JPH01203962A - 免疫化学的測定法 - Google Patents
免疫化学的測定法Info
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- JPH01203962A JPH01203962A JP63027471A JP2747188A JPH01203962A JP H01203962 A JPH01203962 A JP H01203962A JP 63027471 A JP63027471 A JP 63027471A JP 2747188 A JP2747188 A JP 2747188A JP H01203962 A JPH01203962 A JP H01203962A
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
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-
- G—PHYSICS
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、微量な抗原または抗体を検出できる免疫化学
的測定法に関し、特に酵素免疫測定法においてイオン選
択性電極あるいはイオン感応性ＦＥＴを検出電極に用い
る免疫化学的測定法に関する。
的測定法に関し、特に酵素免疫測定法においてイオン選
択性電極あるいはイオン感応性ＦＥＴを検出電極に用い
る免疫化学的測定法に関する。
［従来の技術］
抗原−抗体反応の特異性を利用した微量の抗原必るいは
抗体の測定法として酵素免疫測定法（ＥｎＺｙｍｅ ｉ
ｍｍＵｎｏａｓｓａＶ、以下ＥＩＡと略す）が知られて
いる。
抗体の測定法として酵素免疫測定法（ＥｎＺｙｍｅ ｉ
ｍｍＵｎｏａｓｓａＶ、以下ＥＩＡと略す）が知られて
いる。
ＥＩＡの原理は次のようである。サンドイツチ法の場合
、測定すべき抗原または抗体を、それと特異的に反応す
る固定化された抗体または抗原と反応させた後、未反応
物を取除き、ざらに測定すべき抗原または抗体と特異的
に反応する酵素標識された抗体または抗原と反応させる
。その後、未反応物を取除き、抗原−抗体反応により固
定化された酵素標識抗体または抗原の割合を酵素反応の
測定から求めることにより、被測定抗原または抗体の母
を測定することができる。また、競合法の場合、測定す
べき抗原または抗体を含む溶液に所定量の標識抗原また
は標識抗体を添加し、測定すべき抗原または抗体と特異
的に反応する固定化された抗体または抗原と反応させた
後、未反応物を取除き、反応により固定化された酵素標
識抗原または抗体の割合を酵素反応の測定から求めるこ
とにより、被測定抗原または抗体の量を測定することが
できる。
、測定すべき抗原または抗体を、それと特異的に反応す
る固定化された抗体または抗原と反応させた後、未反応
物を取除き、ざらに測定すべき抗原または抗体と特異的
に反応する酵素標識された抗体または抗原と反応させる
。その後、未反応物を取除き、抗原−抗体反応により固
定化された酵素標識抗体または抗原の割合を酵素反応の
測定から求めることにより、被測定抗原または抗体の母
を測定することができる。また、競合法の場合、測定す
べき抗原または抗体を含む溶液に所定量の標識抗原また
は標識抗体を添加し、測定すべき抗原または抗体と特異
的に反応する固定化された抗体または抗原と反応させた
後、未反応物を取除き、反応により固定化された酵素標
識抗原または抗体の割合を酵素反応の測定から求めるこ
とにより、被測定抗原または抗体の量を測定することが
できる。
従来、上記したような方法で用いられてきた酵素標識さ
れた抗原または抗体を測定するための酵素活性測定の手
段としては、酵素の作用をうける基質または生成物の吸
光度や螢光の測定や、酸素電極などを用いる溶存酸素の
変化の測定、およびイオン選択性電極によるｐＨ変化の
測定等が用いられてきた。このうち、ｐＨ変化による酵
素活性測定法は、ｐＨ電極としてイオン感応性ＦＥＴ
（以下、ｌ５ＦＥＴと略す）を使用することができ、
このため、ｌ５ＦＥＴを用いた微量なサンプルを測定で
きるセンサの実現が期待されている。
れた抗原または抗体を測定するための酵素活性測定の手
段としては、酵素の作用をうける基質または生成物の吸
光度や螢光の測定や、酸素電極などを用いる溶存酸素の
変化の測定、およびイオン選択性電極によるｐＨ変化の
測定等が用いられてきた。このうち、ｐＨ変化による酵
素活性測定法は、ｐＨ電極としてイオン感応性ＦＥＴ
（以下、ｌ５ＦＥＴと略す）を使用することができ、
このため、ｌ５ＦＥＴを用いた微量なサンプルを測定で
きるセンサの実現が期待されている。
［発明が解決しようとする課題］
