JPH01222790A - 精製ε―ポリリシンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、精製ε−ポリリシンの製造法に関するもので
ある。更に詳しくは限外濾過膜を用いて精製ε−ポリリ
シンを製造する方法に関するものである。

（従来の技術） ε−ポリリシンは、例えば、ストレプトマイセス・アル
プラス・サブスピーシーズ・リジノボリメラス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｌｂｕｌｕｓ　５ｕｂｓｐ。

ｌｙｓｉｎｏｐｏｌｙｍｅｒｕｓ）　Ｎｌ１３４６を培
養することによって得られることは既に知られている（
特開昭５３−７２８９６号）。

当該物質は以下の構造式で表されるように、Ｌ−リシン
のポリマーで、Ｌ−リシンのε−位のアミノ基が隣合う
し一リジンのカルボキシル基とペプチド結合で直値上に
結合した高分子化合物である。

当該物質は必須アミノ酸であるＬ−リシンのポリマーで
あるので安全性が高く、かつカチオン含量が高いので特
異な物性を有する。従ってそれらの性質を利用して、ト
イレタリー用品、化粧品、飼料添加物、農薬、医薬、食
品添加物、電子材料等の用途が開発されつつある。

従来のε−ポリリシンの製造は次のように行ってきた。

すなわち、ε−ポリリシン培養液について菌体を分離し
た後、分離液のｐＨをアルカリ液を用いてｐＨ＝８．５
に調整した後、弱酸性カチオン交換樹脂に通して、ε−
ポリリシンを樹脂に吸着させる。樹脂を洗浄した後、０
．１規定希塩酸液を流して樹脂からε−ポリリシンを溶
出せしめる。溶出液を濃縮した後、活性炭で脱色し、し
かる後、溶剤、例えばメタノール、アセトン等を添加し
てε−ポリリシンを析出せしめる。

（発明が解決しようとする課題） 前記従来法による製造方法は種々の欠点を持っていた。

その第１は、発酵が終わった培養液は、菌体を除去した
上澄液について、カチオン交換樹脂処理をしなければな
らないことである。菌体を含有した培養液を、そのまま
カチオン交換樹脂にかけると、短時間のうちに樹脂層に
菌体が詰まって操作の続行が不能となるからである。又
発酵の途中で培養液を間歇的或いは連続的に発酵槽より
抜き出し、これをイオン交換樹脂にかけ通過液を発酵槽
に戻すこともできなかった。これは一つは菌体が樹脂層
に詰まるからである。二つはイオン交換樹脂処理が雑菌
混入の原因となり易い為である。

従来法の第２の欠点は、ε−ポリリシンの製造中のロス
が大きいことである。カチオン交換樹脂は培養液中の着
色成分をε−ポリリシンと共に吸着し、０．１規定希塩
酸で溶出する時は、ε−ポリリシンと共に溶出するため
、溶出液の着色度が大きく、この脱色のため次の工程で
大量の活性炭を要する。カチオン交換樹脂工程自体で８
−ポリリシンのロスが２５％あるが、次工程の活性炭処
理では、活性炭が着色成分だけでなく、ε−ポリリシン
も吸着するため、活性炭処理工程での８−ポリリシンの
ロスは２４％と非常に大きい。

以上述べたように従来の精製ε−ポリリシン製造法はプ
ロセス的に大きな欠点を持っていた。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、従来法による精製ε−ポリリシンの製造
法の欠点を改善すべく種々研究を続けた結果、分画分子
量の異なる限外濾過膜を用いることにより、課題が解決
できることを見出した。

本発明に用いる限限外過膜は分画分子量が３０００以上
と１０００以下の２種のものである。

先ずε−ポリリシンを含む液（通常は培養液）を分画分
子量３０００以上の限外濾過膜で処理すると、分子量が
３０００以下の成分は限外過膜を透過し、それ以上の分
子量を持つ成分は限外濾過膜を透過しない。分画分子１
３０００以上の限外濾過膜を通過したフラクションにつ
いて分画分子量１０００以下の限外濾過膜で処理すると
、分子量が約１ｏｏｏ以下の成分は限外濾過膜を透過し
それ以上の分子量をもつ成分はこの限外濾過膜を透過し
ない。

発酵法によって得られたε−ポリリシンは、Ｌ−リシン
の直鎖ホモポリマーであり、分画分子量３０００以上の
限外濾過膜で処理する時は、膜を透過し、分画分子量１
０００以下の限外濾過膜で処理する時は、膜を透過しな
い。

