JPH0123480B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なネオカルチノスタチン複合体の
製造方法に関する。更に詳しくは本発明は式
（） 〔式中、ｎは１〜35の整数を意味し、（〓Ｎ〓Ｃ〓Ｓ）
はネオカルチノスタチン残基を意味し、（〓Ｓ〓Ｍ〓Ａ
）
はそのマレイン酸部分が （〓Ｎ〓Ｃ〓Ｓ）と結合したマレイン酸残基 （〓Ｎ〓Ｃ〓Ｓ）と結合していないマレイン酸残基 （但し、は平均１分子当り１個、とと
の合計は平均１分子当り50モル％以下である。）
及び、 半エステル化されたマレイン酸残基 より構成されている部分半エステル化された平
均分子量1000〜10000のスチレンマレイン酸共
重合体残基を意味する。〕 で示されるネオカルチノスタチン複合体の製造方
法に関する。 ネオカルチノスタチンはストレプトミセス・カ
ルチノスタチカス・バリアントＦ−41・クロヤ
（Streptomyces carzinostaticus var.F−41
Kuroya）の培養物中に産生される蛋白質性抗癌
物質であり（特公昭42−21752号、米国特許第
3334022号）、その一次構造は本発明者の一人であ
る前田によつて、アミノ酸総残基数が109の推定
分子量10700のものとして報告されている
（Science，178巻、875〜876頁、1972年、及び
Arch.Biochem.Biophys.，163巻、379〜385頁）。 癌の治療においては、癌細胞の転移が最も重要
な問題であり、就中特にリンパ節転移が最大の問
題である。先に、本発明者はネオカルチノスタチ
ンの毒性の軽減と薬効の持続性を高め、かつ薬物
をリンパ系に特異物に移行せしめることについて
種々研究した結果、ネオカルチノスタチンの分子
中に存在する２個の遊離アミノ基を水溶性スチレ
ンマレイン酸共重合体の部分水解物と反応せしめ
て得られるネオカルチノスタチン誘導体が上記目
的に合致することを見出し、特許出願した（特開
昭53−117095号）。 しかし、制癌剤は癌の転移を抑制するための上
記リンパ系に移行する性質の必要性に加えて、腫
瘍親和性が高いことが望ましい。腫瘍親和性が高
いと腫瘍における制癌剤の濃度が選択的に高まり
その結果副作用の発現が軽減し、制癌剤の効果を
有効に発揮し得るのである。 そこで、本発明者らはさらに種々研究した結
果、スチレン無水マレイン酸共重合体又はその部
分水解物とは異なる、無水マレイン酸残基を有
し、部分半エステル化された平均分子量が1000〜
10000のスチレン無水マレイン酸共重合体とネオ
カルチノスタチンとを反応させて得られるネオカ
ルチノスタチン複合体が意外にも上記目的を達成
することを見出し、別の特許出願を行つた（特願
昭57−31555号）。 該発明においては、マレイン酸残基が半エステ
ル化されていると共に、平均１分子当り１個以下
の無水マレイン酸残基をもつスチレン無水マレイ
ン酸共重合体を用いることが技術上の要点であつ
た。特に平均１分子当り１個以下の無水マレイン
酸残基をもつことが重要な点であつた。これはネ
オカルチノスタチン（以下NCSと略記する）と
ステレン無水マレイン酸重合体半エステル化物
（以下SMAとする）の反応が高分子同志の反応で
あり、双方が多官能性であることより、分子間で
種々の反応が起こりうることより、可及的副反応
を抑えて目的とする反応物を得るために、反応性
を有する無水マレイン酸残基数の少ないSMAを
選んだのである。該発明は上記問題点を解決する
上では有効であつた。しかしながら他の問題とし
て、反応収率の向上があり、かかる問題に対して
は有効でないことが判明した。即ち副反応を抑え
つつ反応収率を上げるためには、更に研究を進め
