドのすべての用量において誘導
される抗体の水準は、免疫後２週におけるよりも４週に
おいてより高い。CHO−細胞に対する活性百日咳トキシ
ンの効果を中和する血清抗体の能力を追跡することによ
る血清学的応答の測定は、同様の特徴を示す（第４表、
第３図）。応答は、用量および時間依存性である。免疫
後２週において、百日咳トキシン中和抗体の顕著な水準
は観察されないが、４週において、最大応答での中和力
価増加は75μｇ用量においてみられる。
吸着された百日咳トキソイドはまた、アカゲザル（rh
esus monkeys）において免疫応答を導くことが示された
（第５表および第６表）。ELISAにより測定される百日
咳トキシン特異抗体は、同じ参照血清を使用して患者が
115の平均ELISA応答を与える百日咳から回復した患者か
ら得た血清にみられると比較しうる応答を生じる。免疫
応答はまた、CHO細胞検定において百日咳トキシンを中
和しうる抗体の産生を生じる。CHO細胞検定におけるELI
SA応答および中和力価の両方は、用量依存性であると認
められ、そしてブースター用量を投与することにより増
加する。
esus monkeys）において免疫応答を導くことが示された
（第５表および第６表）。ELISAにより測定される百日
咳トキシン特異抗体は、同じ参照血清を使用して患者が
115の平均ELISA応答を与える百日咳から回復した患者か
ら得た血清にみられると比較しうる応答を生じる。免疫
応答はまた、CHO細胞検定において百日咳トキシンを中
和しうる抗体の産生を生じる。CHO細胞検定におけるELI
SA応答および中和力価の両方は、用量依存性であると認
められ、そしてブースター用量を投与することにより増
加する。
幼若アカゲザルを、０、21および71日に、吸着された
百日咳トキソイドPTH-05で、指示した用量において免疫
した。それら検体の百日咳トキシン抗体を地理的平均と
して示し、そしてそれらの免疫前水準の４倍もしくはそ
れ以上の上昇を有するサルとして指定されたリスポンダ
ーの数をかつこ内に示す。
百日咳トキソイドPTH-05で、指示した用量において免疫
した。それら検体の百日咳トキシン抗体を地理的平均と
して示し、そしてそれらの免疫前水準の４倍もしくはそ
れ以上の上昇を有するサルとして指定されたリスポンダ
ーの数をかつこ内に示す。
ａアカゲザルの１頭は、10の初期CHO細胞力価が観察さ
れたのでこの群から除いた。
れたのでこの群から除いた。
幼若アカゲザルを、０、21および71日に、吸着された
百日咳トキソイドPTH-05で、指示された用量において免
疫した。結果を、地理的平均として、および10もしくは
それ以上の中和力価を有するサルと指定されたリスポン
ダーの数（かつこ内に示す）を示す。
百日咳トキソイドPTH-05で、指示された用量において免
疫した。結果を、地理的平均として、および10もしくは
それ以上の中和力価を有するサルと指定されたリスポン
ダーの数（かつこ内に示す）を示す。
百日咳トキソイドの効力 百日咳トキソイドを、ビー・パーツシス微生物での脳
内攻撃に対しマウスを保護するそれらの能力について試
験した（第７表、第３図）。試験した３ロツトの百日咳
トキソイドワクチンで、２週において計算したED-50
（μｇ蛋白）は、PTH-04で44μｇ（８μｇデーターポイ
ントは除いた）、PTH-05で51μｇ、そしてPTH-06-75で3
0μｇであつた。百日咳トキソイドは脳内攻撃に対しマ
ウスを保護する能力を発揮するけれども、効力は現在の
FDAの規制を満たすには不充分である。吸着された百日
咳トキソイドは、蛋白mg当り10マウス保護単位以下を与
える。10および75μｇの間の提案されたトキソイド用量
は、１回人間用量当り0.4マウス単位以下を生じる。
内攻撃に対しマウスを保護するそれらの能力について試
験した（第７表、第３図）。試験した３ロツトの百日咳
トキソイドワクチンで、２週において計算したED-50
（μｇ蛋白）は、PTH-04で44μｇ（８μｇデーターポイ
ントは除いた）、PTH-05で51μｇ、そしてPTH-06-75で3
0μｇであつた。百日咳トキソイドは脳内攻撃に対しマ
ウスを保護する能力を発揮するけれども、効力は現在の
FDAの規制を満たすには不充分である。吸着された百日
咳トキソイドは、蛋白mg当り10マウス保護単位以下を与
える。10および75μｇの間の提案されたトキソイド用量
は、１回人間用量当り0.4マウス単位以下を生じる。
百日咳トキソイドワクチンの効力を、致死量の百日咳
トキシンでマウスを攻撃することにより評価した（第８
表）。ED-50についての蛋白質の量は、PTH-04について
5.2μｇ、PTH-05について41μｇ、およびPTH-06-50につ
いて4.9μｇであると計算された。この検定におけるPTH
-05の低い効力は、標準CHO−細胞中和検定において、中
和抗体を誘導することにおけるこのロツトのワクチンの
