JPH01285858A - 抗酸菌の核酸配列測定用試薬およびこの試薬を用いる核酸配列測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［）Ｉ＋′業１．の利用分野］ 未発１！１は、抗酸菌から核酸を抽出し配列を測定−ｉ
るための試薬署・びにこの試薬の使用に関するものであ
る、 更に＋ｉｉ　Ｌ　（は、臨床検査領域等における結核菌
に代表、ぎれる抗酸菌の同定、あるいｊｆ検出に４ｆ　
ｔｔＪな核酸の抽出試薬、および試験に関するものであ
る。

［従来技術］ 遺伝イの分析にあたっては、一般に細胞からの核酸の抽
出が必要となる。中でも臨床検査領域等を中心として実
用化されている病原性の微生物やウィルス、あるいは発
癌遺伝ｆ−に代表される異常遺伝子等の核酸ハイブリダ
イゼーションアッセイ（以下ＤＮＡ−ＨＡと略す）等に
おいては、細胞からの核酸抽出効率が分析感度を左右す
る。

特に一般の細菌や真核細胞等に比べて構造［、核酸の抽
出が困難な結核菌に代表される抗酸菌の核酸分析では、
核酸の抽出が大きな問題となる。従来より一般細菌を対
象としてプロテアーゼ等の酵素類、ドデシル硫酩ナトリ
ウム、トリトン等Ｗ面活性剤を用いる抽出法が知られて
いる。抗酸菌の場合もこれらの方法が試みられたが、収
率に関しては必ずしも満足できるものではなかった。

収率の向トを［１的として、海砂やビーズ等の微粒子押
体と細胞とを拐突させこれを粉砕する方法や、超ｇｆ波
処理による抽出、あるいは両名の併用（特開昭６２−２
３６４７８）１が報告されている。現在臨床検査用に市
販されているキン）の使用にあｔ−っでも、検体からの
核酸抽出のために超Ｔ％波処理装置を併用しているのが
実情である。

しか］２微粒子−但体の使用は煩雑であり、超音波処理
においては場合により抽出された核酸が壊れてしまうこ
ともある［ザルター等（５ａｌｔｅｒ　Ｄ、Ｗ。

ｅｔ、ａｌ、）ブリデイツシュ　ジャーナル　オブ　ニ
、−１・ライジョン（Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｎｕｔローｔｉｏｎ　）ｊｌ、５３１−５３９
（１９８４）］　、このように、現在知られている抗酸
菌の核酸抽出技術はそれぞれ問題Ｃ，ＩＮ、を右してお
り、迅速で簡便な核酸抽出技術の開発がｑ；まれている
。

［発１！１の目的１ 本発明は、これまで困難とされていた抗酸菌の核酸抽出
を容易に行ないうる試薬と、これを用いる核酸配列測定
法の提供を１−１的としている。

［発明の構成］ 本発明は、核酸抽出用試薬としてリゾチームを含んでな
ることを特徴とする抗酸菌の核酸配列測定用試薬、およ
び抗酸菌にリッヂ−１、をｆ１用、させて核酸を抽出し
これを試料として用いることを特徴とする核酸配列測定
法である。

本発明の核酸配列測定用試薬および核酸配列測定法にお
いて用いられるリゾデームは、その由来が特に限定され
るものではなく、いづれのリゾチームも使用可能である
。

本発明による核酸配列測定用試薬は、少なくともリゾチ
ームを含んでいれば使用することができるが、リゾチー
ムの他に好適な反応条ヂ］を与えることを目的として緩
衝剤等を含有することもできる。また試薬の安定化を図
るために、公知の酵素安定剤を加えることもできる。こ
れらの試薬成分は溶液状態で供給してもよいし、凍結乾
帰することにより乾燥状態で供給することもできる。

次いで本発明による核酸測定〃、について説明する。本
発明においては、微粒子担体や超ン″Ｙ波処理装置等を
用いることなく、実質的にリゾチームの作用のみによっ
て核酸の抽出が行なわれる。このときのリソｆ−ムの使
用条件は酵素の特性に合わせて設定されるものであり、
特定の範囲に限定されるものではないが特に好ましい条
件を例示すると市販きれている卵白由来の精製品を使う
場合ｐ＋（７０〜８０、酵素濃度は２〜８ｍｇ／ｍｌ程
度が挙げられる。

