JPH0140630B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、抗凝血性特性を付与する置換基を有
するポリマーから構成される抗凝血性材料及びそ
の製造方法に関する。 血液中に存在する天然の抗凝固物質であるヘパ
リンは、血栓塞栓症の優れた治療薬の一つであ
る。すでに長年にわたりヘパリンの欠点を解消す
るために、種々の合成又は半合成製品をこの貫重
な物質の代替品として使用する試みがなされてき
た。 代替品として提案されているものには、以下の
如きものがある：コンドロイチン硫酸（これも不
均質なポリホロシドの一種である）；キチンの完
全Ｎ−脱アセチル化により製造されるキトーサン
（キチンの分解生成物）［ホートン及びジヤスト
“カーボハイドレート リサーチ”29（1973）、
173〜179］；硫酸化キトーサン［ウオルフロム及
びシーナン、“ジヤーナル オブ アメリカン
ケミカル ソサイエテイー”（1959）81、1764〜
1766］；硫酸ヘパラン（heparan sulfate）［ジヨ
ープス及びガローエル、“ジヤーナル オブ バ
イオロジカル ケミストリー”176〜267（1948）］、
及び一定数のスルフエート及び／又はスルホネー
ト基を有するオサミン（主としてＤ−グルコサミ
ン）により及びウロン酸（通常Ｄ−グルクロン酸
及びＬ−イズロン酸）により構成される二糖単位
の重合により形成される他の多糖類。 これ等物質の“ヘパリン類似”の作用がヘパリ
ン自体の作用程顕著でないことに加えて、これ等
は天然物であり、その起源が、ヘパリンの場合と
同様に、調製の時点によつて製品のバラツキを大
きくし、また不均質とする。 他の一連のヘパリノイド類は、アミロース（こ
れは、ヘパリンと同様にα（１→４）結合を有し
ている）に由来する製品である。これ等のうち、
アミノ化及び硫酸化アミロースについてはウオル
フロム及びウオン［“カーボハイドレート リサ
ーチ”18（1971）23〜27］により、またアミロー
スの（１→４）２−アミノ−２−デオキシ−αD
−グルコピランウロナンへの転換についてはホー
トン及びジヤスト［“カーボハイドレート リサ
ーチ”30（1973）349〜357］により特に研究され
ている。このようにして得られた製品の“ヘパリ
ン的作用”は、弱いか或は実質的に無いに等しい
（アミノ化及び硫酸化アミロース）。 上記以外にも、以下の如き多糖類が、程度には
差があるにせよ、抗凝血特性を有するものとして
挙げられている：硫酸デキストラン［V.ポツズ
ニク“J.Hyg.Epid.Microbiol.Immunol.”16、
293（1972）］；ペントサンの硫酸ポリエステル［ク
ラン−ミデイ ラボラトリーズ（CLIN−MIDY
Laboratories）により「ヘモクラール
（HEMOCLAR）」の商品名で販売されている］；
アルギン酸誘導体［L.ラルムとその協力者“カー
ボハイドレート リサーチ”73、332（1979）］。但
し、残念ながら、これ等はいづれもヘパリン程有
効ではない。 ポリヘプチドのスルホン化誘導体、即ちリシン
のコポリマー及びトリプトフアンのコポリマーも
提案されている（フランジ特許第2280387号）。こ
れ等は、凝血時間を大巾に延長させると共に、ヘ
パリンと同様の作用を奏し得るけれども、人体機
能に対して極めて重大な副作用を及ぼすので大量
に使用することは出来ない。 1975年になつて、ハリーＰ グレガー
［“Polym.Sci.Technol.U.S.A.”（1975）７、51〜
56］は、スルホン化ポリマー類及びコポリマー類
（特にポリスチレンスルホン酸及びポリエチレン
スルホン酸）の“ヘパリン類似”物質としての用
途を見出した。T.ブウージエリング及び協力者
［“J.Biomed.Mater.Res.”（1974）Vol.8、375〜
379及び“Biocompat.Inplant.Mater.”187〜192
（1976）］は、ポリイソプレン類から合成されるポ
リマーの使用を見出した。該ポリマーの単位は下
式（）で示される： これは、アミノスルホン酸塩及びカルボン酸塩
を有する誘導体である。 これ等研究者は、実質的に可溶性の誘導体を得
たが、これ等は基準物質としてのヘパリンに比
べ、その12〜15％程度の抗凝血作用を示すに過ぎ
ない。 更に他の興味ある試みとして、ヘパリン分子自
体をポリマー類表面にグラフト重合させる試みが
なされている［（例えば、レニンジヤー及びその
協力者により“Trans.Amer.Soc.Artif.Int.
Organs”18、10（1972）等に発表されているよう
に、トリドデシルメチルアンモニウムクロライド
により構成されたカプリング剤により）、或いは
（例えばホフマン及びその協力者により“Trans.
Amer.Soc.Artif.Int.Organs.”18、10（1972）等
に発表されているように、共有結合により）］。残
念ながら、比較的少量のヘパリンが固定されるに
過ぎないという欠点の他に、上記の如き“ヘパリ
ン化”ポリマーは安定ではないという欠点を有し
ている：即ち、固定されたヘパリンは時間の経過
と共に不活性となる傾向がある。 従つて、安定であり、製造ロツトが異なつてい
ても再現性に優れ且つ均質であり、加えて必要な
らば不溶性とし得る抗凝血作用を有する製品の製
造の為、新しい抗凝固剤についての種々の研究が
引続き行なわれている。 かくて、ヘパリン上にビニルモノマー類を化学
的又は放射線化学的にグラフト重合させることに
より非常に高活性の製品が得られている［例え
ば、C.バケー及びその協力者によるAnn.Phys.
Biol.Med”９(2)131〜138（1975）及びD.ラバルに
よる“These de Doctoratd′Etat Paris”（1977）
を参照されたい。］しかしながら、このようにし
て得られた不溶性ポリマーは、実用には供し得な
い。何故ならば、これ等は時間の経過と共に不活
性となるのみならず、グラフト重合されたヘパリ
ンが、製品の使用中に分子中に移行して、完全に
マスクされてしまうからである。 上述の種々の化合物の抗凝血作用を検討した結
果、本発明者は、一つの仮説を設定した；この仮
説によれば、ヘパリンの抗凝血作用は、その二次
又は三次構造に依存するのではなく、より正確に
は、多糖類の鎖上に存在する種々の基の性質及び
これ等の基による効果の結合に依存し、これ等の
要因は、相乗的に作用して、トロンビン及びアン
チトロンビンに対する個々の要因の活性を著る
しく増大させる。 ヘパリンは、下式（）により一般的に示され
る。 またこれは下記（）で示されるウロン酸残基
の非Ｏ−スルホン化単位又は２−Ｏ−スルホン化
単位を有する。 更に、ラセミ体混合物の液体クロマトグラフイ
ー用のイオン交換樹脂が製造されている。これ等
の樹脂は、以下のアミノ酸を固定したポリスチレ
ンにより基本的に構成されている：アラニン、バ
リン、ノルバリン、フエニルアラニン、ロイシ
ン、イソロイシン、チロシン、セリン、スレオニ
ン、アスパラギン酸、プロリン、ヒドロキシプロ
リン及びグルタミン酸［特に、ベザ（VESA）及
び協力者によるZh.Obsch.Khim.SSSR42(12)2780
（1972）及びTr.Akad.Nauk、Lit.SSR.Ser.B.2−
69、93（1972）、及びプテイ（PETIT）とジヨゼ
フオンビツチ（JOZEFONVICZ）によるJour.of
Applied Polymer.Sci.Vol.21 2589〜2596（1977）
を参照されたい］。 高分子支持体上に上記（）式及び（）式に
示された基が同時に存在することが重要であると
の仮説を出発点として、本発明者は、このような
