JPH01308236A - 腎臓障害の判定のための方法なびに組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明の主題は腎臓の障害を判定するための方法に関し
、その方法においては、ポリクローン性もしくはモノク
ローン性抗体が腎臓中に存在するタンパクと接触せしめ
られ、かつ、受容される反応生成物がその後において免
疫学的固定に付せられるものであり、さらにまた、この
方法を実施するだめの組成物に関するものである。

［従来の技術］ 通常、腎障害は、たとえば健全な腎臓の場合においてツ
ェナセチンなどの腎障害性薬物の継続的摂取が行なわれ
たとき、あるいは移植腎の場合において免疫抑制薬剤の
投与が行なわれなかったときに発生する実質の損傷によ
りはじめて認識されるに至るものである。この限りにお
いて、腎実質の損傷の早期検出は医学）−の重要課題で
ある。

現時点においては、腎実質の損傷の判定のために、主と
して３種の検査方法か適用されている。

ａ　　生検により、腎から組織検体を採取する古典的方
法。しかし、この侵害的方法には合イ〕↑症かイ」随し
、したかって、この方法は例外的な症例にのみ適用され
る。

ｈ　　尿中の組織酵素の活性を判定する。しかし、この
臨床的試験は、腎中の障害位置に関して信頼性のある決
定を与え得るものとはされておらず、また、尿中酵素の
活性は多数の外部要因によって影響を受けるので、その
証明力はきわめて限られたものである。この試験は、定
性的見地からみても、あまりにも非特定的である。

Ｃさらに、腎障害の検出のために免疫学的方法か試みら
れた。これを実施するため、尿とともに多量に排出され
る腎タンパク中の未知のもの、もしくＧ」特性把握か不
充分なものに対してモノクローナル抗体か適用された。

クンバクに対して向りられた抗体が単頭１されていない
こと、ならびにその結果として測定値の定量的検定には
用いられないので、この方法は、腎障害の判定のために
は、せいぜい、相い定性的方法としてしか考えられてい
ない。この点において、本方法は、腎障害の重篤度の評
定に必要とされる定量的記述を与え得るものとはまった
くなされていない。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、したかって、腎障害を、軽微であるか進行中
であるかを問わす、定量的に判定し得る方法で、上記種
類の方法を改良することを目標とするものである。

本発明は、さらに、上記方法の実施のための組成物の利
用をも目標とする。

［課題を解決するだめの手段］ フィンブリンタンパクもしくはビリンタンパクに対して
特異的な抗体を使用することにより、問題は解決される
。

本発明において、」二部尿細管」−皮のタンパク分１　
】　　　。

子種として確定された２種のもの、すなわちとワンタン
パクおよびフィンブリンタンパクが、実用上、腎障害に
対する定量的測度として採用され得るものであることが
、驚くべき充分さを以って見出された。すなわちこれら
の尿タンパクは、定量的な判定がなされ得る。上部細管
に影響するものであるが、もしくはそれを包含する腎障
害の場合には、両種タンパクの排出量は増大する。した
かって、本発明によれば、非侵害的診断法が利用可能と
なり、それによりたとえば、循環障害、切迫急性腎不全
あるいは移植器官の切迫拒絶反応によってひき起された
腎障害の定量的判定か早期に可能となる。

本発明による方法に基づき、下記の臨床上の疑問点に関
する記述を行なうことが可能である。すなわち、 ａ、１部細管中における腎障害の位置決定ｂ　細胞傷害
の重篤度の判断 Ｃ腎障害の治療指標への応答性 ｄ　腎疾患を持つ被験患者および腎移植患者における腎
障害性副作用のある薬剤による危険度の評定 ビリンタンパクならびにフィンブリンタンパクは、その
排出とともに、尿中において簡単に同定され得る。通常
、患者か排出した尿の約０１ｍβか必要とされるにすぎ
ない。排出された尿は型中（ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ）で分析
されるのであるから、この限りにおいて、同定によって
患者か障害を受け、あるいは毒作用を受けることはない
。

ビリンタンパクおよびフィンブリンタンパクは、純粋な
形態において定量される。このことによって測定値の精
確な判定か可能となるのであり、すなわちフィンブリン
タンパクおよびビリンタンパクは、尿中において精確か
つ定量的に同定されることかでき、したがって、尿細管
障害の重篤度に関する指標が与えられる。本発明の方法
の一利点は、尿中のビリンタンパクおよび／またはフィ
ンブリンタンパクの含有量を定量的に同定するために適
用される試薬の検定である。

尿中のビリンタンパクおよびフィンブリンタンバクの定
量的同定のための典型的かつ単純な方法は、下記の特質
を包含している。ビリンタンパクおよびフィンブリンタ
ンパクはニワトリまたはブタの腸管上皮から、いずれか
の既知方法によって単離される。この方法は、Ａ、　Ｂ
ｒｅｔｓｃｈｅｒおよびに、　Ｗｅｂｅｒにより、Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７６巻（
１９７９）、２３２１−２３２５ページならびにＪ、Ｃ
ｅ１１．Ｂｉｏｌ、　８６巻（１９８０）。

