JP7745890B2

JP7745890B2 - 改変光受容クロライドチャネル

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Publication number: JP7745890B2
Application number: JP2022510605A
Authority: JP
Inventors: 浩史冨田; 江里子菅野
Original assignee: Iwate University
Current assignee: Iwate University
Priority date: 2020-03-24
Filing date: 2021-03-24
Publication date: 2025-09-30
Anticipated expiration: 2041-03-24
Also published as: WO2021193732A1; JPWO2021193732A1; US20240270799A1

Description

本発明は、改変光受容クロライドチャネルに関する。より詳細には、波長感受域が狭いことに加え、光照射を始めてからチャネルが開くまでの時間（開速度：τｏｎ）と光照射を止めてからチャネルが閉じるまでの時間（閉速度：τｏｆｆ）のいずれもが短い、優れた光反応特性を有する改変光受容クロライドチャネルに関する。

遺伝子導入によって光応答性タンパク（チャネルロドプシン）を発現させた神経細胞に、光を当てることで細胞応答を制御するオプトジェネティックス（Ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：光遺伝学）により、視機能の再建を図る研究が世界的に行われていることは周知の通りであり、これまでに様々な研究がなされている。光駆動性のチャネルには、細胞内外での陽イオンの流通を担うカチオンチャネルと、陰イオンの流通を担うアニオンチャネルが知られているが、光駆動性のアニオンチャネルは、発見からまだ日が浅いこともあり、その改変体についての報告は、光駆動性のカチオンチャネルの改変体についての報告に比べて少ない。このような状況下、Ｋａｔｏらの研究グループは、緑藻の１つであるグィラルディア・セータ（Ｇｕｉｌｌａｒｄｉａｔｈｅｔａ）から単離された光受容クロライドチャネル－１（ＧｔＡＣＲ１）（非特許文献１）に着目し、そのＡｒｇ８３とＡｓｎ２３９をＧｌｕに置換した改変光受容クロライドチャネル（ＦＬＡＳＨ）が、ＧｔＡＣＲ１よりもτｏｆｆが短いことを報告している（非特許文献２）。しかしながら、波長感受域が狭いことに加え、τｏｎとτｏｆｆのいずれもが短い、優れた光反応特性を有する改変光受容クロライドチャネルについての報告は、これまでのところ存在しない。

Ｇｏｖｏｒｕｎｏｖａ，Ｅ．Ｇ．ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒａｌｌｉｇｈｔ－ｇａｔｅｄａｎｉｏｎｃｈａｎｎｅｌｓ：ａｆａｍｉｌｙｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎｓｆｏｒａｄｖａｎｃｅｄｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４９，６４７－６５０（２０１５）ＨｉｄｅａｋｉＥ．Ｋａｔｏｅｔａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｇａｔｉｎｇｉｎａｎｉｏｎｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎｓ．，Ｎａｔｕｒｅ，５６１，３４９－３５４（２０１８）

そこで本発明は、波長感受域が狭いことに加え、τｏｎとτｏｆｆのいずれもが短い、優れた光反応特性を有する改変光受容クロライドチャネルを提供することを目的とする。

本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意検討を行った結果、７回膜貫通タンパク質であるＧｔＡＣＲ１のＮ末端側から数えて４番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域を、ＧｔＡＣＲ１とともにグィラルディア・セータから単離された、ＧｔＡＣＲ１と同じ７回膜貫通タンパク質である光受容クロライドチャネル－２（ＧｔＡＣＲ２）の対応する領域（即ちＮ末端側から数えて４番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域）で置換することにより、波長感受域をＧｔＡＣＲ１とＧｔＡＣＲ２よりも狭くすることができることに加え、τｏｎとτｏｆｆのいずれもをＧｔＡＣＲ１とＧｔＡＣＲ２よりも短くすることができることを見出した。

