JPH01171484A - キシロオリゴシル転移酵素の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「技術分野」 本発明は、アクレモニウム属菌による新規なキシロオリ
ゴシル転移酵素Ａの製造法に関するものであ　る。

「従来技術」 広い意味での糖転移反応は、重要な界面活性剤の一つで
ある蔗糖エステルや１．さ各°種の糖を含む医薬品の合
成において工業的に重要な反応である。

従来、こうした化学製品や医薬は、有機化学的合成法や
、それらを含む天然物からの抽出により製造されてきた
。近年、糖転移酵素を用いた合成法の開発がなされつつ
あり、プルラナーゼの逆反応を用いた、分岐サイクロデ
キストリンの合成などが注目されている。

糖転移を触媒する酵素としては、糖ヌクレオチド誘導体
を供与体とするもの、蔗糖や各種のオリゴ糖、グリコシ
ドを供与体とするものが知られており、これらの中には
、その逆反応により糖転移をおこなう糠油水分解酵素も
含まれる。このうち、供与体の得やすさから、糖ヌクレ
オチド誘導体を供与体として要求する酵素は工業的な利
用には不適当と考えられ、それ以外を供与体とする糖転
移酵素、あるいは加水分解酵素の逆反応の利用が検討さ
れている。

従来、これらの糖転移酵素を利用する転移生成物の合成
は、供与体が取得しやすいという点から蔗糖、グルコ−
１゛夏あるいはガラクトース系のグリコシド、オリゴ糖
を供与体とする系で研究開発がなされており、キシロー
ス系の利用に関する研究開発はほとんどない、また、キ
シロース系で知られている酵素による糖転移反応は、キ
シラナーゼ、キシロシダーゼの逆反応によるもののみで
、それもキシロースを一つづつ転移するキシロシル転移
のみが知られているにすぎない。

一方、植物性バイオマス中に多量に含まれいるキシラン
、あるいはキシランから調製されるキシロオリゴ糖を供
与体として、糖転移反応により有用な転移生成物を製造
できるならば、キシランのより高度な利用を可能にし、
したがって再生産可能なバイオマスの工業的利用におい
ても非常に重要な技術を提供することになる。

「目的Ｊ 本発明者らは、植物性バイオマスに多量に含まれている
キシランの高度利用という観点から、キシランおよびキ
シランから調製されるキシロオリゴ糖を供与体゛とじて
、キシロシルあるいは従来ま一２゛ ったく知られ゛ていなかったキシロオリゴシル転移によ
り、有用な転移生成物を製造することを口指し、キシロ
ース系での糖転移酵素の開発に着手した。その結果、中
温性糸状菌の一種アクレモニウム属の一菌株が、キシロ
オリゴシル転移作用をもち、かつ糖以外のアルコール類
を受容体として利用できる新規なキシロオリゴシル転移
酵素＾を生産することを見いだし本発明を完成するに至
った。

「構成」 本発明は、キシロオリゴシル転移酵素を生産するアクレ
モニウム属菌を培養し、培養物より新規なキシロオリゴ
シル転移酵素＾を採取することを特徴とする、キシロオ
リゴシル転移酵素＾の製造法に関するものである。

以下に、本発明の内容を具体的に説明する０本発明にお
いては、その例示菌株としてアクレモニウム・セルロリ
ティカスが有効に利用される。

次に、本発明において使用されるキシロオリゴ・′：１
１ シル転移酵素Ａ生産菌・の菌学的性質を示すと下記の、
１′− 通りである。　　　′ 生育：　麦芽エキス寒天培地上では生育は速く、３０’
Ｃ７日間で直径７１）ａｍに達する。集落は最初白色で
後にやや黄色味をおびる。気生菌糸は緩く盛り上がり羊
毛状を呈し、時に縄状の菌糸束を形成する。

培養後期辱さは集落裏面は桃褐色ないし赤褐色を呈する
。ツアペック寒天上でもほぼ同様な生育を示すが、気生
菌糸の盛り上がりはより少ない、生育ｐＨ範囲は３．５
〜６．０で最適ｐ旧よ４付近、生育温度範囲は１５℃〜
４３°Ｃで、最適生育温度は３０℃である。

