JPH0129560B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は、抗生物質の修飾剤をはじめ、医薬、
農薬の中間体として有用なＤ−アミノ酸の生化学
的製造法に関する。 （従来技術および問題点） 従来、生化学的にＤ−アミノ酸を製造する方法
は、５−置換ヒダントイン類に微生物の有するヒ
ダントイナーゼを作用させる方法（特開昭55−
104890）、α−アミノ酸のアミドに微生物の有す
るアミダーゼを作用させる方法（特開昭60−
184392）、Ｎ−アシル−DL−アミノ酸にアシラー
ゼを作用させて、Ｌ−アミノ酸を光学分割し、残
つたＮ−アシル−Ｄ−アミノ酸に酸を作用させる
方法（特公昭41−22380）などが知られている。 しかしながら、これらの方法は高価な基質を必
要とし、かつ反応系も複雑であることから工業的
生産の方法として不利な点を有している。一方、
Ｎ−アシル−DL−アミノ酸にストレプトミセス
属に属する微生物の有するＤ−アミノアシラーゼ
を作用させてＤ−アミノ酸を得る方法（特公昭53
−36035）やフアカルタテイブ・メタノール資化
性菌の生産するＤ−アミノアシラーゼを作用させ
てＤ−アミノ酸を得る方法（特公昭60−31477）
は、反応工程も短くＤ−アミノ酸の工業的生産方
法としてはすぐれた方法の１つではあるが、これ
らの微生物はＬ−アミノアシラーゼをも同時に生
産することから、高い光学純度のＤ−アミノ酸を
得難いという欠点を有する。 また、本発明者らはストレプトミセス属に属す
るＤ−アミノアシラーゼ生産菌を改良し、Ｌ−ア
ミノアシラーゼ生産能の極めて低い菌株を見出し
この菌株を用いて光学純度の高いＤ−アミノ酸を
得る方法（特願昭60−265860）を発明したが、こ
れは先に挙げたＤ−アミノアシラーゼによるＤ−
アミノ酸の製法に比べ、非常に光学純度の高いＤ
−アミノ酸を得られる方法ではあるが、基質濃度
を高くすると、菌体中に微量に存在するＬ−アミ
ノアシラーゼの影響で生成するＤ−アミノ酸の光
学純度が低下するという問題点が生じる。 （問題点を解決するための手段） 本発明者らは、光学純度の点で十分満足のいく
Ｄ−アミノ酸を特に高濃度基質から工業的に有利
に製造する方法の開発を目的に鋭意検討した結
果、ストレプトミセス属に属する微生物の生産す
るＤ−アミノアシラーゼの作用により、Ｎ−アシ
ル−DL−アミノ酸またはその塩のＮ−アシル基
を加水分解してＤ−アミノ酸を生成する反応を、
EDTAの存在下で行なうことにより、非常に光
学純度の高いＤ−アミノ酸を工業的に有利に高収
率で得られることを見出し、これに基づいて本発
明を完成した。 即ち本発明は一般式

【式】 （ただし、Ｒは、低級アルキル基、置換低級アル
キル基、フエニル基、置換フエニル基、フリル
基、ピリジル基、チアゾリル基、イミダゾリル基
又はインドリル基を表わす。R′は直鎖状もしく
は分枝状のアシル基を表わす。ＸはＨ、Na、Ｋ、
NH₄を表わす。）で表わされるＮ−アシル−DL
−アミノ酸もしくはその塩に、EDTAの存在下、
ストレプトミセス属に属しＮ−アシル基加水分解
能力を有する微生物菌体もしくは菌体処理物を作
用させることを特徴とするＤ−アミノ酸の製造法
である。 本発明の一般式で示されるＮ−アシル−DL−
アミノ酸およびその塩の例として、たとえばＮ−
アセチル−DL−バリンおよびそのカリウム、ナ
トリウム、アンモニウム塩、Ｎ−アセチル−DL
−フエニルグリシンおよびそのカリウム、ナトリ
ウム、アンモニウム塩等が挙げられる。このほか
Ｎ−アシル−DL−アミノ酸を構成するアミノ酸
として、フエニルアラニン、アラニン、メチオニ
ン、システイン、アスパラギン酸等が挙げられ
る。 本発明に使用される微生物はストレプトミセス
属に属するものであり、その代表例として、スト
レプトミセス・ツイルス０−33（微工研菌寄第
8446号）が挙げられる。 微生物の培養は通常は振盪培養、あるいは通気
撹拌培養などの好気的条件下で行なう。培養温度
