JPH01281014A

JPH01281014A - プロトプラスト培養によるネギ属植物の再生法

Info

Publication number: JPH01281014A
Application number: JP63111762A
Authority: JP
Inventors: Akihiro Morita; 森田　昭博; Wataru Kawasaki; 渉川崎; Jinichiro Kojima; 小島　甚一郎; Masahiro Kano; 正博加納; Osamu Kimura; 修木村
Original assignee: MOMOYA KK
Current assignee: MOMOYA KK
Priority date: 1988-05-09
Filing date: 1988-05-09
Publication date: 1989-11-13
Anticipated expiration: 2012-07-02
Also published as: JP2625495B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は、ネギ属植物のプロトプラストから植物体を
再生する方法に関する。

〔従来の技術〕

バイオテクノロジーの進歩により、新しい植物を作る技
術に関しても新たな育種法として、（１）染色体数を増
減させて形質に変異を起こさせる方法、（２）化学物質
、放射線などにより突然変異を起こさせる方法、（３）
遺伝子組み換え技術により異種遺伝子を導入する方法、
（４）細胞砲台により異種の核や細胞質遺伝子を付与し
、新しい形質を獲得させる方法が、開発されている。こ
れらの方法のうち（２）〜（４）では、プロトプラスト
からの植物体再生が重要であり、特に、細胞から細胞壁
を除去したプロトプラストを融合して形質転換しプロト
プラスト融合物から植物体を再生する（４）については
必須である。

プロトプラストおよびその融合物から植物体を再生する
方法について、殆どが双子葉植物であり、単子葉植物で
は、イネ科（山田原２や、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　Ｒｅｐ
ｏｒｔ　５．８５−８８．ｆ９８８）　、ユリ科のアス
パラガス（Ｄｕｅ−Ｂｕｔ−Ｄａｎｇ−１１ａら、プロ
トプラスト７８．２１５−２２１　、１９７３）　、イ
ネのプロトプラスト融合物（島本功ら、第１０回植物組
織培養シンポジウム、講ａ要旨集Ｐ１７８，１８５　’
）などの限られた種類の植物に適用されているにすぎな
い。

〔発明が解決しようとする課題〕

ユリ科ネギ属植物のラッキョウ類、タマネギ類、ニラ類
、ネギ類およびニンニク類などについて、プロトプラス
トおよびぞの融合物から植物体を再生する方法が、十分
に確立されておらず、従来の再生法をそのまま転用した
のでは、再生せず実用化されていなかった。

この発明は、上述の背景に基づきなされたものであり、
その目的とするところは、ユリ科ネギ属植物のプロトプ
ラストおよびその融合物から植物体を効率よく再生する
方法が、十分に確立することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、ユリ科ネギ属植物のプロトプラストおよ
びその融合物から植物体を再生する方法について種々の
研究をして、簡便な手法で、細胞分裂活性を引き起こし
て分裂能力を維持するプロトプラストを選択し、かつ最
適の培養条件の検索すれば、この発明の目的達成にｑ効
であることを見出し、この発明を完成するに至った。

すなわち、この発明のネギ属植物の再生法は、次の工程
を含むものである。

（イ）　ラッキョウ類、タマネギ類、ニラ類、ネギ類お
よびニンニク類などのネギ属植物に由来する細胞からプ
ロトプラストを調製する工程（ロ）　得られたプロトプ
ラストから比重の重いプロトプラストを分画する工程（ハ）　分画されたプロトプラストを、培養培地を変え
て継続培養し、カルスを形成する工程（ニ）　得られた
カルスを、植物ホルモン素行分化培地で分化させて植物
体を再生する工程この発明の好ましい態様では、ネギ属
植物に由来する細胞は、ぶどう状で増殖の活発なカルス
から得られたものとすることができる。

更に、この発明の好ましい態様では、プロトプラストに
対する培養培地として、シエンク・ヒルデブランド氏Ｓ
Ｈ培地の一部組成を改変したＳＨ改変培地を用いること
が好ましい。

発明の詳細な説明以下、この発明をより詳細に説明する。

ユリ科ネギ属この発明で用いられる植物は、ユリ科ネギ属（Ａｌｌ！
ｕｓ）であり、具体的には、開隔、ラクダ、へ房、九頭
陀、益田二号など種々の系統に分れた多種のラッキョウ
類、タマネギ類、ニラ類、ネギ類およびニンニク類など
がある。

植物の用いる部位としては、葉肉組織をはじめとする植
物体の一部、茎、根、燐茎などから誘導された培養細胞
、特に、組織片などからカルス化された細胞塊（カルス
）がある。