しかしながら、グルコースオキシダーゼを標識酵素に用
いる免疫化学的測定法において、イオン選択性電極また
はイオン感応性ＦＥＴを検出電極として用いた場合、免
疫反応によりグルコースオキシダーゼで標識された抗体
または抗原が検出電極に固定化された後、グルコースオ
キシダーゼにより酸化されるグルコースを含む酵素活性
測定溶液に上記検出電極を浸して標識酵素の邑を測定し
た場合、ｐＨ変化が遅いと共に、その値も小さく、実用
化するには不十分なものであった。
いる免疫化学的測定法において、イオン選択性電極また
はイオン感応性ＦＥＴを検出電極として用いた場合、免
疫反応によりグルコースオキシダーゼで標識された抗体
または抗原が検出電極に固定化された後、グルコースオ
キシダーゼにより酸化されるグルコースを含む酵素活性
測定溶液に上記検出電極を浸して標識酵素の邑を測定し
た場合、ｐＨ変化が遅いと共に、その値も小さく、実用
化するには不十分なものであった。
本発明の目的は、酵素免疫測定においてイオン選択性電
極やｌ５ＦＥＴを検出電極とする場合に、十分大きなＩ
）Ｈ変化が得られ、かつ速いスピードで測定することを
可能にする高感度な免疫化学的測定法を提供することに
ある。
極やｌ５ＦＥＴを検出電極とする場合に、十分大きなＩ
）Ｈ変化が得られ、かつ速いスピードで測定することを
可能にする高感度な免疫化学的測定法を提供することに
ある。
［課題を解決するための手段］
本発明は、酵素標識抗原または抗体を用いた酵素免疫測
定法において、標識抗原あるいは標識抗体として、少な
くともグルコースオキシダーゼおよびグルコノラクトナ
ーゼの２種類の酵素で標識された抗原あるいは抗体を用
いてなることを特徴とする免疫化学的測定法である。
定法において、標識抗原あるいは標識抗体として、少な
くともグルコースオキシダーゼおよびグルコノラクトナ
ーゼの２種類の酵素で標識された抗原あるいは抗体を用
いてなることを特徴とする免疫化学的測定法である。
［作用］
本発明において、グルコースオキシダーゼおよびグルコ
ノラクトナーゼで標識された抗体あるいは抗原は、免疫
反応により検出電極表面に固定化された後、グルコース
溶液に浸されることにより次の反応を引起す。
ノラクトナーゼで標識された抗体あるいは抗原は、免疫
反応により検出電極表面に固定化された後、グルコース
溶液に浸されることにより次の反応を引起す。
グルコースオキシダーゼ
グルコース＋０２□
一→グルコノラクトン十Ｈ２Ｏ２
グルコノラクトナーゼ
グルコノラクトン グルコン酸グルコ
ースオキシダーゼだけで標識した場合、グルコースがグ
ルコースオキシダーゼにより酸化されて生成したグルコ
ノラクトンは、グルコン酸に変化するのに時間がかかる
。このためｐＨ電極で検出する方法では、ｐＨ変化が緩
慢で小さな信号しか得られなかった。一方、グルコース
オキシダーゼとグルコノラクトナーゼで標識した場合は
、グルコースがグルコースオキシダーゼにより酸化され
て生成したグルコノラクトンは、直らにグルコノラクト
ナーゼにより加水分解されてグルコン酸になり、大きな
Ｉ）Ｈ変化を引起す。このため、イオン選択性電極やｌ
５ＦＥ丁で検出する場合も、大きな信号が得られる。
ースオキシダーゼだけで標識した場合、グルコースがグ
ルコースオキシダーゼにより酸化されて生成したグルコ
ノラクトンは、グルコン酸に変化するのに時間がかかる
。このためｐＨ電極で検出する方法では、ｐＨ変化が緩
慢で小さな信号しか得られなかった。一方、グルコース
オキシダーゼとグルコノラクトナーゼで標識した場合は
、グルコースがグルコースオキシダーゼにより酸化され
て生成したグルコノラクトンは、直らにグルコノラクト
ナーゼにより加水分解されてグルコン酸になり、大きな
Ｉ）Ｈ変化を引起す。このため、イオン選択性電極やｌ
５ＦＥ丁で検出する場合も、大きな信号が得られる。
［実施例コ
以下本発明の一実施例について図面を参照して詳細に説
明する。
明する。
本実施例では人免疫グロブリンＧ（以下、人ＩｇＧと略
す）を検出する場合について述べる。グルコースオキシ
ダーゼおよびグルコノラクトナーゼをそれぞれ５ｍｇお
よび１０ｍｇを、１．２５％グルタルアルデヒドを含む
０．２Ｈリン酸緩衝液（ｐＨ６，８） ０．３ｄ中に溶
かし、室温で２０時間放置した後、セファデックスカラ
ムを用い、０．１５８塩化ナトリウム（Ｎａ（、ｅ＞で
平衡化、溶出する。その後、グルコースオキシダーゼお
よびグルコノラクトナーゼ溶液１ｍｌを、抗人ヒツジＩ
ｇＧ５ｍｇを含む０．１５ＨのＮａ［、ｅ溶液１．０ｍ
および１Ｈ炭酸ソーダ緩衝液（１）Ｈ９，５）０．１戒
と混合し、４℃で２時間放置した後、生理食塩緩衝液に
対し透析を行う。以上のようにしてグルコースオキシダ