イオン交換樹脂が抗凝血作用を有する抗凝血性材
料として使用し得ることを見出すにいたつた。 より詳しくは、前記の如き現象を理解した上で
更に実験及び研究を重ねた結果、本発明者は、そ
の鎖状構造部に置換可能な基を有する架橋又は非
架橋の一定のポリマーに適合するより一般的な構
造を確立することに成功したものである。本発明
者は、更にこのようにして抗凝血特性を有する可
溶性及び不溶性材料の両者を製造することにも成
功した。 本発明によれば、抗凝血特性を付与された抗凝
血性材料が得られる。これら抗凝血性材料は、そ
の鎖状部分に置換可能な基を有し、これ等の基上
に以下に示すＸ及び／又はＹ及び／又はＶなる基
が統計的に固定されているポリスチレン及び多糖
類から選ばれたポリマーにより構成されている点
に特徴を有している。ここにＸ、Ｙ及びＶは以下
の通りである。 Ｘ：−SO₃R₁又は−R₃SO₃R₁基である。但し、
R₁は水素原子又は生理学的に許容される金属
を示し、R₃は、−CH₂−CO−NH−R₄基又は置
換又は非置換の

【式】基を示す。 R₄は置換若しくは非置換のアルキル、アリー
ル又はアルキルアリール基を示す。 Ｙ：−SO₂−R₂又は−R₃−SO₂−R₂基である。但
し、R₂は、そのアミン官能基により−SO₂−鎖
に結合されたアミノ酸残基を示す。R₃は上記
に同じ。 Ｖ：−CH₂−CO−NH−CHR−COOH基であ
り、Ｒはアミノ酸の側鎖を示す。 但し上記Ｘ、Ｙ及びＶにおいて、 (a) Ｘが−SO₃R₁である場合には、Ｘは必ずＹ及
び／又はＶと併存し、 (b) Ｖは常にＸ及び／又はＹと併存する。 本発明においては、アミノ酸は以下の如きグル
ープから選択される：即ち、少なくともも１個の
遊離のカルボン酸官能基を有しており、もし他の
アミノ官能基を有している場合には、１個以外の
全ての基は生理的に許容される電子求引基により
保護されているアミノ酸のグループである。 本発明の特定の実施態様においては、電子求引
基は、好ましくはベンジルオキシカルボニル又は
tert−ブチルオキシカルボニル基により構成され
ている。 本発明においては、アミノ酸は、以下のグルー
プに属するアミノ酸から選択される：グルタミン
酸、アスパラギン酸、メチオニン、システイン、
システイン酸、プロリン、オキシプロリン、トレ
オニン、セリン、チロシン、アラニン、フエニル
アラニン、バリン、ロイシン、ベンジルオキシカ
ルボニル−リシン、tert−ブチルオキシカルボニ
ル−リシン、ε−アミノカプロン酸、β−アラニ
ン、γ−アミノ−ｎ−酪酸、δ−アミノ−ｎ−吉
草酸。これ等は、置換、非置換のいづれであつて
もよい 本発明の好ましい一実施態様において、上記ア
ミノ酸は二塩基性アミノ酸から選択される。 本発明の好ましい一実施態様においては、固定
されたＸ及び／又はＹ及び／又はＶなる基を有す
る前記ポリスチレン及び多糖類から選ばれたポリ
マーは、架橋ポリマーである。 このようにして得られた抗凝血性材料は、水及
び生物液（biological fluids）に不溶であり非凝
血圧の人工心臓血管、カテーテル、縫合糸等の製
造材料とすることができる。 本発明の他の好ましい一実施態様においては、
その高分子鎖に固定されたＸ及び／又はＹ及び／
又はＶなる基を有する前記ポリスチレン及び多糖
類から選ばれたポリマーは、非架橋型の可溶性ポ
リマーである。 この水及び生物液に可溶の抗凝血性材料は、医
薬として使用し得る抗凝血作用を有する溶液の製
造を可能ならしめる。 本発明の一実施態様の特定例においては、前記
ポリマーはデキストランにより構成されている。
デキストランと血液との生物学的な適合性
（biocompatibility）は、古くから知られている。
A.グロンウオール及びその協力者［“Acta.
Physiol.Scand.”７ 97（1944）］は、デキストラ
ンの血漿代替物としての有用性を認めており、ま
たW.アペル及びその協力者［Angew.Chem.
Intern.Ed.”７ 702（1968）］は、血漿及び組織
におけるデキスラナーゼの作用下でのデキストラ
ンの酵素的分解を報じている。 本発明は、抗凝血特性を付与された抗凝血性材
料の製造方法をも提供する。この製造方法は、Ｘ
が−SO₃R₁でＹが−SO₂−R₂であり（但しR₁及び
R₂は前記に同じ）且つＶを有しない抗凝血性材
料を製造するに際し、第一の工程において適当な
溶剤中で前記ポリスチレン及び多糖類から選ばれ
たポリマーにクロルスルホン酸を反応させてクロ
ルスルホン化ポリマー（POL−SO₂Cl）を製造
し、第二の工程において塩基性媒体中で該クロル
スルホン化ポリマーに適当量のアミノ酸を反応さ
せてポリマー中の−SO₂Cl基を−SO₃Na基及び−
SO₂AA基（但しAAはアミノ酸を示す）に変換
させることを特徴とする。 抗凝血作用を有する、置換された可溶性の前記
ポリマーを得る為の本発明の特定実施態様におい
ては、非架橋型ポリマーのスルホン化は有機溶剤
中で、好ましくは塩素化された溶剤中で、より好
ましくはジクロロメタン中で行なわれ、ポリマー
は、ニトロメタン中で析出せしめられ、アミノ酸
との反応は水−ジオキサン混合物を含む媒体中で
行なわれる。 抗凝血作用を有する、置換された不溶性の前記
ポリマーを得るための本発明の特定実施態様にお
いては、架橋型ポリマーのスルホン化は、ジクロ
ロメタン及びニトロメタンを含む混合物中で行な
われ、アミノ酸との反応は、水−ジオキサン混合
物を含む媒体中で行なわれる。 上記特定の実施態様の改良例において、凝血因
子と相互作用するおそれのある不純物を出来るだ
け完全に除去するために、不溶性ポリマーの場合
には、アミノ酸の固定後に、水による十分な洗
浄、NaCl溶液（1.5M）による洗浄、クエン酸ナ
トリウム溶液（1M）による洗浄、ミハエリスの
緩衝液の数回洗浄によるPH約7.30への平衡調整、
水による再度の洗浄及び最終的な乾燥が行なわれ
る。 上記特定実施態様の改良剤において、可溶性ポ
リマーの場合には、不純物の除去は、アミノ酸の
固定後に、水に対する透析により行なわれ、必要
ならば、精製された最終生成物は、凍結乾燥によ
り回収される。 本発明において、Ｘが−R₃−SO₃R₁で、Ｖが
−CH₂−CO−NH−CHR−COOH（Ｒ、R₁及び
R₃は前記に同じ）で且つＹを有しない抗凝血性
材料を得る方法は、第一工程において前記ポリス
チレン及び多糖類から選ばれたポリマーのカルボ
キシメチル化誘導体を製造し、第二工程において
適当なアミン又はベンジルクロライドを固定し、
第三工程においてアミノ酸を固定し、最後に第四
工程においてスルホン化を行なうことを特徴とし
ている。 上記実施態様の特定改良例においては、上記ポ
リマーのカルボキシメチル化誘導体に対するアミ
ン及び／又はアミノ酸のカプリングは、Ｎ−エト
キシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒド
ロキノリン（EEDQ）又は他の類似のカプリング
剤により行なわれる。 上記実施態様の特定改良例において、スルホネ
ート基の量を増大させたい場合には、スルホン化
工程は数回にわたり繰返し行なわれる。 上記実施態様の特定改良例において、最終生成
物が不溶性のポリマーである場合、これは過剰量
のクロロスルホン酸で処理することにより可溶性
のポリマーとすることができる。 上記実施態様の特定改良例において、最終生成
物が可溶性の非架橋型のポリマーである場合に
は、加圧下の限外過により精製される。 本発明において、Ｘが−R₃−SO₃R₁、Ｖが−
CH₂−CO−NH−CHR−COOH、Ｙが−R₃−
SO₂−R₂（Ｒ、R₁、R₂及びR₃は前記に同じ）であ
る抗凝血性材料を得る方法は、第一工程において