植物の組織片からカルス化する場合、組織片としては、
鱗茎の茎頂、および近傍組織、普通葉中下部を小片に、
例えば、０．５〜１１長に切断したものが好ましい。こ
の切断に先立って、組織体、例えば、ラッキジウ鱗茎の
表面を次亜塩素酸ソーダ、エチルアルコールなどで殺菌
処理したのち、減菌水でよく洗っておくことが望ましい
。

この発明において、組織片生育のための培地の基本組成
は、通常の植物組織培養に用いられる培地のものとする
ことができる。そのような培地として、例えば、ムラシ
ゲ・スクーグ（Ｍｕｒａｓｌｇｅ　−８ｋｏｏｇ）氏培
地、リンスマイヤー争スクーグ（Ｌｌ　ｎｓｓ＋ａｌｅ
ｒ　−Ｓｋｏｏｇ）氏培地などがある。培地を固体状に
するために寒天および／またはジェランガム（Ｇｅｌｌ
ａｓ　（ｉｕｓ）を用いることができる。組織片をカル
ス化（脱分化）に進める働きを有する物質として、例え
ば、ベンジルアデニン、カイネチン、ナフタレン酢酸、
インドール酢酸、２．４−ジクロロフェノキシ酢酸など
がある。

プロトプラストの調製この発明おいて、先ず、プロトプラストを調製する。

植物細胞の細胞壁はセルロースを主成分とし、細胞間同
士をペクチン物質が接召しているので、通常、プロトプ
ラストを分離する場合、これらの物質を消化する酵素、
すなわち、ペクチナーゼやセルラーゼなどが使用される
。

プロトプラストの調製は、例えば、目的とする植物種の
組織を、−段階または多段階で酵素で処理し、得られた
酵素処理液、すなわちプロトプラストの懸濁液からプロ
トプラストを分離する。次いで、解離したプロトプラス
トには、分解した細胞壁やその他の色々な組織の解離物
が共存するので、ガーゼやステンレスまたはナイロン製
の網で濾過し、洗浄してプロトプラストを調製する。

この発明で用いられるプロトプラストには、細胞融合技
術により、融合されたプロトプラスト融合物も含ｉれる
。

プロトプラストの分画この発明の（ロ）工程では、得られたプロトプラストか
ら比重の重いプロトプラストが分画される。

具体的な比重の数値は、その植物の種類、組織の種類な
どに応じて変化し、相対的である。この発明では比重の
重い方を分画するが、その割合は、同様に適宜変更選択
することができる。

比重の重い方を分画する方法は、例えば、濃度勾配遠心
分離法、その他、比重の異なる複数の基準液に順次装入
して浮遊するものと沈降するものとを分は取る方法があ
る。濃度勾配遠心分離法を用いる場合、ショ糖の高重合
体やデキストランなどの分画用試薬を用いることができ
る。

比重の重い方のプロトプラストを分画することにより、
細胞質の充実した分裂活性が高いものを選択することが
でき、再生率を向上させることができる。

プロトプラストの培養この発明の（ハ）工程で、比重の玉い方のプロトプラス
トが、培養培地を変えて継続培養され、カルスに形成さ
れる。

この発明のこの工程において用いられる初期の培養培地
としては、例えば、ムラシゲ・スクーグ（Ｍｕｒａｓｈ
ｉｇｅ　−Ｓｋｏｏｇ）氏ＭＳ培地、リンスマイヤー・
スクーグ（１，１ｎ５ｓａｌｅｒ　−Ｓｋｏｏｇ）氏Ｌ
Ｓ培地、シエンク・ヒルデブランド氏のＳＨ培地、（ｉ
ａｓｂｏｒｇのＢ５培地などがあるが、下記第１表に例
示すＳＨ培地を改変したＳＨ改変培地（１）、すなわち
、ＫＨ２ＰＯ４が、０．０７〜０．２６ミリモル、好ま
しくは０．１３ミリモルであり、ＫＮＯが、２．５〜２４，８ミリモル、好ましくは１２
．４ミリモルであり、（ＮＨ４）２Ｓ０４が、０，１３〜０．６５ミリモル、
好ましくは０．２６ミリモルであり、有機成分について
、ＴＭ　（ＴＯＭＡＴＯＭＥＤＩＵＭ）−２培地（Ｅ　
Ｉ　Ｌ　ａ　ｓ　　Ａ。

