JP3848416B2 - 質量感受性バイオセンサー - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は診断及び分析の過程において、特に診断に関連する特異的結合パートナーの免疫化学的検出のために使用する圧電センサーに関する。
圧電センサー自体は例えばDickert等の記述（Chemie in unserer Zeit（今日の化学）（1994年），28巻（３号），147〜152ページ）から既知である。そのようなバイオセンサーは例えば米国特許第４,２３６,８９３号及び４,７３５,９０６号にも記述されている。
【０００２】
診断的に関連する分子（被分析物質）の検出に使用することができるようなバイオセンサーは、一般に検出される分子に特異的な結合パートナーでコートされており、それによりこれらの分子を選択的に結合することができる表面を持つ変換器からなる。圧電石英結晶が通常変換器として使用される。石英結晶が対応する電子回路に組み込まれると、それは特定の共振周波数で共振する。そこで検出される分子が蓄積されると、共振周波数は変化する。そのような電子回路は例えばＤＥ−Ａ ３９ ２０ ０５２の記述から当業者に知られている。
【０００３】
これらの既知のバイオセンサーは既に上に述べた目的を部分的には達成している。しかしながら、使用される方法例えば抗体がシラン誘導体により石英表面に結合される方法の場合、一方で、抗体を石英表面に結合する方法は極めて手がかかり且つ再現性に乏しく、他方、検出される抗原と抗体との間の結合を破壊し、そして結合した抗原を分離する意図で反応物溶液で処理することによりセンサー表面を再使用可能にするための方法はそれ自体再現性に乏しく、そしてセンサー表面上で抗体の抑制されない破壊という結果になることが分かっている。
【０００４】
Davis等の報告書（Anal.Chem.(1989年)，61巻（11号），1227〜1230ページ）は変換器に金をコートし、この層にプロテインＡを結合することが可能であると説明している。これにより、プロテインＡは診断的に関連する分子の検出のため抗体と可逆的に結合することができる。著者自身が説明しているように、プロテインＡコーティングはシグナルを強く変更し、測定を全部にわたって妨害する。従って、本発明の目的は特異的結合パートナーでコートすることが簡単であり、同時に特異的反応が起こった後簡単で信頼性をもって再生することができる分析及び診断の過程に使用するバイオセンサーを提案することである。
【０００５】
本発明により、この目的はセンサーを貴金属好ましくは金でコートし、そして特異的結合パートナーをこのコーティングに結合しうることによって達成される。特異的結合パートナーはこのようにコートしたバイオセンサーから、例えばＤＥ ４４ ３６ ９１０に開示された試薬を使用して分離することができる。
【０００６】
変換器の態様又は被分析物質の蓄積による変化が測定シグナルに変換される仕方は本発明にとって本質的なことではない。本発明は二つの手動的方法、例えばセンサーを試料に浸漬する方法、及び自動分析器による方法に使用することができる。
【０００７】
原則として、本発明の方法は次のように実行することができる。すなわち、適当な電子回路（例えば Sensotec 社が販売する）に組み込まれた市販の金をコートした圧電結晶に測定する被分析物質に特異的な結合パートナーをコートする。そのような特異的結合パートナーは、例えばモノクローナル又はポリクローナル抗体又は抗体断片、レクチン又は抗原でよい。コーティング時間は５分〜数時間、好ましくは１０〜１２０分である。コーティング後、センサー表面を洗浄用緩衝液で洗いすすぐ。洗浄用緩衝液は好ましくは洗浄剤を含有する。この特異的コーティングには、非特異的結合を防ぐため、場合により、さらに非特異的コーティング例えばＢＳＡ又は不活性化ＰＯＤをコートしてよい。このような方法はそれ自体当業者に既知である。洗浄操作はそのような非特異的コーティングの後に行ってもよい。
【０００８】
コートしたセンサーは試料と一緒にインキュベートするが、これは例えば試料に浸漬するか又はセンサー表面に塗布して実行することが可能である。さらに別の有利な実施態様は測定を連続的流動条件下で実行しうるようにセンサー表面が設計されているそれである。それぞれのセンサーについてその適用に対してどの設計にすべきかの決定は当業者にとって容易なことである。
【０００９】
被分析物質が特異的結合パートナーと反応した結果である測定される量例えば共振周波数は電子回路を変更することにより測定される。結合した被分析物質の量は、例えば参照曲線との対比により得られる測定される量の変化から導き出すことができる。この手順は集団単位で直接測定するためにも適している。測定される量の変化を求めるため、例えば特異的結合パートナーでコートされていない参照電極を使用することができる。試料とのインキュベーション終了後、さらに洗浄操作を置くのが好都合である。試料とのインキュベーションは１〜１００分、特に５〜６０分間実行するのが有利であり、そして１０〜３０分がもっとも有利である。