は、20〜37℃の範囲で可能であるが、好ましくは
25〜30℃である。培養PHは５〜９の範囲で可能で
あるが、好ましくはPH6.5〜8.5である。 培地に使用する栄養源は、使用可能なものなら
ば、何れの種類のものを用いてもよい。即ち、炭
素源としては、グルコース、マルトース、でんぷ
ん、糖蜜などの炭水化物、更にグリセリンなども
使用できる。窒素源としては、ペプトン、酵母エ
キス、肉エキス、コーンステイプリカーなどの有
機窒素源、さらに硫酸アンモニウム、酢酸アンモ
ニウム等の無機、有機アンモニウム塩なども使用
できる。更にDL−バリン等のDL−アミノ酸を
0.01〜１％、好ましくは0.1〜0.5％濃度で培地に
添加しておくと本反応に関与する酵素が誘導され
好適である。 本発明の反応はEDTAの存在下で行なわれる
が、予め微生物の培養菌体をEDTAで処理し、
あるいは培養菌体または菌体を破砕して得られる
無細胞抽出液を含む反応液中にEDTAを添加し
て反応が行なわれる。また予めEDTAで処理し
た菌体を固定化して使用することもできる。 本発明の反応においてEDTAの使用量は、基
質濃度、酵素量、その他の諸条件によつて好適な
値を適宜選択すればよいが、例えば反応液中の濃
度が0.005〜0.5％の範囲になるように添加され
る。反応に使用する基質であるＮ−アシル−DL
−アミノ酸の濃度に特に制限はないが、通常0.1
〜30％の濃度が用いられ、反応温度は10〜60℃、
好ましくは20〜40℃、反応PHは４〜10、好ましく
は６〜９である。 反応終了後、反応液中からのＤ−アミノ酸の単
離は、直接晶析法、イオン交換樹脂処理等により
行なうことができる。 （発明の効果） 本発明の方法により、高濃度、高収率でかつ光
学純度の高いＤ−アミノ酸を工業的に安価に製造
することができ、産業上の効果は極めて大きい。 （実施例） 以下実施例により本発明を更に詳述するが、本
発明はこれらの実施例のみに限定されるものでは
ない。 実施例 １ ストレプトミセス・ツイルス０−33（微工研菌
寄第8446号）を第１表に示した寒天斜面培地で培
養した後、第２表に示した液体培地を500ml振盪
フラスコ中に100ml加え、そこに一白金耳接種し、
28℃振盪培養を行なつた。 培養終了後、遠心集菌し、100mlの生理食塩水
で洗浄した後再び、遠心集菌した。この菌体を
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）100mlに懸濁して菌
体懸濁液とした。この菌体懸濁液10ml、20％Ｎ−
アセチル−DL−バリンのナトリウム塩溶液10ml、
およびEDTA5mgを混合した後、30℃で15時間撹
拌しながら反応させた。反応終了後、遠心分離し
て除菌した後、反応生成物の分析をHPLCで行な
つた。分析方法は、キラルモービルフエイズ法
（J.Am.Chem.Soc.102、5115（1980））で行なつ
た。その結果、15時間反応後、Ｎ−アセチル−Ｄ
−バリンの92.2％がＤ−バリンに変換した。光学
純度100％であつた。 第１表 酵母エキス 1ｇ 肉エキス 1ｇ NZアミンタイプＡ 2ｇ マルトース 10ｇ 寒 天 20ｇ 蒸留水 1 PH7.3 第２表 可溶性でんぷん 20ｇ ペプトン 10ｇ 酵母エキス 5ｇ 食 塩 5ｇ DL−バリン 5ｇ 蒸留水 1 PH7.0 実施例 ２ 実施例１と同様にして得た菌体を、NaOHで
PH7.0に調整した0.025％EDTA水溶液100mlに懸
濁し、室温30分放置した後遠心集菌した。この
EDTA処理菌体を蒸留水100mlに懸濁して菌体懸
濁液とした。この菌体懸濁液10mlとNaOHでPH
7.0にした20％Ｎ−アセチル−DL−バリンのナト
リウム塩溶液10mlを混合した後、30℃で15時間撹
拌しながら反応させた。反応終了後、遠心分離し
て除菌した後、６規定塩酸でPH１とした。遠心分
離して析出したＮ−アセチル−Ｌ−バリンを除
き、上清を活性炭処理した後再びPHを7.0とし、