３３５−３４０ページにまたはり、　Ｄｒｅｎｃｋｈａ
ｈｎらによりＣｅ１１．Ｔｉ５ｓ、Ｒｅｓ、　２２８巻
（１９８３）に記述されている。それらの中に略述され
ている各単離方法ば、引用により詳細に具現されている
。

人体の腸管から外科的に摘出された腸管上皮からこれら
のタンパクを単離することが、同一の方法によって可能
となる。

抗フィンブリンおよび／または抗ビリン抗体は、上記引
用の参照文献に従うが、もしくはまた、一般的に知られ
た方法によって調製され得る。それらの方法は、たとえ
ば、Ｈ，Ｊ、　ＭｅｙｅｒおよびＪ、　）１．　Ｗａｌ
ｋｅｒにより、「生物科学における免疫化学的方法　酵
素およびタンパク」なる標題を付してロンドンのＡｃａ
ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓにより１９８０年に刊行された
モノグラフ（専門報告書）中に記述されている。たとえ
ば、５０−１００μｇ量の単離されたタンパクが、Ｆｒ
ｅｕｄによる佐薬の完全型のものもしくは不完全型のも
のを添加されまたは添加されることなく、ウサギまたは
モルモットの背部皮膚または腹腔内に注射される。各３
週つつの間隔をおいて、再度、同量のタンパクが注射さ
れる。第３回またはそれ以後の注射のあと、通常の標準
法によって化学的に精製され、その特性について試験ず
みのモノクローナル抗体の良好な力価が求められる。そ
のような方法は、１９８３年にＤｒｅｎｃｋｈａｈｎら
により、１９７９年、１９８０年にＢｒｅｔｓｃｈｅｒ
およびＷｅｂｅｒによって出された上記刊行物、あるい
はＴａ１ｉａｎらによるＪ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、
　９７巻（１９８３）、１２７７−１２８２ページに記
載されたものであって、それらはいずれも参照文献への
言及がなされている。

ポリクローナル抗体のみならず、一般的に知られた方法
（ヘルリンのＳｐｒｉｎｇｅｒにより１９８５年に出版
されたＪ、Ｍ、　Ｐｅｔｅｒｓらの刊行物「モノクロー
ナル抗体・調製と特性つけ」を参照されたい。）によっ
てもマウスおよびウサギに生成させることができるモノ
クローナル抗体もまた同様に適用できる。

そのような抗ビリンモノクローナル抗体は、ヨーロッパ
特許出願中に記載されており、すてに、ハンブルグのＭ
ｅｓｓｒｓ、　Ｄｉａｎｏｖａにより市販されていて、
同じくビリンな放出する腸管腫瘍の組織学的治療に用い
られている。

本発明においては、ビリンタンパクおよび／またはフィ
ンブリンタンパクに対するポリクローナル抗体またはモ
ノクローナル抗体は、反応担体の表面に結合されている
。この文節中での「結合」とは、基体表面への抗体の物
理的吸着、あるいはこれら抗体の基体への化学的共有結
合のいずれかを意味している。

濾過材料、ミクロ力価プレートなどの反応器材料、セフ
ァロース（商品名）などのカラムクロマトグラフイ材料
あるいはそれらの類似物は、いずれも反応用担体として
作用する。抗体は、水溶液中、好ましくは水性緩衛溶液
中において、吸着平衡に到達するまで基体材料と接触せ
しめられる。

この平衡到達は温度に依存し、約２１℃においては３時
間内外、４℃においては１２時間内外を要する。

基体材料としては、合成材料、とくにポリスチレンが好
ましく、このものはミクロ力価プレートの製造のために
通常用いられている。

結合反応を完結させ、かつ、タンパクの空欠結合部位を
飽和させる目的をもって、吸着された抗体は、タンパク
溶液、たとえばアルブミン溶液、ゼラチン溶液または脱
脂乳で処理され、その際、もし必要ならば塩水および／
または界面活性剤が添加される。

その後、こうして処理された抗体塗剤は数回洗浄され、
かくして検体圧での処置の実行が可能となる。

尿とのインキュベーション（恒温保持）は、抗体とビリ
ンタンパクＪ３よび／またはフィンｌ）ンタンパクとの
間の反応平衡に到達するまで行なわれる。このインキュ
ベーション過程は、およそ３０−９０分間を要するよう
にすることか好ましい。その後で尿を除去し、ミクロ力
価ブレーｊ・か用いられている場合ならば、前記洗浄用
溶液を再びくぼみに満たし、その液を適宜の間隔て数回
取り換える。