【００１０】
再生はＤＥ ４４ ３６ ９１０に記述されているように実行することができる。固相として貴金属特に金を使用する場合のこの操作は、特定の還元剤又は酸化剤例えば水素化ホウ素ナトリウム又はテトラブチルアンモニウムヒドロキシドを固相として、洗浄剤を添加するか又はしないで再生のために使用する。
次の例証的具体例は本発明を説明するためであって、それに何らの制限を加えようとするものではない。
【００１１】
実施例
ヒトＩｇＥの定量的測定
支持体：
テフロン環（外径３６mm）の中にはめこんだSensotec社から入手の金をコートした圧電結晶。金表面直径：９mm，金表面積：１４mm² 。
コーティング：
抗ヒトＩｇＥ（ウサギ）ポリクローナル抗体の５０μlをセンサーに塗布する。抗体濃度は５μg／mlである。この溶液はその他にリン酸ナトリウム７５mM，NaCl ７５mM，Na₂SO₄ １００ｇ／ｌを含有する。pHは６.０である。抗体溶液は３７℃で１時間又は室温で一晩静置する。
洗浄段階：
上清を除き、センサーをそれぞれ２５０μlの洗浄用緩衝液で５回洗いすすぐ。この洗浄用緩衝液はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）５０mM及びクエン酸５０mMからなるpH７.４の溶液である。
【００１２】
後続するコーティング：
不活性化したペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）５０μlをセンサーに塗布する。ＰＯＤ濃度は１ｇ／ｌである。この溶液はその他にリン酸ナトリウム７５mM，NaCl７５mM，Na₂SO₄ １００ｇ／ｌを含有する。pHは６.０である。ＰＯＤ溶液は３７℃で１時間又は室温で一晩静置する。
洗浄段階：
上清を除き、センサーをそれぞれ２５０μlの洗浄用緩衝液で５回洗いすすぐ。この洗浄用緩衝液はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）５０mM及びクエン酸５０mMからなるpH７.４の溶液である。
【００１３】
試料のインキュベーション：
所定量のＩｇＥを含有するヒト血清５０μlをセンサーに塗布し、３７℃で３０分間インキュベートする。
洗浄段階：
上清を除き、センサーをそれぞれ２５０μlの洗浄用緩衝液（リン酸ナトリウム５mM，NaCl ８５mM，ツイーン２０１ｇ／ｌ，フェノール０.５ｇ／ｌ，pH６.５）で５回洗いすすぐ。
【００１４】
固相の再生：
２０重量％テトラブチルアンモニウムヒドロキシド溶液２５０μlをセンサーに塗布し、３７℃で１時間インキュベートする。
洗浄段階：
上清を除いた後、センサーを脱イオン水で５回洗いすすぐ。
【００１５】
２回目の再生：
１重量％NaBH₄溶液２５０μlをセンサー上で、室温で１５分間インキュベートする。この溶液はその他に２−（シクロ−ヘキサアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）５０mMを含有する。pHは１０.０である。
洗浄段階：
上清を除いた後、センサーを脱イオン水で３回そしてリン酸緩衝生理食塩水（pH７.２）で３回洗いすすぐ。
【００１６】
結果¹⁾：
１．１００IU／mlのヒトIgEの測定＝８２９ａＵ²⁾
２．１００IU／mlのヒトIgEの測定＝５７６ａＵ
３．１００IU／mlのヒトIgEの測定＝６２３ａＵ
４． ０IU／mlのヒトIgEの測定＝１９ａＵ
５．１００IU／mlのヒトIgEの測定＝７６７ａＵ
６．１００IU／mlのヒトIgEの測定(対照＝非特異的コーティング抗体)＝１４aU
1) ｎ＝２の平均
2) 任意の単位

Claims (7)

1. 第一の特異的結合パートナーを貴金属でコートされている圧電センサーである固相に直接結合すること、
   上記センサーを試料と一緒にインキュベートすること、
   試料中の被分析物質を検出すること、および、
   第一の特異的結合パートナーを試薬により固相から分離することにより固相を再生すること、
   からなる生物学的流体の試料中の被分析物質の免疫化学的検出方法。
2. 第一の特異的結合パートナーが免疫グロブリン又は免疫グロブリンの断片である請求項１記載の方法。
3. 試薬が還元剤を含有する請求項１記載の方法。
4. 試薬が酸化剤を含有する請求項１記載の方法。
5. 試薬がＮａＢＨ₄を含有する請求項１記載の方法。
6. 試薬がテトラブチルアンモニウムヒドロキシドを含有する請求項１記載の方法。
7. 貴金属が金である請求項１記載の方法。