H⁺型強酸性陽イオン交換体（アンバーライトIR
−120B）に加え、５％アンモニア水溶液で脱着
した。脱着物を80℃で減圧乾燥することによりＤ
−バリン0.687ｇを得た。収率93.3％、〔α〕²⁰ _D：−
28.3° （Ｃ＝86N HCl）、光学純度100％であつ
た。 また、新たに同様の方法で反応を行ない、一定
時間ごとに反応液をサンプリングし、生成物の分
析をHPLCで行なつた。分析方法はキラルモービ
ルフエイズ法で行なつた。この反応の経時変化を
図１に示した。 比較例 １ 実施例１と同様にして得た菌体懸濁液10mlと、
20％Ｎ−アセチル−DL−バリンのナトリウム塩
溶液10mlを混合した後、30℃で15時間撹拌しなが
ら反応させた。一定時間ごとに反応液をサンプリ
ングし生成物の分析をHPLCで行なつた。分析方
法はキラルモービルフエイズ法で行なつた。この
反応の経時変化を図２に示した。 実施例 ３ 第２表に示した液体培地100mlにストレプトミ
セス・ツイルス０−33（微工研菌寄第8446号）の
胞子を一白金耳接種し28℃で振盪培養を行なつ
た。培養終了後遠心集菌し、生理食塩水で十分洗
浄した後、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）100mlに
懸濁し、超音波破砕器で細胞を破砕した。遠心分
離で細胞の破片を除去して、Ｄ−アミノアシラー
ゼの粗酵素液を得た。20％Ｎ−アセチル−DL−
バリンのナトリウム塩1.25ml、粗酵素液2.5ml、
0.5Mリン酸緩衝液（PH7.0）1.25mlおよび
EDTA1.25mgを混合した後、30℃で25時間撹拌し
ながら反応させた。一定時間ごとに反応液をサン
プリングし、生成物の分析をHPLCで行なつた。
分析方法は、キラルモービルフエイズ法で行なつ
た。この反応の経時変化を図３に示した。 比較例 ２ 実施例３と同様の方法で粗酵素液を調整し、20
％Ｎ−アセチル−DL−バリンのナトリウム塩
1.25ml、粗酵素液2.5mlおよび0.5Mリン酸緩衝液
（PH7.0）1.25mlを混合した後、30℃で25時間撹拌
しながら反応させた。一定時間ごとに反応液をサ
ンプリングし、生成物の分析をHPLCで行なつ
た。分析方法は、キラルモービルフエイズ法で行
なつた。この反応の経時変化を図４に示した。

【図面の簡単な説明】

図１−１、図１−２および図１−３は、実施例
２におけるＤ−体の反応率（Ｄ−バリンへの転化
率）、Ｌ−体の反応率（Ｌ−バリンへの転化率）
およびＤ−体の光学過剰率（e.e.）の経時変化を
表わす。図２−１、図２−２および図２−３は、
比較例１におけるＤ−体の反応率（Ｄ−バリンへ
の転化率）、Ｌ−体の反応率（Ｌ−バリンへの転
化率）およびＤ−体の光学過剰率（e.e.）の経時
変化を表わす。図３−１、図３−２および図３−
３は、実施例３におけるＤ−体の反応率（Ｄ−バ
リンへの転化率）、Ｌ−体の反応率（Ｌ−バリン
への転化率）およびＤ−体の光学過剰率（e.e.）
の経時変化を表わす。図４−１、図４−２および
図４−３は、比較例２におけるＤ−体の反応率
（Ｄ−バリンへの転化率）、Ｌ−体の反応率（Ｌ−
バリンへの転化率）およびＤ−体の光学過剰率
（e.e.）の経時変化を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 【式】 （ただし、Ｒは、低級アルキル基、置換低級アル
   キル基、フエニル基、置換フエニル基、フリル
   基、ピリジル基、チアゾリル基、イミダゾリル基
   又はインドリル基を表わす。R′は直鎖状もしく
   は分枝状のアシル基を表わす。ＸはＨ、Na、Ｋ、
   NH₄を表わす。）で表わされるＮ−アシル−DL
   −アミノ酸もしくはその塩に、EDTAの存在下、
   ストレプトミセス属に属しＮ−アシル基加水分解
   能力を有する微生物菌体もしくは菌体処理物を作
   用させることを特徴とするＤ−アミノ酸の製造
   法。