JP7846932B2 - 改変チャネルロドプシン - Google Patents

改変チャネルロドプシン

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Description

本発明は、改変チャネルロドプシンに関する。より詳細には、イオン透過性（光反応性）が高い改変チャネルロドプシンに関する。
遺伝子導入によって光応答性タンパク（チャネルロドプシン）を発現させた神経細胞に、光を当てることで細胞応答を制御するオプトジェネティックス（Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：光遺伝学）により、視機能の再建を図る研究が世界的に行われていることは周知の通りであり、本発明者らも、ボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ）由来のチャネルロドプシンのＮ末端領域を、クラミドモナス・レインハルトチイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）由来のチャネルロドプシン－１のＮ末端領域に置換することで、細胞膜上での発現効率が改善された改変チャネルロドプシンを特許文献１において報告している。この改変チャネルロドプシンは、光を当てることでイオンチャネルを開いて興奮を誘起することができるものであり、失明に至ったラットの網膜にその遺伝子を導入することによって視力を回復させることに本発明者らは成功している。
しかしながら、これまでに報告されている改変チャネルロドプシンよりも、イオン透過性が高い改変チャネルロドプシンが求められている。
特許第５３２２０６７号公報
そこで本発明は、イオン透過性が高い改変チャネルロドプシンを提供することを目的とする。
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意検討を行った結果、ボルボックス由来のチャネルロドプシンが有する３つの細胞外ドメインのＮ末端側から数えて３つめの細胞外ドメインを、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－２の対応する細胞外ドメインに置換することで、イオン透過性が高いチャネルロドプシンが得られることを見出した。
上記の知見に基づいてなされた本発明の改変チャネルロドプシンは、請求項１記載の通り、ボルボックス由来のチャネルロドプシンが有する３つの細胞外ドメインのＮ末端側から数えて３つめの細胞外ドメインが、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－２の対応する細胞外ドメインに置換されてなるポリペプチドであって、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドで構成される。
（ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつチャネルロドプシン機能を有するポリペプチド
また、請求項２記載の改変チャネルロドプシンは、請求項１記載の改変チャネルロドプシンにおいて、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの１７２番目のＨｉｓが他のアミノ酸に置換されてなるポリペプチドで構成される。
また、請求項３記載の改変チャネルロドプシンは、請求項２記載の改変チャネルロドプシンにおいて、配列番号９～１２のいずれかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドで構成される。
また、本発明の改変チャネルロドプシンは、請求項４記載の通り、ボルボックス由来のチャネルロドプシンが有する３つの細胞外ドメインのＮ末端側から数えて３つめの細胞外ドメインが、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－２の対応する細胞外ドメインに置換されてなるポリペプチドであって、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドで構成される。
（ａ）配列番号７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号７に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつチャネルロドプシン機能を有するポリペプチド
また、本発明のポリヌクレオチドは、請求項５記載の通り、請求項１～４のいずれかに記載の改変チャネルロドプシンを構成するポリペプチドをコードする。
また、本発明の発現ベクターは、請求項６記載の通り、プロモーターと機能的に連結された請求項５記載のポリヌクレオチドを含む。
また、本発明の細胞は、請求項７記載の通り、請求項１～４のいずれかに記載の改変チャネルロドプシンを構成するポリペプチドを発現する。
また、請求項８記載の細胞は、請求項７記載の細胞において、細胞が神経細胞である。
また、本発明は、請求項９記載の通り、網膜外層の障害を患う被検体を治療するための医薬の製造における、請求項１～４のいずれかに記載の改変チャネルロドプシンを構成するポリペプチド、請求項５記載のポリヌクレオチド、請求項６記載の発現ベクターのいずれかの使用である。
また、請求項１０記載の使用は、請求項９記載の使用において、網膜外層の障害が、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、網膜はく離のいずれかである。
また、本発明の網膜外層の障害を治療するための医薬組成物は、請求項１１記載の通り、請求項１～４のいずれかに記載の改変チャネルロドプシンを構成するポリペプチド又は請求項６記載の発現ベクターのいずれかを有効成分として含む。
本発明によれば、イオン透過性が高い改変チャネルロドプシンを提供することができる。
実施例１における、ｐ５２５発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドの構成である。 試験例１において、ｐ５２５、ｐ５４８、ｐ５５０が、ｍＶＣｈＲ１よりもイオン透過性が高いことを示すグラフである。 試験例４における、ｐ５７８、ｐ５７９、ｐ５８０、ｐ５８１のイオン透過性を示すグラフである。 試験例５において、ｐ５７９がｐ５４８よりもτｏｎが短いことを示すグラフである。 同、ｐ５７９がｐ５４８よりもτｏｆｆが短いことを示すグラフである。 試験例６において、ｐ５４８遺伝子を網膜に導入することで視覚誘発電位を記録することができることを示すグラフである。 同、蛍光顕微鏡下で網膜伸展標本を観察するとｐ５４８の発現を神経網膜の全体において確認することができることを示す写真である。 同、蛍光顕微鏡下で網膜切片標本を観察するとｐ５４８の発現を主として網膜神経節細胞層において確認することができることを示す写真である。
本発明の改変チャネルロドプシンは、ボルボックス由来のチャネルロドプシンが有する３つの細胞外ドメインのＮ末端側から数えて３つめの細胞外ドメインが、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－２の対応する細胞外ドメインに置換されてなるポリペプチドである。