ーゼおよびグルコノラクトナーゼで標識された抗人ヒツ
ジ１ｇＧが得られた。
す）を検出する場合について述べる。グルコースオキシ
ダーゼおよびグルコノラクトナーゼをそれぞれ５ｍｇお
よび１０ｍｇを、１．２５％グルタルアルデヒドを含む
０．２Ｈリン酸緩衝液（ｐＨ６，８） ０．３ｄ中に溶
かし、室温で２０時間放置した後、セファデックスカラ
ムを用い、０．１５８塩化ナトリウム（Ｎａ（、ｅ＞で
平衡化、溶出する。その後、グルコースオキシダーゼお
よびグルコノラクトナーゼ溶液１ｍｌを、抗人ヒツジＩ
ｇＧ５ｍｇを含む０．１５ＨのＮａ［、ｅ溶液１．０ｍ
および１Ｈ炭酸ソーダ緩衝液（１）Ｈ９，５）０．１戒
と混合し、４℃で２時間放置した後、生理食塩緩衝液に
対し透析を行う。以上のようにしてグルコースオキシダ
ーゼおよびグルコノラクトナーゼで標識された抗人ヒツ
ジ１ｇＧが得られた。
次に、得られた酵素標識された抗人ヒツジＩｇＧを用い
て人１ｑＧの濃度を次のようにして測定した。
て人１ｑＧの濃度を次のようにして測定した。
まず、第１図（ａ）に示すように抗人ヒツジＩｇＧが表
面に固定化されたｌ５ＦＥＴ １を、人１（ＩＧを含む
被測定溶液２に５分間浸し、抗原−抗体反応を行わせる
。更に、このｌ５ＦＥＴ １を第１図（ｂ）に示すよう
に、上記グルコースオキシダーゼおよびグルコノラクト
ナーゼで標識された抗ＡヒツジＩｉＧ溶液３に５分間浸
す。その後、第１図（Ｃ）に示すように上記ｌ５ＦＥＴ
１をグルコース濃度５００ｍｇ／ｄｊ！の０．０１ｍ
ｔ４． ｐＨ６，８リン酸緩衝液４に浸し、ｌ５ＦＥＴ
１の表面に固定化された膜中のＤＩ変化を測定した。
面に固定化されたｌ５ＦＥＴ １を、人１（ＩＧを含む
被測定溶液２に５分間浸し、抗原−抗体反応を行わせる
。更に、このｌ５ＦＥＴ １を第１図（ｂ）に示すよう
に、上記グルコースオキシダーゼおよびグルコノラクト
ナーゼで標識された抗ＡヒツジＩｉＧ溶液３に５分間浸
す。その後、第１図（Ｃ）に示すように上記ｌ５ＦＥＴ
１をグルコース濃度５００ｍｇ／ｄｊ！の０．０１ｍ
ｔ４． ｐＨ６，８リン酸緩衝液４に浸し、ｌ５ＦＥＴ
１の表面に固定化された膜中のＤＩ変化を測定した。
第２図は、人１０Ｇの濃度が１０．２０および３０μＨ
の場合に対する、免疫反応後にｌ５ＦＥＴがグルコース
溶液に浸された時の応答特性を示す図である。
の場合に対する、免疫反応後にｌ５ＦＥＴがグルコース
溶液に浸された時の応答特性を示す図である。
ｌ５ＦＥＴの出力は、ソースフォロワ−回路により測定
した。第２図に示すように、ｌ５ＦＥＴの出力は、時間
と共に増加した。ｌ５ＦＥＴをグルコース溶液に浸して
１分後のｌ５ＦＥＴの出力と人１（ＩＧ ｓｍとの関係
を第３図に示す。
した。第２図に示すように、ｌ５ＦＥＴの出力は、時間
と共に増加した。ｌ５ＦＥＴをグルコース溶液に浸して
１分後のｌ５ＦＥＴの出力と人１（ＩＧ ｓｍとの関係
を第３図に示す。
本実施例かられかるように、グルコースオキシダーゼと
共にグルコノラクトナーゼを標識すると、免疫反応後の
ｌ５ＦＥＴはグルコース浸漬時に短時間で大きな出力が
得られ、高感度な測定ができるようになった。
共にグルコノラクトナーゼを標識すると、免疫反応後の
ｌ５ＦＥＴはグルコース浸漬時に短時間で大きな出力が
得られ、高感度な測定ができるようになった。
なお、本実施例では、グルコースオキシダーゼとグルコ
ノラクトナーゼを同時に抗体と反応させ標識抗体を得た
が、グルコースオキシダーゼとグルコノラクトナーゼを
別々に抗体と反応させた後、混ビて用いることも可能で
ある。
ノラクトナーゼを同時に抗体と反応させ標識抗体を得た
が、グルコースオキシダーゼとグルコノラクトナーゼを
別々に抗体と反応させた後、混ビて用いることも可能で
ある。
［発明の効果］
以上説明したように、本発明によれば、ｌ５ＦＥＴのよ
うなポテンショメトリーによる検出電極を用い酵素免疫
センサを構成した場合においても、高感度な測定が可能
になる。これは、ポテンショメトリー型酵素免疫センサ
において、グルコースを基質に用いた場合、従来アンペ
ロメトリー型酵素免疫センサで行われたグルコースオキ
シダーゼだけで標識した抗体あるいは抗原を使用すると
、免疫反応により検出電極の表面に固定化されるグルコ
ースオキシダーゼは、グルコースをグルコノラクトンに
酸化するが、グルコノラクトンがイオン電極やｌ５ＦＥ
Ｔにより検出できるグルコン酸に変化するためには長時
間かかり、免疫センサからの出力は非常に小さくなるの
に対し、グルコースオキシダーゼと共にグルコノラクト
ナーゼも同時に標識することにより、免疫反応により検
出電極にはグルコースオキシダーゼと共にグルコノラク
トナーゼも固定化され、グルコースオキシダーゼにより