形態：　菌糸の直径は０，５〜２．５μ霧、無色で菌糸
には隔壁が認められる。また、菌糸表面は平滑である。

分生子：　分生子形成能は非常に不安定で、ツアペック
寒天および麦芽エキス寒天培地による継代培養により容
易に消失した０分離時に１おける観察では、分生子柄は
気生菌糸側面より突出し、無色であった０分生子は亜球
形で滑面、無色で連鎖は非常に緩く分散しやすかった。

以上の菌学的・性・°質について、Ｗ、　Ｇａ＋ａｓ　
　ｒ　（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ　　ａｒｔｉｇ
ｅ　　５ｃｈｉ＋ｓｍｅｌｐｉ１ｇｅ）　　ｐ８４．　
　Ｇ、Ｆｉｓｈｅｒ編（１９７１）　ＪおよびＣ，１１
，旧ｃｋｉｎｓｏｎ　　ｒ　ＭｙｃｏｌｏｇｉｃａｌＰ
ａｐｅｒｓ　１１５巻　ｐｌＯ（１９６８）Ｊを参照し
た結果、本菌はアクレモニウム（＾ｃｒｅｍｏｎｉｕｍ
）ｒＩｔに近縁の糸状菌と考えるのが妥当であると考え
た。なお、本菌はキシロオリゴシル転移酵素の他に著量
のセルラーゼを生産するという特徴をもっており、従来
アクレモニウム属菌にはセルラーゼ生産能の高い菌が知
られていなかったことがら、本菌をアクレモニウム・セ
ルロリティカス　（Ａｃｒｅ＋ｓｏｎｉｕｍ　ｃｅｌｌ
ｕｌ。

１ｙｔｉｃｕｓ）と命名した０本菌はＦＥＲＭ　Ｐ−６
８６７として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れている。

本発明のアクレモニウム属によるキシロオリゴシル転移
酵素＾を生産するためには、通常、キシログルカン、セ
ルロー人　アビセル、キシラン、　フスマ、稲ワラ、バ
ガスなと植物性バイオマスを炭素源とし、これに窒素源
として、硝酸塩、アンモニウム塩あるいはペプトン、酵
母エキスのような無機または有機の窒素源と小量の金属
塩を含む液体または個体培地°！を用い、　２０〜４０
℃で、　２〜１５日間ｉ′ぐ・　、−； 程度、好気的に培′養される。キシロオリゴシル転移酵
素Ａは菌体外に生産される酵素であるため、液体培地の
場合は、培養後濾過あるいは遠心分離した上澄液を、そ
して個体培養の場合は培養後、水または適当な無機塩類
で抽出した液を、租酵素液として用いることができる。

！酵素液は、そのまま使用してもよいが、例えば硫安塩
析法やアセトン沈澱法など公知の方法により、酵素粉末
を得ることができる。さらに、本酵素は耐熱性であるこ
とから、この性質を利用して、ｐＨ４，９６５℃で２時
間３０分の熱処理を行うことにより、キシロオリゴシル
転移酵素Ａの活性を損なうことなく、不純物を変性沈澱
させて除くことができ、キシロオリゴシル転移酵素＾活
性の純度の高まった酵素液を簡単に調製することができ
る。このようにして得られた、キシロオリゴシル転移酵
素Ａ標品は次のような性譬を持っている。

（１）　分子量および等電０点 精製されたキシロオリゴシル転移酵素＾は、分子量５１
．ＯＱＯで等電煮碍約５．０である。

（２）　作用　　、ｉ キシロオリゴシル転移酵素Ａは、キシランおよびキシラ
ンから調製された′キシロビオース以上のキシロオリゴ
糖に作用し、これをキシロシルまたはキシロオリゴシル
供与体として、受容体のアルコール性水酸基に転移し、
キシロシルまたは、キシロオリゴシル転移生成物を生成
する。この転移作用について、キシロペンタオースの場
合を例に具体的に述べると、本供与体は該酵素によって
キシロトリオシル転移およびキシロビオシル転移を引き
起こす供与体として利用される。それぞれの転移の起こ
る確率は、キシロトリオシル転移が約８５％の確率で、
またキシロビオシル転移が約１５％の確率で起こる。そ
の他の直鎖キシロオリゴ糖について初期反応におけるキ
シロオリゴシル転移の起こる確率を、キシロペンタオー
スも含めて表−１に示した。