カルボキシメチル化を行ない、第二工程において
適当なアミン又はベンジルクロライドを固定し、
第三工程においてクロロスルホン化を行ない、第
四工程においてアミノ酸を固定することを特徴と
する 本発明では、置換可能な基を有する前記ポリス
チレン及び多糖類から選ばれたポリマーから形成
された管、人工心臓血管、カテーテル、糸、フイ
ルム等の表面に前記に定義したＸ及び／又はＹ及
び／又はＶなる基を固定することにより抗凝血特
性を付与した内科用及び外科用医療材料として使
用される抗凝血性材料を得ることもできる。換言
すれば、置換可能な基を有する上記ポリマーから
先ず所望の形状及び寸法の上記材料を形成し、次
いでこれに化学的に（例えば前述の方法で）所望
量のＸ及び／又はＹ及び／又はＶなる基を固定し
て、抗凝血作用を有し、経時的にも安定してお
り、塩析又は劣化を生ずることのない固形材料を
得るのである。 上記した以外の本発明の特徴とするところは、
以下の記載から明らかとなろう。 下記の記載は本発明抗凝血性材料の製造例とそ
の性状、その抗凝血活性及びその他ヘパリンに類
似する活性の研究並びに各置換基の活性への影響
に関する。 しかし下記記載及び添付図面に示される種々の
実施例、同定及び研究等は単に例示に過ぎず、何
ら本発明をこれに限定するものではない。 ポリスチレン（PS）が支持ポリマーである
抗凝血性材料の製造 下記材料を製造した。 (a) 本発明の抗凝血性材料 製造番号 材料名 １ PS−ヒドロキシプロリン ２ PS−プロリン ３ PS−α−アラニン ４ PS−フエニルアラニン ５ PS−グルタミン酸 ６ PS−メチオニン ７ PS−トレオニン ８ PS−α又はε−ベンジルオキシカ
ルボニルリシン ９ PS−ε−ターシヤリブチルオキシ
カルボニルリシン 16 PS−アスパラギン酸 17 PS−β−アラニン 18 PS−ε−アミノカプロン酸 (b) 研究及び比較材料 製造番号 材料名 10 PS−リシン（ジアミノ酸） 11 PS−CH₂−プロリン（アミノ酸が
−CH₂−を介して固定されている） 12 PS−CH₂−ヒドロキシプロリン
（アミノ酸が−CH₂−を介して固定
されている） 13 PS−CH₂−アラニン（アミノ酸が
−CH₂−を介して固定されている） 14 PS−ブチルアミン（ア酸ノ酸では
なくアミンが固定されている） 15 PS−SO₃（スルホン化のみされた樹
脂） 出発原料のポリスチレンはスチレンとジビ
ニルベンゼン（２％）のコポリマーであり商
品名が「フルカ（FLUKA）」である。これ
は直径200〜400メツシユ、主に0.037〜0.074
mmのビーズ状形態で用いた。上記市販品を
NaOHの1M溶液、水、HClの1M溶液及び水
で順次洗浄して、減圧下60℃で乾燥した。 用いたアミノ酸は「フルカ プリス
（FLUKA Puriss）」試薬である。 (c) PS−SO₃（15）の製造 25ｇのポリスチレンを200mlのジクロルメ
タンに加え一晩室温に放置して膨潤させた。
次いでこれにニトロメタン160mlとクロルス
ルホン酸140mlの混合物を加える。得られる
サスペンシヨンを40℃で７時間振盪する。粗
製樹脂を過し、ニトロメタンとアセトンで
注意深く洗浄して、最後に減圧下50℃で乾燥
する。 クロルスルホニル（−SO₂Cl）基は次のよ
うにして定量した。 クロルスルホン化ポリスチレン200mgを
NaOHの1M溶液50mlと共に、24時間還流し
て加水分解する。酸性とした後、銀指示電極
を用いて、AgNO₃の0.1M溶液によりCl^-イ
オンを滴定した。 スルホン化ポリスチレンは2Mソーダによ
り室温で定量的に加水分解され、これは過
後、水洗され、減圧下乾燥された。 (d) 製品１〜10、14及び16〜18の製造 86ミルモルのアミノ酸を水−ジオキサン
（３：２）混合物130ml中に、4Mソーダの最
小量を用いて溶解した。PHを測定した後、上
記で得られたクロルスルホン化ポリスチレン
10ｇを（43ミリ当量の−SO₂Cl）加えた。
2Mソーダを加えて初期PH値を保つ。PHが安
定したときに反応を停止させる。得られたポ
リマーを過し、多量の水で洗浄し、次いで
10^-2Mソーダ、更に水で洗浄し、最後に減圧
下に乾燥する。 (e) アミノ酸−SO₂基のみを有し、スルホネー
ト基（−SO₃R₁）を含有しないポリスチレン
の製造 86ミリモルのアミノ酸のメチルエステルを
ジクロルメタン250ml中に溶解する。次いで
上記で得られたクロルスルホン化ポリスチレ
ン10ｇを加え、40℃で48時間撹拌する。得ら
れたポリマーを過し、多量のエタノールで
洗浄し、次いで減圧下乾燥する。メチルエス
テルの加水分解を、2Mソーダ中で行い、ア
ミノ酸スルフアミド基のみを有しそのカルボ
キシル基は遊離の基である樹脂を得る。 (f) PS−CH₂−アミノ酸ポリマー11、12、13
（アミノ酸は−CH₂−を介してポリスチレン
に固定されている）の製造 第１工程：クロルメチル化ポリスチレンの製
造 25ｇの架橋ポリスチレンを150mlのクロロ
ホルム中において25℃で30分間膨潤させる。
次いでモノクロロジメチルエーテル100mlと
塩化スズ10mlを加える。室温下、撹拌しなが
ら1.5時間反応させる。得られた樹脂を過
し、ジオキサン−水（３：１）混合物、次い
でジオキサン−3NHCl（３：１）混合物で洗
浄する。更にポリマーを順次ジオキサンを増
やした水とジオキサンの混合物により洗浄
し、次にジオキサン単独で洗浄し、それから
順次メタノールを増加させたジオキサンとメ
タノールの混合物により洗浄し、最後にメタ
ノール単独により洗浄する。その後減圧下50
℃で樹脂を乾燥する。 クロルメチル（−CH₂Cl）基の定量は次の
ようにして行つた。即ちクロルロメチル化ポ
リスチレン200mgを純粋なブチルアミン５ml
中で沸点温度で６時間かけて四級化する。硝
酸により系を酸性とした後、銀指示電極を用
いて、AgNO₃の0.1M溶液によりCl^-イオン
を滴定した。 第２工程：スルホニウム塩の製造 クロルメチル化ポリスチレン20ｇ（80ミリ
モル）をジメチルスルフアイド30ml（400ミ
リモル）、水100ml及びイソプロパノール120
mlの混合物中に懸濁させる。混合物を室温で
48時間撹拌する。反応媒体の整除できる部分
中のCl^-イオンを電位差滴定により定量して
反応収率を求めた。収率は約80％であつた。
スルホニウム塩は単離しなかつた。 第３工程：アミノ酸の固定 第２工程の懸濁液に、170mlのイソプロパ
ノールと200mlの水に溶かした64ミリモルの
ソーダと20ミリモルのアミノ酸ソーダ塩（ア
ミノ酸／基−CH₂S⁺（CH₃）₂＝２）を加える。
反応混合物を還流下24時間撹拌する。粗製樹
脂を過し、4Mアンモニア水中で４時間還
流させて再び懸濁させ、ジメチルスルフアイ
ドを除く。PS−CH₂−アミノ酸ポリマーを
過し、水、1MHCl、水及び1Mソーダで順
次洗浄し、その後水で液が中性になるまで
数回洗浄し、その後減圧下に乾燥する。 上記(d)及び(f)により得られた抗凝血性材料
の性状を第１表にまとめて示す。

【表】

【表】 (g) 可溶性抗凝血材料の製造 第一工程：クロルスルホン化ポリスチレンの
合成 非架橋ポリスチレン25ｇをジクロルメタン
200mlに溶解する。次いで激しく撹拌しなが
らクロルスルホン酸16mlを加え、40℃で７時
間反応させる。ニトロメタンを加えて全ポリ
マーを沈澱させ、過し、ニトロメタンで洗
浄してクロルスルホン酸の痕跡量を除去し、
次いで減圧下に乾燥する。クロルスルホニル
基は次のようにして定量した。即ちクロルス
ルホン化ポリスチレン200mgをNaOHの1M
溶液50mlにより、24時間還流して加水分解す