ボルボックス由来のチャネルロドプシンの具体例としては、配列番号１に示すアミノ酸配列の６７～３２２番目のアミノ酸を少なくとも含んでなるポリペプチドが挙げられる。配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、本発明者らが特許文献１において報告した改変チャネルロドプシンである（特許文献１において配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド）。この改変チャネルロドプシンは、ボルボックス由来のチャネルロドプシンのＮ末端領域を、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－１のＮ末端領域（細胞膜局在発現に関与する領域であって膜貫通ドメインを含まない）に置換することで、細胞膜上での発現効率が改善された、３４４個のアミノ酸からなるポリペプチドである。配列番号１に示すアミノ酸配列の１～６６番目のアミノ酸は、配列番号２に示すクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－１のアミノ酸配列の１～６６番目のアミノ酸である。本発明では、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドである改変チャネルロドプシンをｍＶＣｈＲ１と称する。また、特許文献１に記載された事項は、本明細書に記載された事項として取り扱う。
配列番号１に示すｍＶＣｈＲ１のアミノ酸配列は下記の通りである。ｍＶＣｈＲ１が有する３つの細胞外ドメインのＮ末端側から数えて３つめの細胞外ドメイン（ＥＸ３）は、Ｇｌｙ２７１～Ｓｅｒ２７９である。
（ｍＶＣｈＲ１のアミノ酸配列）
MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICMPRGQCYCEGWLR

SRGTSIEKTIAITLQWVVFALSVACLGWYAYQAWRATCGWEEVYVALIEMMKSIIEAFHEFDSPATLWLSSGNGVVWMR
TM1 IN1 TM2 EX1 TM3
YGEWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLISLSYGMYTYFHAAKVYIEA
IN2 TM4 EX2TM5
FHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAKNMWGVLGNYLRVKIHEHILLY
IN3 TM6 EX3 TM7
GDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEEDR
※ ＴＭ：膜貫通ドメイン
ＩＮ：細胞内ドメイン
ＥＸ：細胞外ドメイン
本発明の改変チャネルロドプシンは、ｍＶＣｈＲ１を例にとると、上記のＥＸ３が、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－２の対応する細胞外ドメイン、即ち、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－２が有する３つの細胞外ドメインのＮ末端側から数えて３つめの細胞外ドメインに置換されてなるポリペプチドである。クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－２のアミノ酸配列は、配列番号３に示す通りであり、そのＮ末端側から数えて３つめの細胞外ドメインは、Ｇｌｙ２３３～Ｓｅｒ２４１である。ＥＸ３の置換に伴い、その前後の膜貫通ドメイン、即ち、ＥＸ３のＮ末端に隣接するＴＭ６のＣ末端側のアミノ酸、及び／又は、ＥＸ３のＣ末端に隣接するＴＭ７のＮ末端側のアミノ酸が併せて置換されてもよいが、置換されてもよいアミノ酸の個数は最大で３個であることが好ましい。３個を超えるアミノ酸の置換は、膜貫通ドメインの機能に影響を及ぼす恐れがある。
本発明の改変チャネルロドプシンは、ボルボックス由来のチャネルロドプシンが有する３つの細胞外ドメインのＮ末端側から数えて３つめの細胞外ドメインが、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－２の対応する細胞外ドメインに置換されていることに加え、その他のドメインや領域がさらに改変されてなるポリペプチドであってもよい。例えば、ｍＶＣｈＲ１を例にとると、配列番号１に示すアミノ酸配列の１４２～１６９番目のアミノ酸が、配列番号２に示すクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－１のアミノ酸配列の１４３～１７０番目のアミノ酸に置換されてなるポリペプチドであってもよい。
こうした改変チャネルロドプシンの具体例としては、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。このポリペプチド（ｐ５２５）は、ｍＶＣｈＲ１のＥＸ３が、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－２の対応する細胞外ドメインに置換され、かつ、ｍＶＣｈＲ１の１４２～１６９番目のアミノ酸が、配列番号２に示すクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－１の１４３～１７０番目のアミノ酸に置換されてなる（なお、ＥＸ３の置換に伴い、ＴＭ７の２８０番目のＰｒｏがＶａｌに置換されている）。
また、本発明の改変チャネルロドプシンは、例えば、ｍＶＣｈＲ１を例にとると、そのＮ末端側から数えて６つめの膜貫通ドメイン（ＴＭ６）が、クロロモナス・オオガマ（Ｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ ｏｏｇａｍａ）由来のチャネルロドプシンの対応する膜貫通ドメインに置換されてなるポリペプチドであってもよい。クロロモナス・オオガマ由来のチャネルロドプシンのアミノ酸配列は、配列番号５に示す通りであり、そのＮ末端側から数えて６つめの膜貫通ドメインは、Ａｒｇ１８７～Ｖａｌ２１２である。
また、本発明の改変チャネルロドプシンは、例えば、ｍＶＣｈＲ１を例にとると、配列番号１に示すアミノ酸配列の３２３番目以降のアミノ酸が、配列番号５に示すクロロモナス・オオガマ由来のチャネルロドプシンのアミノ酸配列の２６５番目以降のアミノ酸に置換されてなるポリペプチドであってもよい。
こうした改変チャネルロドプシンの具体例としては、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。このポリペプチド（ｐ５４８）は、ｍＶＣｈＲ１のＥＸ３が、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－２の対応する細胞外ドメインに置換され、かつ、ｍＶＣｈＲ１の１４２～１６９番目のアミノ酸が、配列番号２に示すクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－１の１４３～１７０番目のアミノ酸に置換され、さらに、ｍＶＣｈＲ１のＴＭ６が、クロロモナス・オオガマ由来のチャネルロドプシンの対応する膜貫通ドメインに置換され、ｍＶＣｈＲ１の３２３～３４４番目のアミノ酸が、配列番号５に示すクロロモナス・オオガマ由来のチャネルロドプシンの２６５～２８６番目のアミノ酸に置換されてなる（なお、ＥＸ３の置換に伴い、ＴＭ７の２８０番目のＰｒｏがＶａｌに置換されている）。