第２段階として、その後、こうして到達した抗体タンパ
ク結合複合体は免疫学的定量化反応に付せられる。

工程の第２段階にともなう定量化反応を実施するため、
抗体タンパク結合複合体か付着する基体は、抗ビリンも
しくは抗フィンブリン抗体で再び処理される。

工程の第１段階においてポリクローナル抗体か用いられ
た場合には、第２段階において、ビ１ノンまたはフィン
フリンに対する同一のポリクローナル抗体またはモノク
ローナル抗体のいずれかか適用される。

しかしなから、第２の態様として、もしも工程の第１段
階においてモノクローナル抗体が用いられるならば、第
２段階においては、第１の抗体とは異なるポリクローナ
ル抗体または第２のモノクローナル抗体のい１゛れかが
、タンパク分子の他の結合部位を指向せしめられた抗体
として用いられ得る。

本明細書中以下の部分において、工程のこの第２段階で
用いられる抗体は、「第２抗体」と称さ、ｉ′する。

本発明においては、ミクロ力価プレー］・のくぼみにこ
の第２抗体の溶液を満たし、およそ３０−９０分間イン
キュへ−トすることも行なわれる。

その後第２抗体溶液を除去し、さらにくぼみを洗浄用溶
液て洗浄する。基体どともに、第］抗体、結合されたビ
リンタンパク、フィンブリンタンパクおよび第２抗体の
複合体か残存する。これば以下本明細書中で「定量化複
合体」と称される。

この定量化複合体は、多様な方法で定量化反応にイー」
されることかてきる。

第１の態様においては、第２抗体は、酵素たとえばペル
オキシダーゼ、アルカリホスファターセ、グルコースオ
キシダーゼまたはヘータガラクトシダーゼとの共有結合
に至らしめられる。定量化複合体中に結合せしめられた
酵素標識つき第２抗体の容積は、ついて、酵素発色反応
により、定量的に測定できる。このような定量化反応は
まったくよく知られたものであり、適用可能な酵素なら
びに典型的な酵素発色反応については、Ｌ、ＡＳ　１：
　ｅ　ｒ　ｎ　ｂ　ｅ　ｒ　ｇ　ｅ　ｒによって、ニュ
ーヨークのＪｏｈｎ　Ｗｉ−１ｅｙ　＆　５ｏｎｓから
１９８６年に刊行された［免疫細胞化学ｊ　　（Ｔｍｍ
ｕｎｏｃｙｔｏ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第３版中に、あ
るいはＷ、　Ｄ、　Ｋｕｈｌｍａｒｎにより、］９８４
年にＷｅｉ−ｎｈｅｉｍのＶｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ
から刊行された単行本［細胞化学におりる免疫酵素技術
Ｊ　　（Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ　ｉｎ　ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）の中に記述
されていて、いずれも引用を伴っている。

第２の態様においては、第２抗体は、一般に知られた方
法に従い、たとえばヨウ素］２５を用いて、放射能碇識
されることとしてもよい。これらの目的のためには、放
射能標識用キットおよび材料か用いられ、また、たどえ
ばＤｒｅｉｅｉｃｈ　（ドイツ国）のＮＥＮによって供
給されている。

したがって、結合された第２抗体の量は粒子線カウンタ
ーまたは放射線カウンターを使用することにより、直接
的かつ定量的に測定することができる。

定量化反応の第３の態様においては、複合体は、結合さ
れた第２抗体に対して特異的な第３抗体で処理される。

これらの目的のために、たとえば、マウス免疫グロブリ
ンまたはウサギ免疫グロブリンに対する抗体を用いるこ
とができる。それらの抗体は、酵素またはラジオアイソ
ト−プて標識づけされた形で市販され、たとえば、Ｈａ
ｍｂｕｒｇのＭｅｓｓｅｓ　Ｄｉａｎｏｖａ、ヘルギー
のＭｅｓｓｒｓ、　ＪａｎｓｓｅｎまたばＤｒｅｉｅｉ
ｃｈ　（ドイツ国）のＮＥＮによって頒布されているも
のを利用することかできる。次の段階は、すてに上述し
た定量化工程である。この段階においては、発色反応ま
たは放射線の定量的測定か行なわれる。

非標識型のこれら第３抗体もまた、第４のインキュヘー
ション段階に少しでも導入される酵素−抗酵素免疫複合
体を形成している橋架ｉ−１性抗体としての作用を演し
る。これらの間接的免疫グロブリン同定は、文献からも
同様に知られており、たとえばＳｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ
による前記引用つきモノグラフ中にも見出すことかでき
る。ともかく、酵素−抗酵素免疫複合体もまた市販品を
利用することかでき、たとえば、ＨａｍｂｕｒｇのＭｅ
ｓｓｒｓ、　ＤｉａｎｏｖａまたはヘルギーのＭｅｓｓ
ｒｓ、　Ｊａｎｓｓｅｎによって頒布されている。