このようにして得られたリゾチーム処理試料は公知の核
酸配列測定法に供される。好ましい核酸配列測定法とし
ては、・＼イドロキシルアパタイトや各種固相を利用し
たＤＮＡ−ＨＡを挙げることができる。中でも本願出願
人が先に出願した強塩基性ポリアミノ酸被覆ビーズを利
用する方法と本発明法の組み合わせは、より簡便でより
迅速なアンセイ系を可能とするものである。

［発明の作用］ 未発１！Ｉ＋にかかる核酸配列測定用試薬並びに核酸配
列測定法におけるリゾチームは、抗酸菌の膜構造を破壊
し核酸の溶出を促准する作用を有するものである。リソ
チーＩ・は溶菌酵素としては知られ−Ｃいるか、抗酸菌
の核酸配列測定用試料の調製のために使用しうることは
知られていない。

以下実施例に基づいて、本発明を更に詳しく説明する。

［実施例］ 実施例１．結核菌の核酸抽出並びにＤＮＡ−ＨＡＯ核酸
抽出液 ２５ＩＩＭトリスー塩酸Ｍ＃ｉ液（ｐＨ７，０）にリゾ
チーＩ、（和光純薬工業輛製）を４ｍｇ／＋ｉｌ加えて
核酸抽出液とした。

○核酸の抽出 １％小川用１１！！（栄研化学■製）表面の被検菌コロ
ニーをかき取って滅菌水に浮遊さぜ、ナンバー１マクフ
アーランドスタンダードで菌数が試験管１本当り　３Ｘ
　１０５〜３Ｘ　１０”となるように調整した。

この菌体浮遊液１００−に核酸抽出液１００　ｐｐを加
え、室温で１時間反応させて菌体内の核酸を溶出させ試
料溶液とした。

なお被検菌は結核菌としてマイコバクテリウムを、に、
ｌ　ｊｇｊとしてでイコ・ヘクテリウム・アビウム（Ｎ
ヶ−ＶすＩ−！り夕明いた。

０−ドＩｌ　−Ｌ−１・ごユ・被覆に−ズの調製０　１
Ｍ）　　”　　２　　　　ｊ！ｊ　酸緩＃Ｍ　（ｐＨ７
，３）　　ＬｍＩ０１１ｇ／ｍｌ　　Ｑ１０ｒ’ｆリ−
■、−リ・ン〉・（以ドＰ　Ｌ　Ｌと略す）１１４Ｍ鳴
（Ｎｏ、Ｐ−１３９９，ジグマンＩ製）を溶がし、この
中にボリスチ［・７′ヒーズ（１／４　・インチ−１活
水化学丁業昧Ｓｊ）を浸清り、て室温で１時間感恰させ
た。これＧ、　０．０２５Ｍ　）　’Ｊ　ス−１１ｘｌ
’１ｌｆｉ液（ＰＨ７，４）　−ｃ洗浄り、テＰ　Ｌ　
Ｌ被覆上−ズを得た。

０標識イ１１−、ブ プローブＤＮＡとして２５＋ｍｅｒオリゴヌクレオー１
１・合成プローブ（１木鎖）を塩化タリウムを用い−Ｃ
Ｎ　ａ　　１：′’Ｉで標識し、標識プローブとした。

なお合俵４プローグは、アプライドバイオシステムを乃
１．Ｉ　Ｓ　Ａ合成機を使−〕て〕β−シアノエチルア
ミダイトにより合ｌ＆シたものを用いた。

○Ｄ　Ｎ　Ａ　−ＨＡ 前記試本１溶液中を２規定の水醇化ナトリウム水溶靜２
０μｐによりアルカ１）処理した後２規定の１′１！酎
で中和し、これにＰＬＬ被覆ビーズを侵漬Ｉ７て、６５
℃で１峙間放置してＲＮＡを固定後０．０２５Ｍ　）リ
スーＩ′！！醇緩衝液（ｐＨ７，４）３００ｉ１１７で
洗節した。このＰＬ　Ｌ被覆ビーズの入った試験管へ、
標識プローブを含むハイブリダイゼーション溶液２００
ｕ　ヲ分１１１ッた。