別の具体例としては、配列番号７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。このポリペプチド（ｐ５５０）は、ｍＶＣｈＲ１のＥＸ３が、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－２の対応する細胞外ドメインに置換され、かつ、ｍＶＣｈＲ１の１４２～１６９番目のアミノ酸が、配列番号２に示すクラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－１の１４３～１７０番目のアミノ酸に置換され、さらに、ｍＶＣｈＲ１のＴＭ６が、クロロモナス・オオガマ由来のチャネルロドプシンの対応する膜貫通ドメインに置換され、ｍＶＣｈＲ１の３２３～３４４番目のアミノ酸が、配列番号５に示すクロロモナス・オオガマ由来のチャネルロドプシンの２６５～２８６番目のアミノ酸に置換されてなることは、上記の配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｐ５４８）と同じであるが、加えて、ｍＶＣｈＲ１の２８～６０番目のアミノ酸が欠失されてなる（なお、ＥＸ３の置換に伴い、ＴＭ７の２８０番目のＰｒｏがＶａｌに置換されている）。
本発明の改変チャネルロドプシンは、配列番号４，６，７のそれぞれに示すアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつチャネルロドプシン機能を有するポリペプチドを含む。また、配列番号４，６，７のそれぞれに示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつチャネルロドプシン機能を有するポリペプチドを含む。ここで、「複数個」とは、５０個以下の整数、好ましくは３０個以下の整数、より好ましくは１０個以下の整数、例えば２～９個、２～７個、２～５個である。配列番号４，６，７のそれぞれに示すアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは少なくとも９１％であり、より好ましくは少なくとも９２％であり、より好ましくは少なくとも９３％であり、より好ましくは少なくとも９４％であり、より好ましくは少なくとも９５％であり、より好ましくは少なくとも９６％であり、より好ましくは少なくとも９７％であり、より好ましくは少なくとも９８％であり、最も好ましくは少なくとも９９％である。なお、同一性の％は、複数（２つ）のアミノ酸配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＤＡＮＡＳＹＳ、ＢＬＡＳＴなど）をデフォルトの設定で使用して算出した値をいう。こうした改変チャネルロドプシンの具体例としては、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの２１０番目のＴｒｐがＴｙｒに置換され、２１１番目のＴｈｒがＶａｌに置換された、配列番号８に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｐ５２８）が挙げられる。また、配列番号４，６，８のそれぞれに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの１７２番目や、配列番号７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの１３９番目のＨｉｓが、他のアミノ酸、例えばＧｌｙ，Ａｌａ，Ｌｙｓ，Ａｒｇなどに置換されてなるポリペプチド、具体的には、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの１７２番目のＨｉｓが、Ｇｌｙに置換された配列番号９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｐ５７８）、Ａｌａに置換された配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｐ５７９）、Ｌｙｓに置換された配列番号１１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｐ５８０）、Ａｒｇに置換された配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（ｐ５８１）などが挙げられる。配列番号４，６，８のそれぞれに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの１７２番目や、配列番号７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの１３９番目のＨｉｓを、他のアミノ酸に置換することにより、光照射を始めてからチャネルが開くまでの時間（開速度：τｏｎ）と光照射を止めてからチャネルが閉じるまでの時間（閉速度：τｏｆｆ）の少なくとも一方に変化をもたらすことができる。なお、「チャネルロドプシン機能を有する」とは、光を感受することで細胞の外側と内側の間でのイオン透過性を制御するチャネル機能を有することを意味することは当業者に周知の通りであり、光感受性の程度や光感受波長、イオン透過性の程度、τｏｎやτｏｆｆなどによって評価される生物学的活性の少なくとも１つが、配列番号４，６，７，８のそれぞれに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが有する生物学的活性と少なくとも同等であることが好ましい。
本発明の改変チャネルロドプシンは、遺伝子工学的手法により製造することができる。具体的には、まず、本発明の改変チャネルロドプシンをコードするポリヌクレオチド（以下、「本発明の改変チャネルロドプシン遺伝子」という）を調製する。本発明の改変チャネルロドプシン遺伝子は、当業者に公知の手法によって調製することができる。具体的には、例えば、本発明者らが特許文献１において報告した改変チャネルロドプシンをコードするポリヌクレオチドと、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－２をコードするポリヌクレオチド、さらに必要であれば、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－１をコードするポリヌクレオチドや、クロロモナス・オオガマ由来のチャネルロドプシンをコードするポリヌクレオチドのそれぞれの配列情報に基づいて化学合成することで調製することができる。また、それぞれのポリヌクレオチドの配列情報に基づき、それぞれのポリヌクレオチドの所望領域を増幅するＰＣＲプライマーを用いてそれぞれのポリヌクレオチドの所望領域を増幅し、例えばＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙシステム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）等を用いて連結することによって調製することもできる。次に、プロモーターと機能的に連結された本発明の改変チャネルロドプシン遺伝子を、宿主菌体内で複製維持が可能であり、コードされるポリペプチドを安定に発現させることができ、この遺伝子を安定に保持できる発現ベクターに組み込み、得られた組換え発現ベクターを用いて宿主を形質転換し、宿主において本発明の改変チャネルロドプシンを生産させることができる。