る必要があつた。本発明は該研究の結果完成した
ものである。 すなわち本発明はネオカルチノスタチンと、平
均１分子当り１個を超える無水マレイン酸残基を
有し、半エステル化された平均分子量1000〜
10000のスチレン無水マレイン酸共重合体とを反
応させることを特徴とする式（） 〔式中、ｎは１〜35の整数を意味し、（〓Ｎ〓Ｃ〓Ｓ
）
はネオカルチノスタチン残基を意味し、（〓Ｓ〓Ｍ〓Ａ
）
は、そのマレイン酸部分が （〓Ｎ〓Ｃ〓Ｓ）と結合したマレイン酸残基 （〓Ｎ〓Ｃ〓Ｓ）と結合していないマレイン酸残基 （但し、は平均１分子当り１個、との
合計は平均１分子当り50モル％以下である。） ；及び 半エステル化されたマレイン酸残基 式中Ｒは炭素数１〜４の低級アルキル基又は多
価アルコールモノエーテル残基である。）より
構成されている部分半エステル化された平均分
子量1000〜10000のスチレンマレイン酸共重合
体残基を意味する。〕 で示されるネオカルチノスタチン複合体の製造方
法である。 本発明の複合体（）は、先のネオカルチノス
タチン誘導体と同様の有用な性質を有すると共
に、脂溶性に優れており、油性製剤としての適用
が可能となる。本発明の複合体（）は油性製剤
として投与すると薬物を腫瘍部位に集中させるこ
とができる。そして本発明複合体（）は腫瘍に
対する親和性にも優れており、腫瘍部位に滞留し
て制癌効果を強力を発揮することができるのであ
る。 一方、本発明の複合体（）は脂溶性に加えて
水溶性の性質をも兼ね備えているので、水溶性製
剤例えば静注等により全身投与も可能である。 このような本発明の複合体（）によるネオカ
ルチノスタチンの好ましい改質は、１個以上の無
水マレイン酸残基を有し、部分半エステル化され
たスチレン無水マレイン酸共重合体を用いたこと
により、ネオカルチノスタチンを水溶性の性質を
保持しつつ、脂溶性の性質を兼ね備えたものとし
たことによると考えられる。 本発明の特に目的とするところは、制癌剤が静
脈注射剤として用いられた場合は制癌剤が毛細血
管より組織に出、さらにリンパ系に特異的に移行
することであり、一方制癌剤が油性製剤として用
いられた場合には制癌剤が油性製剤より血液中、
組織液中又はリンパ液中など必要な部位に徐放さ
れることであり、またいずれの投与形態の場合で
あつても制癌剤がそのまま又は分解を受けて腫瘍
組織（部位）にはよく集積し、なおかつ体外に安
全に排出されることである。 この目的に対しては、本発明の複合体（）は
毛細血管より組織に漏出するため分子量は８万以
下であることが好ましく、油性基剤への溶解性、
リンパ系への特異的な移行性のためには分子量は
１万以上であることが望ましい。 本発明の複合体（）は生体内で所定の部位に
到達したのち、そのままあるいは一部は加水分解
を受け、ネオカルチノスタチンが遊離し抗腫瘍性
を発揮するものと推定される。なお、本発明の複
合体（）はポリアニオンを形成し、生体内で免
疫系を賦活化する効果を期待される。 本発明の複合体（）はNCI分子当り１〜35分
子通常は２〜15分子のSMAとの複合体である。
NCSとSMAとの結合状態の詳細については不明
である。NCSの構造については、すでに前記
1972年発行のScience178巻875〜876頁にて明示さ
れており、それによりポリペプチドの側鎖に遊離
アミノ基が存するのは構成アミノ酸の１位のアラ
ニンと20位のリジンのみであるから、NCSと
SMAの反応においてNCSの２個の遊離アミノ基
はSMAの無水マレイン酸残基と反応しうる。ま
たNCSには多数の２級アミノ基や水酸基等があ
るから、これらの官能基とSMAが二次的な結合
を形成することも考えられ、式（）の複合体が