５ｈａｈｉｎＳＣＥＬＬ　　ＣＵＬＴＵＲＥＡＮＤ　　
ＳＯＭＡＴＩＣＣＥＬＬＧＥＮＥＴＩＣ３ＯＦ　　ＰＬＡＮＴＳ、ＶＯＬ。

１．３７３）の有機成分を添加され、更に、浸透圧調整剤としてぶどう糖が用いられた培地で
ある。

第１表　ＳＨ改変培地（１）の組成ＳＨ改変培地（１）は、上記の＜Ａ＞と＜Ｂ＞との培地
を１＝１の割合で混合したものである。

＜Ｂ＞ＳＨ改変培地（１）の形態は、液体、半固体、固体培地
などが挙げられる。培地の固化剤としては、寒天、アガ
ロース、ジュランガムなどがあり、ジュランガムを用い
た固体培地が好ましい。

この発明では、培養は、培地を変えて実施され、その様
な培養培地として、初期の培地と同様に、例えば、ムラ
シゲ・スクーグ（Ｍｕｒａｓｌｇｃ−８ｋｏｏｇ）氏Ｍ
Ｓ培地、リンスマイヤー・スクーグ（Ｌｌｎｓｍａｌｃ
ｒ　−Ｓｋｏｏｇ）氏ＬＳ培地、シエンク・ヒルデブラ
ンド氏（Ｓｅｈｅｎｋ　−Ｈｌｌｄｃｂｒａｎｄｔ）の
ＳＨ培地、Ｇａａ＋ｂｏｒｇのＢ５培地などがあるが、
前記のＳＨ改変培地（１）の（ＮＨ４）２Ｓ０４とＫＨ２ＰＯ４との濃度を２倍にしジュランガムを除去し
たＳＨ改変培地（２）がある。

ＳＨ改変培地（２）の形態は、液体、半固体、固体培地
などが挙げられが、液体が望ましい。

更に、その後に定期的に交換する培地として、ＳＨ改変
培地（３）、すなわち、１／２３Ｈコンデイシヨン培地
とＳＨ改変培地（２）を１：１１：混合した培地を用い
ることが好ましい。

なお、ここで、１／２ＳＨコンデイシヨン培地は、１／
２８Ｈ液体培地中にカルスを培養した後の液体を濾過滅
菌した培地である。

ＳＨ改変培地（３）の形態は、液体、半固体、固体培地
などが挙げられが、液体や半固体が望ましい。

上記の培養培地には、植物ホルモン類として、例えば、
インドール酢酸（ＩＡＡ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）
　、インドール酪酸（ＩＢＡ）、２゜４−ジクロロフェ
ノキシ酢酸（２，４−Ｄ）などのオーキシン類、および
ベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチン、ゼアチンなど
のサイトカイニン類などがある。

分画されたプロトプラストは、例えば、次の培養条件で
培養される。

分画されたプロトプラスｈは、先ず、前記のＳＨ改変培
地（１）で培養する。培養初期では明所より暗所の方が
望ましい。初期の培養条件で５〜１５日間、好ましくは
７〜１０日間培養する。

培養温度は２０〜３０℃が望ましいが、好適には２３〜
２７℃である。

次いで、初期の培養期間の経過後に、前記のＳＨ改変培
地（２）で培養する。この培地をそのまま添加し、また
は、前記の培地（１）を４〜８分割してから添加し、培
地中でまたは浮遊させてもよい。照明をせず、または、
照明しても８〜１６時間日長が望ましい。この培養条件
で５・〜１５日間、好ましくは７〜１０日間培養する。

培養の後半では、前記のＳＨ改変培地（２）を除去し、
前記のＳＨ改変培３１！！（３）を添加して培養する。

この培養は、定期的にＳＨ改変培地（３）を交換して継
続する。

この様なプロトプラストの継続培養により、カルスが形
成される。

植物体の再生この発明では、工程（ニ）で、得られたカルスが、植物
ホルモン含有分化培地で分化して植物体に再生される。

この工程は、得られたカルス（細胞塊）をシュート再生
用培地に移植し、引き続き、発根を促進させる培地に移
植し、継続して培養を実施して植物体に再生することが
できる。

このようにして得られた根と鱗茎とを有する幼植物体は
、通常の方法で種苗として使用できる植物体にまで生育
させることができる。

〔作　用〕

上記の構成゛をなすこの発明は、次のように作用すると
考えられる。

この発明では比重の重い方を分画し、比重の重い方のプ
ロトプラストを分画することにより、結果的に細胞質が
充実し、細胞分裂活性を引き起こして分裂能力を維持す
るプロトプラストを選択することができ、再生率を向上
させることができる。

更に、この発明では、プロトプラストの培養に最適の培
養条件、すなわち、培養培地が選択されつるので、確実
にプロトプラストからカルスに培養される（実施例〕以下、例を示してこの発明をより具体的に説明する。