表−１ 表中の　Ｘ−〜×６−はそれぞれキシロシル残基からキ
シロトリオシル転移を示している。

表に示したように、キシロヘキサオース以上のキシロオ
リゴ糖を供与体としたとき、キシロトリオシル転移物以
上の転移物が生成するが、反応時間が長くなるとこれら
は再分解され、最終的にキシロビオシル転移物およびキ
シロトリオシル転移物を与える。

本酵素は、基質オリゴ糖の濃度が１χという低いル以上
のオリゴ糖残基を受容体のアルコール性水酸基に転移で
きる。このような作用をもつ糖転移酵素はこれまでまっ
たく知られていなかったものであり、本発明による開示
が最初のものである。

そこで、本酵素をキシロオリゴシル転移酵素＾と命名し
た。

（３）供与体 供与体としてはキシロビオース以上のキシロオリゴ糖お
よびキシランが利用できるが、キシロテトラオース以上
のキシロオリゴ糖およびキシランを供与体としたとき転
移活性が充分となる。

（４）受容体 受容体としては、キシロビオース以上のキシロオリゴ糖
が利用でき、これらは供与体としても働くので、これら
を受容体とすると、事実上オリゴ糖のキシロシド結合の
再配置、いわゆる、結合の不均化がおこる。キシロース
、グルコースなとの単糖類は、受容体として適していな
い、また、蔗糖、マルトースなど、キシロース系以外の
オリゴる糖量外の各種アルコール類のうち、水溶性およ
び微水溶性のアルコール類は、受容体となり、その水酸
基に対してキシロオリゴシル転移が起こり、キシロオリ
ゴ糖誘導体を生成する。

（５）作用ｐＨおよび最適作用ρ） 本酵素の作用ｐｆｌ範囲は、４５℃で１ｏ分間作用させ
たとき第１図ａに示したように、２１１３〜６であり、
最適作用ｐＨは約５に認められた。

（６）安定ＰＨ範囲 クエン酸−リン酸塩Ｍ衝液中で、２５℃２４時間放置し
たときの安定ｐＨ範囲は、第１図すに示したように、約
ｐＨ２，５〜８．５であった。

（７）作用温度範囲および最適作用温度０．１駕キシロ
テトラオースを供与体および受容体として用い、ｐＨ４
，９で１ｏ分間作用させたとき、第２図ａに示したよう
に、約９０℃までの高温まで転移活性が認められたが、
最適作用温度は８０’Ｃであっり、一方、キシロオリゴ
糖以外のアルコール類を受容体と口上用いたときは、第
２図すに示したように作用温度の低下がおこり、５０％
プロピルアルコール存在下では、５５℃まで作用し、ｆ
ｋ３１！！作用温度は５０℃であった。　　− （８）熱安定性 キシロオリゴシル転移酵素Ａを０．１Ｍ酢酸ｙＩ街液（
ｐＨ４，９）のもとで、各温度で１時間加熱処理した残
存活性は、第３７　ａに示したように、７０℃まではほ
とんど失活せず、７５°Ｃで約４ｏχそして８５°ｃ、
１時間の加熱で約９５％が活性を失った。また、５０％
　ｎ−プロピルアルコール存在下、ｐＨ４，９で加熱処
理した場合は、第３図すに示したように、４５°Ｃまで
はほとんど失活せず、５５℃で約２５％、そして７０’
Ｃ１１時間の加熱で約９５瓢が活性を失った。

（９）阻害剤 各種金属イオンのうちで、ｌｓＭ以上の水銀イオンおよ
び銅イオンにより、本酵素は強く阻害された。

（１０）精製法 本酵素は培養Ｐ液を、６５℃２時間３０分加熱処理し、
含まれる不純タンパク質を変性させ生じた沈澱を遠心分
離により除・□−いた後、ＤＥＡＥ−トヨバール、陰イ
オン交換体ｐｎ′Ｅ’　９４のカラムをもちいたイオン
交換および吸着クロマトグラフィー、さらにバイオゲル
＾０．５−カラムによるゲルが過により、ディスクゲル
電気泳動的に均一にまで分離精製できた。

（１１）活性測定法 本酵素は、キシロオリゴ糖を受容体および供与体として
転移をおこなうことから、キシランから調製した、キシ
ロテトラオースの０．Ｂ水溶液１００μｍ　（ｐＨ４，
９＞に対して、適量の酵素を添加し全量を１５０μｌと
し、４５℃で１０分間反応させ、生成するキシロペンタ
オース以上の転移生成物を、リクロソルブＮ１１２カラ
ムをもちいた高速液体クロマトグラフィーにより分離定
量して活性を求めた。この条件で、１分間に１μｇのキ
シロペンタオース以上のキシロオリゴ糖を生成する酵素
量を１単位とした。

