JPH01165525A

JPH01165525A - レトロウイルス感染症治療および予防用薬剤

Info

Publication number: JPH01165525A
Application number: JP62324869A
Authority: JP
Inventors: Shinichi Furukawa; 真一古川; Shigeki Kuwata; 茂喜桑田; Yukio Tokiyoshi; 時吉　幸男; Yoichi Ogata; 洋一緒方
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1987-12-21
Filing date: 1987-12-21
Publication date: 1989-06-29

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】り粟上辺且■血１本発明は、レトロウィルスによる感染症を治療または予
防するための薬剤に間し、特に、ヒト免疫不全ウィルス
（ＨＩ　Ｖ）に起因するエイズ（ＡＩＤＳ）の治療およ
び予防に期待てきる新規な薬剤に関する。

今世紀最大の奇病と形容され、注目を？谷びている後天
性免疫不全症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　
ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ：Ａ　Ｉ　Ｄ
　Ｓ　）はレトロウィルスに属するヒト免疫不全ウィル
ス（ＨＩ　Ｖ）に起因するウィルス性疾患である。この
疾患は、１９８１年アメリカＣＤＣの週報に、ロスアン
ゼルスの男性同性愛者５人にカリニ肺炎が発症したこと
に端を発する（Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓ
ｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ：　ＭＭＷＲ，３０２５０１９８１
）。その後、この病気は、またたく間に世界中に広がり
、世界保険機構（’ＩＩＶＨＯ）の集計によれば、１９
８７年８月１２日時点においてすてに１２２力国に発生
が認められ、患者総数は６万人を越している。わが国に
おいても１９８７年９月４日時点で５０人の患者が確認
され、そのうち２８人はすでに死亡している。ＡＩＤＳ
が、このように急速に世界中に広がりをみせているにも
かかわらず、木屑の予防法はほとんど確立されていない
。木屑予防のためのワクチン開発の研究はさかんに行わ
、れてはいるが、ＨＩＶ（Ｄ盟が、少なくともＨＩＶ−
１，ＨＩＶ−２の２つは存在すること、さらには、本ウ
ィルスがインフルエンザウィルス以上の速度で変異して
いることなどがワクチン開発の実用化を困難にしている
。世界の主たるＡＩＤＳ学者は、今後新たなＨＩＶの型
が発見される可能性を否定していない。

このように、ＡＩ　ＤＳ制圧の手段として、ワクチンに
よる対処は極めて困難であると考えられるので、抗ＨＩ
Ｖ剤による治療又は予防的治療法が期待されている。Ａ
ＩＤＳ患者数の急激な増加の背景にはｒＡＩＤｓ予備群
ｊとも言われる多数の未発症ＨＩＶ感染者（キャリア）
の存在がある。

これらキャリアをいかに発症させないかが、ＡＩＤＳ対
策上、重要な課題である。抗ＨＩＶ剤はまさにこの命題
にかなうものであり、その開発が強く望まれている。

抗ＨＩＶ剤の投薬は、ＨＩＶ感染症の特性上、連続的な
頻回投与によって実施されることが考えられる。したが
って、開発される抗ＨＩＶ剤は、抗ＨＩＶ作用はもちろ
んのこと、生体に対して副作用を示さないという条件を
具備しなければならない。このような意味において、生
体由来物質が抗ＨＩＶ作用を有するとすれば、それらは
この条件にかなう特に望ましいものと考えられる。

従来豊孜韮抗ＨＩＶ剤として、唯一実用化されているものとしてア
ジドチミジン（ＡＺＴ）がある（Ｎａｔｕｒｅ３２６、
４３０．１９８７）、　　これは、制ガン剤として合成
されたものであり、ＨＩ　Ｖの逆転写簿素阻害作用に基
づく抗ＨＩ　Ｖ剤であるが、生体の造血組織に対する強
い毒性を有するため、多くの例で貧血をもたらすことが
わかっている。その他、多くの物質が、抗ＨＩＶ剤の候
補として研究が行われているが、有効であり且つ安全な
抗ＨＩＶ剤はまだ開発されているとは言えない。

抗ＨＩＶ作用を有する物質を生体又は生体由来物質に求
めた例として、インターフェロンがある（１０ｔ、　Ｊ
、　Ｃａｎｃｅｒ　３８．４３３．１９８６）がその有
効性に関しての明確な報告はない。さらに、最近、筋肉
内に含まれている単ｖｉ類の一つである自撚（イノシト
ール）に硫酸基を結合したものの抗ＨＩＶ作用が試験管
内反応（インビトロテスト）により確認されたが、この
化合物は培養液１ｍｌ当りｍｇ単位の濃度が必要とされ
ることから、抗ＨＩ　Ｖ活性の低いものと考えられる。