以下に詳述され、好まれている第４の定量化反応におい
ては、尿中のビリンおよびフィンブリンの定量化は、第
２の抗体のビオチンとの共有結合によって行なわれる。

ビオチン結合は、たとえばＮ、　ＩＣ）ｌｅｇｇｅｎｅ
ｓｓらによりＣｅ１１．Ｂｉｏｌ、　７３巻（１９７７
）７８３−７８８ページに引用つきで記述された既知の
過程と一致するように第２抗体との間でなされる。この
目的に対しては、たとえば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−）
１ｏｅｃｈｓｔによって頒布されている、ビオチンーＮ
−ヒドロキシサクシンイミドエステルが用いられる。

ビオチン標識を有し、かつ定量化複合体と結合せしめら
れた第２抗体は、ビオチン結合ストレフトアビジンタン
パクにより定量化される。ストレフトアビジンは、ペル
オキシダーゼ酵素または上述のそれ以外の酵素によって
第２抗体と共有結合的に結合せしめられる。このストレ
フトアビジン酵素溶液は市販品を用いることができ、た
とえばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｈｏｅｃｈｓｔによって
頒布されている。

その後において、また、酵素がペルオキシダーゼである
場合には、ストレフトアビジン酵素−抗体複合物は１，
２−フェニレンジアミンおよびＨ２Ｏ２溶液で希釈され
、ペルオキシダーゼと過酸化水素の反応に、よって、無
色のフェニレンジアミンが黄色染料に変換される。４９
２ｎｍにおけるその吸光を波長６２．０ｎｍと対照する
ことにより、その染料はＵ■光度計を用いて定量するこ
とかできる。この吸光は以下に示されるように、結合さ
れたビリンおよび／またはフィンブリンの分子の量と関
連している。

第５の態様においては、尿中のビリンおよびフィンブリ
ンはまた、置換試行によって同定することができる。こ
の試験においては、反応担体は精製されたビリンおよび
／またはフィンブリンによって被覆される。その後で検
査される検体尿と、ビリンまたはフィンブリンに対して
特異的な抗体か添加される。尿中のビリンまたはフィン
ブリンの量が多いほと、すてに反応担体に吸着している
ビリンまたはフィンブリンの分子と結合している抗体の
量か減少する。その後、酵素またはラジオアイソトープ
で抗体を直接に標識づけするが、または本明細書中に記
載される他の過程を適用することにより、結合された抗
体の量を定量化することかできる。

定量化複合体のために用いられる定量化反応が、まった
くよく知られたものであるということを、さらにもう−
度述へておくべきである。このことに関して、結合され
たビリンまたはフィンブリンの分子を定量的に含有する
ことか可能ならば、その限りにおいて、定量化反応をさ
らに改変することを想定できる。

本発明においては、上記の方法を実施するための組成物
も同様に提供される。

第１態様Ａにおいては組成物中には、抗フィンブリンお
よび／または抗ビリンモノクローナル抗体またはポリク
ローナル抗体が包含される。

好ましくは、反応担体にあらかじめ結合せしめられた抗
体が市場に紹介されており、そのことによって抗体をミ
クロ力価プレート中に適用することが好ましいとされて
いる。したがって、市販品のユニットは多数のくぼみを
持つミクロ力価プレートで構成されており、それぞれの
くぼみは、抗ビリンおよび／または抗フィンブリン抗体
の一定量がみたされている。

この基体ユニットに加えて、本発明による組成物は、都
合のよいことには定量化複合体の発生のための前記第２
抗体を包含している。この第２抗体と都合よく、かつ共
有結合的に結合せしめられているのはビオチン基である
。

ビオチン標識を有するこれらの抗体は、完成された緩１
Φ１溶液の形で、あるいは親液化形態の緩衝物質と共に
頒布されて市場に紹介され得るものであり、親液化生成
物を包含する容器を一定量の水で満たずことだけが必要
とされている。

このような市販ユニッ１〜は、さらに−実験室内での利
用かできない程度に一定量化試薬であるストレプ１〜ア
ビジン　ペルオキシダーセと並んで前記洗浄液の濃縮物
を、また、Ｈ２Ｏ２、定量化複合体の定量化に用いられ
るフェニレンジアミンを含んでいる。

さらに、測定値を検定するため、またそれぞれの基体ユ
ニッ［・について、単離され、精製されたフィンブリン
タンパクおよび／またはビリンタンパクか供給されるこ
と、かつそれか約４μｇの好都合な量であることは有利
である。それらは親液化された形で容器に入れて頒布さ
れ、その用型は、使用者によって一定量の水または検査
されるべき尿で満たされる。

上記の置換分析に基つくものである第２態様Ｂにおいて
は、本医薬は、十記態様Ａに関して記述された抗フィン
ブリンおよび／または抗ビリン抗体のほが、単離された
ビリンタンパクまたはフィンブリンタンパクからなって
いる。