「効果」 以上のとおり、本発明に開示した新規なキシロオリゴシ
ル転移酵素Ａは、キシランから調製されるキシロオリゴ
糖あるいはキシランを供与体としてキシロオリゴシル転
移をおこなう、新規な酵素であり、また５０χアルコー
ル中で安定に作用しキシロオリゴ糖誘導体を生成すると
いう有用な性質をもつものである。そして、このように
生成したキシロオリゴ糖誘導体は、親水性の糖部分と疎
水性の修飾部分をもつことから界面活性作用をもつもの
が多くあると推定され、キシランからこれまで考えられ
なかった有用なキシロオリゴ糖誘導体を酵素反応により
製造する道をｔＷＩいたものである。この意味において
本発明は、キシランの利用分野に新しい技術的進歩をも
たらしたものである。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ セルロース４％、ペプトンＩＸ、硝酸カリウム０．６ｘ
、塩化カリウム０．１５Ｌ　　ｉＪＥ酸マグネシウム０
．１２Ｘ、　　Ｑ酸−カリウム１．２ｘおよび硫酸亜鉛
、硫ｌ！（ｆ銅、Ｍ酸ｖ　７　カフ’ｔ　ソｉｔ　（’
れ０．００１％含む培地（ｔＩｌｌ　４．０＞２０＋＊
Ｉ８６７）を接種し、３０℃で６日間通気培養した。培
養後遠心分離により除菌し、得られた上澄液についてキ
シロオリゴシル転移酵素＾活性を測定した結果。

培養液１ｍｌ当り２２０単位であった。

実施例２ 実施例１において、炭素源をセルロースに代えて、キシ
ログルカン（大日本製薬製　グリロイド３３）　４Ｋを
添加した培地に、アクレモニウム・セルロ６ティカス（
ＦＥＲＮ　Ｐ−６８６７）を接種し３０℃で８日間通気
培養した。遠心分離した上澄液中のキシロオリゴシル転
移酵素Ａ活性は、培養液１１当り１２００単位であった
。

この培養上澄液のＰＨを４．９に調製して、６５℃２時
間３０分加熱処理した後、生じた沈澱を遠心分離により
除き、キシロオリゴシル転移酵素Ａｔ１Ｉｉ性をもつ酵
素標品を得な、キシロオリゴシル転移酵素Ａの回収率は
、９２．４瓢であった。　′ 実施例３ 実施例２で得た熱処理酵素標品を、濃縮、脱塩ＩＪＩＤ
ＨＡＥ−）ヨパール　Ｍ６５０および陰イオン交換体　
ＰＢＥ　９４ラムによりイオン交換クロマトグラフィー
をおこない活性画分を得た。この活性画分をさらにバイ
オゲルＡ０４５■カラムによるゲルー過をおこないキシ
ロオリゴシル転移酵素＾を精製した。精製酵素はディス
ク電気泳動的に均一であり、活性の収率は培養上清にた
いして２２％であった。また、凍結乾燥酵素標品１■ｇ
あたりのキシロオリゴシル転移酵素Ａ活性は、６１単位
であった。

実施例４ 実施例３で得られた精製酵素０．５単位を、ｌχキシロ
トリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース
およびキシロヘキサオースに６０℃１５分間および２時
間作用させ、反応生成物をバイオゲルＰ−２カラムによ
り分析した。第４図ａに示すように、１５分の初期反応
において、キシロトリオースからはキシロテトラオース
が、キシロテトラオースかオースからはキシロノナオー
スおよびキシロデカオースが主たる転移生成物として得
られ、本酵素がキシロオリゴシル転移を触媒しているこ
とが示された。さらに、反応時間２時間では、第４図す
に示したように、転移反応が進み、加えた基質より大き
な重合度をもつキシロウンデカオース以下の多数の転移
生成物が生成し、分子間糖転移反応がおこっていること
が示された。

実施例５ 実施例３で得られた精製酵素０．５単位を、１πキシロ
テトラオースおよび炭素数１からｌＯまでの直鎖アルキ
ルアルコールをそれぞれ２５％含む反応液中で４５℃、
２時間反応させ、転移生成物をリクロソルプＮｌｈカラ
ムをもちいた高速液体クロマトグラフィーにより分析し
た結果、キシロテトラオースに対する収率が、表−２に
示したような収率でアルキル化キシロビオースが得られ
た。