ｗ類を硫酸化したものについては、硫酸デキストランが
、ある種のウィルスに対して抗ウィルス作用を示すこと
が知られており（Ａｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ　１３．３６５．１９６５）、ＨＩＶに対しても
抗ウィルス作用を示すことが報告されている（ＴＩＩＥ
　ＬＡＮＣＥＴ、　ＪＬＩＮＥ　１３．１３７９゜＋９
８７）が、これは、生体由来物質ではない。

、″　　　　　　　ン　　　　　か　　の　　１本発明
者は、前述したような状況下において、レトロウィルス
に起因する各種の疾患の治療または予防的治療に有効な
新規な薬剤を求めて研究を重ねた結果、哺乳動物の体内
に存在するα１−酸性糖タンパク（ａ　＋−ａｃｉｄ　
ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ：　ａ　＋　−Ａ　Ｇ　Ｐ　
）をスルホン化したポリサッカライドが、レトロウィル
スの増殖を抑制する機能を有することを見出し、本発明
を導くに至った。

例えば、このようなα＋−ＡＧＰ由来スルホン化ポリサ
ッカライド（ｓｕｌｆｏｎａｔｅｄ　ａｔ−ａｃｉｄ　
ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｐｏｌｙ
ｓａｃｃａｒｉｄｅ　：以下、Ｓ−ａｔＡＧＰＤＰＳと
略称する）は、ヒ）Ｔ細胞由来株化細胞を用いてＨＩ　
Ｖによる細胞変性効果を調べるインビトロテストにおい
て、該変性効果を抑制する能力がきわめて優れており、
その最小有効濃度は、これまで知られていた薬剤のうち
最も有効であるとされている硫酸デキストランの数分の
−から数十分の−であることが見出されている。

かくして、本発明は、有効成分としてＳ−α＋ＡＧＰＤ
ＰＳを含有することを特徴とするレトロウィルス感染症
、特に、ＡＩＤＳの治療および予防に有効な薬剤を提供
するものである。

本発明において用いるＳ−α＋　Ａ　Ｇ　Ｐ　Ｄ　Ｐ　
Ｓの原料となるα＋−ＡＧＰは、オロソムコイドとも呼
ばれ、α１グロブリン領域の糖タンパクの１種であり、
約４０，０００〜４４，０００の分子量を有する物質で
ある。

このα＋−ＡＧＰのｗ＠製そのものは公知の方法に従っ
て行われ、例えば、Ｈａｓ、　Ｗｉｃｋｅｒｈａｕｓｅ
ｒの方法によるコーンのエタノール分画フラクションＶ
上清からの調製法（Ｂ、　Ｂ、　Ａ、、邸、　１２６．
１９７３）、あるいはＳｅｔ＋ｍｉｄの方法によりコー
ンのエタノール分画フラクション■からの調製法（Ｊ、
　Ａ、　Ｃ，Ｓ、、　７７゜７４２、１９５５；　Ｊ、
　Ｂ、　Ｃ，２３０，８５３，１９５８；　ＪＣｌ、、
　４４、１３９４．１９６５）等により調製できる。用
いるα１−ＡＧＰはヒトの血清から得られるものが最も
好ましいが、必要に応じて他の哺乳動物、特に、ウシ、
ウマ、ブタ、ヒツジなどの産業用動物から上述したのと
同様の操作で回収したα＋−ＡＧＰを使用することもて
きる。得られたα＋−ＡＧＰは混入ウィルスを不活化す
るため、加熱処理に供されることが好ましく、この加熱
処理は、例えば、液状で加熱する場合には６０℃、ＩＯ
時閏、また、凍結乾燥後に加熱処理を行う場合には、６
５℃で９６時間実施するのが好ましい。

本発明において用いるＳ−αＩＡＧＰＤＰＳは、上記の
ようにして得られたα＋−ＡＧＰをスルホン化すること
によって調製される。このスルホン化そのものは、既知
の方法に従って行われる。好ましい態様においては、有
機溶媒（例えば、ピリジン）に硫酸化剤（例えば、クロ
ロスルホン酸）を混合し、この混合液にα＋−ＡＧＰを
添加し反応させる。スルホン化反応は、一般に３５℃〜
７０℃、好ましくは５０〜６５℃の温度下に行われる。