タンパクは、反応担体と結合された形で販売されている
。それぞれの市販ユニットは、各くぼみに単離されたビ
リンタンパクおよび／またはフィンブリンタンパクの一
定量（たとえば０．５−１μｇ）か注入されているミク
ロ力価プレート１個で構成されていることもある。

この基体ユニットに加えて、第２の組成物には、前述の
抗とリンまたは抗フィンブリンモノクローナル抗体ある
いはポリクローナル抗体が含まれており、それらには、
ビオチン基か都合よく、かつ共有結合的に結合せしめら
れている。ビオチンで標識−５６づされたこれらの抗体
は、完成された緩衝溶液または第１の態様に記載された
親液化形態のいずれかとして頒布されている。

さらに、この態様における検定を目的とするユニットの
それぞれが、態様Ａにも記載されているビリンタンパク
および／またはフィンブリンタンパクの単離物をも包含
しているということは有利である。

この同定キットには、その上、また態様Ａに記載されて
いるように、定量化試薬と共に前述の洗浄液か包含され
ていてもよい。

］２記の例は本発明を説明するものである。

抗フィンブリンおよび／または抗ビリンポリクローナル
抗体は、］９７９年と１９８０年にＢｒｅ−ｔｓｃｈｅ
ｒおよびＷｅｂｅｒにより、また、１９８３年にＤｒｅ
ｎｃｋｈａｈｎらによって記述された工程に従って製造
される。モノクローナル抗体は、１９８５年にＰｅｔｅ
ｒらによって記述された工程に従って製造されるが、あ
るいはハンブルグのＭｅｓｓｒｓ、　Ｄｉａｎｏｖａに
よる抗ビリンモノクローナル抗体か使用される。

これらの抗体は、１９８５年にＰｅｔｅｒらによって記
述された工程に従い、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ　　（ｔ’イ
ツ国）のＭｅｓｓｒｓ、　Ｎｕｎｃから人手てきるポリ
スチレン製ミクロ力価プレートに結合せしめられている
。

単離された抗体は、免疫グロブリンを濃度５μｇ／ｍｇ
で含有するｐ　ｒ−ｒ値１０．６の０２モル炭酸塩緩衝
液中に溶解されている。未精製の抗血清は、便利なよう
に、炭酸塩緩衝液中で１］００の比率で希釈されている
。以下本明細書中では、用語「抗体」は単離された免疫
グロブリンおよび抗血清のための用語として使用される
。

抗体をミクロ力価プレートのくほみと充分に結合させる
ため、希釈抗体溶液の各］○Ｏμ４をミクロ力価プレー
トのくぼみの中で、２１°Ｃにおいて約３時間、または
４℃において］２時間それぞれ保持される。その後抗体
溶液をくぼのから除去し、つぎに空欠の結合部位を飽和
させるため、１重量％のゼラチンを含む前記炭酸塩緩衝
液中４００μ℃がくぼみに満たされる。

１時間のインキュベーションを経過したのち、ゼラチン
溶液を除去し、約４００μ℃の洗浄用緩衝液かくぼみに
満たされる。

上記洗浄用緩衝液は、リン酸塩で緩衝された塩水（リン
酸塩緩衝剤２５ミリモル、Ｎａｃ１１００ミリモルを含
むｐＨ値７４のもの）からなり、以下本明細書中ではＰ
ＰＫと表示される。

この緩衝液に、ｌｌ−１ｅｉｄｅｌｂｅｒ　（Ｆイツ国
）のＭｅｓｓｒｓＳｅｒｖａから入手てきる界面活性剤
Ｔｗｅｅｎ２０　　を０．０５重量％添加する。

この洗浄用緩衝液は、各５分の間隔て３回取り換えられ
る。

こうして調製されたミクロ力価プレートは、ただちに検
査されるべき検体圧との反応に掛けられるが、あるいは
乾燥後、使用にそなえて包製される。

こうして調製されたミクロ力価プレートのくぼみに、未
希釈の被検尿１００μ℃を満たし、この尿をくぼみの中
で約１８５時間保持する。その後で尿を除去し、くぼみ
には前記洗浄用緩衝液４００μ℃を満たして再びインキ
ュベーションを行ない、この洗浄用緩衝液は各５分の間
隔て３回取り換える。

洗浄用緩衝液を除去したのち、プレートの被覆用として
記述された抗ビリンおよび／または抗フィンブリンポリ
クローナル抗体１００μ℃をくほみに入れて再びインキ
ュベーションを行なう。

これらの第２抗体は、まずはじめに、１９７７年にｌ（
ｅｇｇｅｎｅｓｓによって記述された方法（上記参照）
に従い、ビオチンと共有結合的に結合せしめられる。ビ
オチンで標識づけされた抗体は濃度１０μ（２／　ｍ℃
の免疫グロブリンを含む、Ｎａｃ１１５０ミリモル、　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　２０ミリモル、尿素０．５ミルモル
およびゼラチン１％を含むｐＨ値７．４の緩衝液中に溶
解される。