与えられる。 従つて、本発明の複合体にはNCSの２個の遊
離アミノ基の１又は２個がSMAと酸アミド結合
を形成したものだけでなく、更に上記官能基が
SMAと２次的な結合を形成することが考えられ、
官能基の数は合計35個存在するので、結果的に複
合体中のNCS分子に対するSMA分子の含有割合
は１〜35のものが存在しうるのである。通常は２
〜15分子のSMAが反応して複合体を生成するも
のと考えられる。 本発明で用いられるSMAは、マレイン酸半エ
ステル残基

【式】スチレン残基

【式】及び無水マレイン残基

【式】を主鎖単位とし、分子量が 1000〜10000である。ここでＲはメチル、エチル、
プロピル、ブチル等の低級アルキル、又はエチレ
ングリコールモノエーテル、ポリエチレングリコ
ールモノエーテル等の多価アルコールモノエーテ
ル残基である。これらの主鎖単位から成る分子量
は数平均分子量で1000〜10000より好ましくは
1500〜5000であり、無水マレイン酸残基は平均１
分子当り１以上、より好ましくは1.5以上で50モ
ル％以下（分子量1000の場合１分子当り平均2.5
以下、分子量10000の場合25以下）である。分子
量が大になるにつれ無水マレイン酸残基は多くと
り得るが、あまりに多いとNCSとの反応が複雑
となり副生物が多くなるので、上記範囲とするこ
とが望ましい。NCSとの反応に与からなつた
SMA中の無水マレイン酸残基は、反応過程で加
水分解により開環しマレイン酸残基となる。従つ
て反応を水系で行う場合（）式の複合体中の
SMA残基中には無水マレイン酸残基は実質的に
は存在しないので、またここで半エステルとは無
水マレイン酸が開環したマレイン酸の有する２個
のカルボキシル基の一つがエステル化されている
ことを意味し、無水マレイン酸残基以外はすべて
のマレイン酸残基が半エステル化されていること
が好ましいが、一部は半エステル化されていない
マレイン酸残基があつても差支えない。 本発明者らは、NCSとSMAの反応率を上げる
ためには無水マレイン酸残基の多いSMAを用い
るのが望ましいが、かかるSMAを用いれば反応
が複雑となり架橋構造をもつ生成物ができるので
はないかと予想した。しかしながら意外なこと
に、かかるSMAを用いても15℃以下の比較的低
温域で反応を行わせれば副反応なく高収率で
SMA、NCS複合体が得られることを見い出し
た。NCSとSMAとの反応は多官能性の高分子
（又はオリゴマー）同志の反応であるので、反応
生成物個々の反応位置を明示したり、分子構造を
明示することは不可能である。但し、反応生成物
の構造は電気泳動、ゲルパーミエーシヨンクロマ
トグラフイー、ゲル過等の分子サイズに関する
分析と、赤外線吸収スペクトル、紫外線吸収スペ
クトル及び元素分析等の構成成分に関する分析と
によつて平均的に解析することはできる。 本発明のネオカルチノスタチン複合体（）
は、NCSとSMAとを反応させることによつて製
造される。反応は通常、重炭酸ナトリウム水溶液
にNCSを溶解し、NCS1分子に対し１分子以上の
SMA好ましくは３分子以上のSMAの粉末を室温
ないし冷却下好ましくは15℃以下で撹拌下に添加
して行なわれる。また、SMAを無水マレイン酸
とは反応せず、かつ水溶性の有機溶媒（例えばア
セトニトリル、ジオキサン、テトラヒドロフラ
ン）に溶解し、これにNCSの重炭酸ナトリウム
の水溶液を添加し、次いで溶媒を減圧乾燥等によ
り除去することによつても製造することができ
る。本発明の複合体（）はSMAの無水マレイ
ン酸残基が開環し、NCSの官能基と反応するこ
とによつて生成するものと考えられ、NCS1分子
に対し、１〜35分子のSMAが反応して複合体を