このため、分子量が１０００以下である培地中の糖（炭
素源）や塩類着色成分、ア°ミノ酸等、或いは分子量が
３０００以上ある高分子成分とε−ポリリシンとを容易
に分離できる漬 本発明に用いる限外濾過膜は、基本的には分画分子量が
３０００以上と１０００以下の限外濾過膜であれば何で
も良いが、比較的好結果をもたらすものは、分画分子量
が３０００と１０００の限外濾過膜である。

限外濾過膜の材質はポリスルフォン、ポリアクリロニト
リル、ポリエーテルスルフォン、酢酸セルロース、ポリ
オレフィン等、種々あるが、本発明の実施にあたっては
、材質に制限はなく、いずれの材質のものでも用いるこ
とができる。

本発明に用いる分画分子量が３０００以上の限外濾過膜
としては例えば、フィルトロン３Ｋ（富士フィルター工
業製）、また分画分子量１０００以下の限外波過膜とし
ては例えば、フィルトロン１Ｋ（富士フィルター工業製
）が好ましいものとして挙げられる。

（発明の効果） 本発明の効果の第１は、発酵液から菌体を分離すること
なく、ε−ポリリシン含有液を取得できることである。

分画分子量３０００以上の限外濾過膜を透過しないフラ
クション及び分画分子量１０００以下を透過したフラク
ションは、そのまま発酵槽に戻すことができる。かくす
ることによってε−ポリリシン生産菌は生成物阻害を受
けることが少なくなるので、かなり長時間連続して発酵
を行うことができる。勿論ε−ポリリシンの産生に伴っ
て炭素源、窒素源が減少してくるので、減少する分だけ
連続的に或いは間歇的に補給してやることが必要である
。

本発明の第２の効果は、精製ε−ポリリシンの製造に伴
う損失が非常に小さいことである。従来法ではカチオン
交換樹脂処理工程における２５％濃縮工程で１２％、活
性炭処理工程で２４％等、かなりの損失があり、最終的
には６０％のε−ポリリシンの損失があった。

これに対し本発明法では、 ■　着色成分が分画分子量１０００以下の限外濾過膜を
大部分透過すること、 ■　ε−ポリリシンが、通過分子量１ｏｏｏ以下の限外
濾過膜を殆ど透過しないこと、 ■　分画分子：１）０００以下の限外濾過膜で処理する
時はＣ−ポリリシンの濃縮が行われるが、これは常温で
行われる為、加熱に神うロスが発生しないこと、 ■　分画分子量１０００以下の限外濾過膜で濃縮された
ε−ポリリシン含有液は着色が少ないので、極く少量の
活性炭で脱色されること、 等の理由で、８−ポリリシンの損失は、限外濾過工程で
１７％、活性炭処理工程で６％等と少なくなり、最終的
には３７％の損失しか発生しない。

本発明の第３の効果は、従来法が加熱減圧方式で濃縮す
るため熱エネルギーが必要であったが、本発明法は常温
で相変換を伴わずに濃縮することができるので、濃縮に
伴うエネルギーコストを大幅に削減することができる。

このように、本発明の工業上の利用価値は大きい。

（実施例） 以下、本発明を実施例に基づき説明するが本発明はこれ
に限定されるものではない。

実施例１ ストレプトマイセス・アルプラスを用いてミニジャー培
養を９６時間行い、得られた培養液について菌体を濾別
し、分離して上澄液（菌体分離液）２、ＯＲを得た。こ
のもののε−ポリリシン濃度は、１）．５ｇ／　１であ
った。

この菌体分離液１．０１について富士フィルター工業■
製の分画分子１３０００の限外濾過膜（商品名フィルト
ロン・ツバ（Ｆｉｌｔｒｏｎ　Ｎｏｖａ）　３　Ｋ　％
表面積７００ｃｄ）を用いて限外濾過を行った。

限外濾過条件は次の如くであった。

循環流速：　７００　ｄ／ｍｉｎ 入口圧　：　１．Ｏｋｇ／ｃｆｆｌ 出口圧　：　０．６　ｋｇ／ｃｄ 限外濾過の方法としては、ｉ、ｏ　ｚの菌体分離液が４
００ｍ１まで濃縮された時、６００　ｍノ１／１００−
１−７１゜酢酸を新たに加え、これを更に限外濃縮を行
って４００Ｗ１）まで濃縮した。この濃縮を３回行い、
透析液１．８０　Ｊを得た。この透析液のε−ポリリシ
ン濃度は５．９４ｇ／　ｌでε−ポリリシン回収率は９
３％であった。