上記の知見に基づいてなされた本発明の改変光受容クロライドチャネルは、請求項１記載の通り、ＧｔＡＣＲ１のＮ末端側から数えて４番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域が、ＧｔＡＣＲ２の対応する領域で置換されてなるポリペプチドであって、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドで構成される。
（ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号３に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ光受容クロライドチャネル機能を有するポリペプチド
また、本発明の改変光受容クロライドチャネルは、請求項２記載の通り、ＧｔＡＣＲ１のＮ末端側から数えて４番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域が、ＧｔＡＣＲ２の対応する領域で置換されてなるポリペプチドであって、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドで構成される。
（ａ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ光受容クロライドチャネル機能を有するポリペプチド
また、本発明のポリヌクレオチドは、請求項３記載の通り、請求項１又は２記載の改変光受容クロライドチャネルを構成するポリペプチドをコードする。
また、本発明の発現ベクターは、請求項４記載の通り、プロモーターと機能的に連結された請求項３記載のポリヌクレオチドを含む。
また、本発明の細胞は、請求項５記載の通り、請求項１又は２記載の改変光受容クロライドチャネルを構成するポリペプチドを発現する。
また、請求項６記載の細胞は、請求項５記載の細胞において、細胞が網膜を構成する細胞である。
また、本発明は、請求項７記載の通り、網膜外層の障害を患う被検体を治療するための医薬の製造における、請求項１又は２記載の改変光受容クロライドチャネルを構成するポリペプチド、請求項３記載のポリヌクレオチド、請求項４記載の発現ベクターのいずれかの使用である。
また、請求項８記載の使用は、請求項７記載の使用において、網膜外層の障害が、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、網膜はく離のいずれかである。
また、本発明の網膜外層の障害を治療するための医薬組成物は、請求項９記載の通り、請求項１又は２記載の改変光受容クロライドチャネルを構成するポリペプチド又は請求項４記載の発現ベクターのいずれかを有効成分として含む。

本発明によれば、波長感受域が狭いことに加え、τｏｎとτｏｆｆのいずれもが短い、優れた光反応特性を有する改変光受容クロライドチャネルを提供することができる。

実施例１における、ＣｈｉｍＧｔ１２発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドの構成である。試験例１において、ＣｈｉｍＧｔ１２がＧｔＡＣＲ１とＧｔＡＣＲ２よりも波長感受域が狭いことを示すグラフである。同、ＣｈｉｍＧｔ１２がＧｔＡＣＲ１とＧｔＡＣＲ２よりもτｏｎが短いことを示すグラフである。同、ＣｈｉｍＧｔ１２がＧｔＡＣＲ１とＧｔＡＣＲ２よりもτｏｆｆが短いことを示すグラフである。試験例３において、ＣｈｉｍＧｔ１２遺伝子を網膜に導入することで網膜厚の減少を有意に抑制することができることを示すグラフである。同、ＣｈｉｍＧｔ１２遺伝子を網膜に導入することで視細胞の過分極反応が増大することを示すグラフである。

本発明の改変光受容クロライドチャネルは、非特許文献１において報告されているグィラルディア・セータから単離されたＧｔＡＣＲ１の、Ｎ末端側から数えて４番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域が、ＧｔＡＣＲ２の対応する領域で置換されてなるポリペプチドである。ＧｔＡＣＲ１は、下記の２９５個のアミノ酸からなるポリペプチド（配列番号１）であり、そのＮ末端側から数えて４番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域は、Ａｓｎ１２３～Ｐｈｅ２１３である。ＧｔＡＣＲ２は、下記の２９１個のアミノ酸からなるポリペプチド（配列番号２）であり、そのＮ末端側から数えて４番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域は、Ａｓｎ１１９～Ｉｌｅ２０９である（ＧｔＡＣＲ１及びＧｔＡＣＲ２のアミノ酸配列については必要であれば例えば非特許文献１を参照）。

（ＧｔＡＣＲ１のアミノ酸配列）
MSSITCDPAIYGEWSRENQFCVEKSLITLDGIKYVQLVMAVVSACQVFFMVTRAPKVPWEAIYLPTTEM
TM1 TM2
ITYSLAFTGNGYIRVANGKYLPWARMASWLCTCPIMLGLVSNMALVKYKSIPLNPMMIAASSICTVFGI
TM3 TM4
TASVVLDPLHVWLYCFISSIFFIFEMVVAFAIFAITIHDFQTIGSPMSLKVVERLKLMRIVFYVSWMAY
TM5 TM6
PILWSFSSTGACIMSENTSSVLYLLGDALCKNTYGILLWATTWGLLNGKWDRDYVKGRNVDGTLMPEYE
TM7
QDLEKGNTERYEDARAGET
※ ＴＭ：膜貫通ドメイン

（ＧｔＡＣＲ２のアミノ酸配列）
MASQVVYGEWASTHTECYNMSRIDSTFVSLLQLVWAVVSGCQTIFMISRAPKVPWESVYLPFVESITYA
TM1 TM2
LASTGNGTLQMRDGRFFPWSRMASWLCTCPIMLGQISNMALVKYKSIPLNPIAQAASIIRVVMGITATI
TM3 TM4
SPAEYMKWLFFFFGATCLVFEYSVVFTIFQVGLYGFESVGTPLAQKVVVRIKMLRLIFFIAWTMFPIVW
TM5 TM6
LISPTGVCVIHENVSAILYLLADGLCKNTYGVILWSTAWGVLEGKWDPACLPGQEKPEADDPFGLNHEK
TM7
NAPPNDEVNIRMFGR
※ ＴＭ：膜貫通ドメイン