栽培ラッキョウ（品種；ラクダ）の鱗茎を常法により表
面殺菌した後、無菌的に茎頂、茎頂近傍、普通葉中下部
を摘出し、ＢＡｌｏ−５Ｍ、２．４−Ｄ１０’Ｍ、およ
びジュランガム２ｇ／ｌの濃度を含むＬＳ培地に管床に
てカルスを誘導した。

セルラーゼオノズカＲＳ　　１％（または、セルラーゼ
オノズカＲ−１０の２％）、ペクトリアーゼＹ−２３０
，１％、塩化カルシウム　１０ミリＭ１マンニトール　
０，６Ｍの酵素液をｐＨ５，８に調整し、０．２μｍの
フィルターで濾過滅菌して酵素液を調製した。得られた
カルスは、黄色ブドウ状で粒の小さなラッキョウカルス
であり、十分に細断して酵素液に入れる。その後に１０
分間減圧条件下で脱気し、そして、２５℃暗所下で穏や
かに振盪しながら、２時間酵素処理を行ってプロトプラ
ストを単離した。

プロトプラストの懸濁液を６０μｍのナイロンメツシュ
で濾過し、０．６Ｍのマンニトール、１０ミリＭの塩化
カルシウム溶液で２回洗浄した。

フィコール７０（ファルマシア社製）濃度１５％、１０
％および５％の０．６Ｍのマンニトール溶液を順次、遠
沈管中に重層し、最上層に、得られたプロトプラストの
懸濁液が入れられた。

この遠沈管をスイング式ローター遠心分離機（１６０Ｇ
、１０分）にかけた。１５％、１０％および５％のフィ
コール層に沈澱するプロトプラストの各々を、１０ミリ
Ｍの塩化カルシウムを含む０．６Ｍのマンニトール溶液
で洗浄し、予め溶解していた前記の培地Ａを４０℃以下
まで冷却し、培地Ｂと１：１の割合で混合した。得られ
た液のプロトプラスト濃度は、１０６個／（Ｉｌｌであ
った。

それぞれに分画されたプロトプラストの懸濁液は、各々
、１０口間、２５℃暗所下で培養後、ＳＨ改変培地（２
）を重層し、１６時間ロ長で培養した。そのＳＨ改変地
の培養後、９［コ目に培地（２）を除去し、培地（３）
を添加して培養後、１力月目にコロニーを形成した。そ
の後に下記組成のシュート形成用培地と発根誘導用培地
で培養することにより植物体を再生した。

第３表発根誘導用上記の様に得られた植物体の再生率を、１５％、１０％
および５％のフィコール層に沈澱して得たプロトプラス
トの各々について比較した。

その結果、１５％のフィコール層に沈澱して得たプロト
プラストから得られた比重の重いものが、高い再生率を
示した。

なお、この発明の方法は、この実施例に限定されず、種
々の変形が可能である。

〔発明の効果〕

上記の例から実証されるように、この発明は、次の様な
効果を奏する。

（ａ）　２求項１記載の方法より、ユリ科ネギ属植物の
プロトプラストおよびその融合物から植物体を効率よく
再生することができる。

（ｂ）請求項２により方法では、ネギ属植物に由来する
細胞として、ぶどう状で増殖の活発なカルスから得られ
たものを用いるので、より細胞分裂活性が高いプロトプ
ラストを得ることができ、より再生率を高めることがで
きる。

（Ｃ）請求項３による方法では、プロトプラストの培養
培地として、シェンク・ヒルデプラント氏培地の一部組
成を改変したＳＨ改変培地を用いるので、プロトプラス
トの培養に最適の培養条件にすることができ、確実にプ
ロトプラストからカルスに培養することができる。

出願人代理人　　佐　　藤　　−雄

Claims

【特許請求の範囲】１、次の工程を含む、ネギ属植物の再生法。（イ）ネギ属植物に由来する細胞からプロトプラストを
調製する工程（ロ）得られたプロトプラストから比重の重いプロトプ
ラストを分画する工程（ハ）分画されたプロトプラストを、培養培地を変えて
継続培養し、カルスを形成する工程（ニ）得られたカルスを、植物ホルモン含有分化培地で
分化させて植物体を再生する工程２、ネギ属植物に由来
する細胞が、ぶどう状で増殖の活発なカルスから得られ
たものである、請求項１記載の再生法。３、プロトプラストに対する培養培地が、シェンク・ヒ
ルデプラント氏培地の一部組成を改変したＳＨ改変培地
である、請求項１または２記載の再生法。