抗体溶液は、つぎに再びくぼみの中で約９０分間保持さ
れる。くぼみから第２抗体溶液を除去したのち、それぞ
れのくぼみには０．０５重量％のＴｗｅｅｎ　２０とと
もにＰＰＫ４００μｎが満たされるが、これは各５分の
間隔で３回取り換えられる。

その後で、つぎのようにして定量化反応が行なわれる。

洗浄用緩衝液を除去したのち、くぼみには前記のリン酸
塩緩衝塩水（ＰＰＫ、ｐＨ７，，４）１００μ℃が満た
される。この溶液には、ペルオキシダーセ酵素か共有結
合的に結合した、ビオチン結合用ストレフトアビジンタ
ンパクか含まれている。

ペルオキシダーゼーストレプトアビシンは、Ｃａｌｂｉ
ｏｃｈｅｍ−ｌ（ｏｅｃｈｓｔから一次溶液として購入
され、ｐＨ７，４のＰＰＫ中で１・５，０００に希釈さ
れた形で使用される。このストレフトアビジン溶液は２
１°Ｃで約１時間くぼみの中に保持されたのち除去され
る。

つぎに前記洗浄用緩衝液（ＰＰＫ、ｐＨ７，４、Ｔｗｅ
ｅｎ　２０　０．０５重量％含有）　４ｏｏμｇかくぼ
みに満たされる。この緩衝溶液は、各５分の間隔て３回
取り換えられる。

その後で、リン酸塩−クエン酸塩緩衝液（リン酸水素２
ナトリウム０２モル、クエン酸１水和物Ｏ］モル含有、
ｐＨ５）１００μ℃かそれぞれのくぼみに満たされる。

この緩衝液には、１ｍ℃につき、１，２−フェニレンシ
アミン（Ｍｅｓ７ｓｒｓ、　Ｍｅｒｃｋから人手される
）１．５ｍｇおよび３０％Ｈ２０□溶液（Ｍｅｓｓｒｓ
、　Ｍｅｒｃｋにより、ｒ　Ｐｅｒｈｙｄｒｏｌ　Ｊの
名称で頒布される）１μ℃が含有されている。

フェニレンジアミンとＨ２Ｏ２とは、使用の直前に、リ
ン酸塩−クエン酸塩緩衝液に対して添加される。その後
、〈はみにはこの溶液を入れて３０分間インキュベーシ
ョンが行なわれる。　くぼみ１個につき０．５Ｎ硫酸５
０μ℃を添加することによって反応は完了する。

ビオチン標識つきの結合抗体およびペルオキシダーゼで
標識されたビオチン基結合ストレフトアビジン分子の量
に比例して、無色のフェニレンジアミンの酸化によって
黄色の染料が生成する。波長６２０ｎｍと対照したこの
染料の４９２ｎｍでの吸光は、ＵＶ光度計を用いて測定
される。

［実施例］ 第１図のグラフは、１軸上の吸光度と他軸上のタンパク
濃度との相関に関して、ビリンおよびフィンブリンの標
準検定曲線２本を示すものである。

この検定曲線は、規定量のビリン（ａ）またはフィンブ
リン（ｂ）か標準的健康人の尿に添加され、前述の免疫
学的過程を適用して定量化されたことか示されるように
設定されたものである。ミクロ力価のくぼみのタンパク
保有■は、それぞれ、 ＃１　　］　０μｇ／ｍｊ２．＃２：５μｇ　／　ｍ　
Ａ　。

＃３　２５　μｇ／ｍｆ１．＃４　　：　１．２５μｇ
　／　ｍ　１２　。

＃　５　：　０．６２５μｇ　／　ｍ　Ｅおよび＃　６
　：　０．３１２μｇ　／　ｍ　Ａである。

これらの標準曲線は、ビリンおよびフィンブリンのいず
れも、前述のＵＶ光度測定法により、尿中において定量
的に同定され得ることを明らかにしている。

第２図は、基準線での吸光度をＯ○５として患者の尿中
のビリン濃度を示すものである。患者の尿中におけるビ
リンの絶対濃度は、第１図により、検定曲線から求める
ことかできる。

第２図中の矢印は、クレアチニン価の増大と臨床」−の
症状および徴候とによって臨床的に証明される拒絶発症
を指示するものである。これらの拒絶発症中の処置は、
免疫抑制剤の投与量の増加であるが、これば尿中へのビ
リン排出の減少、すなわち腎障害の危険度の減少をもた
らすものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、タンパク濃度と吸光度の標準検量線グラフで
ある。第２図は、基準線での吸光度を０．０５としての
患者の尿中のビリン濃度を示すグラフである。 特許出願人　ブトレフ　ドレンクハーン手糸売ネ甫了■
五書（方式） １　事件の表示 平成　１年特許願第４２９０１号 ２　発明の名称 腎臓障害の判定のための方法ならびに組成物３　補正を
する者 事件との関係　　特許出願人 氏　名　　　ブトレフ　ｌ・レンクハーン４　代理人 住所　〒１０３東京都中央区日本橋本町４丁目４番１１
号５　補正命令の日付 「発送日」　　平成　１年５月３０日 ６　補正の対象 図面

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体が
   腎中に存在するタンパクと接触せしめられ、受容される
   反応生成物がその後において免疫学的反応に付せられる
   ものであって、用いられる該抗体がフィブリンタンパク
   もしくはビリンタンパクに関して特異的なものであるこ
   とを特徴とする、腎障害の判定方法。 ２、抗フィンブリン抗体もしくは抗ビリン抗体が、態様
   Ａに従い、基体の表面に結合せしめられ、その後におい
   て、結合せしめられた該抗体が、定量化可能なタンパク
   抗体複合体の生成にともない、分析されるべき検体尿と
   接触せしめられること、もしくは、態様Ｂ（置換分析）
   に従い、該検体尿と混合され、これにより得られる溶液
   が、つぎに該基体表面と結合されたビリンもしくはフィ
   ンブリンと接触せしめられ、他方、該抗体が、該尿中に
   含有されるビリンおよびフィンブリンの量に反比例して
   該基体の表面に結合し、その後、得られる反応生成物が
   免疫学的反応に付せられることを特徴とする請求項１に
   よる方法。３、該基体として、濾過材料、反応器材料、
   カラム吸着クロマトグラフィ材料もしくは合成材料が用
   いられることを特徴とする、請求項２による方法。 ４、該基体として、ポリスチレン製ミクロ力価プレート
   が用いられることを特徴とする、請求項３による方法。 ５、態様Ａに従い、該抗体を含有する溶液が該基体表面
   と接触せしめられ、吸着平衡に到達したのちに該溶液が
   除去され、被覆された該基体が洗浄用溶液をもって洗浄
   され、その後該基体が検体尿とともにインキュベーショ
   ンに付せられ、該検体尿の除去後に該基体表面が再度洗
   浄され、かつ、最終的に、該抗体と結合せしめられた該
   ビリンタンパクもしくはフィブリンタンパクが免疫学的
   定量化反応に付せられることを特徴とする、請求項２に
   よる方法。 ６、該基体に吸着する該抗体が、空欠結合部位を飽和せ
   しめる目的をもって、タンパク溶液もしくはゼラチン溶
   液によって処理されることを特徴とする、請求項５によ
   る方法。 ７、界面活性剤が該タンパク溶液もしくはゼラチン溶液
   に添加されることを特徴とする、請求項６による方法。 ８、該免疫学的定量化反応が、第２抗体をもって行なわ
   れることを特徴とする、請求項５による方法。 ９、第１のポリクローナル抗体の使用とともに、抗ビリ
   ンもしくは抗フィンブリンの、同一ポリクローナル抗体
   もしくはモノクローナル抗体の使用が行なわれることを
   特徴とする、請求項８による方法。 １０、第１のモノクローナル抗体の適用に際して、ポリ
   クローナル抗体もしくは第１の抗体とは異なる第２の抗
   体が、ビリンもしくはフィンブリンに抗して使用される
   ことを特徴とする、請求項８による方法。 １１、適用される該第２抗体が、ペルオキシダーゼ、グ
   ルコース−オキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、
   ベータガラクトシダーゼもしくは他の酵素と結合せしめ
   られることを特徴とする、請求項８による方法。 １２、免疫学的定量化が、結合された該第２抗体を該第
   １抗体に結合せしめられたタンパクと接触せしめること
   、結合平衡に到達したのちに該溶液を除去すること、被
   覆された基体を洗浄用溶液をもって洗浄すること、およ
   び、その後、生成した基体複合体の量を、酵素−基体間
   の特異反応において、光学的方法もしくは放射化学的方
   法を適用して判定することを特徴とする、請求項１１に
   よる方法。 １３、ビオチンが該第２抗体と共有結合的に結合せしめ
   られることを特徴とする、請求項８による方法。 １４、結合せしめられ、かつビオチンで標識づけされた
   該第２抗体が、該酵素のうちの１種を共有結合的に結合
   した該アビジンタンパクと接触せしめられることによっ