生成しうるが通常は２〜15分子のSMAが反応し
て複合体を生成するものと考えられる。 従つて、生成した複合体には、NCSの２個の
遊離アミノ基の１又は２個がSMAと酸アミド結
合を形成した反応体だけでなく、更にSMAが、
NCSの他の官能基と２次的な結合を形成した複
合体も同時に生成する。なお、上記反応は重炭酸
ソーダ水溶液中にNCSを溶解し、それにSMAを
加えつつ反応させる方法により行うが、かかる系
を用いることにより反応生成物中には重炭酸ソー
ダ由来の種々の塩や一部過剰のSMA等が含まれ
るから、これらを透析等の各種手段で除去する。 本発明のネオカルチノスタチン複合体（）を
ヒトに投与するには、癌の原発部位、手術後の癌
摘出部位等の局所組織内投与法、皮内、皮下、筋
肉内、静脈内、動脈内、経口等の投与法、及び局
所への塗布、噴霧、坐薬、膀胱内注入の外用的投
与法が好適である。投与量は投与法と癌の悪性
度、癌の種類、患者の病状及び一般状態、癌の進
行度等によつて一定ではなく、また術後等のリン
パ節転移予防等の目的か、あるいは治療目的かに
よつて異なるが、例えば１日１回0.01〜10mg／Kg
を主として週１〜２回、あるいは連日投与するの
が好ましい。局所塗布、経口投与法では更に投与
量を増量することも可能である。 なお、本発明の複合体（）はＸ線造影剤リピ
オドール（仏国ラボラトワール・ゲルベ製、リピ
オドール ウルトラフルイド−ヨード化ケシ油脂
肪酸エチルエステル）に超音波により懸濁可溶化
する。本発明複合体（）１〜２mg／リピオドー
ル１mlの油性製剤を動脈内投与すると、腫瘍血管
内にリピオドール及び当該薬物が長期にとどまる
ので、強力に抗腫瘍効果を発揮する。また、リピ
オドールに溶解することにより、本発明の複合体
（）が局所に滞留する状態がＸ線によつて観察
することができる。 このような油性製剤として用いることは本発明
複合体（）の性質を生かした使用法の一つであ
る。 また、本発明の複合体（）は１〜９％重炭酸
ナトリウム水溶液に溶解する。この水溶液を静脈
内投与すると、当該薬物はリンパ管に多く分布す
るので強力に制癌作用を発揮する。 このような塩類水溶液剤として用いることも本
発明複合体（）の性質を生かして用いる使用法
の一つである。 以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
る。 参考例 試験管中に蒸気浸透圧法で求めた数平均分子量
2100のスチレン無水マレイン酸共重合体10ｇ
（0.0048モル）、酢酸リチウム0.1ｇ、所定量ずつ
のアルコールおよびジオキサンを仕込み、上部を
溶封したのち24時間室温で振とうして均一に溶解
した。ついで得られた溶液を15時間加熱し、しか
る後室温に冷却してから反応液を取り出し、ジオ
キサンにて約２倍に希釈してから凍結乾燥し、つ
いでさらに60℃にて24時間減圧乾燥して淡黄色フ
レーク状の一部無水マレイン酸環を残した生成物
（SMA）を得た。得られた生成物はすべて半エス
テル化SMAであつた。得られたSMAの残存無水
環量は赤外吸収スペクトル法により波数1780およ
び700cm^-1での光学密度の比より定量した、個々
のアルコールとの反応時のアルコールとジオキサ
ンの仕込量および得られたSMAの蒸気浸透圧法
で求めた平均分子量と残存無水環量を表１にまと
めて示す。

【表】 実施例 １−４ ネオカルチノスタチン0.5を0.5M重炭酸ナトリ
ウム水溶液50mlに氷冷、遮光下で溶解し、撹拌し
つつ表１に示した粉末状のSMAを加えた。3.0ｇ
のSMAを数回にわけて添加し、完全に溶解する
まで十分に撹拌した。溶解後４〜６℃にて16時間
静置した。なお撹拌中反応系のpHは8.3より8.7の
間に維持されていた。ついで反応液をセロフアン
チユーブ中に移し、10mM重炭酸アンモニウム水
溶液１に対して加圧下に４〜６℃で３日間透析
液を度々とりかえつつ透析した。透析終了後の反
応液を凍結乾燥し、白色わた状の固形物として目
的とするSMANCS複合体を得た。それらの分子
量を電気泳動法で求めたところ、夫々約57000、
56000、40000及び65000であつた。 表２に本複合体の遊離アミノ基反応率（モル
％）および複合体の収率をまとめて示す。

【表】

【表】 本複合体の残存遊離アミノ基を反応終了後の溶
液を水で希釈してからトリニトロベンゼンスルホ
ン酸を反応させ、生じたニトロベンゼン誘導体を
可視光吸収スペクトロメーターを用いて分光学的
に定量した。表３に得られた各複合体の元素分析
結果をまとめて示す。KBr錠剤法で得た各複合
体の赤外線吸収スペクトルを第１図ａ，ｂ，ｃ，
ｄに示す。第２図ａ，ｂ，ｃ，ｄに東洋曹達
（株）製Ｇ−3000SWカラムを用い、10mM重炭酸
アンモニウムを移動相とし、pH7.9で測定したゲ
ルパーミエーシヨンクロマトグラムを示す。第３
図に比較のためNCSについて得たゲルパーミエ
ーシヨンクロマトグラムを示した。第４図ａ，
ｂ，ｃ，ｄに各複合体の0.5M重炭酸水溶液中で
の、紫外、可視光吸収スペクトルを示す。また表
４に各種溶媒に対する複合体の溶解性をそれぞれ
まとめて示す。

【表】 比較例 １ NCS0.2ｇを氷冷下で0.8Mの重炭酸ソーダ水溶
液30mlに溶解し、これに数平均分子量3100、無水
マレイン酸環含量平均0.40／分子の部分半ブチル
セロソルブエステル化スチレン無水マレイン酸
１：１共重合体粉末1.0ｇを実施例と同様に数回
に分けて添加した。該粉末が全部溶解したのち、
冷蔵庫中で16時間放置した後残存アミノ基を定量
した所、反応率は16.9％を得た。反応液をセロフ
アンチユーブ中氷冷下で３日間透析外液（5mM
重炭酸アンモニウム水溶液）をとりかえつつ透析
した後凍結乾燥し、白色わた状固形物0.75ｇを得
た。複合体収率は79.3％であつた。 上記固形物の元素分析値は以下の通りであつ
た。 Ｎ：2.32％、Ｃ：63.31％、Ｈ：6.69％

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による複合体の赤外線吸収スペ
クトルの例を示し、第２図は同じくゲルパーミエ
ーシヨンクロマトグラム（GPC）の例を示す。
第３図はNCSのGPCの例を示し、第４図は本発
明複合体の紫外・可視光吸収スペクトルの例を示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ネオカルチノスタチンと、平均１分子当り１
   個を超える無水マレイン酸残基を有し、半エステ
   ル化された平均分子量1000〜10000のスチレン無
   水マレイン酸共重合体とを反応させることを特徴
   とする式（） 〔式中、ｎは１〜35の整数を意味し、（〓Ｎ〓Ｃ〓Ｓ
   ）
   はネオカルチノスタチン残基を意味し、（〓Ｓ〓Ｍ〓Ａ
   ）
   は、そのマレイン酸部分が （〓Ｎ〓Ｃ〓Ｓ）と結合したマレイン酸残基 （〓Ｎ〓Ｃ〓Ｓ）と結合していないマレイン酸残基 （但し、は平均１分子当り１個、との
   合計は平均１分子当り50モル％以下である。） ；及び 半エステル化されたマレイン酸残基 式中Ｒは炭素数１〜４の低級アルキル基又は多
   価アルコールモノエーテル残基である。）より
   構成されている部分半エステル化された平均分
   子量1000〜10000のスチレンマレイン酸共重合
   体残基を意味する。〕 で示されるネオカルチノスタチン複合体の製造方
   法。