表−２ 実施例６ 実施例３で得られた精製酵素０，５単Ｃ◇を、ｌχキシ
ロテトラオースおよび炭素数２からｌＯまでの両末端に
水酸基を持つ直鎖アルキルジオールをそれぞれ果、キシ
ロテトラオースに対する収率が、表−３に示したような
収率でそれぞれのジオールからアルキル基の末端に水酸
基をもった、アルキル化キシロビオースが得られた。

表−３ 実施例７ 実施例３で得られた精製酵素０．５単位を、１ｘキシロ
テトラオースおよび５ｅｅ−ブチルアルコールを２移生
成物を−１し語例５と同様に分析した。その結果、キシ
ロテトラオースに対する収率が２６％で５ｅｅ−ブチル
アルコールの水酸基にキシロビオースの転移した転移物
が得られた。

実施例８ 実施例３で得られた精製酵素０．５単位を、１！キシロ
テトラオースおよびベンジルアルコールを２５χ含む反
応液中で、４５℃、２時間反応させた後、転移生成物を
実施例５と同様に分析した。その結果、キシロテトラオ
ースに対する収率が３２χでベンジルアルコールの水酸
基にキシロビオースの転移した転移生成物が得られた。

実施例９ 実施例５のキシロテトラオースの代わりに、キシロペン
タオースをもちいて同様な反応を行った結果、アルキル
化キシロビオースのほかに、アルキル化キシロトリオー
スも生成した。

ラン（大麦由来）および２５１ｍ−プロピルアルコール
を含む反応液中で、４５℃、１８時間反応させた後、転
移生成物を実施ｇ４５と同様に分析した。その結果、キ
シランに対する収率が８駕でプロピルアルコールの水酸
基にキシロビオースの転移した転移生成物が得られた。

　　　−

【図面の簡単な説明】

第１図はアクレモニウム・セルロリティカス（ＦＥＲＮ
　Ｐ−６８６７）の生産する、キシロオリゴシル転移酵
素＾の最適作用ｐＨ（ａ　）、ｐＨ安定範囲（ｂ）をそ
れぞれ示している。 第２図は　アクレモニウム・セルロリティカス（ＦＥＢ
Ｎ　Ｐ−６８６７）の生産する、キシロオリゴシル転移
酵素Ａの、酢酸緩衝液中（ａ）、および５０％　ｎ−プ
ロピルアルコール中（ｂ）での最適作用温度を示してい
る。 第３図は、アクレモニウム・セルロリティカス（ＦＦ、
ＲＭ　Ｐ−６８６７）の生産するキシロオリゴシル転移
酵素＾の、酢酸緩衝、液−１（ａ＞、および５０％ｎ−
プロピルアルコール中（ｂ）での熱安定性を示している
。 第４図は、キシロトリオース（×３）からキシロヘキサ
オース（Ｘ６）を供与体および受容体として１５分間（
ａ）および２時間（ｂ）キシロオリゴシル転移酵素と反
応させたときの、反応生成物のバイオゲルＰ−２による
ゲルー過分析の溶出パターンを示している８図の上部に
示したｌ〜１２はキシロオリゴ糖の重合度を示し、また
Ａ〜Ｅは１５分間反応における主要な転移生成物を示し
、それらがキシロテトラオースからキシロデカオースで
あることを示している。 特許出願人　工業技術院長　飯塚　幸三第１図 ｐＨ 第２図 反応温度（”Ｃ） 第３図 処理温度（”Ｃ） 図面の浄書 溶出液量（ｍｌ） 官庁出願 手続補正書く方式） ％式％ １、事件の表示　　　昭和６２年特許願第３２８４６８
号２、発明の名称 キシロオリゴシル転移酵素の製造法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　　所　　東京都千代田区霞が関１丁目３番１号氏　
　名　　（１１４）工業技術院長　飯　塚　幸　三４、
指定代理人　　〒３０５

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. キシロオリゴシル転移酵素Ａ生産能を有するアクレモニ
   ウム属菌を培養し、培養物よりキシロオリゴシル転移酵
   素Ａを採取することを特徴とするキシロオリゴシル転移
   酵素Ａの製造法。