本発明の改変光受容クロライドチャネルは、ＧｔＡＣＲ１のＮ末端側から数えて４番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域が、ＧｔＡＣＲ２の対応する領域で置換されていることに加え、その他のドメインや領域がさらに改変されてなるポリペプチドであってもよい。例えば、ＧｔＡＣＲ１のＮ末端側から数えて３番目の膜貫通ドメインと４番目の膜貫通ドメインの間の細胞内ドメインや、６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインが、ＧｔＡＣＲ２の対応するドメインでさらに置換されてなるポリペプチドであってもよい。ＧｔＡＣＲ１とＧｔＡＣＲ２のそれぞれの、Ｎ末端側から数えて３番目の膜貫通ドメインと４番目の膜貫通ドメインの間の細胞内ドメイン、６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインは、上記の、ＴＭ３とＴＭ４の間のアミノ酸、ＴＭ６とＴＭ７の間のアミノ酸からそれぞれなる。

本発明の改変光受容クロライドチャネルの具体例としては、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。このポリペプチド（ＣｈｉｍＧｔ１２）は、ＧｔＡＣＲ１のＮ末端側から数えて４番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域が、ＧｔＡＣＲ２の対応する領域で置換され、さらに、６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインが、ＧｔＡＣＲ２の対応するドメインで置換されてなる。

また、本発明の改変光受容クロライドチャネルは、Ｎ末端に、クラミドモナス・レインハルトチイ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）由来のチャネルロドプシン－１のＮ末端領域、例えば、配列番号４に示すＣｈＲ１のアミノ酸配列の１～７１番目のアミノ酸の全部又は一部が付加されてなるポリペプチドであってもよい。その具体例としては、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。このポリペプチド（ｍＶ２Ｇｔ１２）は、ＣｈｅｍＧｔ１２のＮ末端に、配列番号４に示すＣｈＲ１のアミノ酸配列の１～２４番目のアミノ酸が付加されてなる。

本発明の改変光受容クロライドチャネルは、配列番号３，５のそれぞれに示すアミノ酸配列において、１個若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつ光受容クロライドチャネル機能を有するポリペプチドを含む。また、配列番号３，５のそれぞれに示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ光受容クロライドチャネル機能を有するポリペプチドを含む。ここで、「複数個」とは、５０個以下の整数、好ましくは３０個以下の整数、より好ましくは１０個以下の整数、例えば２～９個、２～７個、２～５個である。配列番号３，５のそれぞれに示すアミノ酸配列との配列同一性は、好ましくは少なくとも９１％であり、より好ましくは少なくとも９２％であり、より好ましくは少なくとも９３％であり、より好ましくは少なくとも９４％であり、より好ましくは少なくとも９５％であり、より好ましくは少なくとも９６％であり、より好ましくは少なくとも９７％であり、より好ましくは少なくとも９８％であり、最も好ましくは少なくとも９９％である。なお、同一性の％は、複数（２つ）のアミノ酸配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＤＡＮＡＳＹＳ、ＢＬＡＳＴなど）をデフォルトの設定で使用して算出した値をいう。また、「光受容クロライドチャネル機能を有する」とは、光を感受することで細胞の外側と内側の間でのイオン透過性を制御するチャネル機能を有することを意味することは当業者に周知の通りであり、光感受性の程度や光感受波長、イオン透過性の程度、τｏｎやτｏｆｆなどによって評価される生物学的活性の少なくとも１つが、配列番号３，５のそれぞれに示すアミノ酸配列からなるポリペプチドが有する生物学的活性と少なくとも同等であることが好ましい。