このｉｆｆ液１．８βについて富士フィルターエ業■製
の分画分子量１０００の限外濾過膜（商品名フィルトロ
ン・ツバ（Ｆｉｌｔｒｏｎ　Ｎｏｖａ）　Ｉ　Ｋ、表面
積７００ｃａｌ）を用いて限外濾過を行った。限外濾過
条件は実施例１分画分子量３０００の限、外波過膜の場
合と同じ条件で行い、透析液１．８０７’を２５０−ま
で濃縮した。この濃縮液のε−ポリリシン濃度は３８．
３ｇ／　１でε−ポリリシン回収率は９０％であった。

この濃縮液にアンバーライトＩ　ＲＡ４０２（ＯＨ型）
を１０ｇ添加し、１時間攪拌後、濾紙を用い樹脂を吸引
濾別、除去した。濾液を６規定塩酸を用いｐＨ６，８に
中和した。得られた中和液量は２５５−でε−ポリリシ
ン濃度は３５．９ｇ／　ｌ、ε−ポリリシンの回収率は
９５．６％であった。

この中和溶液２５５−に粉状活性炭（白鷺Ａ−５０Ｗ）
４ｇを添加し、常温で１時間攪拌した後、濾紙を用いて
活性炭を吸引濾別、除去した。濾紙上の活性炭は少量の
水で洗浄し、洗浄液は濾液と合体した。合体した濾液量
は２６０　ｍで、ε−ポリリシン濃度は３３．１ｇ／　
ｌ　、活性炭処理工程におけるε−ポリリシン回収率は
９４％であった。この活性炭脱色液２６０−にメタノー
ル２６０　ｍ、続いてアセトン７５０−を攪拌しつつ徐
々に加えて、ε−ポリリシンを晶析した。生じた沈澱を
吸引濾別し、減圧乾燥した。得られた沈澱は７．４２ｇ
、白色で純度は９８．３％であった。晶析工程における
ε−ポリリシン回収率は８６．２％であった。

ε−ポリリシンの通算の回収率は６３％であった。

比較例１ 実施例１で用いた菌体分離液１．Ｏｎ！（ε−ポリリシ
ン濃度１）．５ｇ／　Ｉｔ　）を用いて次の如く、従来
法に基づく精製を行った。

菌体分離液１．ＯｆをｐＨ８，５に調整し、濾過後、弱
酸性カチオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＣ−５０Ｈ
０型）２００ＷｄニＳ　Ｖ　＝　１　（７）スヒ−）’
テ通Ｌ、ε−ポリリシンをカチオン交換樹脂に吸着させ
た。

０．２規定の酢酸溶液８００−で洗浄し、つづいて純水
８００−で水洗した。（いずれも５Ｖ−２）。洗浄終了
後０．１規定の塩酸水溶液１０００−を５Ｖ＝１でカチ
オン交換樹脂に通し、ε−ポリリシンを溶出せしめた。

溶出液は押出液を合せて１ｏｏｏ−であった。溶出液中
のε−ポリリシン量は８．６３ｇ／　ｌでε−ポリリシ
ンの回収率は７５％であった。

溶出液を苛性ソーダ液で中和してｐＨ＝６．８に調整し
た後、粉状活性炭（白鷺Ａ　−５０Ｗ）１８ｇを添加し
、常温で１時間攪拌した。活性炭を濾紙を用いて吸引濾
別、除去した。濾紙上の活性炭は洗浄し、洗浄液は濾液
と合体した。合体した濾液量は１２０〇−であり、６−
ポリリシン濃度は５．４９ｇ／　１で、活性炭処理工程
におけるε−ポリリシンの回収率は７６．３％であった
。

活性炭で脱色した液を温度３５℃、減圧下で濃縮し２０
０−とじた。この濃縮液中のε−ポリリシン濃度は２９
．０ｇ／　１で、ε−ポリリシンの回収率は８８％であ
った。

この濃縮液２００　ｄにメタノール２００　ｄ　、つづ
いてアセトン６００　ｄを攪拌しつつ徐々に加えて、ε
−ポリリシンの沈澱を析出せしめた。生じた沈澱を吸引
濾別し、減圧乾燥した。得られた沈澱物は４．８５　ｇ
、白色で、純度は９５．６％であった。晶析工程におけ
るε−ポリリシンの回収率は８０％であった。

ε−ポリリシンの通算の回収率は４０％であった。

実施例２ 前記菌株を用い、ミニジャー培養（培地量３．０１）を
行い、培養２４時間後、分画分子量３０００の限外濾過
膜（商品名フィルトロン・ツバ（ＦｉｌｔｒｏｎＮＯＶ
Ａ３　Ｋ、　　０ＰＥＮ　ＣＨＡＮＮＥＬ）、表面積７
００ｃｄ）を用い、毎時１００−の透過速度で連続的に
培養液を限外濾過した。この時の限外濾過条件は次の如
くであった。

循環流速：　８００ｍｆｆ１／ｗｉｎ 入口圧　：０．８ｋｇ／ｃｓｊ 出口圧　：０．６ｋｇ／ｃｄ 更に透過液が５００　ｄになった時点で、その透過液を
分画分子量１０００の限外濾過膜（商品名フィルトロン
・ツバ（Ｆｉｌｔｒｏｎ　Ｎ０ＶＡ）　Ｉ　Ｋ　、表面
積７００ｃＪ）を用い、透過速度毎時１００Ｗｔ１で限
外濾過を行い、透過液を培養槽に返送した。この時の限
外濾過条件は実施例１と同様にした。上記連続処理条件
で、培養を９６時間行い、分画分子量３０００の限外濾
過膜を透過し、かつ、通過分子量１０００の限外濾過膜
濃縮液５００−を得た。この溶液のε−ポリリシンの濃
度は２１．６ｇ１５００ｄであった。

この溶液を、実施例１と同様にアンバーライトＩ　ＲＡ
４０２（ＯＨ型）を用い、以後を実施例１と同様に処理
し、白色粉末１６．９ｇを得た。純度は９８．５％であ
った。

手続補正書 昭和６３年　３月２９日 特許庁長官　　小　　川　　邦　　夫　　殿１、事件の
表示　　昭和６３年特許願第４８６７２号２、発明の名
称 精製ε−ポリリシンの製造法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 〒５３０大阪府大阪市北区中之島三丁目６番３２号（２
０？）チッソ株式会社 代表者　野　　木　　貞　　雄 ４ｏ代理人 住所■１０５東京都港区西新橋−丁目１０番１号正直屋
ビルディング６階　電話（５０４）　０７１７番（代表
）６、補正の内容 （１）　　　明細書第５頁第９行目の「限限外過膜」を
「限外濾過膜」に訂正し、 （２）　　　明細書第５頁第１３行目の「分子量が３０
００以下」を「分子量が３０００未満」に訂正し、 （３）　　　明細書第５頁第１３行目の「限外過膜」を
「限外濾過膜」に訂正し、 （４）　　　明細書第５頁第１５行目の「通過」を「透
過」に訂正し、 （５）　　　明細書第７頁第１９行目の「法ではカチオ
ン交換樹脂処理工程における２５％濃」を 「法では該損失がカチオン交換樹脂処理工程で２５％、
濃」に訂正し、 （６）　　　明細書第９頁第１６行目の［ＮｏｖａＪを
ｒＮＯＶＡＪに訂正し、 （７）　　明細書第１０頁第１）行目のｒＮｏνａ」を
ｒＮＯＶＡＪに訂正し、 （８）　　　明細書第１０頁第１７行目１７）　ｒ　Ｉ
　ＲＡ４０２ＣＯＨ型）」をｒ　Ｉ　ＲＡ　−４０２（
ＯＨ−型）」に訂正し、（９）　　　明細書第１２頁第
３行目の「５０Ｈ＋型）」をｒ５０（Ｈ’型））」に訂
正し、 α・　　明細書第１４頁第１４行目１７）　ｒ　Ｉ　Ｒ
Ａ４０２（ＯＨ型）」をｒ　Ｉ　ＲＡ　−４０２（ＯＨ
−型）」に訂正する。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ε−ポリリシン含有液を分画分子量３０００以上
   の限外濾過膜で処理し、透過したε−ポリリシン含有液
   を分画分子量１０００以下の限外濾過膜で処理して、透
   過しない画分を採取することを特徴とする精製ε−ポリ
   リシンの製造法。
2. （２）ε−ポリリシン含有液がε−ポリリシンを生産す
   る能力をもった微生物を培養して得られる発酵培養液で
   ある請求項１記載の製造法。
3. （３）分画分子量３０００以上の限外濾過膜がフィルト
   ロン３Ｋ（富士フィルター工業）である請求項１記載の
   製造法。
4. （４）分画分子量１０００以下の限外濾過膜がフィルト
   ロン１Ｋである請求項１記載の製造法。
5. （５）ε−ポリリシン含有液が発酵液から遠心分離或い
   は濾過の手段で菌体を分離した培養液である請求項２記
   載の製造法。