組換え技術については、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９８４ ８１：５６６２や、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓなどを参照することができる。発現ベクターとしては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２８、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、及び他のプラスミドＤＮＡ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、及び他のプラスミドＤＮＡ）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、及び他のプラスミドＤＮＡ）、λファージ（λｇｔ１１やλＺＡＰ）、哺乳動物用プラスミド（ｐＣＭＶやｐＳＶ４０）、ウイルスベクター（例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなどの昆虫ウイルスベクター）、植物用ベクター（例えばバイナリベクターｐＢＩ系）、コスミドベクターなどを用いることができる。ここで、「機能的に連結された」とは、プロモーター配列が目的のポリヌクレオチド配列の転写を開始することができるような、プロモーター配列と目的のポリヌクレオチド配列との間の機能的な結合をいう。プロモーターは特に制限されず、宿主に応じて適するプロモーターを選択すればよく、公知の構成的プロモーターや誘導性プロモーターを用いることができるが、構成的プロモーターを用いることが好ましい。その具体例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター、シナプシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ＣａＭＶプロモーター、解糖系酵素プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ｔｈｙ１プロモーター、ＧＲＫプロモーター、ＲＰＥＪプロモーターなどが挙げられる。本発明の改変チャネルロドプシンを特定の細胞で特異的に発現させることを目的として、これらのプロモーターの上流にその細胞で特異的に発現しているポリペプチド遺伝子の転写調節領域（例えば視細胞で特異的に発現しているＩＲＢＰ（Ｉｎｔｅｒｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｔｉｎｏｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）の転写調節領域（Ｍａｒｊｏｒｉｅ Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌｕｍｅ ９，Ｉｓｓｕｅ１２，１０１３－１１０７，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００７））を結合したりしてもよい。本発明の改変チャネルロドプシン遺伝子の発現ベクターへの挿入は、例えば、本発明の改変チャネルロドプシン遺伝子にフランキングする制限酵素部位を作製又は連結し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより行う。発現ベクターは、プロモーター及び本発明の改変チャネルロドプシン遺伝子の他、必要に応じてエンハンサー及び他のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（アンピシリン耐性マーカー、テトラサイクリン耐性マーカーなどの薬剤耐性遺伝子マーカー、ＬＥＵ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３などの栄養要求性相補遺伝子マーカー、ＡＰＨ、ＤＨＦＲ、ＴＫなどの優性選択マーカーなど）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）などを含んでもよい。宿主の形質転換は、プロトプラスト法、スフェロプラスト法、コンピテントセル法、ウイルス法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ジーンボンバートメント法、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーションなどを用いて行うことができる。こうして得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミンなどを含む培地を用いて適当な条件で培養する。形質転換体の培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、２５～３７℃で３～６時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液などを用いて行う。培養中は、必要に応じて、組換え発現ベクターに挿入した選択マーカーに応じて、アンピシリンやテトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。また、形質転換に使用する宿主は、本発明の改変チャネルロドプシンを発現できるものであれば特に制限されるものではなく、細菌（大腸菌や枯草菌）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）、動物細胞（ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞など）、昆虫細胞などが挙げられる。本発明の改変チャネルロドプシンは、形質転換体の培養により得られた培養物（培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞や菌体のホモジェネートなど）から一般的な方法によって分取や精製を行い、限外濾過濃縮、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化などによって、その活性を保持する形態で得ることができる。或いは、本発明の改変チャネルロドプシンは、単離や精製を行うことなく、本発明の改変チャネルロドプシンを発現する細胞の形態で提供してもよい。この場合、形質転換に使用する宿主細胞は、その後の用途に適した宿主細胞、例えば神経細胞（視細胞、双極細胞、神経節細胞など）、好ましくヒトの神経細胞である。また、本発明の改変チャネルロドプシンを医療用途に使用する場合には、本発明の改変チャネルロドプシンの発現ベクターの形態で提供してもよい。この場合には、細胞への導入効率、細胞内での複製維持、安定性、発現効率などに優れた発現ベクターを用いることが好ましい。このようなベクターとしては、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクター、（自立複製可能な）プラスミド、トランスポゾンなどを挙げることができる。本発明の改変チャネルロドプシンの発現ベクター作製用プラスミドは、例えばＴｏｍｉｔａ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００７ Ａｕｇ；４８（８）：３８２１－６や、Ｓｕｇａｎｏ Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２００５ Ｓｅｐ；４６（９）：３３４１－８に記載される方法に従って調製することができる。