本発明の改変光受容クロライドチャネルは、遺伝子工学的手法により製造することができる。具体的には、まず、本発明の改変光受容クロライドチャネルをコードするポリヌクレオチド（以下、「本発明の改変光受容クロライドチャネル遺伝子」という）を調製する。本発明の改変光受容クロライドチャネル遺伝子は、当業者に公知の手法によって調製することができる。具体的には、例えば、ＧｔＡＣＲ１及びＧｔＡＣＲ２をコードするポリヌクレオチドの配列情報に基づいて化学合成することで調製することができる。また、それぞれのポリヌクレオチドの配列情報に基づき、それぞれのポリヌクレオチドの所望領域を増幅するＰＣＲプライマーを用いてそれぞれのポリヌクレオチドの所望領域を増幅し、例えばＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙシステム（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社）等を用いて連結することによって調製することもできる。次に、プロモーターと機能的に連結された本発明の改変光受容クロライドチャネル遺伝子を、宿主菌体内で複製維持が可能であり、コードされるポリペプチドを安定に発現させることができ、この遺伝子を安定に保持できる発現ベクターに組み込み、得られた組換え発現ベクターを用いて宿主を形質転換し、宿主において本発明の改変光受容クロライドチャネルを生産させることができる。組換え技術については、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９８４８１：５６６２や、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９８９）Ｓｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓなどを参照することができる。発現ベクターとしては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２８、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、及び他のプラスミドＤＮＡ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、及び他のプラスミドＤＮＡ）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、及び他のプラスミドＤＮＡ）、λファージ（λｇｔ１１やλＺＡＰ）、哺乳動物用プラスミド（ｐＣＭＶやｐＳＶ４０）、ウイルスベクター（例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどの動物ウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなどの昆虫ウイルスベクター）、植物用ベクター（例えばバイナリベクターｐＢＩ系）、コスミドベクターなどを用いることができる。ここで、「機能的に連結された」とは、プロモーター配列が目的のポリヌクレオチド配列の転写を開始することができるような、プロモーター配列と目的のポリヌクレオチド配列との間の機能的な結合をいう。プロモーターは特に制限されず、宿主に応じて適するプロモーターを選択すればよく、公知の構成的プロモーターや誘導性プロモーターを用いることができるが、構成的プロモーターを用いることが好ましい。その具体例としては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター、シナプシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ＣａＭＶプロモーター、解糖系酵素プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ｔｈｙ１プロモーター、ＧＲＫプロモーター、ＲＰＥＪプロモーターなどが挙げられる。本発明の改変光受容クロライドチャネルを特定の細胞で特異的に発現させることを目的として、これらのプロモーターの上流にその細胞で特異的に発現しているポリペプチド遺伝子の転写調節領域（例えば視細胞で特異的に発現しているＩＲＢＰ（Ｉｎｔｅｒｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｒｅｔｉｎｏｉｄｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）の転写調節領域（ＭａｒｊｏｒｉｅＮｉｃｏｕｄｅｔａｌ．，ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌｕｍｅ９，Ｉｓｓｕｅ１２，１０１３－１１０７，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００７））を結合したりしてもよい。本発明の改変光受容クロライドチャネル遺伝子の発現ベクターへの挿入は、例えば、本発明の改変光受容クロライドチャネル遺伝子にフランキングする制限酵素部位を作製又は連結し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより行う。発現ベクターは、プロモーター及び本発明の改変光受容クロライドチャネル遺伝子の他、必要に応じてエンハンサー及び他のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー（アンピシリン耐性マーカー、テトラサイクリン耐性マーカーなどの薬剤耐性遺伝子マーカー、ＬＥＵ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３などの栄養要求性相補遺伝子マーカー、ＡＰＨ、ＤＨＦＲ、ＴＫなどの優性選択マーカーなど）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）などを含んでもよい。宿主の形質転換は、プロトプラスト法、スフェロプラスト法、コンピテントセル法、ウイルス法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ジーンボンバートメント法、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーションなどを用いて行うことができる。こうして得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミンなどを含む培地を用いて適当な条件で培養する。形質転換体の培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、２５～３７℃で３～６時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液などを用いて行う。培養中は、必要に応じて、組換え発現ベクターに挿入した選択マーカーに応じて、アンピシリンやテトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。また、形質転換に使用する宿主は、本発明の改変光受容クロライドチャネルを発現できるものであれば特に制限されるものではなく、細菌（大腸菌や枯草菌）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）、動物細胞（ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞など）、昆虫細胞などが挙げられる。本発明の改変光受容クロライドチャネルは、形質転換体の培養により得られた培養物（培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞や菌体のホモジェネートなど）から一般的な方法によって分取や精製を行い、限外濾過濃縮、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化などによって、その活性を保持する形態で得ることができる。或いは、本発明の改変光受容クロライドチャネルは、単離や精製を行うことなく、本発明の改変光受容クロライドチャネルを発現する細胞の形態で提供してもよい。この場合、形質転換に使用する宿主細胞は、その後の用途に適した宿主細胞、例えば網膜を構成する細胞である神経細胞（視細胞、双極細胞、神経節細胞など）や網膜色素上皮細胞、好ましくヒトの網膜を構成する細胞であるが、その他の細胞であってもよい。また、本発明の改変光受容クロライドチャネルを医療用途に使用する場合には、本発明の改変光受容クロライドチャネルの発現ベクターの形態で提供してもよい。この場合には、細胞への導入効率、細胞内での複製維持、安定性、発現効率などに優れた発現ベクターを用いることが好ましい。このようなベクターとしては、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクター、（自立複製可能な）プラスミド、トランスポゾンなどを挙げることができる。本発明の改変光受容クロライドチャネルの発現ベクター作製用プラスミドは、例えばＴｏｍｉｔａＨｅｔａｌ．，ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ．２００７Ａｕｇ；４８（８）：３８２１－６や、ＳｕｇａｎｏＥｅｔａｌ．，ＩｎｖｅｓｔＯｐｈｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ．２００５Ｓｅｐ；４６（９）：３３４１－８に記載される方法に従って調製することができる。