低い効力を反映している（第４表）。
トキシンでマウスを攻撃することにより評価した（第８
表）。ED-50についての蛋白質の量は、PTH-04について
5.2μｇ、PTH-05について41μｇ、およびPTH-06-50につ
いて4.9μｇであると計算された。この検定におけるPTH
-05の低い効力は、標準CHO−細胞中和検定において、中
和抗体を誘導することにおけるこのロツトのワクチンの
低い効力を反映している（第４表）。
百日咳トキシンの効果 マウスに吸着された百日咳トキソイドで免疫する１時
間前に非致死、非免疫原用量の活性百日咳トキシンを与
えたとき、著しい変化がマウス脳内攻撃モデルにより判
定した効力においてみられる（第９表）。活性百日咳ト
キシンは、51μｇから12.5μｇまでのED-50の減少をも
たらす。ワクチン効力におけるこの増加は、ELISAによ
り判定される高められた免疫応答またはCHO−細胞中和
力価から生じるようではない。これは全細胞百日咳ワク
チンを標準化するために現在使用されている方法である
ことが認識されねばならない。活性百日咳トキシンは悪
い反応に強力に貢献しうるので、無細胞百日咳ワクチン
を導くためにここに使用する方法は、活性百日咳トキシ
ンを最小水準に減少させるように設計される。
間前に非致死、非免疫原用量の活性百日咳トキシンを与
えたとき、著しい変化がマウス脳内攻撃モデルにより判
定した効力においてみられる（第９表）。活性百日咳ト
キシンは、51μｇから12.5μｇまでのED-50の減少をも
たらす。ワクチン効力におけるこの増加は、ELISAによ
り判定される高められた免疫応答またはCHO−細胞中和
力価から生じるようではない。これは全細胞百日咳ワク
チンを標準化するために現在使用されている方法である
ことが認識されねばならない。活性百日咳トキシンは悪
い反応に強力に貢献しうるので、無細胞百日咳ワクチン
を導くためにここに使用する方法は、活性百日咳トキシ
ンを最小水準に減少させるように設計される。
アジユバント含量の効果 百日咳トキソイドの効力 百日咳トキソイドロツトPTH-06を、各種アジユバント
／蛋白質比率（第10表）において混合した後、ELISAに
よる効力（第３表）、CHO−細胞中和力価（第４表）お
よびマウス効力（第７表）につき追跡した。それら基準
の各々により判定して、蛋白質に対するアルミニウムの
比率における増加は、より強力なワクチンを生じた。ロ
ツトPTH-06-10において、10μｇトキソイドにより誘導
される応答は、ロツトPTH-06-75における50μｇトキソ
イドでみられる応答と等価である。
／蛋白質比率（第10表）において混合した後、ELISAに
よる効力（第３表）、CHO−細胞中和力価（第４表）お
よびマウス効力（第７表）につき追跡した。それら基準
の各々により判定して、蛋白質に対するアルミニウムの
比率における増加は、より強力なワクチンを生じた。ロ
ツトPTH-06-10において、10μｇトキソイドにより誘導
される応答は、ロツトPTH-06-75における50μｇトキソ
イドでみられる応答と等価である。
トキソイドは、アルヒドロゲルに、緩和な振盪で、４
℃において48時間吸着させた。PTH-06バルクトキソイド
のビンを、ついで各々2.2mlを含有する5.0ml容バイヤル
中への配送のためにフアーマシー、セクシヨン（Pharma
cy Section）CC、NIHに移した。
℃において48時間吸着させた。PTH-06バルクトキソイド
のビンを、ついで各々2.2mlを含有する5.0ml容バイヤル
中への配送のためにフアーマシー、セクシヨン（Pharma
cy Section）CC、NIHに移した。
吸着された百日咳トキソイドの安定性および毒性 吸着された百日咳トキソイドは、ELISA、CHO細胞検定
における百日咳トキシン中和抗体の誘導およびマウス保
護により判定して、４℃で、効力における明らかな変化
なしに、６ケ月までの期間貯蔵された（第３図）。吸着
された百日咳トキソイドを腹腔内に注射したとき、毒性
は、白血球数およびヒスタミンに対する感作により判定
して、マウスを注射に引続き３ケ月まで観察したとき、
観察されなかつた（第11表）。非吸着百日咳トキソイド
の37℃における３週間を超える貯蔵は、トランスデユシ
ンのADP-リボシル化により測定して活性トキシンへの逆
戻りを導かない（第12表）。
における百日咳トキシン中和抗体の誘導およびマウス保
護により判定して、４℃で、効力における明らかな変化
なしに、６ケ月までの期間貯蔵された（第３図）。吸着
された百日咳トキソイドを腹腔内に注射したとき、毒性
は、白血球数およびヒスタミンに対する感作により判定
して、マウスを注射に引続き３ケ月まで観察したとき、
観察されなかつた（第11表）。非吸着百日咳トキソイド
の37℃における３週間を超える貯蔵は、トランスデユシ
ンのADP-リボシル化により測定して活性トキシンへの逆
戻りを導かない（第12表）。
過酸化水素不活性化百日咳トキシンの製剤を指定した日
数貯蔵し、ついで受容体としてトランスデユシンでのAD
P−リボシルトランスフエラーゼ活性を検定した。デー
ターは、参照百日咳トキシン製剤を基礎として計算した
ml当りのトキシンのナノグラムとして表わされている。
数貯蔵し、ついで受容体としてトランスデユシンでのAD
P−リボシルトランスフエラーゼ活性を検定した。デー
ターは、参照百日咳トキシン製剤を基礎として計算した
ml当りのトキシンのナノグラムとして表わされている。
上記の如く過酸化水素での百日咳トキシンの処理は、
先行技術製剤で普通に遭遇する悪い効果がなくて安全で
ある化学的に不可逆性の抗原を生成することは、ここに
提示したデーターから明らかである。更に製剤は、百日
咳感染に対し、安定で、免疫原性で、そして保護性であ
る。もちろん、百日咳トキシンの特定の実施例によりこ
こに説明した新規方法は、百日咳トキシンのみに限定さ
れるものではない。それは一般的適用のものであり、そ
して他のトキシン類、たとえば破傷風、ジフテリア、コ
レラトキシン等の製造のために同様に使用できる。
先行技術製剤で普通に遭遇する悪い効果がなくて安全で
ある化学的に不可逆性の抗原を生成することは、ここに
提示したデーターから明らかである。更に製剤は、百日
咳感染に対し、安定で、免疫原性で、そして保護性であ
る。もちろん、百日咳トキシンの特定の実施例によりこ
こに説明した新規方法は、百日咳トキシンのみに限定さ
れるものではない。それは一般的適用のものであり、そ
して他のトキシン類、たとえば破傷風、ジフテリア、コ
レラトキシン等の製造のために同様に使用できる。
本発明のトキシンがまた、免疫原量のトキソイドおよ
びこの技術分野においてよく知られている医薬的に受容
しうる担体、たとえば滅菌された生理的塩水、無毒性の
生理的バツフアー等からなる医薬組成物に使用しうるこ
とは、もちろん明らかである。もちろん、この技術分野
においてよく知られている殺菌剤、添加剤およびアジユ
バントたとえばアルミニウム化合物がまた、そのような
製剤中に存在しうる。
びこの技術分野においてよく知られている医薬的に受容
しうる担体、たとえば滅菌された生理的塩水、無毒性の
生理的バツフアー等からなる医薬組成物に使用しうるこ
とは、もちろん明らかである。もちろん、この技術分野
においてよく知られている殺菌剤、添加剤およびアジユ
バントたとえばアルミニウム化合物がまた、そのような
製剤中に存在しうる。
ここに記載した実施例および態様は説明目的のみのた
めのものであり、そしてその光のもとで種々の変形およ
び変化がこの技術分野において熟練している者に対し示
唆され、そしてこの出願の権限内および添付した請求の
範囲の範囲内に包含されることが理解される。
めのものであり、そしてその光のもとで種々の変形およ
び変化がこの技術分野において熟練している者に対し示
唆され、そしてこの出願の権限内および添付した請求の
範囲の範囲内に包含されることが理解される。
Claims (17)
- 【請求項１】少なくとも部分的に単離されたタンパク質
トキシンを酸化剤および微量の金属イオンで処理し、こ
のトキシンの免疫原性を保持しながら、このトキシンを
化学的に不活性化し、その後、不活性化されたトキシン
またはその一部を採取することからなり、前記酸化剤は
前記トキシンを、システイン、シスチン、メチオニン、
トリプトファン及びチロシンからなる群から選択される
アミノ酸残基が存在するトキシンのペプチド鎖の特定の
位置で酸化する、トキソイドの製造方法により製造され
たトキソイド。 - 【請求項２】アルミニウム化合物でアジュバント化され
た、請求の範囲第１項のトキソイド。 - 【請求項３】寒冷保存された、請求の範囲第２項のトキ
ソイド。 - 【請求項４】トキソイドが宿主に対し免疫原量において
投与されるとき、宿主に保護抗体を誘導しうる、請求の
範囲第１項のトキソイド。 - 【請求項５】トキソイドが百日咳トキソイドである、請
求の範囲第４項のトキソイド。 - 【請求項６】酸化剤が、過酸化水素、過酸化ナトリウ
ム、Ｎ−クロロ−４−メチル−ベンゼンスルホンアミド
ナトリウム塩（クロラミン−Ｔ）、過ギ酸、ジオキサン
パーオキサイド、過ヨウ素酸、過マンガン酸ナトリウ
ム、次亜塩素酸ナトリウムおよびそれらの混合物からな
る群から選択されるものである、請求の範囲第１項のト
キソイド。 - 【請求項７】酸化剤が過酸化水素である、請求の範囲第
６項のトキソイド。 - 【請求項８】酸化剤がクロラミン−Ｔである、請求の範
囲第６項のトキソイド。 - 【請求項９】金属イオンが第一鉄、第二鉄、コバルトお
よびクロムからなる群から選択されるものである、請求
の範囲第１項のトキソイド。 - 【請求項１０】化学的不活性化がキレート剤の添加によ
り制御される、請求の範囲第１項のトキソイド。 - 【請求項１１】キレート剤がエチレンジアミンテトラア
セテートである、請求の範囲第10項のトキソイド。 - 【請求項１２】トキシンが細菌性トキシンである、請求
の範囲第１項のトキソイド。 - 【請求項１３】トキシンが百日咳トキシンである、請求
の範囲第12項のトキソイド。 - 【請求項１４】酸化剤が過酸化水素である、請求の範囲
第13項のトキソイド。 - 【請求項１５】金属イオンが第二鉄である、請求の範囲
第14項のトキソイド。 - 【請求項１６】キレート剤がエチレンジアミンテトラア
セテートである、請求の範囲第15項のトキソイド。 - 【請求項１７】少なくとも部分的に単離されたタンパク
質トキシンを酸化剤および微量の金属イオンで処理し、
このトキシンの免疫原性を保持しながら、このトキシン
を化学的に不活性化し、その後、不活性化されたトキシ
ンまたはその一部を採取することからなり、前記酸化剤
は前記トキシンを、システイン、シスチン、メチオニ
ン、トリプトファン及びチロシンからなる群から選択さ
れるアミノ酸残基が存在するトキシンのペプチド鎖の特
定の位置で酸化する、トキソイドの製造方法により製造
された百日咳トキソイドの免疫原量を動物（ヒトを除
く）に投与することからなる動物におけるボルデテラ
パーツシスに対する抗血清の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US874,637 | 1986-06-16 | ||
| US06/874,637 US4762710A (en) | 1986-06-16 | 1986-06-16 | Novel method of preparing toxoid by oxidation and metal ions |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01500354A JPH01500354A (ja) | 1989-02-09 |
| JP2617500B2 true JP2617500B2 (ja) | 1997-06-04 |
Family
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP62504462A Expired - Lifetime JP2617500B2 (ja) | 1986-06-16 | 1987-06-04 | トキソイドを製造する方法 |
Country Status (14)
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| JP (1) | JP2617500B2 (ja) |
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| CN (1) | CN1033003C (ja) |
| AT (1) | ATE87486T1 (ja) |
| AU (1) | AU604497B2 (ja) |
| CA (1) | CA1302883C (ja) |
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| GR (1) | GR870917B (ja) |
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| WO2021001540A1 (en) | 2019-07-04 | 2021-01-07 | Proxi Biotech Aps | Detoxification of proteins |
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-
1986
- 1986-06-16 US US06/874,637 patent/US4762710A/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-06-04 DE DE87905002T patent/DE3785157T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-04 AT AT87905002T patent/ATE87486T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-06-04 EP EP87905002A patent/EP0269729B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-04 AU AU78047/87A patent/AU604497B2/en not_active Expired
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Non-Patent Citations (1)
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