ハイブリダイゼーション溶液の組成は。

６Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ’ １０膓ＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ ５ＸＰＭ　傘ψ ０゜５％ＳＤＳ傘會赤 傘：１ＸＳＳＣの組成は０．１５Ｍ食塩、０．１５Ｍク
エン酸ナトリウムである ”：ｌＸＰＭの組成は０．０２％ポリビニルピロリドン
、０．０２％フィコール、および’０．０２％ウシ血清
アルブミンである 一＃−：Ｓ　Ｄ　ＳはＦデシル硫酸すトリウム水溶液で
ある。また標識プローブは試験管１本当り　３×＋０５
ｃｐｓ　（Ｓ、Ａ、：　８Ｘ　１０’　ｃｐｓ／Ｋ　・
ＤＮＡ）となるように加えた。

６５°Ｃで１時間ハイブリダイズさぜた後ハイブリダイ
ゼーション溶液を除去し、更に０．１％ＳＤＳ含イＩＯ
，１Ｘｓｓｃ溶液３００μρで洗ＭＩ　Ｌ、γ−カウン
ターでＰＬＬ被覆ビーズ上の標識プローブに由来する放
射縁縫を、１１数した。結果は第１図に示すとおりであ
る。

実施例２．結核菌の核酸抽出並びにＤＮＡ−ＨＡ核酎耐
出液とし、て、次のものを用いる他は、実施例１と同様
の操れにより核酸抽出とＤＮＡ−ＨＡを行なった。

Ｏ核酸抽出液 ５０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）にリゾチ
ーム（和光紬薬［−業■製）を４ｍｇ／ｍｌ加えて核酸
抽出液とした。

結果は第２図に示した。

実施例３．結核菌の核酸抽出管ひにＤＮＡ−ＨＡ○核酎
の耐出 実施例１と同様の核酸抽出液および被検菌を用い、同一
の操作に従って試料溶液を得た。

０ＤＮＡ−ＨＡ 前記試料溶液に、試験管１本当り　ＩＸ　１０５ｃｐｓ
（Ｓ、Ａ、：　８Ｘ　１０’　ｃｐ＋＊／ｌＪｇ−ＤＮ
Ａ）となるように標識プローブを混ぜたハイブリダイゼ
ーション溶液を加え、６５°Ｃで１時間ハイブリダイズ
させた。なおハイブリダイゼーション溶液は、実施例１
と同じものを用いた。

反応終了後、１％ハイトロキシルアパタイトを含む０．
２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　１ｍｌを加え、２分
間攪拌した後１分間遠心分離した。上清を吸引除去した
後０．００５％ＳＤＳ含有０．０８Ｍリン酸緩ＩＴ液（
ｐＨ７，０）　１ｍｌで洗浄し、沈渣の放射線鼠をカウ
ントして次の式に従ってＢ／Ｔ％を決定した。結果は第
３図に示した。

プローブの総カウント数 実施例４．リゾチームの作用条件の検討Ａ　、　ｐ）ｌ
の検討 緩檜剤としてトリス−塩酸緩衝液を用いた場合における
リゾチーム作用時のｐＨについて、次のような方法によ
り検討を行なった。

実施例１における２５ｍＭ１リス−塩酸緩衝液のｐＨを
　５０〜８．０とし菌数を試験管１本当り　１ＸｌＯｉ
と１−る他は、実施例１と同様の操作に従って結核菌の
核酸抽出並びにＤＮＡ−ＨＡを行なった。なお被検菌と
してはマイコバクテリウム・ラベルクロシスを用いた。

結果は第４図に示すとおりｐＨ７，０〜　８０の範囲に
おいて、最も高い抽出効率が？ｊ）　１′）ねｔ−０ Ｂ　、緩衝剤濃１＆の検、ト１ リンチー１、を竹田させるときの緩衝剤としてト１１ス
ー塩醜緩衝液を用いた場合の緩衝剤濃度について、次の
ような方法により検討を行なった。