ここで、本発明の改変光受容クロライドチャネル遺伝子としては、例えば、配列番号６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード）、配列番号７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコード）が挙げられる。しかしながら、本発明の改変光受容クロライドチャネル遺伝子は、これらのポリヌクレオチドに限定されず、これらのポリヌクレオチドの相補鎖に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、光受容クロライドチャネル機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。また、配列番号６，７のそれぞれに示す塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドであって、光受容クロライドチャネル機能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ここで、「ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーション」とは、例えば、３０～５０℃、３～４×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）、０．１～０．５％ＳＤＳ中で１～２４時間のハイブリダイゼーション、好ましくは４０～４５℃、３．４×ＳＳＣ、０．３％ＳＤＳ中で１～２４時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び１×ＳＳＣ溶液、０．２×ＳＳＣ溶液による室温での連続した洗浄などの条件が挙げられる。ただし、上記条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の要素や他の要素（例えば、ハイブリダーゼーションプローブの濃度、長さ及びＧＣ含量、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。

本発明の改変光受容クロライドチャネルは、波長感受域がＧｔＡＣＲ１とＧｔＡＣＲ２よりも狭いことに加え、τｏｎとτｏｆｆのいずれもがＧｔＡＣＲ１とＧｔＡＣＲ２よりも短い、優れた光反応特性を有するものである。波長感受域が狭いことは、神経細胞の興奮と抑制を制御するための波長域の選択性の設計を容易にする点において有効であり、τｏｎとτｏｆｆのいずれもが短いことは、神経細胞を高い時間分解能で制御することを可能にする点において有効である。従って、本発明の改変光受容クロライドチャネルや、これをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、視細胞の変性や消失によって視機能不全や視機能障害が生じることの抑制、生じてしまった視機能不全や視機能障害の改善などに寄与することで、網膜外層の障害を患う被検体の治療に有用である。ここで、「網膜外層の障害」とは、網膜外層に存在する視細胞が変性、消失するなどして視機能不全や視機能障害を生じているが、視細胞以外の細胞は依然として正常なままであったり、機能の一部が保持されていたりする任意の疾患をいう。このような疾患としては、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、網膜はく離などを挙げることができる。「被検体」とは、網膜外層の障害に起因して、失明している被検体や、失明のリスクを有する被検体を意味する。被検体はヒトに限らず、その他の哺乳動物であってもよい。その他の哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどが挙げられる。「網膜外層の障害を患う被検体の治療」とは、網膜外層の障害に起因して失明していたり、失明のリスクを有したりする被検体において、本発明の医薬の投与前と比較して、視機能を回復することを意味する。また、本発明の改変光受容クロライドチャネルは、脳や中枢・末梢神経系の障害、脊髄損傷、自己免疫疾患など、光反応が関係する各種の障害に対しても有用である。

本発明の医薬組成物は、本発明の改変光受容クロライドチャネルや、これをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有効成分とし、網膜外層の障害を患う被検体を治療するための医薬として製剤化される。その有効量は、所与の症状や用法について治療効果を与え得る量であり、動物を用いた試験、臨床試験の実施により当業者によって適宜決定されるが、投与対象とする被検体の年齢、体重、性別、疾患の状態や重篤度、投与方法などが考慮される。ウイルスの場合、ウイルス量は、例えば１０^１２～１０^１３ｃａｐｓｉｄｓ／ｍｌ（例えば、約１０^１３ｃａｐｓｉｄｓ／ｍｌ）である。医薬としての製剤化に際し、有効成分は１以上の薬学的に許容される担体と共に製剤化されてよい。薬学的に許容される担体としては、各種緩衝液、例えば生理食塩水、リン酸塩、酢酸塩などの緩衝液が挙げられる。医薬は、その他の治療成分を含んでよい。その他の治療成分としては、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、網膜はく離などの治療剤として公知の薬剤が挙げられる。医薬は、例えば局所投与用の注射剤、点眼剤、洗眼剤などに製剤化することができる。注射用製剤は、保存剤を添加して、例えばアンプルや複数回投与容器中の単位投与剤形として提供することができる。また、医薬は、好適なビヒクル、例えば発熱物質不含の滅菌水などで使用前に再構成するための凍結乾燥剤としてもよい。医薬の投与は、被検体の患部、すなわち網膜への直接的な注射や、硝子体への直接的な接触によって行うことが好ましい。