ここで、本発明の改変チャネルロドプシン遺伝子としては、例えば、配列番号１３に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード）、配列番号１４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード）、配列番号１５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード）、配列番号１６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号８に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード）、配列番号１７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号９に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード）、配列番号１８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１０に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード）、配列番号１９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード）、配列番号２０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード）が挙げられる。しかしながら、本発明の改変チャネルロドプシン遺伝子は、これらのポリヌクレオチドに限定されず、これらのポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、チャネルロドプシン機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。また、配列番号１３～２０のそれぞれに示す塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、チャネルロドプシン機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ここで、「ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーション」とは、例えば、３０～５０℃、３～４×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）、０．１～０．５％ＳＤＳ中で１～２４時間のハイブリダイゼーション、好ましくは４０～４５℃、３．４×ＳＳＣ、０．３％ＳＤＳ中で１～２４時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び１×ＳＳＣ溶液、０．２×ＳＳＣ溶液による室温での連続した洗浄などの条件が挙げられる。ただし、上記条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の要素や他の要素（例えば、ハイブリダーゼーションプローブの濃度、長さ及びＧＣ含量、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
本発明の改変チャネルロドプシンは、特許文献１に従って、ボルボックス由来のチャネルロドプシンのＮ末端領域を、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－１のＮ末端領域に置換されてなるポリペプチドである場合、特許文献１に記載の改変チャネルロドプシン（例えばｍＶＣｈＲ１）が有する細胞膜上での発現効率が高いという特性を保持し、さらに、イオン透過性が高いという特性を有する。従って、本発明の改変チャネルロドプシンや、これをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、網膜外層の障害を患う被検体の治療に有用である。ここで、「網膜外層の障害」とは、網膜外層に存在する視細胞が変性、消失するなどして視機能不全や視機能障害を生じているが、視細胞以外の細胞は依然として正常なままであったり、機能の一部が保持されていたりする任意の疾患をいう。このような疾患としては、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、網膜はく離などを挙げることができる。「被検体」とは、網膜外層の障害に起因して、失明している被検体や、失明のリスクを有する被検体を意味する。被検体はヒトに限らず、その他の哺乳動物であってもよい。その他の哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどが挙げられる。「網膜外層の障害を患う被検体の治療」とは、網膜外層の障害に起因して失明していたり、失明のリスクを有したりする被検体において、本発明の医薬の投与前と比較して、視機能を回復することを意味する。
本発明の医薬組成物は、本発明の改変チャネルロドプシンや、これをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分とし、網膜外層の障害を患う被検体を治療するための医薬として製剤化される。その有効量は、所与の症状や用法について治療効果を与え得る量であり、動物を用いた試験、臨床試験の実施により当業者によって適宜決定されるが、投与対象とする被検体の年齢、体重、性別、疾患の状態や重篤度、投与方法などが考慮される。ウイルスの場合、ウイルス量は、例えば１０１２～１０１３ｃａｐｓｉｄｓ／ｍｌ（例えば、約１０１３ｃａｐｓｉｄｓ／ｍｌ）である。医薬としての製剤化に際し、有効成分は１以上の薬学的に許容される担体と共に製剤化されてよい。薬学的に許容される担体としては、各種緩衝液、例えば生理食塩水、リン酸塩、酢酸塩などの緩衝液が挙げられる。医薬は、その他の治療成分を含んでよい。その他の治療成分としては、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、網膜はく離などの治療剤として公知の薬剤が挙げられる。医薬は、例えば局所投与用の注射剤、点眼剤、洗眼剤などに製剤化することができる。注射用製剤は、保存剤を添加して、例えばアンプルや複数回投与容器中の単位投与剤形として提供することができる。また、医薬は、好適なビヒクル、例えば発熱物質不含の滅菌水などで使用前に再構成するための凍結乾燥剤としてもよい。医薬の投与は、被検体の患部、すなわち網膜への直接的な注射や、硝子体への直接的な接触によって行うことが好ましい。
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
実施例１：配列番号４に示すアミノ酸配列からなる本発明の改変チャネルロドプシン（ｐ５２５を発現する細胞の取得）