実施例１におけるトリス−１ム酸緩酌液（ｐＨ７，０）
のｉｎ　Ｉｆｆを　０−１００ｍＭとし菌数を試験管１
本当りｌＸｌ０Ｉと１−る他は、実施例１と同様の操作
に従って結核菌の核酸抽出並びにＤＮＡ−ＨＡを行な、
った６なお被検菌としては、マイコバクテリウド・ラベ
ルクロシスを用いた。結果は第５図に示すとおり２５〜
７５ｍＭの範囲において、最も高い抽出効率か得られた
。

Ｃ作用時間の検討 緩衝剤として２５１１Ｍ）リスーｊ！！酸緩術液を用い
た場合におけるリゾチームの作用時間について、次のよ
うな方法により検討を行なった。

実施例１におけるリゾチームの作用時間を１０−１８０
分間、並びに１晩とし菌数を試験管１本当り＋ｘ　１ｏ
ノとする他は、実施例Ｉと同様の操ｆ’ｌｉ、：従って
結核菌の核酸抽出並びにＤＮＡ−ＨＡを行なった。なお
被検菌としてはマイコバクテリウム・ラベルクロシスを
用いた。結果は、第６図にｒｊ＜　＃ように作用時間６
０分で抽出効果のプラトーに達１゜ている。

［発１５１の効果］ 本発明によれば、伺帯操作や特殊な装置を用いることな
く核酸配列測定に供する抗酸菌より核酸の抽出を行ない
うる。すなわちリッチ−Ｉ、以閃の特別な試薬やあるい
は超音波処理装置等が不夛であるため、従来技術に比べ
舒済的に有利である。

また１本の試験管内で菌体からの核酸抽出からＤＮ　Ａ
−ＨＡまでを行ないうるため操作性の点でも右利である
。ことに先に述へた強塩基性ポリアミノ酩被覆ビーズを
用いるＤＮＡ−ＨＡと本発明との組み合わせは、簡便Ｈ
の点において非常に有利なものであり、抗酸菌のＤＮＡ
−ＨＡの臨床応用に大きな有用性をゲえるものと考えら
れる。

・力、従来技術では抗酸菌のように強固な外膜を右する
微生物の核酸抽出は困難であり、特殊な抽出操竹を要す
るのみならず、抽出効率そのものが満ｒｉで、きない場
合もあった。しかし本発明によれば高い収率の維持が可
能であり、したがって少％の検体から［１的とする抗酸
菌を高感度で検出することがｒＩｆ能となる。

更に未発１！ＩＩにおけるリッチ〜Ｊ・は、抗酸菌の膜
構造に作用するため、超音波処理の際にみられるような
核酸への影響を回避できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の結果を、第２図は実施例２の結果を
゛示］グラフである。図中、縦軸は試験管ｌ本当りのＰ
　Ｌ　Ｌ被覆ビーズ［−の標識プローブに由来１−　；
！Ｎ放射線椿の計数値を、横軸は試験管ｌ本当りの細胞
数を示す。 第３図は実施例３の結果を示すグラフである。 図中、縦軸はＢ／Ｔ％を、横軸は試験管１本当りの細胞
数を示す。 第４図〜第６図は実施例４の結果を示すグラフである。 図中、縦軸は試験管１本当りのＦ　Ｔ＝　Ｌ被覆ビーズ
トの標識プローブに由来する放射線￥の計数イ４を、横
軸はｐ）ｌ（第４図）、］・］リスー塩酎緩衝剤濃度第
５図）または作用時間（第６図）を示す。 特　　許　　出　　順　　大 栄研化学株式会ン１ 第１図 第２図 第３図 （ビＢ、、１．．１　／　ｔｕｂ（：ｑ第４図 第５図 作用時間（分）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）核酸抽出用試薬としてリゾチームを含んでなること
   を特徴とする抗酸菌の核酸配列測定用試薬 ２）抗酸菌にリゾチームを作用させて核酸を抽出しこれ
   を試料として用いることを特徴とする核酸配列測定法 ３）リゾチームとして卵白リゾチームを用い、ｐＨ７．
   ０〜８．０の範囲内で抗酸菌に作用させることを特徴と
   する請求項２に記載の核酸配列測定法