る。酸性とした後、銀指示電極を用いて、
AgNO₃の0.1M溶液によりCl^-イオンを滴定
した。 第２工程：アミノ酸の固定 ナトリウム塩の形態のアミノ酸50ミリモル
を水−ジオキサン（３：２）混合液100ml中
に溶解し、PHを測り、上記ポリマー10ｇを加
える。2Mソーダを加えることによりPHを初
期の値に保持し、PHが安定した時に反応を停
止する。反応系を水を用いて透析し、純粋な
抗凝血性材料を凍結乾燥により得る。 (h) 調整及び整粒 出発原料として平均粒子径が30〜80μの市
販のポリスチレンを用いた。種々の官能基の
固定により、乾燥状態における粒子径は殆ん
ど変動しないが、これらの官能基はポリマー
に顕著な親水性を付与するため、水性媒体中
の懸濁物の大きさは実質的に増大する。 予備実験により抗凝血活性は粒子の特定表
面の機能であることが明らかであつたので、
該表面を粉砕により増加させた。粉砕された
サンプルをミカエリス緩衝液中に懸濁し、粒
子径に応じて分別して、準コロイド状懸濁物
である平均粒子径が約2μ以下の粒子を除去
する。 上記で得られた各種の粗製ポリマー粒子を
洗浄し、PH7.35（ミカエリス緩衝液）に保持
し、乾燥した。次いで樹脂ビーズを粉砕し
（めのう容器中でめのうボールを急速に動か
すことにより）、粒子径を小さくする。非常
に細かい粒子を除くために粗製の製品をミカ
エリス緩衝液中に懸濁させることにより数回
洗浄し、次い傾斜して上澄液を除去する。得
られた製品の粒子径分布を定量的顕微鏡分析
（Technic Analysis System）により測定す
る。粒子をその大きさにより分別することに
より、粒子径分布がほぼ同じサンプルにおけ
る抗凝血活性の研究が可能となる。 支持ポリマーとしてデキストランを有する抗
凝血性材料の製造 Ａ 可溶性、非架橋化合物の合成 の製造 第１工程：デキストランのカルボキシメチ
ル化 E.Antoniniら（Giorn.Biochi14、88
（1965））の実験方法を応用した。 撹拌機、コンデンサを備え、油浴中に2/
３をつけた平板の１フラスコを用いて、
12Mソーダの500ml（６モル）中にデキス
トラン16.2ｇ（0.1モル）を室温下に溶解
する。温度を70℃近くにし、この温度で３
時間保つ。クロル酢酸283.5ｇ（３モル）
を反応系を約70℃に保ちながら少しずつ加
える。添加時間は約0.5時間であつた。約
70℃で24時間撹拌する。反応混合物を室温
に戻し、メタノール1.5中に沈澱させ、
沈澱物を別し、少量のメタノールで洗
い、蒸留水約100ml中に再溶解する。次い
でメタノール約500ml中に再び沈澱させ、
別し、洗浄、オーブンを用いて減圧下約
40℃で乾燥する。 第２工程：ベンジルアミンの固定 撹拌機を有する200mlの平底フラスコを
用いて、室温で５ｇのカルボキシメチル−
デキストラン（上記で得られたもの）を20
mlの蒸留水中に溶解する。溶液のPHを少量
の濃塩酸により約４に調節する。次いでゆ
つくりと（約15分の添加時間）、無水エタ
ノール50ml中に溶かした６ｇのＮ−エトキ
シカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジ
ヒドロキノリン（EEDQ）を添加する。
0.5時間撹拌し、ベンジルアミン３mlを加
え、ついで１晩撹拌する。反応混合物をア
セトン700ml中に加え、生成した沈澱を
別し、アセトンで洗浄し、オーブン中で減
圧乾燥する。 第３工程：グルタミン酸の固定 第２工程で得られた化合物２ｇを蒸留水
10mlに溶解し、濃塩酸を数滴加えてPHを４
に調節した。EEDQ1.7ｇを無水エタノー
ル13mlに溶かした液をゆつくりと加え、30
分間撹拌し、更にグルタミン酸1.6ｇ及び
ソーダ0.87ｇを含む水溶液10mlを加える。
混合物を室温で１晩撹拌し、次いでHClに
より酸性化（PH４〜５）し、メタノール
800ml中に沈澱させる。沈澱を別し、メ
タノールで洗浄し、オーブン中で減圧下に
一晩乾燥する。 第４工程：スルホン化 第３工程で得られた化合物1.2ｇを秤量
し、これをニトロメタン100ml中に撹拌下
に加える。次いでクロルスルホン酸1.4ml
をゆつくりと加え２時間撹拌する。得られ
た生成物を別し、ニトロメタンで洗浄
し、1Mソーダ中に２時間置き、メタノー
ルで沈澱させ、洗浄し減圧乾燥する。 第５工程：精製 第４工程で得られた乾燥生成物を、２度
蒸留した蒸留水の存在下、２バールの加圧
下で３日間、限外過（5000膜）する。 の製造 実施例(a)の第１、第２、第４及び第５
工程を行う。 Ｂ 不溶性、架橋化合物の合成 出発原料 酸型のカルボキシメチル−セフアデツクス
（4.0〜4.5meq／ｇ） (1) ベンジルアミンの固定 −250cm²のフラスコ中、カルボキシメチル
−セフアデツクス５ｇを水60cm³中に撹拌
分散する −無水エタノール160mlに溶かした
EEDQ20ｇをゆつくりと加え0.5時間反
応させる −ベンジルアミン4.4cm³を加える −混合物を24時間撹拌放置する −生成物を別回収する −多量の水、無水エタノール、再度水で洗
浄する −オーブン中で減圧下、40℃で24時間乾燥
する。約２〜2.6meq／ｇのベンジルア
ミンが固定される。 (2) トレオニンの固定 −250cm³のフラスコ中、上記で得られた生
成物６ｇを蒸留水60cm³中に分散させる −無水エタノール160mlに溶かした
EEDQ20ｇをゆつくりと加え0.5時間反
応させる −次にトレオニン３ｇ、ソーダ1.1ｇ及び
蒸留水20cm³からなる混合物を加え、24時
間撹拌する −上記(1)と同様にして生成物を回収する。
約1.6meq／ｇのトレオニンが固定され
る。 (3) スルホン化 −上記で得られた生成物５ｇをニトロメタ
ン500cm³中に撹拌しながら分散させる −クロルスルホン酸2.8cm³（ベンジルアミ
ンの約３倍当量に相当）を加える −２時間反応させる −生成物を別回収する −多量のニトロメタン、次いで蒸留水で洗
浄する。 −オーブン中で減圧下、40℃で24時間乾燥
する。大過剰のクロルスルホン酸（ベン
ジルアミンの４倍当量以上）の存在下に
反応を行うと可溶性の生成物が得られ
る。 (4) 生成物の洗浄及び調整 原料等の合成試薬を完全に除去するため
に、生成物を1.5Mの塩化ナトリウム溶液
で２回、次いで1Mのクエン酸トリナトリ
ウム塩溶液で２回引き続き洗浄する。 次いでミカエリス緩衝液で３回連続洗浄
してPHを7.3〜7.35に調整する。 生成物を最後に蒸留水で完全に洗浄し
て、オーブン中で減圧下、40℃で24時間乾
燥する。 凝固試験 血小板減少血漿（PPP）を新鮮な人間の血
漿から遠心分離（４℃−10000ｇ−30分）によ
つて調製する。これを−20℃で貯蔵し、小量を
解凍したのち４℃に保つ。 使用するフイブリノーゲンは精製した牛のフ
イブリノーゲン（ベーリング、Behring）の
0.85％NaCl中６ｇ／濃度の溶液である。こ
の溶液は使用直前に作られ37℃で保存される。 トロンビン（Roche50NIH／mg）、ヘパリン
拮抗剤｛ポリブレーン（polybrene）又はポリ
リシン（polylysine）、シグマ（Sigma）社｝
は使用直前にミカエリス緩衝液で稀釈し４℃
（トロンビンに対し）又は室温（ポリブレーン
及びポリリシンに対し）で保存する。レプテイ
ラーゼ（reptilase）（Stago）は蒸留水で稀釈
し37℃で保存する。抗トロンビン（Kabi）
は蒸留水に溶かして４℃で保存する。 ポリマーは１ｇ／の乳化剤（LensexTA01
−NP40Shell）を加えたミカエリス緩衝液中に
懸濁させた。 凝血時間はすべてガラス管中37℃で直接観察
によつて測定した 抗凝血活性の研究 樹脂の抗凝血性を研究すべき樹脂の種々の濃