酸化されてグルコノラクトンになったグルコースは、す
みやかに加水分解されてグルコン酸になり、短時間で大
きなｐＨ変化を引起し、イオン電極やｌ５ＦＥＴを使用
する場合にも高感度な測定が可能になる。
うなポテンショメトリーによる検出電極を用い酵素免疫
センサを構成した場合においても、高感度な測定が可能
になる。これは、ポテンショメトリー型酵素免疫センサ
において、グルコースを基質に用いた場合、従来アンペ
ロメトリー型酵素免疫センサで行われたグルコースオキ
シダーゼだけで標識した抗体あるいは抗原を使用すると
、免疫反応により検出電極の表面に固定化されるグルコ
ースオキシダーゼは、グルコースをグルコノラクトンに
酸化するが、グルコノラクトンがイオン電極やｌ５ＦＥ
Ｔにより検出できるグルコン酸に変化するためには長時
間かかり、免疫センサからの出力は非常に小さくなるの
に対し、グルコースオキシダーゼと共にグルコノラクト
ナーゼも同時に標識することにより、免疫反応により検
出電極にはグルコースオキシダーゼと共にグルコノラク
トナーゼも固定化され、グルコースオキシダーゼにより
酸化されてグルコノラクトンになったグルコースは、す
みやかに加水分解されてグルコン酸になり、短時間で大
きなｐＨ変化を引起し、イオン電極やｌ５ＦＥＴを使用
する場合にも高感度な測定が可能になる。
第１図は、本発明の方法によって抗ＡヒツジＩｇＧが表
面に固定化されたｌ５ＦＥＴを用いて人１０Ｇを測定す
る手順を示す説明図、第２図は免疫反応後のｌ５ＦＥＴ
がグルコース溶液に浸された時の応答特性を示す図、第
３図はｌ５ＦＥＴの出力と人Ｉ（ＩＧ濃度との関係を示
す図である。 １・・・ｌ５ＦＥＴ ２・・・被測定溶液 ３・・・標識抗ＡヒツジＩｇＧ溶液 ４・・・リン酸緩衝液 ５・・・参照電極
面に固定化されたｌ５ＦＥＴを用いて人１０Ｇを測定す
る手順を示す説明図、第２図は免疫反応後のｌ５ＦＥＴ
がグルコース溶液に浸された時の応答特性を示す図、第
３図はｌ５ＦＥＴの出力と人Ｉ（ＩＧ濃度との関係を示
す図である。 １・・・ｌ５ＦＥＴ ２・・・被測定溶液 ３・・・標識抗ＡヒツジＩｇＧ溶液 ４・・・リン酸緩衝液 ５・・・参照電極
Claims (1)
- （１）酵素標識抗原または抗体を用いた酵素免疫測定法
において、標識抗原あるいは標識抗体として、少なくと
もグルコースオキシダーゼおよびグルコノラクトナーゼ
の２種類の酵素で標識された抗原あるいは抗体を用いて
なることを特徴とする免疫化学的測定法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63027471A JP2638877B2 (ja) | 1988-02-10 | 1988-02-10 | 免疫化学的測定法 |
| DE89301237T DE68912151D1 (de) | 1988-02-10 | 1989-02-09 | Elektrochemische Sensoren für immunologische Testverfahren. |
| EP19890301237 EP0328380B1 (en) | 1988-02-10 | 1989-02-09 | Electrochemical sensors in immunological measurement |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63027471A JP2638877B2 (ja) | 1988-02-10 | 1988-02-10 | 免疫化学的測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01203962A true JPH01203962A (ja) | 1989-08-16 |
| JP2638877B2 JP2638877B2 (ja) | 1997-08-06 |
Family
ID=12222028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63027471A Expired - Lifetime JP2638877B2 (ja) | 1988-02-10 | 1988-02-10 | 免疫化学的測定法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0328380B1 (ja) |
| JP (1) | JP2638877B2 (ja) |