特許文献１に記載のｍＶＣｈＲ１の配列番号１に示すアミノ酸配列の１～１４１番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－１の配列番号２に示すアミノ酸配列の１４３～１７０番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、配列番号１に示すアミノ酸配列の１７０～２７０番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－２の配列番号３に示すアミノ酸配列の２３３～２４２番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、配列番号１に示すアミノ酸配列の２８０～３４２番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域が連結され、その５’末端と３’末端に制限酵素配列を付加したポリヌクレオチドを化学合成し、アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入した。こうして調製したｐ５２５発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドの構成を図１に示す。このプラスミドは、マルチクローニングサイトの３’領域に蛍光タンパク質遺伝子（ｖｅｎｕｓ）が配置されており、目的遺伝子はＣ末端領域にｖｅｎｕｓを付加した融合タンパク質として発現される。従って、このプラスミドをリン酸カルシウム法により細胞にトランスフェクトし、ｖｅｎｕｓを指標にしてｐ５２５を発現する細胞を特定した。具体的には、このプラスミドの溶液（プラスミド量は１５μｇ）を加えたチューブに、１．５ｍＬの０．３Ｍ ＣａＣｌ２を加えて転倒攪拌した後、内容物を別のチューブに用意した１．５ｍＬの２Ｘ ＨＢＳ（２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１）に加え、再度転倒攪拌してから、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で培養したヒト胎児腎由来細胞株であるＨＥＫ（Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ）２９３細胞に滴下添加することでプラスミドをトランスフェクトし、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。６時間後、培地を新鮮な培地に交換し、２日間培養した後、蛍光顕微鏡下で細胞を観察することで、細胞内におけるｐ５２５の発現を確認した。
実施例２：配列番号６に示すアミノ酸配列からなる本発明の改変チャネルロドプシン（ｐ５４８を発現する細胞の取得）
特許文献１に記載のｍＶＣｈＲ１の配列番号１に示すアミノ酸配列の１～１４１番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－１の配列番号２に示すアミノ酸配列の１４３～１７０番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、配列番号１に示すアミノ酸配列の１７０～２４４番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、クロロモナス・オオガマ由来のチャネルロドプシンの配列番号５に示すアミノ酸配列の１８７～２１２番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－２の配列番号３に示すアミノ酸配列の２３３～２４２番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、配列番号１に示すアミノ酸配列の２８０～３２２番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、配列番号５に示すアミノ酸配列の２６５～２８６番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域が連結され、その５’末端と３’末端に制限酵素配列を付加したポリヌクレオチドを化学合成し、アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入すること以外は実施例１と同様にして、ｐ５４８を発現する細胞を作製した。
実施例３：配列番号７に示すアミノ酸配列からなる本発明の改変チャネルロドプシン（ｐ５５０を発現する細胞の取得）
特許文献１に記載のｍＶＣｈＲ１の配列番号１に示すアミノ酸配列の１～２７番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、配列番号１に示すアミノ酸配列の６１～１４１番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－１の配列番号２に示すアミノ酸配列の１４３～１７０番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、配列番号１に示すアミノ酸配列の１７０～２４４番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、クロロモナス・オオガマ由来のチャネルロドプシンの配列番号５に示すアミノ酸配列の１８７～２１２番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－２の配列番号３に示すアミノ酸配列の２３３～２４２番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、配列番号１に示すアミノ酸配列の２８０～３２２番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域と、配列番号５に示すアミノ酸配列の２６５～２８６番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドの領域が連結され、その５’末端と３’末端に制限酵素配列を付加したポリヌクレオチドを化学合成し、アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入すること以外は実施例１と同様にして、ｐ５５０を発現する細胞を作製した。
試験例１：ｐ５２５、ｐ５４８、ｐ５５０のそれぞれを発現する細胞のパッチクランプ法による光誘発電流の測定（その１）
ｐ５２５、ｐ５４８、ｐ５５０のそれぞれを発現する細胞について、顕微鏡下でｖｅｎｕｓの発現を確認した後、パッチクランプシステム（ＥＰＣ－１０、ＨＥＫＡ）を用いて測定した。細胞外液は、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２からなり、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ７．４に調整したものを用いた。電極内液は、１３０ｍＭ ＣｓＣｌ、１．１ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｎａ２ＡＴＰからなり、１Ｎ ＣｓＯＨでｐＨ７．２に調整したものを用いた。光照射（光源：ＬＥＤ）は１秒間、光強度は１μＷ／ｍｍ２、刺激間隔は６０秒、固定電位は－６０ｍＶに設定した。波長は４０５、４５５、５０５、５６０、６１７、６５６ｎｍのそれぞれとした。結果を図２に示す。図２には、ｐ５２５、ｐ５４８、ｐ５５０のそれぞれを発現する細胞と同様にして取得したｍＶＣｈＲ１を発現する細胞についての測定結果をあわせて示す。図２から明らかなように、ｐ５２５、ｐ５４８、ｐ５５０は、いずれもｍＶＣｈＲ１よりもイオン透過性が高いことがわかった。
試験例２：ｐ５２５を発現する細胞のパッチクランプ法による光誘発電流の測定（その２）
光照射を１０ミリ秒で行うこと以外は試験例１と同様にして、ｐ５２５の光誘発電流を測定したところ、ｍＶＣｈＲ１よりもイオン透過性が高かった。
試験例３：ｐ５２８を発現する細胞のパッチクランプ法による光誘発電流の測定
試験例１と同様にして、ｐ５２８の光誘発電流を測定したところ、ｍＶＣｈＲ１よりもイオン透過性が高かった。
実施例４：配列番号９に示すアミノ酸配列からなる本発明の改変チャネルロドプシン（ｐ５７８（Ｈ１７２Ｇ）を発現する細胞の取得）
実施例２で調製したｐ５４８発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドに対し、ＫＯＤ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＳＭＫ－１０１，ＴＯＹＯＢＯ）を用い、そのマニュアルに従って部位特異的変異導入を行い、１７２番目のＨｉｓをＧｌｙに置換することで、ｐ５７８発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドを調製した。具体的には、変異プライマー（配列番号２１の１７２Ｇ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：ＧＧＡＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＴＧＡＡ）１０ｐｍｏｌ／μＬと、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２２のＧＡＴＣＡＧＧＡＴＣＡＣＡＧＧＡＣＡＧＧＴＣＡＧ）１０ｐｍｏｌ／μＬを用い、ｐ５４８発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミド５０ｎｇ／μＬを鋳型にしてＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応サイクルは、９４℃２分間→９８℃１０秒間→６８℃７分間を５サイクルとした。ＰＣＲ産物を制限酵素ＤｐｎＩで処理することで、鋳型にしたｐ５４８発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドを消化し、その後、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＫｉｎａｓｅとＬｉｇａｓｅを同時に作用させ、直鎖状プラスミドをＳｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎすることにより環状化し、ｐ５７８発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドを得た。こうして得たｐ５７８発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドを用いること以外は実施例１と同様にして、ｐ５７８を発現する細胞を作製した。
実施例５：配列番号１０に示すアミノ酸配列からなる本発明の改変チャネルロドプシン（ｐ５７９（Ｈ１７２Ａ）を発現する細胞の取得）
変異プライマーとして配列番号２３の１７２Ａ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：ＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＴＧＡＡを用いること以外は実施例４と同様にして、ｐ５７９発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドを調製し、ｐ５７９を発現する細胞を作製した。
実施例６：配列番号１１に示すアミノ酸配列からなる本発明の改変チャネルロドプシン（ｐ５８０（Ｈ１７２Ｋ）を発現する細胞の取得）
変異プライマーとして配列番号２４の１７２Ｋ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：ＡＡＡＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＴＧＡＡを用いること以外は実施例４と同様にして、ｐ５８０発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドを調製し、ｐ５８０を発現する細胞を作製した。
実施例７：配列番号１２に示すアミノ酸配列からなる本発明の改変チャネルロドプシン（ｐ５８１（Ｈ１７２Ｒ）を発現する細胞の取得）
変異プライマーとして配列番号２５の１７２Ｒ Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ：ＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＴＧＡＡを用いること以外は実施例４と同様にして、ｐ５８１発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドを調製し、ｐ５８１を発現する細胞を作製した。
試験例４：ｐ５７８、ｐ５７９、ｐ５８０、ｐ５８１のそれぞれを発現する細胞のパッチクランプ法による光誘発電流の測定
試験例１と同様にして、それぞれの光誘発電流を測定した。結果を図３に示す。図３には、ｐ５４８を発現する細胞についての測定結果をあわせて示す。図３から明らかなように、ｐ５７８、ｐ５７９、ｐ５８０、ｐ５８１のイオン透過性は、いずれもｐ５４８よりも低かったが、ｍＶＣｈＲ１よりは高かった（ｍＶＣｈＲ１のイオン透過性は図２を参照）。
試験例５：ｐ５７９を発現する細胞のパッチクランプ法によるτｏｎとτｏｆｆの測定
試験例４における光誘発電流の測定と同じ条件でτｏｎとτｏｆｆを測定した。結果をτｏｎについて図４にτｏｆｆについて図５に示す。それぞれの図には、ｐ５４８を発現する細胞についての測定結果をあわせて示す。図４と図５から明らかなように、ｐ５４８の１７２番目のＨｉｓをＡｌａに置換したｐ５７９は、τｏｎとτｏｆｆがいずれもｐ５４８よりも短く、高い時間分解能で細胞を制御することがわかった。
試験例６：アデノ随伴ウイルスベクターを用いたｐ５４８遺伝子の網膜への導入とその効果
（実験方法）
アデノ随伴ウイルスベクターの作製
ＡＡＶヘルパーフリーシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊａｌｌａ，ＣＡ）を用い、そのマニュアルに従って、実施例２で調製したｐ５４８発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミド、ｐＡＡＶ－ＲＣ、ｐＨｅｌｐｅｒの３種類のプラスミドから、ｐ５４８遺伝子を網膜に導入するためのアデノ随伴ウイルスベクターを作製した。具体的には、それぞれのプラスミドの溶液（プラスミド量はいずれも１５μｇ）を加えてタッピングしたチューブに、１．５ｍＬの０．３Ｍ ＣａＣｌ２を加えて転倒攪拌した後、内容物を別のチューブに用意した１．５ｍＬの２Ｘ ＨＢＳ（２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１）に加え、再度転倒攪拌してから、１５ｃｍ培養皿に培養した２９３Ｔ細胞に滴下添加することにより、３種類のプラスミドをリン酸カルシウム法によって共トランスフェクトし、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。３日間培養した後、回収した細胞から目的とするウイルス粒子を精製した。
実験動物
７ヶ月齢のＲｏｙａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｏｎｓ（ＲＣＳ：ｒｄｙ／ｒｄｙ）ラットを用いた。ＲＣＳラットは、生後いったん正常に網膜が形成されるが、生後３週より視細胞の変性が始まり、生後３ヶ月で視細胞がほぼ消失して失明に至る。従って、７ヶ月齢のＲＣＳラットでは視覚誘発電位は記録されない。
ｐ５４８遺伝子の網膜への導入
ケタミン（６６ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（３．３ｍｇ／ｋｇ）の混合麻酔下で、ＲＣＳラットの両眼の眼球結膜を１ｍｍ程度切開し、毛様体扁平部から３２ゲージマイクロシリンジを刺入して硝子体内に５μＬのウイルス溶液を注入した。
視覚誘発電位の測定
ＲＣＳラットの硝子体内にウイルス溶液を注入してから２ヶ月後、視覚誘発電位を測定し、誘発反応記録装置（メイヨー社のＰｕＲＥＣ）を用いて記録した。視覚誘発電位を測定するための電極は、頭皮を切開して頭蓋を露出させた状態で、ブレグマからラムダへ正中線を６．８ｍｍ、その中心から３ｍｍの左右の位置の硬膜上に設置した。基準電極は、ブレグマからラムダへ正中線を１２ｍｍの位置の硬膜上に設置した。設置した電極は歯科用セメントで固定した。視覚誘発電位の測定は、ケタミン（６６ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（３．３ｍｇ／ｋｇ）の混合麻酔下で、１％のアトロピンと２．５％のフェニレフリン塩酸塩により散瞳した状態で行った。視覚刺激は各種ＬＥＤ（刺激光波長：４６５、５２５、６５０ｎｍ）を光源とし、照射時間１０ｍｓ、刺激周波数１Ｈｚで、２００回刺激を繰り返し、加算平均により記録した。
網膜伸展標本と網膜切片標本の作製とその観察
ＲＣＳラットの硝子体内にウイルス溶液を注入してから８ヶ月後、ｐ５４８の発現を確認する目的で網膜伸展標本を作製した。眼球を摘出し、４％パラフォルムアルデヒド溶液で直ちに固定した後、前眼部を取り除き、神経網膜を脈絡膜から剥離した。脈絡膜から剥離した神経網膜をスライドガラス上に伸展し、蛍光顕微鏡下で観察することでｖｅｎｕｓを指標にしてｐ５４８の発現を確認した。続いて、作製した網膜伸展標本を凍結組織切片作製用包埋剤（サクラファインテックジャパン社のＯ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド）に包埋して凍結切片（網膜切片標本）を作製し、蛍光顕微鏡下で観察することでｖｅｎｕｓを指標にして網膜断面におけるｐ５４８の発現を確認した。
（実験結果）
視覚誘発電位の測定結果を図６に示す。図６から明らかなように、ｐ５４８遺伝子を網膜に導入することにより、４６５、５２５、６５０ｎｍのいずれの刺激光波長においても視覚誘発電位を記録することができた。視覚誘発電位の振幅は、光強度が強いほど大きかった。蛍光顕微鏡下で観察した網膜伸展標本の写真を図７に示す。図７から明らかなように、ｐ５４８の発現を神経網膜の全体において確認することができた。蛍光顕微鏡下で観察した網膜切片標本の写真を図８に示す。図８から明らかなように、ｐ５４８の発現を主として網膜神経節細胞層において確認することができた（右下の写真は染色された核である）。
本発明は、イオン透過性（光反応性）が高い改変チャネルロドプシンを提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。

Claims (11)

  1. ボルボックス由来のチャネルロドプシンが有する３つの細胞外ドメインのＮ末端側から数えて３つめの細胞外ドメインが、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－２の対応する細胞外ドメインに置換されてなるポリペプチドであって、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドで構成される改変チャネルロドプシン。
    （ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつチャネルロドプシン機能を有するポリペプチド
  2. 配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの１７２番目のＨｉｓが他のアミノ酸に置換されてなるポリペプチドで構成される請求項１記載の改変チャネルロドプシン。
  3. 配列番号９～１２のいずれかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドで構成される請求項２記載の改変チャネルロドプシン。
  4. ボルボックス由来のチャネルロドプシンが有する３つの細胞外ドメインのＮ末端側から数えて３つめの細胞外ドメインが、クラミドモナス・レインハルトチイ由来のチャネルロドプシン－２の対応する細胞外ドメインに置換されてなるポリペプチドであって、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドで構成される改変チャネルロドプシン。
    （ａ）配列番号７に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （ｂ）配列番号７に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつチャネルロドプシン機能を有するポリペプチド
  5. 請求項１～４のいずれかに記載の改変チャネルロドプシンを構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  6. プロモーターと機能的に連結された請求項５記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  7. 請求項１～４のいずれかに記載の改変チャネルロドプシンを構成するポリペプチドを発現する細胞。
  8. 細胞が神経細胞である請求項７記載の細胞。
  9. 網膜外層の障害を患う被検体を治療するための医薬の製造における、請求項１～４のいずれかに記載の改変チャネルロドプシンを構成するポリペプチド、請求項５記載のポリヌクレオチド、請求項６記載の発現ベクターのいずれかの使用。
  10. 網膜外層の障害が、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、網膜はく離のいずれかである請求項９記載の使用。
  11. 請求項１～４のいずれかに記載の改変チャネルロドプシンを構成するポリペプチド又は請求項６記載の発現ベクターのいずれかを有効成分として含む網膜外層の障害を治療するための医薬組成物。
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