度の存在下に、脱石灰質した血小板減少
（PPP）血漿でのトロンビン時間又はフイブリ
ノーゲン溶液時間を測定するによつて研究し
た。種々の比率の−SO₃Na基を含有する数種
の樹脂（PS−SO₃）の予備研究によつて、ト
ロンビン時間は試験の際の一定量のPPP中に
存在する−SO₃Na基の量にのみ依存すること
が判つた。従つて、異なつた樹脂の抗凝血性を
直接比較可能とするため、トロンビン時間を−
SO₃Naの濃度で表わされる樹脂の量の函数と
してプロツトした。 その結果を第１図（Fig.1）に示す。トロン
ビン時間（秒）を縦軸とし、ポリマー懸濁液の
濃度（SO₃ ^-／ml数で表わす）を横軸とし、ト
ロンビン30U／ml（Fig.1a）、トロンビン
50U／ml（Fig.1b）及びトロンビン75U／ml
（Fig.1c）に対しプロツトする。 曲線１はPPP中での樹脂（PS−SO₃）に対
応する。 曲線２はPPP中での樹脂（PS−SO₂）に対
応する。 曲線３はフイブリノーゲン溶液での樹脂
（PS−SO₃）に対応する。 曲線４はフイブリノーゲン溶液での樹脂
（PS−SO₂−Glu）に対応する。 0.1mlのポリマー（種々の濃度の）懸濁液を
0.2mlのPPPと共に（Fig.1の実線）又はフイブ
リノーゲン溶液と共に（Fig.1の破線）37℃で
30分間インキユベートした。次いで0.1mlのト
ロンビンを加え凝血時間（トロンビン時間）を
測定した。 第１図より樹脂（PS−SO₂−Glu）の抗凝血
活性は樹脂（PS−SO₃）より大きいことが直
ちに認められる。この差を粒子の大きさや比表
面の差に帰因させることはできない。之等は凝
血時間に観察される偏差を説明するにはあまり
に小さ過ぎる。 すべての場合に、下記の追加テストを行つ
た： (a) ポリマーの不存在下におけるPPP又はフ
イブリノーゲン溶液でのトロンビン時間（対
照時間）の測定。 (b) ポリマーと共に予めインキユベートした後
のPPPを遠心分離し得られる上澄液でのト
ロンビン時間の測定。すべての場合にこの時
間は対照時間に非常に近いことを認めた。加
うるに、トロンビン時間の増大がフイブリノ
ーゲンの変化によるものでないことをテスト
するために、ポリマーと共にインキユベート
したPPPでの又はフイブリノーゲン溶液で
凝血時間（レプテイラーゼ時間）をレプテイ
ラーゼによつても測定した。第２図（Fig.2）
に示される結果から明らかな通り、ポリマー
存在下及び不存在下に得られるレプテイラー
ゼ時間の間には顕著な差は現われない。この
Fig.2は凝血時間（秒）をポリマー懸濁液の
濃度（−SO₃ ^-／mlの数により表わされる）
の函数としてプロツトしたものである。ポリ
マー懸濁液（0.1ml）を0.2mlのPPPと共に30
分間37℃でインキユベートした。次いでトロ
ン9U／ml（実線）又はレプテイラーゼ（破
線）の0.1mlを添加した。トロンビンの濃度
はレプテイラーゼと同じ対照時間、即ち20秒
を与える如く選んだ。曲線１は樹脂（PS−
SO₃）に対応し、曲線２は本発明のポリマー
（PS−SO₂−Glu）に対応する。 異なるトロンビン濃度に対して得られた血
漿についての曲線を試験中に存在する樹脂の
量の函数として不活性化されたトロンビンの
量に置き換えた。実際、最初の概算で、延長
されたトロンビン時間はトロンビンの最初の
画分の不活性化を示すものと考えられ、この
画分は種々の量のトロンビンによつて測定さ
れた対照時間の曲線につき求められた凝血時
間を比較することによつて測定された。第３
図（Fig.3）は斯しくして得られた曲線を示
す。 曲線１はポリマー（PS−SO₃）に対応す
る。 曲線２は本発明によるポリマー（PS−
SO₂−Gln）に対応する。 曲線３は上澄液（PPP＋PS−SO₃及び
PPP＋PS−SO₂−Gln）に対応する。 不活性化されたトロンビンを、Ｕ／mlの単
位で縦軸に、SO₃ ^-／ml数で表わされるポリ
マーの懸濁液濃度を横軸にしてプロツトし
た。不活性化されたトロンビンの量は対照時
間の検量線（0.2mlのPPPを0.1mlのミカエリ
ス緩衝液と37℃でインキユベートし、種々の
濃度のトロンビン0.1mlを加え、凝血時間を
測定する）から評価した。PPPをポリマー
懸濁液と共にインキユベートした後に測定さ
れたトロンビン時間を上記検量線と比較し、
これにより活性酵素の濃度を評価することが
でき、従つて対応する不活性化トロンビンの
量を評価することができる。 第３ａ，３ｂ，３ｃ図（Fig.3a、3b、3c）
に示された曲線は、不活性トロンビンの割合
が試験中に存在するポリマーの量と共に増加
することを明らかにしている。加うるに、上
澄液について行なわれたトロンビン時間の測
定（曲線３を参照）はトロンビンの不活性化
がなかつたことを示す。これらの結果よりポ
リマーの抗凝血効果は、該ポリマーがPPP
中に存在する限りにおいてのみ発現されるこ
とが判る。 PPP及びフイブリノーゲン溶液につき同
一条件下で得られたトロンビン時間（Fig.1
と３）を比較するとポリマーの抗凝血効果は
フイブリノーゲン溶液には無い血漿性因子
（Plasmic factor）の存在においてのみ表わ
れることが判る。 これらの結果全体よりこれらのポリマーの
抗凝血活性は、抗トロンビンを血漿性共因
子（plasmic cofactor）として含む抗トロン
ビン活性であることが示唆される。換言すれ
ば、これらのポリマーは抗凝血性（ヘパリン
類似）物質であることが示唆される。 不活性化トロンビンの量及びPS−SO₂−ア
ミノ酸存在量との間の変化の一般法則の確立 種々の試料の抗凝血活性を、本発明によるポ
リマーの量を増加させながら種々培養した
PPPでのトロンビン時間の測定によつて研究
した。先ず各樹脂の抗凝血活性が上記項及び
下記項に記載する試料のそれらと同様である
ことを確かめるため、ポリマーを用いてインキ
ユベートしたPPPのレプテイラーゼ時間及び
ポリマーを用いてインキユベートしたフイブリ
ノーゲン溶液のトロンビン時間を測定した。こ
れらはすべて対応する対照時間（ポリマーの不
存在下に測定）に実質的に等しい。 最初のトロンビンの画分の不活性化に対応す
るトロンビン時間の延長（検量線とある量の樹
脂の存在下に測定された凝血時間との比較）
は、PPP中に存在するこの量の樹脂によつて
不活性化されるトロンビンの量の測定を可能と
する。第４図（Fig.4）は、スルホネート基に
関して種々の比率でプロリンを含有する一連の
化合物に対する樹脂懸濁液の濃度の函数とし
て、不活性化されたトロンビンの量的変化を示
す図である。樹脂懸濁液の濃度は懸濁液１ミリ
リツトル当りの−SO₃Naのミリ当量で表わさ
れ、これはプロリン基の効果の直接比較を可能
にし、また抗凝血活性がこれ等の基の比率と共
に増大することを示す。 Fig.4は事実PS−SO₂ポリマー−プロリンの
懸濁液の濃度（ミリ当量−SO₃Na／mlで表わ
される）の函数としての不活性化トロンビンの
量を示しており、上記ポリマー−プロリンの懸
濁液としては、 ポリマー１ｇ当り2.59meqプロリン：（曲線
１） ポリマー１ｇ当り2.09meqプロリン：（曲線
２） ポリマー１ｇ当り1.62meqプロリン：（曲線
３） ポリマー１ｇ当り0.93meqプロリン：（曲線
４） を用いた 各アミノ酸に対し同じ一連の曲線が得られ
た。 第５図（Fig.5）はグルタミン酸基を有する
樹脂についてのポリマー濃度（mg／mlで表わ
す）の函数として、不活性されたトロンビンの
量を縦軸にとりその変化を４種のトロンビン濃
度 −12U／ml（曲線１） −30U／ml（曲線２） −50U／ml（曲線３） −75U／ml（曲線４） ついて示したものである。 本発明に従つて製造された他のすべての抗凝