   て定量化されることを特徴とする、請求項１３による方
   法。 １５、ラジオアイソトープが、該第２抗体もしくはアビ
   ジンと結合せしめられることを特徴とする、請求項８も
   しくは請求項１４による方法。 １６、結合せしめられた該第２抗体の量もしくは結合せ
   しめられた該アビジンの量が、放射化学的方法によって
   判定されることを特徴とする、請求項１５による方法。 １７、請求項５、１１もしくは１２において請求された
   免疫学的定量化反応が、結合せしめられた該第２抗体の
   量を、該第２抗体を指向するものではあるが該第１抗体
   を指向するものではない第３の抗体を用いて同定するこ
   とにより行なわれることを特徴とする、請求項９、１０
   もしくは１２による方法。 １８、該第３抗体が酵素もしくはラジオアイソトープを
   もって標識づけされ、かつ、それらの量が酵素−基体反
   応もしくは放射化学的方法により定量化されることを特
   徴とする、請求項１７による方法。 １９、結合せしめられた該第３抗体の量が、該第２抗体
   に結合された該第３抗体が接触せしめられるべきもので
   ある酵素−抗酵素複合体により定量化されることを特徴
   とする、請求項１７による方法。 ２０、態様Ｂに従い、該ビリンタンパクもしくはフィブ
   リンタンパクを含有する該溶液が、該基体表面と接触せ
   しめられ、吸着平衡に到達したのち該溶液が除去され、
   被覆された該基体が洗浄用液剤をもって洗浄され、引続
   き該基体が抗ビリンもしくは抗フィンブリンモノクロー
   ナル抗体もしくはポリクローナル抗体の規定量を包含す
   る検体尿とともにインキュベーションに付せられ、フィ
   ンブリンもしくはビリンを結合した抗体と基体に結合し
   た抗体との間の平衡が達成された後に検体尿を除去し、
   該基体表面を洗浄用溶液をもって洗浄し、引き続き該基
   体に結合した該抗体を定量化過程に付することを特徴と
   する、請求項２による方法。 ２１、該定量化過程が、請求項１１に従い、該抗体を該
   酵素もしくは該ラジオアイソトープと結合せしめること
   、ならびにその後に行なわれる酵素的分析もしくは放射
   化学的分析により行なわれることを特徴とする、請求項
   ２０による方法。 ２２、結合された該抗体が、ビオチンおよびビオチンで
   標識づけされた該抗体と連結せしめられ、かつ、酵素も
   しくはラジオアイソトープに結合せしめられた該アビジ
   ンタンパクにより定量化されることを特徴とする、請求
   項２０による方法。 ２３、該定量化反応が、結合抗体の量を、該結合抗体を
   指向する第２抗体を使用して判定することによりなされ
   ることを特徴とする、請求項２０の方法。 ２４、該第２抗体が酵素もしくはラジオアイソトープを
   もって標識づけされ、かつ、それらの量が酵素−基体反
   応もしくは放射化学的方法により定量化されることを特
   徴とする、請求項２３による方法。 ２５、結合された該第２抗体の量が、酵素−抗酵素複合
   体により定量化されることを特徴とする、請求項２４に
   よる方法。 ２６、抗フィンブリンポリクローナル抗体またはモノク
   ローナル抗体もしくは抗ビリンポリクローナル抗体を包
   含する、腎障害判定のための組成物。 ２７、腎障害を証明するための、抗ビリンモノクローナ
   ル抗体の使用。 ２８、該抗体が基体と結合せしめられることを特徴とす
   る、請求項２６もしくは請求項２７による態様。 ２９、該基体が、合成材料、とくにはポリスチレン製ミ
   クロ力価プレートであることを特徴とする、請求項２８
   による態様。 ３０、分析される該検体尿に添加されるべき該抗体が、
   溶液もしくは親液化された形態で入手し得るものである
   ことを特徴とする、請求項２６もしくは請求項２７によ
   る態様。 ３１、ビリンもしくはフィンブリンが基体に結合せしめ
   られていることを特徴とする、請求項２９による態様。 ３２、該ビリンタンパクもしくはフィンブリンタンパク
   が、検定用物質として付加的に（該組成物中に）包含さ
   れることを特徴とする、請求項２６もしくは２７のいず
   れか１による態様。 ３３、請求項２６もしくは２７によるものであって、ビ
   オチンで標識づけされた該抗体と同一のものもしくは異
   なるものであってよい第２抗体が（該組成物中に）包含
   されることを特徴とする、請求項２６もしくは２７のい
   ずれか１による態様。 ３４、該第２抗体が、溶液として、もしくは親液化され
   た形態で入手し得るものであることを特徴とする、請求
   項３２のよる態様。 ３５、（請求項）８から１０まで、同１２もしくは同２
   ０の方法により結合せしめられた抗体の同定のための免
   疫学的試薬が（該組成物中に）包含されていることを特
   徴とする、請求項２６もしくは請求項２７による態様。 ３６、該試薬が、ペルオキシダーゼと共役化したストレ
   フトアビジン、１、２−フェニレンジアミンおよびＨ＿
   ２Ｏ＿２を包含するものであることを特徴とする、請求
   項３４による態様。