以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。

実施例１：配列番号３に示すアミノ酸配列からなる本発明の改変光受容クロライドチャネル（ＣｈｉｍＧｔ１２を発現する細胞の取得）
本発明者らによるＷＯ２０１１／０１９０８１に記載の方法に準じて次のようにして取得した。ＧｔＡＣＲ１のＮ末端側から数えて３番目の膜貫通ドメインと４番目の膜貫通ドメインの間の細胞内ドメインまでのアミノ酸をコードするポリヌクレオチド、ＧｔＡＣＲ２のＮ末端側から数えて４番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインと７番目の膜貫通ドメインの間の細胞外ドメインまでのアミノ酸をコードするポリヌクレオチド、ＧｔＡＣＲ１のＮ末端側から数えて７番目の膜貫通ドメインからＣ末端までのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドが連結され、その５’末端と３’末端に制限酵素配列を付加したポリヌクレオチドを化学合成し、アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入した。こうして調製したＣｈｉｍＧｔ１２発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドの構成を図１に示す。このプラスミドは、マルチクローニングサイトの３’領域に蛍光タンパク質遺伝子（ｖｅｎｕｓ）が配置されており、目的遺伝子はＣ末端領域にｖｅｎｕｓを付加した融合タンパク質として発現される。従って、このプラスミドをリン酸カルシウム法により細胞にトランスフェクトし、ｖｅｎｕｓを指標にしてＣｈｉｍＧｔ１２を発現する細胞を特定した。具体的には、このプラスミドの溶液（プラスミド量は１５μｇ）を加えたチューブに、１．５ｍＬの０．３ＭＣａＣｌ_２を加えて転倒攪拌した後、内容物を別のチューブに用意した１．５ｍＬの２ＸＨＢＳ（２８０ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１）に加え、再度転倒攪拌してから、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で培養したヒト胎児腎由来細胞株であるＨＥＫ（ＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＫｉｄｎｅｙ）２９３細胞に滴下添加することでプラスミドをトランスフェクトし、５％ＣＯ_２、３７℃で培養した。６時間後、培地を新鮮な培地に交換し、２日間培養した後、蛍光顕微鏡下で細胞を観察することで、細胞内におけるＣｈｉｍＧｔ１２の発現を確認した。

実施例２：配列番号５に示すアミノ酸配列からなる本発明の改変光受容クロライドチャネル（ｍＶ２Ｇｔ１２を発現する細胞の取得）
ＣｈｉｍＧｔ１２のアミノ酸をコードするコードするポリヌクレオチドの３’末端に、配列番号４に示すＣｈＲ１のアミノ酸配列の１～２４番目のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドが連結され、その５’末端と３’末端に制限酵素配列を付加したポリヌクレオチドを化学合成し、アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入すること以外は実施例１と同様にして、ｍＶ２Ｇｔ１２を発現する細胞を作製した。

試験例１：ＣｈｉｍＧｔ１２を発現する細胞のパッチクランプ法による光誘発電流及びτｏｎとτｏｆｆの測定
（測定方法）
ＣｈｉｍＧｔ１２を発現する細胞について、顕微鏡下でｖｅｎｕｓの発現を確認した後、パッチクランプシステム（ＥＰＣ－１０、ＨＥＫＡ）を用いて測定した。細胞外液は、１３８ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、４ｍＭＮａＯＨ、１ｍＭＣａＣｌ_２、２ｍＭＭｇＣｌ_２からなり、１ＮＨＣｌでｐＨ７．４に調整したものを用いた。電極内液は、１３０ｍＭＣｓＣｌ、１．１ｍＭＥＧＴＡ、２ｍＭＭｇＣｌ_２、０．１ｍＭＣａＣｌ_２、１０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、２ｍＭＮａ_２ＡＴＰからなり、１ＮＣｓＯＨでｐＨ７．２に調整したものを用いた。光照射（光源：ＬＥＤ）は１秒間、光強度は１μＷ／ｍｍ^２、刺激間隔は６０秒、固定電位は０ｍＶに設定した。波長は４０５、４５５、５０５、５６０、６１７、６５６ｎｍのそれぞれとした。