血性材料について同様の曲線が作られ、変化の
法則はすべての場合において同様であることが
認められた。この変化は第１に直線的
（linear）であり、このことは不活性化された
トロンビンの量は、用いたトロンビンの濃度の
如何に拘らず、存在するポリマーの量に比例す
ることを示す。然しながら100％不活性化を達
成するには常に過剰のポリマーが必要となる。 各ポリマーに対し原点における接線の外挿に
より所定量のトロンビンを完全に不活性化する
ために理論上必要とする樹脂の量を求めること
ができる。この結果は第６図（Fig.6）から明
らかである。図において不活性化されたトロン
ビンの全量に対する％を縦軸とし、存在するト
ロンビンを全て不活性化するために理論上必要
なポリマーの％で表わした量を横軸とし、大き
さを縮小した座標でプロツトした。 第７図（Fig.7）はこの比例性の普遍性を調
べることを可能ならしめる。実際に、各々の点
は30単位のトロンビンを不活性化するのに必要
なポリマーの量を、12単位のトロンビンを不活
性化するのに必要な同じポリマーの量の函数と
してプロツトしたものである。これらの点は全
て実質的に一直線をなし比率30／12の傾斜線は
非常に近く、これは研究された全てのアアミノ
酸につき変化関係が有効であることを示してい
る。次いで各樹脂の活性を、30単位のトロンビ
ンを不活性化するのに必要な樹脂の逆数として
求めることができる。 この数値を参照値として用いることによつ
て、第８図（Fig.8）に示す如く、12乃至75単
位／mlの範囲で変化させたトロンビン濃度につ
いて比例の法則が有効であることが判る。 第８図はトロンビンの濃度を横軸として下式
で表わされる比率 Ｘ単位のトロンビンを不活性化するに必要なポリ
マー／30単位のトロンビンを不活性化するに必要なポリ
マー を縦軸としてプロツトされている。 要約すれば、Fig.7及び８から次のことが明
らかとなる： −本発明により得られたポリマー、即ち本発明
の抗凝血性材料の充分な量が添加されるなら
ば、存在するトロンビンを全て不活性化する
ことができる。 −本発明に係る全てのの抗凝血性材料につい
て、樹脂中に存在するアミノ酸（AA）の種
類及びこのAAの量の如何に拘らず、同じ不
活性化法則が履行される。 ジアミノ酸（リシン）の場合 第９図（Fig.9）には、試験中に存在する樹
脂の量の函数として不活性化されるトロンビン
の量（Ｕ／mlとして縦軸にとる）の変化が図示
されている。 曲線１はPS−SO₂−リシンポリマーに関し、 曲線２はスルホン化PS−SO₃ポリマーに関
し、 曲線３はPS−SO₂−プロリンポリマーに関
し、 曲線４はPS−SO₂−α−Ｚ−リシンポリマ
ーに関し、 曲線５はPS−SO₂−グルタミン酸に関する。
（Ｚは電子吸収性ベンジルオキシカルボニル基
である）。 樹脂の量の全ての樹脂について懸濁液のml当
りのスルフオネート基の濃度で表わされ、スル
フオネート基のみを含有する樹脂の曲線（曲線
２）より上の曲線は、対応するアミノ酸が固定
される樹脂に対し、そのスルフオネート基のみ
の抗凝血活性に関し付加的抗凝血活性を与える
ことを示す。 これはリシンを除く全てのアミノ酸に対する
場合に当てはまる。これに反してリシンの場合
には、曲線はスルフオネート基のみを含有する
樹脂（PS−SO₃）の曲線より下にあり、即ち
樹脂上のリシンの存在はスルフオネート基部分
の抗凝血活性の一部を逆に「中和する」のであ
る。これは下記項に記載され、ポリリシン
（その側鎖の、PH7.35に陽子化（protonise）さ
れたアミノ基部分はPS−SO₃樹脂又はPS−
SO₂−AAの、又はヘパリンの負の部位、特に
スルフオネート部分を中和する）について観察
さる抑制効果に近い現象である。 他方に於て、リシンのアミン官能基が保護さ
れると、この中和はもはや認められず、ポリマ
ーはその性質を完全に回復する。 PS−CH₂−AA樹脂（アミノ酸が−CH₂−鎖
を介して高分子鎖に固定される）の場合 この研究はプロリン、ヒドロキシプロリン及
びアラニンをそれぞれ含有する３つの樹脂（第
１表化合物11、12及び13参照）に基づいて行な
われた。各々の場合に、種々の量の樹脂と共に
培養されたPPPのトロンビン時間を測定した。 これらは存在する樹脂の量の如何に拘らず対
照時間に実質的に等しいことが認められた。 各種の置換基自体の活性の評価 30トロンビン単位に関して前記の如くして定
められた各樹脂の活性から１トロンビン単位に
関する活性を推定することができる（第２表参
照）。もし樹脂について異なる置換基の効果が
付加的であるならば、活性「ａ」は下記の関係
式(1)によつて表わされる。 ａ(C_SO3-+C_AA)＝(a_SO3-×C_SO3-) ＋(a_AA×C_AA) ……(1) （式中、a_SO3−及びa_AAはそれぞれスルフオネ
ート基及び−SO₂−アミノ酸基の活性を示し、
C_SO3−及びC_AAはそれぞれの濃度を示す）。 第１０図（Fig.10）は樹脂の活性「ａ」に、
置換基の全数とスルフオネート置換基との比、
即ち式 C_SO3−＋C_AA／C_SO3− で表わされる値を乗じた値（縦軸とする）、−
SO₂−アミノ酸の数とスルフオネート置換基の
数との比、即ち式 C_AA／C_SO3− で表わされる値の函数として（横軸とする）、
プロツトすることにより得られた曲線を示す。 これらの曲線は、スルフオネート基の活性
（a_SO3−）に等しい原点において共通の縦軸を
有し、アミノ酸基の活性（a_AA）に等しい傾斜
を有する。 曲線１はポリマー（PS−SO₂−But−NH₂）
に対応し、 曲線２はポリマー（PS−SO₂−アラニン）
及び（PS−SO₂−フエニルアラニン）に対応
し、 曲線３はポリマー（PS−SO₂−Ｚ−リン）、
（PS−SO₂−ヒドロキシプロリン）、（PS−SO₂
−メチオニン）、（PS−SO₂−プロリン）及び
（PS−SO₂−スレオニン）に対応し、 曲線４はポリマー（PS−SO₂−グルタミン
酸）に対応する。 各種置換基の活性を下記の第２表及び第３表
に再分類して示す。 Ａ 担体ポリマー：ポリスチレン

【表】 次の事が明らかである。 (1) ブチルアミン（But−NH₂）の活性は零
である。 これはスルフアミド基のみでは樹脂に抗
トロンビン活性を与えるに不充分であり、
カルボン酸官能基を欠く置換基は、この活
性に何ら効果を及ぼさないことを示す。 (2) アラニン及びフエニルアラニン基はスル
フオネート基（−SO₃ ^-）の活性60meq^-1
に近い、60乃至80meq^-1の間の活性を有す
る。これは炭化水素側鎖が実際上効果を有
さずアミノ酸のカルボン酸官能基の活性が
スルフオネート基の活性と同じオーダーの
大きさにあることを示す、アラニンとフエ
ニルアラニンとの間の僅かな差は、アラニ
ンに対してフエニルアラニンの側鎖がより
顕著な疎水性を有していることによつて恐
らく説明されるであろう。 (3) 側鎖のアミノ官能基が電子吸引性基（置
換基Ｚ）に置換されたリシンは、正の活性
を有するが、スルフオネート基より多いア
ミノ酸基を含有する樹脂の合成が現在なお
困難なため、その活性の程度が正確に定め
ることは困難である。同じ問題がリシンに
も生ずるが、この場合活性は、正確には定
め難いが、負である。 (4) ヒドロキシプロリン、スレオニン及びメ
チオニンの如く、側鎖に異種原子を含有す
るアミノ酸は、120乃至150meq^-1の間にあ
る高い活性を有する。 (5) プロリンもこの群に入れられる様に思わ
れる。但しポリスチレンにメチレン基によ
つて固定されるこれらの２つのアミノ酸、
プロリン及びヒドロキシプロリン（樹脂
PS−CH₂−AA）は、全く抗凝血活性を示
さないことに注意すべきである。 (6) グルタミン酸又はアスパラギン酸の如
き、ジカルボン酸（二塩基性アミノ酸）
は、他の全てのα−アミノ酸よりも高い活
性を有する。これはそれらの２つのカルボ
キシル官能基に恐らく関連するためであろ
う。 (7) 例えばβ−アラニン又はε−アミノカプ
ロン酸の如くアミン官能基とカルボキシル
官能基とがいくつかのメチレン基によつて
分離されているアミノ酸は、全て高い活
性、殊にメチレン基の数が大きいほど高い
活性を有する。これは恐らくカルボキシル
官能基を一層接近し易く（accessible）す
る炭素鎖の「腕（arm）」効果に関係ある
ものと思われる。 これらの結果の全てから幾つかの結論が
導かれる。即ちスルフアミド基は、抗凝血
活性を充分には与えないが、樹脂（PS−
CH₂−AA）は全く活性を有し得ないた
め、該基は必要であると思われる。 一方、該スルフオネート基は、抗凝血活
性を与えるが、ポリマー（PS）の全置換
基がSO₃ ^-基により置換された場合に、付
与される活性は僅小ないし非常に僅かであ
り、ヘパリンのそれのたかだか15％に過ぎ
ない。 これに対して、高分子鎖がスルフアミド
及び／又はアミド基を介して固定されたス
ルフオネート基とアミノ酸とを含有し、ア
ミノ酸が適当な側鎖を有する場合には、該
材料の抗凝血活性は非常に大きい。 Ｂ 担体ポリマー：デキストラン

【表】 ポリマーなしの対照：７秒
これらの３つの抗凝血性材料の比較から最
も良い結果が得られるのは、20秒のトロンビ
ン時間を得るための濃度が2.5×
10^-3meqSO₃ ^-であるNo.2の材料であること
が判る。 非常に微細化した抗凝血性材料につき、ト
ロンビン時間の測定から、下記の活性係数が
求められた。

【表】 本発明抗凝血性材料の他のヘパリン類似作用 Ａ 抑制剤の作用の研究 ヘパリン抑制剤（ポリブレーン
（polybrene）及びポリリシン（polylysine）
は、本発明抗凝血性材料の抗凝血特性を完全
に抑制する。 結果を第１１図に示す。該図において縦軸
はトロンビン時間（秒）を、また横軸は抑制
剤濃度（mg／ml）を示す。試験は次の通り行
なわれた。即ちポリマー懸濁液（0.1ml）を、
PPP0.2ml及び抑制剤溶液（各種濃度）の0.1
mlと共に37℃下30分間インキユベートする。
次いでトロンビン（12U／ml）の0.1mlを添
加し、凝血時間を測定する。曲線１はポリブ
レーンにおける結果を、また曲線２はポリリ
ジンにおける結果を示している。 第１１ａ図はPS−SO₂−Gluを用いた結果
を、第１１ｂ図は、ボリマー（PS−SO₃）
を用いた結果を夫々示す。 第１１図において、この抑制はポリマーの
負のチヤージに関して抑制剤の正のチヤージ
が過剰である場合のみ完全に行なわれる。一
方ヘパリンに対しては過剰量ではなくとも完
全に行なわれる。またポリリシンについてよ
りもポリブレーンについての方がより過剰量
必要であることが判る。上記各結果より樹脂
に接近する負の部位（accessible negative
sites）の大部分に抗凝血活性が含まれるこ
とが判る。 Ｂ 抗トロンビンの存在下又は不存在下にお
けるポリマーによるトロンビンの不活性化の
研究 この研究は下記二つのシリーズで行なわれ
た。 (a) ポリマーをトロンビンと共に又はトロンビ
ン及び引き続きポリブレーンと共にインキユ
ベートする。 (b) ポリマーをトロンビン次いで抗トロンビン
とインキユベートするか又は順次トロンビ
ン、抗トロンビン及びポリブレーンと共に
インキユベートする。全ての場合、混合物は
次いで遠心分離され、上澄液はPPPに又は
フイブリノーゲン溶液に添加される。凝血時
間を次いで測定する。（第４表参照）。 得られた結果より、抗トロンビンの不存
在下においてトロンビンはポリマーによつて
反比例的に不活性化されること；その活性は
ポリブレーンの存在下再度出現することが判
る。これに対し抗トロンビンの存在下にお
いてトロンビンのポリマーによる不活性化
は、ヘパリンを用いる場合のように逆転でき
ない。

【表】 試験条件：ポリマーを緩衝液に懸濁させた液
（0.2ml）を０℃下、トロンビン0.2ml（５単
位／ml）と共に［(a)、(b)］、又は抗トロンビン
0.016ml（25単位／ml）及びトロンビン0.2ml
（５単位／ml）と共に［(c)、(d)］インキユベー
トする。５分後緩衝剤(a)、(c)の0.2ml又はポリ
ブレーン溶液（40mg／ml緩衝剤溶液）(b)、(d)の
0.2mlを添加する。０℃下５分間放置後、懸濁
液を遠心分離し、上澄液0.3mlを37℃以下に
PPP0.2mlに、又はフイブリノーゲン溶液0.2ml
に加える。凝血時間（秒）を次いで測定する。
コントロール時間は抗トロンビン不存在の場
合は45秒であり、また、抗トロンビンが存在
する場合は60秒である。 上記より本発明の抗凝血性材料は、非常に顕
著な抗凝血活性を有することが判る。支持ポリ
マーとして非架橋ポリマーを選択する場合、可
溶性の抗凝血性材料が得られ、これは水に溶解
させて溶液にすると医薬用途に適したものとな
る。また支持ポリマーとして架橋ポリマーを選
択する場合、不溶性の抗凝血性材料が得られ、
これは例えば内科乃至外科的用途に適してい
る。 この固体状態における抗凝血活性は、かなり
高く、これは重合性物質に共有結合によつて固
定されたヘパリン自体のそれと同程度のオーダ
ーである。しかしながら該ヘパリンに比し本発
明抗凝血性材料は顕著に安定である。 上述したように本発明は、その適用方法、実
施態様及び使用方法に限定されるものではな
く、当業者にとり白明な各種の本発明範囲内に
おける改良をも包含する。

【図面の簡単な説明】

第１図（第１ａ図、第１ｂ図、第１ｃ図）はト
ロンビン時間を−SO₃Naの濃度で表わされるポ
リマーの量の函数として示すグラフ、第２図は凝
血時間をポリマー懸濁液の濃度の函数として示す
グラフ、第３図（第３ａ図、第３ｂ図、第３ｃ
図）は、トロンビンにつき測定された対照時間と
ポリマー懸濁液の凝血時間とを対比して示すグラ
フ、第４図はプロリン含有ポリマー懸濁液の濃度
の函数として、不活性化されたトロンビンの量的
変化を示すグラフ、第５図はグルタミン酸基含有
ポリマー懸濁液の濃度の函数として、不活性化さ
れたトロンビンの量的変化を示すグラフ、第６図
は不活性化されたトロンビンの量と、ポリマーの
理論的必要量との関係を示すグラフ、第７図は各
種アミノ酸につき、トロンビン30単位及び12単位
をそれぞれ不活性化するのに必要なポリマー量を
示すグラフ、第８図はトロンビンを不活性化する
に必要なポリマー量と各ポリマーの活性の関係を
示すグラフ、第９図はポリマー量の函数として不
活性化されるトロンビンの量的変化を示すグラ
フ、第１０図はポリマーの活性を示すグラフ及び
第１１図（第１１ａ図及び第１１ｂ図）は、トロ
ンビン時間と抑制剤濃度の関係を示すグラフをそ
れぞれ示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 鎖状部分に置換可能な基を有し、該基上に下
   記Ｘ及び（又は）Ｙ及び（又は）Ｖ基が統計的に
   固定されており且つポリスチレン及び多糖類から
   選ばれたポリマーから構成されていることを特徴
   とする抗凝血性材料。 ［Ｘは基−SO₃R₁又は基 −R₃−SO₃R₁を示し、R₁は水素原子又は生理
   学的に相溶する金属を、またR₃は−CH₂−CO−
   NH−R₄（R₄は置換基を有しもしくは有しないア
   ルキル、アリール又はアルキルアリール基）又は
   置換もしくは非置換の基【式】を示 す。 Ｙは基−SO₂−R₂又は基 −R₃−SO₂−R₂を示し、R₂は −SO₂−鎖にそのアミン官能基により結合した
   アミノ酸残基を示し、R₃は上記に同じ意味を有
   する。 Ｖは−CH₂−CO−NH−CHR−COOH基を示
   し、Ｒはアミノ酸側鎖を示す。 但し(a)Ｘが基−SO₃R₁を示す場合、これはＹ及
   び（又は）Ｖを伴う必要があり、また(b)Ｖは常に
   Ｘ及び（又は）Ｙを伴うものとする。］ ２ アミノ酸が少なくとも一つの遊離カルボン酸
   官能基を含むものから選択される特許請求の範囲
   第１項に記載の抗凝血性材料。 ３ アミノ酸が置換基を有しもしくは有しないグ
   ルタミン酸、アスパラギン酸、メチオニン、シス
   テイン、システイン酸、プロリン、オキシプロリ
   ン、トレオニン、セリン、チロシン、アラニン、
   フエニルアラニン、バリン、ロイシン、ベンジル
   オキシカルボニル−リシン、ターシアリーブチル
   オキシカルボニル−リシン、ε−アミノカプロン
   酸、β−アラニン、γ−アミノ−ｎ−酪酸及びδ
   −アミノ−ｎ−吉草酸から選択される特許請求の
   範囲第１項に記載の抗凝血性材料。 ４ アミノ酸が二塩基性アミノ酸である特許請求
   の範囲第３項に記載の抗凝血性材料。 ５ アミノ酸が複数個のアミノ官能基を有する場
   合、その１個以外の全ての基は生理的に許容され
   る電子求引基により保護されている特許請求の範
   囲第１項に記載の抗凝血性材料。 ６ 電子求引基が、ベンジルオキシカルボニル基
   又はターシヤリーブチルオキシカルボニル基であ
   る特許請求の範囲第５項に記載の抗凝血性材料。 ７ 固定されたＸ及び（又は）Ｙ及び（又は）Ｖ
   基を有するポリマーが架橋ポリマーである特許請
   求の範囲第１項に記載の抗凝血性材料。 ８ 管、人工心臓血管、カテーテル、糸及びフイ
   ルムの形態にある特許請求の範囲第７項に記載の
   抗凝血性材料。 ９ 高分子鎖に固定されたＸ及び（又は）Ｙ及び
   （又は）Ｖ基を有するポリマーが非架橋の可溶性
   ポリマーである特許請求の範囲第１項に記載の抗
   凝血性材料。 １０ ポリマーがデキストランである特許請求の
   範囲第１項に記載の抗凝血性材料。 １１ 鎖状部分に置換可能な基を有し、該基上に
   Ｘ及び（又は）Ｙ基［ここで、Ｘは、−SO₃R₁基
   を示し、R₁は水素原子又は生理学的に相溶する
   金属を示す。Ｙは、−SO₂R₂基を示し、R₂は−
   SO₂−鎖にそのアミン官能基により結合したアミ
   ノ酸残基を示す。］が統計的に固定されており、
   且つＶ基［ここで、Ｖは−CH₂−CO−NH−
   CHR−COOH基を示し、Ｒはアミノ酸側鎖を示
   す。］を有しておらず且つポリスチレン及び多糖
   類から選ばれたポリマーから構成されている抗凝
   血性材料の製造方法であつて、溶媒中でポリスチ
   レン及び多糖類から選ばれたポリマー上にクロロ
   スルホン酸を反応させてクロロスルホン化ポリマ
   ー（POL−SO₂Cl）を製造する第一工程、及び塩
   基性媒体中でアミノ酸を反応させて上記−SO₂Cl
   基を−SO₂Na基及び−SO₂AA基（AAはアミノ
   酸を示す）に変換する第二工程を包含することを
   特徴とする製造方法。 １２ 非架橋の前記ポリマーのスルホン化を塩素
   化溶媒からなる有機溶媒中で行い、ポリマーをニ
   トロメタン中に沈澱析出させ、且つアミノ酸との
   反応を水−ジキオサン混合物を含有する媒体中で
   行う特許請求の範囲第１１項に記載の製造方法。 １３ スルホン化の媒体がジクロロメタンである
   特許請求の範囲第１２項に記載の製造方法。 １４ 架橋された前記ポリマーのスルホン化をジ
   クロロメタン及びニトロメタンを含有する混合物
   中で行い且つアミノ酸との反応を水−ジオキサン
   混合物を含有する媒体中で行う特許請求の範囲第
   １１項に記載の製造方法。 １５ アミノ酸の固定の後、充分に水洗し、
   1.5MNaCl水溶液で洗浄し、次いで1M−クエン
   酸ナトリウム溶液により洗浄し、ミハエリス緩衝
   液による数度の洗浄によりPHを約7.30に調節し、
   更に水洗し最終的に乾燥する特許請求の範囲第１
   ４項に記載の製造方法。 １６ アミノ酸の固定後、水に対する透析により
   不純物を除去し、必要に応じ凍結乾燥により最終
   純生成物を回収する特許請求の範囲第１２項に記
   載の製造方法。 １７ 鎖状部分に置換可能な基を有し、該基上に
   Ｘ及び（又は）基Ｖ基［ここで、Ｘは、−R₃−
   SO₃R₁基を示し、R₁は水素原子又は生理学的に
   相溶する金属を、R₃は−CH₂CONH−R₄（R₄は
   置換基を有しもしくは有しないアルキル、アリー
   ル又はアルキルアリール基）又は置換もしくは非
   置換の基【式】を示す。Ｖは、− CH₂−CO−NH−CHR−COOH基を示し、Ｒは
   アミノ酸側鎖を示す。］が統計的に固定されてお
   り且つＹ基［ここで、Ｙは基−SO₂−R₂又は基−
   R₃−SO₂−R₂を示し、R₂は−SO₂−鎖にそのアミ
   ン官能基により結合したアミノ酸残基を示し、
   R₃は上記に同じ意味を有する。］を有しておらず
   且つポリスチレン及び多糖類から選ばれたポリマ
   ーから構成されている抗凝血性材料の製造方法で
   あつて、ポリスチレン及び多糖類から選ばれたポ
   リマーのカルボキシメチル化誘導体を製造する第
   一工程、アミンもしくは塩化ベンジルを該誘導体
   に固定する第二工程、アミノ酸を固定する第三工
   程及びスルホン化を行なう第四工程を包含するこ
   とを特徴とする製造方法。 １８ ポリマーのカルボキシメチル化誘導体への
   アミン及び（又は）アミノ酸の固定を、Ｎ−エト
   キシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒド
   ロキノリン（EEDQ）を用いて行なう特許請求の
   範囲第１７項に記載の製造方法。 １９ スルホン化の工程を、数回繰返してスルホ
   ネート基の量を増大する特許請求の範囲第１７項
   に記載の製造方法。 ２０ ポリマーが可溶性の非架橋ポリマーであ
   り、最終生成物が加圧下での限外過により精製
   される特許請求の範囲第１７項に記載の製造方
   法。 ２１ 不溶性の架橋された前記ポリマーを過剰量
   のクロロスルホン酸で処理して可溶性抗凝血性材
   料とする特許請求の範囲第１７項に記載の製造方
   法。 ２２ 鎖状部分に置換可能な基を有し、該基上に
   Ｘ及び（又は）Ｙ及び（又は）Ｖ基［ここで、Ｘ
   は、基−R₃−SO₃R₁を示し、R₁は水素原子又は
   生理学的に相溶する金属を、またR₃は−CH₂−
   CO−NH−R₄（R₄は置換基を有しもしくは有しな
   いアルキル、アリール又はアルキルアリール基）
   又は置換もしくは非置換の基【式】 を示す。Ｖは、基−CH₂−CO−NH−CHR−
   COOHを示し、Ｒはアミノ酸側鎖を示す。Ｙは、
   基−R₃−SO₂−R₂を示し、R₂は−SO₂−鎖にその
   アミン官能基により結合したアミノ酸残基を示
   し、R₃は上記に同じ意味を有する。］が統計的に
   固定されており且つポリスチレン及び多糖類から
   選ばれたポリマーから構成されている抗凝血性材
   料の製造方法であつて、カルボキシメチル化を行
   なう第一工程、アミン又は塩化ベンジルを固定す
   る第二工程、クロロスルホン化を行なう第三工程
   及びアミノ酸を固定する第四工程を包含すること
   を特徴とする製造方法。