スルホン化によって得られた化合物をゲルろ過法、すな
わち、セファクリルＳ−３００（ファルマシア社製Ｎ、
　Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド／アリルデキスト
ラン架橋ゲル）を用いるゲルろ過法により分子量を分析
したところ、約３万ダルトン〜７ｏ万ダルトンの範囲の
スルホン化ポリサッカライドに抗ｆ（ＩＶ活性が認めら
れ、その中でも、約３万ダルトン〜１０万ダルトン、特
に５〜６万ダルトン程度の比較的分子量の低いものが特
に高い抗ＨＩＶ活性を有することが認められている。

本発明に従いα＋−ＡＧＰＤＰＳを含有する薬剤が抗ウ
ィルス作用、特に、抗ＨＩＶ活性を有するのは、上記の
ごときスルホン化によりα＋−ＡＧＰの糖鎖の水酸基に
硫酸基が導入されてスルホン化糖鎖が存在するためでは
ないかと推測される。このようなα＋−ＡＧＰのヌルホ
ン化物が、従来より知られている硫酸化デキストランの
ごとき他の硫酸化糖類よりもＨＩＶ増殖抑制能が優れて
いる詳細な理由は未だ明らかでないが、α＋−ＡＧＰに
由来する糖の特殊な構造に起因するのではないかと考え
られる。かくして、本発明に従うα＋−ＡＧＰＤＰＳは
、後の実施例からも明らかなように、ヒトＴ細胞由来株
化細胞（ＭＴ−４細胞）を用いたインヒドロの抗ＨＩＶ
活性テストにおいて、ＨＩＶの増殖を完全に抑える最小
有効濃度は約０．５μｇ／ｍｌであり、従来より最も有
効であったと言われる′＠酸デキストランの最小有効濃
度が数μ８７１〜１０μｇ／ｌ１１１であることに比べ
ても著しく低い。

本発明の薬剤は、ウィルス増殖能を抑制するという薬効
が優れていることに加えて、その原料が生体由来のもの
である点においても有利である。

すなわち、原料となるα＋−ＡＧＰは血清中に０．５５
〜１．４ｍｇ／ｍｌという比較的高濃度で含有され、し
かも、極性がきわめて高い（したがって、水に溶、け易
い）等の特徴を有するので、血清からの精製や回収が容
易である。α＋−ＡＧＰは、免疫抑制等の作用が報告さ
れていることもあり、従来、積極的に人に適用されるこ
とはなかったが、抗ＨＩＶ剤等の薬剤の原料として使用
されれば貴重な血液資源の有効利用が可能となる。さら
に、本発明のように、ヒト血清などの生体由来物質を有
効成分として用いることは、薬剤として投与した場合の
副作用が少ないことが期待でき、特に抗ＨＩＶ剤のよう
に頻回投与する場合においても許容できる薬剤を提供す
る。

以下、本発明の理解を深めるために、本発明の薬剤の抗
ＨＩＶ活性を示す実施例に沿って、本発明を説明するが
、本発明はこの実施例に制限されるものではない。例え
ば、以下の実施例においては、ＨＩＶ　（ヒト免疫不全
ウィルス）としてＨＩＶ−１（ＬＡＶまたはＨＴ　Ｌ　
Ｖ−ｍｅとも呼ばれる）を用いているが、本発明の薬剤
は、ＨＩＶ−２のごとき他のウィルスに対しても同様の
効果を奏するものである。

Ｉ　：Ｓ−αＩ　Ｇ　　　　の−鵬（１）ａｔ−ＡＧＰの調製：　　ａｔ−ＡＧｐは、Ｓｃ
ｈｍｉｄの方法によるフラクション■からの調製法（Ｊ
、　Ａ、　Ｃ。

Ｓ、　７７、７４２．１９５５）に従って調製した。す
なわち、コーンのエタノール分画フラクション■の上清
（フラクション■）を限外ろ過器で濃縮し、脱塩後、Ｃ
トセファローズファーストフロー（ファルマシア社！り
により精製した。得られたαＩ−ＡＧＰの純度は、電気
泳動を行いコマジブクリアントブルー染色後、９５％以
上を示した。このαＩ−ＡＧＰｉｌｌ液を６０℃、１０
時間加熱しウィルスの不活化を行い凍結乾燥後、以下の
実験に供した。

（２）Ｓ−ａｔＡＧＰＤＰＳ（７）ｉ製：　ｏ’ｃ以下
の温度にて、ピリジン（片山化学製）　１０ｍ１にクロ
ロスルホン酸＜ｐａ−ｙｔ純薬製）　０．５５毎ｊを滴
下し、混合した。

滴下終了後、混合液を加熱し、６５〜７０’Ｃに昇温し
た。この中にα＋−ＡＧＰＩＯ抛ｇを加え、攪拌下６５
〜７０℃にて２時間保持した。反応終了後、冷却し、水
酸化ナトリウム水溶液を加えて中和した。中和後、ピリ
ジン層と水層を分離し、水層を回収した。回収した水層
を水に対して透析を行い、Ｓ−αＩＡＧＰＤＰＳを得た
。得られたＳ−α＋ＡＧＰＤＰＳの回収率は、投入した
α＋−ＡＧＰの糖鎖を１００％とした場合、０８１を示
した。

（３）Ｓ−α＋ＡＧＰＤＰＳの分子量およびその糖濃度
の測定：セファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）
を用いるゲルろ過法により、Ｓ−α＋ＡＧＰＤＰＳの分
子量を求めた。すなわち、セファクリルＳ−３００を１
．５Ｘ　１００ｃｍのガラス管につめ、あらかじめ分子
量のわかっている物質（今回１ｇＭ、　１ｇＧ、アルブ
ミン）を流し、流出量が何ｍ１の時、分子型筒ダルトン
というように求めると、第１１ｉ！Ｉのような検量線が
得られる。なお、このセファクリルＳ−３００の分画範
囲は、２ＸＩＯ’ダルトンから１０’ダルトンである。

このセファクリルＳ−３００のカラムにＳ−α＋ＡＧＰ
ＤＰＳを流し、２１ずつ試験管に集めると流出量に応じ
て、第１因に従って分子量を知ることができる。

さらに各流出画分についてアンスロン−硫酸法により比
色を行うことにより糖の濃度を測定する。その結果を第
２図に示す、同図より、得られたＳ−αＩＡＧＰＤＰＳ
は、１０ｇダルトン（流出盟約５６１に対応）から３．
５万ダルトン（流出終了時）の分子量を有し、糖濃度が
ピークの分子量は約１７万ダルトンであることが示され
た。

２：　　　　ＩＶ”の゛（１）Ｓ−α＋　Ａ　Ｇ　Ｐ　Ｄ　Ｐ　Ｓ濃度測定用標
準曲線の作成：調製したＳ−α＋ＡＧＰＤＰＳの凍結乾
燥品を秤量し１ｍｇ／ｍｌの濃度に調製した。この濃度
から逐次、２倍希釈を行い、各希釈濃度のサンプル（５
本）をアンスロン−硫酸法に従い、６２０ｎｍの吸光度
を測定することにより第３図に示す標準曲線を得た。

この標準曲線を用いると、濃度不明のＳ−α＋ＡＧＰＤ
ＰＳをいちいち凍結乾燥し重量を測定し濃度を求めると
いう操作を行うことなしに、溶液のままで濃度を求める
ことができる。

（２）抗ＨＩ　Ｖ活性ｃＤ測定法：　抗ＨＩ　Ｖ活性ハ
、ＨＩＶによるＭＴ４！Ｉ胞（成人ヒトＴ細胞白血病ウ
ィルス遺伝子により形質転換されたヒ）Ｔ４細胞株：　
ＶＩＲＯＬＯＧＹ　ｕ！２．２７２−２８１　（１９８
５）参照）の細胞変性効果（ＣＰＥ）を抑制する活性を
指標にして以下のように行った。

ＭＴ４細胞１０ｍ１　（ＩＸＩＯ’　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ
）に、ＨＩＶ−１属するＬＡＶを含む培地１ｍｌ　（１
０’　ＴＣＩＤ　５０／ＩＩ＋）　ヲ加え、ウィルスの
細胞への吸着を目的として、３７℃、１時間、保温した
。その後、遠心（１５００ｒｐｎ＋、　５分間）により
未吸着のＬＡＶを除去し、培地（５ＸのＦＣＳを含むＲ
Ｐ　Ｍ　Ｉ　１６４０）を用いて細胞密度を２Ｘ１０Ｓ
ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。他方、９６穴プレート（
ＦＡＬ　ＣＯＮ　３０７２）上で、培地を用イテ抗ＨＩ
Ｖ活性を測定するサンプルの２倍段階希釈（５０７１１
／ｗｅｌｌ）を行い、前述したＬ　Ａ　Ｖ　Ｉｌ１１１
ＭＴ４細胞５０μ＋を各ｗｅｌｌに加えた（ＩＸＩＯ’
　ｃｅｌｌｓ／ｉｆ）。これらのプレートを、５Ｘ炭酸
ガスふ卵器内で３日間、３７℃で培養した。

抗ＨＩＶ活性物質が存在しないと、上記条件で培養した
ＭＴ４細胞はＬＡＶのＣＰＥにより１０ｏｚ死滅する。

一方、サンプルに抗ＨＩＶ活性があると、ＭＴ４細胞の
増殖が認められる。３日間培養後の各プレートを顕微鏡
下でＣＰＥの有無を判定し、ＣＰＥを完全に抑制するサ
ンプルの最小有効濃度を求めた。このときの希釈倍数を
最小有効濃度で除した値を抗ＨＩＶ比活性とした。

また、各ｗｅｌｌ当りテトラゾリウム塩（ＭＴＴ：ケミ
コン社製）溶液ｌＯμｍを加え、さらに４時間培養を続
けた。培養後イソブロマノール１００μｌを加え、よく
混和して、細胞内で形成された有色のフォルマザンを溶
出させた。このフォルマザン形成は生細胞治性と相関し
ており、フォルマザンが形成されることは細胞の存在を
示唆することになる。

このような評価は、上述した顕微鏡下で観察したＣＰＥ
の有無の結果をよく反映していた。

（３）抗ＨＩＶ活性の測定結果：実施例１で調製したＳ
−α＋ＡＧＰＤＰＳをセファクリルＳ−３００でゲルろ
過を行い、各流出フラクションについて前述した方法に
従い抗ＨＩＶ活性を測定した。その結果を第４図に示す
、Ｓ−α＋ＡＧＰＤＰＳは、セファクリルＳ−３００を
用いるゲルろ過法による分子量分析において３万〜７０
万ダルトンの広範囲にわたって抗ＨＩＶ活性を有するが
、第４図に示されるように２つの領域において抗ＨＩＶ
比活性のピークが認められる。図中、ピーク！は分子量
約２２万ダルトンに対応し、また、ピーク２は分子盟約
５．５万ダルトンに対応する。第３図に示すように、３
万〜ｌＯ万ダルトンの分子量を有する領域が比活性が特
に高い。

Ｓ−α＋ＡＧＰＤＰＳの最小有効濃度は０．５μ８１１
であった。同じ評価で、すてに抗ＨＩＶ活性が知られて
いるデキストラン硫酸（ファルマシア社！りの最小有効
濃度を測定すると２μｓ／１であり、Ｓ−ａ＋ＡＧＰＤ
Ｐｓ（Ｄ方が４倍も抗ＨＩＶ活性が高いことが判明した
。なお、Ｓ−α＋ＡＧＰＤＰＳの細胞毒性は、５ｍｇ／
ｍ　Ｉの高濃度でも全く見られなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明において用いるα＋−ＡＧＰ由来スル
ホン化ポリサッカライド（Ｓ−α＋　Ａ　Ｇ　Ｐ　Ｄ　
ＰＳ）の分子量をゲルろ過法で求める時に用いる検量線
である。第２図は、本発明において用いるＳ−α＋　Ａ　Ｇ　Ｐ
　ＤＰＳのゲルろ過における流出量（分子量に対応）と
吸光度（糖濃度に対応）との関係を示すグラフである。第３図は、本発明において用いるＳ−αＩＡ　Ｇ　Ｐ　
ＤＰＳの抗ＨＩＶ活性を測定するに当たってＳ−αＩＡ
ＧＰＤＰＳの濃度を求めるのに用いる標準曲線を示すも
のである。第４図は、本発明に従うＳ−α＋ＡＧＰＤＰＳの抗ＨＩ
Ｖ比活性を示すグラフである。第１図流出量（−）吸光度（６２０ｎｍ）吸光度（８２０ｎ　ｍ　）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）有効成分として、哺乳動物由来のα＿１−酸性糖
タンパク（α＿１−ＡＧＰ）をスルホン化して得られる
α＿１−ＡＧＰ由来スルホン化ポリサッカライドを含有
することを特徴とするレトロウイルス感染症治療および
予防用薬剤。
（２）レトロウイルスがヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ
）である特許請求の範囲第（１）項に記載の薬剤。
（３）α＿１−ＡＧＰが、ヒトの血清に由来するもので
ある特許請求の範囲第（２）項に記載の薬剤。
（４）α＿１−ＡＧＰ由来スルホン化ポリサッカライド
が、ゲルろ過法による分析により３万〜７０万ダルトン
の分子量を有するものである特許請求の範囲第（２）項
または第（３）項に記載の薬剤。
（５）α＿１−ＡＧＰ由来スルホン化ポリサッカライド
が、ゲルろ過法による分析により３万〜１０万ダルトン
の分子量を有するものである特許請求の範囲第（４）項
に記載の薬剤。