（測定結果）
光誘発電流の測定結果を図２に、τｏｎとτｏｆｆの測定結果を図３と図４に、それぞれ示す（ｎ＞１１）。それぞれの図には、ＣｈｉｍＧｔ１２を発現する細胞と同様にして取得した、ＧｔＡＣＲ１を発現する細胞（ｎ＝７）とＧｔＡＣＲ２を発現する細胞（ｎ＝８）についての測定結果をあわせて示す。図２から明らかなように、ＣｈｉｍＧｔ１２の波長感受域とＧｔＡＣＲ１の波長感受域を比較すると、短波長側は同等であったが、長波長側はＧｔＡＣＲ１よりもＣｈｉｍＧｔ１２の方が短かった。ＣｈｉｍＧｔ１２の波長感受域とＧｔＡＣＲ２の波長感受域を比較すると、長波長側は同等であったが、短波長側はＧｔＡＣＲ２よりもＣｈｉｍＧｔ１２の方が短かった。ＧｔＡＣＲ２は、光エネルギーがより大きい短波長側の４００ｎｍにおいて高い反応性を有していたことから、細胞の過分極による光障害の発生が懸念された。また、図３と図４から明らかなように、ＣｈｉｍＧｔ１２のτｏｎとτｏｆｆは、ＧｔＡＣＲ１とＧｔＡＣＲ２のそれらよりも、一部の波長において例外はあるが波長域全体として短かった。なお、ＣｈｉｍＧｔ１２を発現する細胞、ＧｔＡＣＲ１を発現する細胞、ＧｔＡＣＲ２を発現する細胞の、それぞれの蛍光画像を対比すると、ＧｔＡＣＲ１を発現する細胞とＧｔＡＣＲ２を発現する細胞には、細胞内においてＧｔＡＣＲ１やＧｔＡＣＲ２が適正な立体構造を保持していないことに起因すると思われる強い蛍光発光が認められたことから、細胞毒性の発生が懸念された。しかしながら、ＣｈｉｍＧｔ１２を発現する細胞には、こうした蛍光発光はほぼ認められなかった。

試験例２：ｍＶ２Ｇｔ１２を発現する細胞のパッチクランプ法による光誘発電流及びτｏｎとτｏｆｆの測定
試験例１と同様の測定方法によって、ＣｈｉｍＧｔ１２を発現する細胞と同様の測定結果を得た。

試験例３：アデノ随伴ウイルスベクターを用いたＣｈｉｍＧｔ１２遺伝子の網膜への導入とその効果
（実験方法）
アデノ随伴ウイルスベクターの作製
ＡＡＶヘルパーフリーシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪａｌｌａ，ＣＡ）を用い、そのマニュアルに従って、ＣｈｉｍＧｔ１２発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミド、ｐＡＡＶ－ＲＣ、ｐＨｅｌｐｅｒの３種類のプラスミドから、ＣｈｉｍＧｔ１２遺伝子を網膜に導入するためのアデノ随伴ウイルスベクターを作製した。具体的には、それぞれのプラスミドの溶液（プラスミド量はいずれも１５μｇ）を加えてタッピングしたチューブに、１．５ｍＬの０．３ＭＣａＣｌ_２を加えて転倒攪拌した後、内容物を別のチューブに用意した１．５ｍＬの２ＸＨＢＳ（２８０ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１）に加え、再度転倒攪拌してから、１５ｃｍ培養皿に培養した２９３Ｔ細胞に滴下添加することにより、３種類のプラスミドをリン酸カルシウム法によって共トランスフェクトし、５％ＣＯ_２、３７℃で培養した。３日間培養した後、回収した細胞から目的とするウイルス粒子を精製した。なお、ＣｈｉｍＧｔ１２発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドは、実施例１で調製したＣｈｉｍＧｔ１２発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドにおいて用いたＣＡＧプロモーターのかわりに、ＧＲＫプロモーター、または視細胞で特異的にＣｈｉｍＧｔ１２を発現させることを目的としてその上流に視細胞で特異的に発現しているＩＲＢＰ（Ｉｎｔｅｒｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｒｅｔｉｎｏｉｄｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）の転写調節領域（ＭａｒｊｏｒｉｅＮｉｃｏｕｄｅｔａｌ．，ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌｕｍｅ９，Ｉｓｓｕｅ１２，１０１３－１１０７，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００７）を結合したＲＰＥＪプロモーターを用いて調製した。また、コントロールとして、実施例１で調製したＣｈｉｍＧｔ１２発現アデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドと同様にしてｖｅｎｕｓのみを発現させるためのアデノ随伴ウイルスベクター作製用プラスミドを調製した。アデノ随伴ウイルスのセロタイプは、Ｍ８型（ＨｉｌｄａＰｅｔｒｓ－Ｓｉｌｖａｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．３，４６３－４７１，Ｍａｒ．２００９に従って８型のキャプシドタンパク質の７３３番目のＴｙｒをＰｈｅに置換した変異型）またはＤＪ型（フナコシ社）を用いた。
実験動物
１６週齢または２４週齢のＰ２３Ｈ（系統２）ラットを用いた。Ｐ２３Ｈラットは、生後いったん正常に網膜が形成されるが、穏やかに視細胞の変性が進行し、生後４ヶ月で視細胞が半数程度消失する。その後も穏やかに視細胞の変性が進行し、最終的に視細胞がほぼ消失して失明に至る。
ＣｈｉｍＧｔ１２遺伝子の網膜への導入
ケタミン（６６ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（３．３ｍｇ／ｋｇ）の混合麻酔下で、Ｐ２３Ｈラットの両眼の眼球結膜を１ｍｍ程度切開し、毛様体扁平部から３２ゲージマイクロシリンジを刺入して硝子体内に５μＬのウイルス溶液を注入した。または、眼球結膜の上方を切開し、視神経から約１ｍｍ程度離れた場所において、３０ゲージニードルで強膜に傷をつけ、その部位から３２ゲージマイクロシリンジで３μＬのウイルス溶液を網膜下投与した。
網膜厚の測定
ウイルスの投与前と投与後１ヵ月毎に、ケタミン（６６ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（３．３ｍｇ／ｋｇ）の混合麻酔下で、１％のアトロピンと２．５％のフェニレフリン塩酸塩により散瞳した状態で、網膜光干渉断層計（ＯＣＴ）（ＮＩＤＥＫ社のＲＳ－３０００）を用いて行った。
網膜電図の測定
ウイルスの投与前と投与後１ヵ月毎に、ケタミン（６６ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（３．３ｍｇ／ｋｇ）の混合麻酔下で、１％のアトロピンと２．５％のフェニレフリン塩酸塩により散瞳した状態で、網膜電図を測定し、誘発反応記録装置（メイヨー社のＰｕＲＥＣ）を用いて記録した。光刺激強度は、０．０１、３．０、１０．０ｃｄ・ｓ／ｍ^２の３段階とした。

（実験結果）
網膜厚の測定結果を図５に示す。図５から明らかなように、ウイルスを硝子体内投与してｖｅｎｕｓのみを発現させた場合（ＣＡＧ－Ｖｅｎｕｓ－Ｍ８ｉ．ｖ．）、投与後１ヵ月で、網膜全層（ＩＬＭ－ＲＰＥ）、視細胞層（ＯＮＬ－ＲＰＥ）、外顆粒層（ＯＮＬ）の厚みは、投与前の厚みを１００とすると、それぞれ約７５、約７０、約６５にまで減少し、その後も減少し続けた。これに対し、ウイルスを硝子体内投与（ｉ．ｖ．）または網膜下投与（ｓｕｂｒｅｔｉｎａ）してＣｈｉｍＧｔ１２を発現させた場合、それぞれの厚みの減少を有意に抑制することができた。網膜電図の測定結果を図６に示す。図６から明らかなように、ウイルスを硝子体内投与してｖｅｎｕｓのみを発現させた場合、投与前より視細胞の過分極反応が大きく減少した。これに対し、ウイルスを硝子体内投与または網膜下投与してＣｈｉｍＧｔ１２を発現させた場合、投与後１カ月で視細胞の過分極反応が一部の例外を除いて投与前より増大した（光刺激強度が０．０１ｃｄ・ｓ／ｍ^２ではａ波は測定できなかった）。このことから、ＣｈｉｍＧｔ１２は、視細胞の変性を単に抑制するだけでなく、視細胞の機能を向上させる効果を有することが考えられた。

本発明は、波長感受域が狭いことに加え、τｏｎとτｏｆｆのいずれもが短い、優れた光反応特性を有する改変光受容クロライドチャネルを提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。

Claims

グィラルディア・セータ由来の光受容クロライドチャネル－１（ＧｔＡＣＲ１）のＮ末端側から数えて４番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域が、グィラルディア・セータ由来の光受容クロライドチャネル－２（ＧｔＡＣＲ２）の対応する領域で置換されてなるポリペプチドであって、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドで構成される改変光受容クロライドチャネル。
（ａ）配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号３に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ光受容クロライドチャネル機能を有するポリペプチド
グィラルディア・セータ由来の光受容クロライドチャネル－１（ＧｔＡＣＲ１）のＮ末端側から数えて４番目の膜貫通ドメインから６番目の膜貫通ドメインまでの領域が、グィラルディア・セータ由来の光受容クロライドチャネル－２（ＧｔＡＣＲ２）の対応する領域で置換されてなるポリペプチドであって、以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドで構成される改変光受容クロライドチャネル。
（ａ）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ光受容クロライドチャネル機能を有するポリペプチド
請求項１又は２記載の改変光受容クロライドチャネルを構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
プロモーターと機能的に連結された請求項３記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
請求項１又は２記載の改変光受容クロライドチャネルを構成するポリペプチドを発現する細胞。
細胞が網膜を構成する細胞である請求項５記載の細胞。
網膜外層の障害を患う被検体を治療するための医薬の製造における、請求項１又は２記載の改変光受容クロライドチャネルを構成するポリペプチド、請求項３記載のポリヌクレオチド、請求項４記載の発現ベクターのいずれかの使用。
網膜外層の障害が、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、網膜はく離のいずれかである請求項７記載の使用。
請求項１又は２記載の改変光受容クロライドチャネルを構成するポリペプチド又は請求項４記載の発現ベクターのいずれかを有効成分として含む網膜外層の障害を治療するための医薬組成物。