| DE (1) | DE68912151D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008102639A1 (ja) * | 2007-02-20 | 2008-08-28 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | グルコースの電気化学的定量方法、グルコース脱水素酵素組成物、及び、グルコース測定用電気化学センサー |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2591641B2 (ja) * | 1988-02-19 | 1997-03-19 | 株式会社クラレ | 微量アナライト物質の測定方法及び測定装置 |
| DE4028086A1 (de) * | 1990-09-05 | 1992-03-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Stabile 6-phosphogluconolactonase, verfahren zu deren gewinnung sowie verwendung des enzyms zur bestimmung |
| DE4216980C2 (de) * | 1992-05-19 | 1994-04-21 | Eppendorf Geraetebau Netheler | Immunosensorisches Nachweisverfahren |
| US5427912A (en) * | 1993-08-27 | 1995-06-27 | Boehringer Mannheim Corporation | Electrochemical enzymatic complementation immunoassay |
| AU2949795A (en) * | 1994-12-19 | 1996-07-10 | Boehringer Mannheim Corporation | Competitive binding assays having improved linearity |
| US6262264B1 (en) | 1998-06-01 | 2001-07-17 | Roche Diagnostics Corporation | Redox reversible imidazole osmium complex conjugates |
| US6740215B1 (en) | 1999-11-16 | 2004-05-25 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Biosensor |
Family Cites Families (2)
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|---|---|---|---|---|
| GB8314523D0 (en) * | 1983-05-25 | 1983-06-29 | Lowe C R | Diagnostic device |
| GB8406955D0 (en) * | 1984-03-16 | 1984-04-18 | Serono Diagnostics Ltd | Assay |
-
1988
- 1988-02-10 JP JP63027471A patent/JP2638877B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-02-09 DE DE89301237T patent/DE68912151D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-02-09 EP EP19890301237 patent/EP0328380B1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008102639A1 (ja) * | 2007-02-20 | 2008-08-28 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | グルコースの電気化学的定量方法、グルコース脱水素酵素組成物、及び、グルコース測定用電気化学センサー |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0328380A2 (en) | 1989-08-16 |
| EP0328380A3 (en) | 1990-06-27 |
| EP0328380B1 (en) | 1994-01-12 |
| JP2638877B2 (ja) | 1997-08-06 |
| DE68912151D1 (de) | 1994-02-24 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |