CN107531765B - 阴离子通道视紫红质的组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

用于鉴别和表征源自于藻类的一类新的视紫红质的方法和组合物，其为高度敏感和有效的阴离子传导的通道视紫红质。这些阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域已在哺乳动物系统中克隆和表达且因此尤其可用于光基因应用中并且作为电活性细胞介导的病症的治疗剂。

Description

阴离子通道视紫红质的组合物及其使用方法
本申请要求2015年3月19日提交的美国临时申请序号62/135,470、2015年4月20日提交的序号62/149,812以及2015年12月1日提交的序号62/261,821的优先权权益，这些申请的全部内容以引用的方式并入。
本发明在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助号R37GM027750、R21MH098288及S10RR022531下在美国政府支持下完成。政府对本发明享有一定权利。
发明背景
1.发明领域
本公开总体上涉及利用来源于藻类的通道视紫红质且更具体地阴离子传导的通道视紫红质的方法和组合物，所述阴离子传导的通道视紫红质对于光基因应用或治疗剂使用具有新型特征。
2.现有技术的描述
光基因(Deisseroth.Nat Methods 8(1)：26-9，2011)是指使用光学方法来探测和控制完整的神经回路内的遗传靶向神经元。光基因涉及光激活的通道和酶的引入，由此允许以毫秒精度操控神经活动，同时通过使用特定的靶向机制维持细胞类型分辨。因为大脑为一个高速的系统，所以毫秒尺度的时间精度对于光基因概念来说很重要，这允许探测特定的动作电位模式在所限定的细胞中的因果作用。
在绿色有鞭毛的藻类中运动行为的光控制(趋光性和避光反应)是由与原核生物中的趋光性受体和光驱动的离子转运蛋白同源的感觉视紫红质来介导。在趋光性过程中，海藻的感觉视紫红质的激发造成跨膜光感受器电流的产生。当在动物细胞中表达时，海藻趋光性受体用作光门控阳离子通道，其被称为“通道视紫红质”。通道视紫红质成为了细胞活动的光控制的有用的分子工具。
最初，这些光激活通道和酶的来源为若干微生物视蛋白，包括通道视紫红质-2(ChR2)，即来自藻类的单组分光激活的阳离子通道，其在哺乳动物中允许毫秒尺度的时间控制，仅需要一个基因表达以便发挥作用并对具有发色团(视黄醛)的可见光谱的光作出反应，所述发色团已经存在并通过哺乳动物脑组织供应给ChR2。ChR2的实验效用在从有行为的哺乳动物到如苍蝇、蠕虫和斑马鱼的经典模型生物体的多种动物模型中得到快速证明，并且数百组采用了ChR2及相关微生物蛋白来研究神经回路。目前，此家族的若干成员已经募集作为用于光基因的分子工具，即用光来调节细胞活动。来自绿色(绿色植物)有鞭毛的藻类(6)的趋光性受体，最有名的是通道视紫红质(ChR)，由于其可用作光门控阳离子通道而被广泛用于使易兴奋细胞的遗传目标群体去极化。
视紫红质离子泵的超极化已用于抑制神经元激发，但其每个捕获的光子仅转运单个电荷且因此具有有限的能力。近来，ChR被工程化以传导Cl-，但这些光基因工具仍保留一些阳离子电导并且在额外的突变下可以是高度感光的，仅以极大地减缓慢通道动力学为代价(J.Wietek等人，Science344，409(2014)及A.Berndt，S.Y.Lee，C.Ramakrishnan，K.Deisseroth，Science 344，420(2014))。对于光基因超极化来说理想的是通过演化为高度传导性和阴离子选择性的而优化的天然光门控的阴离子通道。
本文描述了来源于一类新鉴别的通道视紫红质、即阴离子通道视紫红质(ACR)、光门控阴离子通道的经修饰和优化的视紫红质域，其通过光门控的氯离子传导提供高度敏感和有效的膜超极化和神经元沉默。
发明概要
本公开的方法和组合物部分基于一类新型的通道视紫红质、即阴离子通道视紫红质(ACR)的发现和鉴别。来自绿色植物藻类的光门控视紫红质阳离子通道通过其作为膜去极化光基因工具的用途而对神经科学研究进行了转化，所述光基因工具用于靶向神经元激发的光活化。神经元动作电位的光抑制受到缺乏用于膜超极化的同等有效工具的限制。本文描述了阴离子通道视紫红质(ACR)，即一种新的光门控阴离子通道家族，其通过光门控的氯离子传导提供高度敏感和有效的膜超极化和神经元沉默。ACR严格地传导阴离子，完全排除质子和更大的阳离子，并且与最有效的目前可用的光基因蛋白相比，以低3000倍的光强度在快100倍的动力学下使膜超极化。编码蓝隐藻视蛋白的7TM结构域(295、291及288aa，分别对应于JGI蛋白质模型111593、146828及161302)的序列是针对人类密码子使用而优化并合成。编码功能性构建体111593(GtACR1：SEQ ID NO 1)和146828(GtACR2：SEQ ID NO：3)的序列信息将在GenBank(分别为登录号KP171708和KP171709)中表示。表达GtACR2的神经元的照射完全抑制了它们的动作电位峰值。这些ACR提供用于建立高水平的膜电位的新型膜超极化工具，其是用作使兴奋的细胞的神经元沉默的光基因工具，尤其用于神经元或神经病症，如但不限于帕金森氏病和癫痫并且还用于心脏病症。因此，本文所提供的ACR可充当用于治疗癫痫以及用于心脏病症的新型膜超极化工具。
在一些实施方案中，本文公开了一种与异源启动子序列可操作地连接的重组核酸，所述重组核酸包含：编码与选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13组成的组的序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的肽的序列；或编码包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的225个连续氨基酸的肽的序列；或与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14-15的核苷酸序列或其互补序列杂交的序列。在另一实施方案中，重组核酸包含表达载体。在重组核酸的另一实施方案中，与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14-15的核苷酸序列或其互补序列杂交的序列进一步包括在65℃下在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠、1mM EDTA中与滤膜结合的DNA杂交并且在42℃下在0.2x SSC/0.1％SDS中洗涤。在又一实施方案中，公开了一种重组宿主细胞，其包含与异源启动子序列可操作地连接的重组核酸，所述重组核酸包含：编码与选自SEQID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的氨基酸序列有至少70％同源性的肽的序列；或编码包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的225个连续氨基酸的肽的序列；或与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：14-15的核苷酸序列或其互补序列杂交的序列。
在其它实施方案中，ACR可在有或没有动作电位的诱导下用作神经元或心肌细胞的隔室中的膜去极化工具。因此，在一些方面中，实施方案的ACR编码序列进一步包含靶向宿主细胞的隔室中的编码mRNA或多肽的信号序列。
在一些实施方案中，宿主细胞为：分离的人细胞；非人哺乳动物细胞；细菌细胞；酵母细胞；昆虫细胞；或植物细胞。
在替代实施方案中，可使用基于CRISPR相关蛋白-9核酸酶(Cas9)的系统将所述核酸序列靶向细胞的基因组，所述Cas9系统是用于基因组编辑和基因组靶向。在一些实施方案中，向一些细胞的递送可能需要递送系统，如但不限于基于慢病毒(LV)、腺病毒(AdV)及腺相关(AAV)的那些。
在一些实施方案中，公开了一种使患有视力受损或失明的受试者的视网膜的感光性恢复的方法，所述方法包括：向所述受试者的视网膜的OFF双极神经元递送包含编码与选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13组成的组的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的多核苷酸的表达载体，所述编码序列编码可在视网膜神经元中表达的ACR的视紫红质域；以及在所述视网膜神经元中表达所述载体，其中所述表达的视紫红质致使所述视网膜神经元有感光性，由此恢复感光性以便在所述视网膜或其一部分中实现这类神经元的光诱发的沉默。在又一实施方案中，受试者为哺乳动物，且在更进一步的实施方案中，受试者为人。在一个实施方案中，公开了一种使患有视力受损或失明的受试者的视网膜感光性恢复的方法，所述方法包括：向所述受试者的视网膜递送表达载体，其中所述递送包括药学上可接受的载剂。
在另一些实施方案中，提供一种分离的核酸分子，其包含编码具有与根据SEQ IDNO：15-24的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的阴离子传导的通道视紫红质的序列。在某些方面中，分离的核酸分子包含在严格条件下与SEQ ID NO：15-24中的一个的核苷酸序列杂交的序列，包括在65℃下在0.5MNaHPO4、7％十二烷基硫酸钠、1mM EDTA中与滤膜结合的DNA杂交并且在42℃下在0.2x SSC/0.1％SDS中洗涤。并且编码阴离子传导的通道视紫红质。在一些方面中，所述核酸为DNA。在其它方面中，所述核酸为RNA(例如，mRNA)。在其它实施方案中，提供一种表达载体，其包含本文所提供的核酸分子，如与根据SEQ ID NO：15-24的序列具有至少约90％同一性的序列。
在甚至进一步的实施方案中，提供一种重组宿主细胞，其包含本文所提供的核酸(例如，与根据SEQ ID NO：15-24的序列具有至少约90％同一性的序列)。在一些方面中，宿主细胞为分离的人细胞。在其它方面中，宿主细胞为非人哺乳动物细胞。在一些方面中，宿主细胞为细菌细胞。在某些方面中，宿主细胞为酵母细胞。在其它方面中，宿主细胞为昆虫细胞。在一些方面中，宿主细胞为植物细胞。在某些方面中，宿主细胞为分离的神经元细胞。具体说来，宿主细胞为分离的电活性细胞。
在另一实施方案中，提供一种治疗患有涉及电活性细胞的病症的受试者的方法，所述方法包括在受试者中在电活性细胞的位点处表达有效量的阴离子传导的通道视紫红质。在一些方面中，所述受试者患有神经性疼痛，所述方法包括在受试者中在疼痛部位处表达有效量的阴离子传导的通道视紫红质。在某些方面中，所述受试者患有断肢、糖尿病、多发性硬化症或已经历手术。
在某些方面中，表达包括向受试者施用阴离子传导的通道视紫红质。在一些方面中，阴离子传导的通道视紫红质包含与SEQ ID NO：1、3或13的序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些方面中，阴离子传导的通道视紫红质是由与根据SEQ ID NO：2、4或14-17的序列具有约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列来编码。在一些方面中，阴离子传导的通道视紫红质进一步包含细胞穿透肽(CPP)序列或细胞受体结合序列。如本文所用，术语“细胞穿透肽”是指允许多肽穿过细胞膜(例如，在真核细胞的情况下为质膜)的多肽序列的区段。CPP区段的实例包括但不限于源自于以下的区段：HIV Tat(例如，GRKKRRQRRRPPQ；SEQID NO：25)、疱疹病毒VP22、果蝇触角同源异型框基因产物、抗微生物肽I、穿膜肽(RQIKIWFQNRRMKWKK；SEQ ID NO：26)或蜂毒素(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ；SEQ ID NO：27)。在某些方面中，CPP包含T1(TKIESLKEHG；SEQ ID NO：28)、T2(TQIENLKEKG；SEQ ID NO：29)、26(AALEALAEALEALAEALEALAEAAAA；SEQ ID NO：30)或INF7(GLFEAIEGFIENGWEGMIEGWYGCG；SEQ ID NO：31)CPP。
在一些方面中，表达包括向受试者施用编码阴离子传导的通道视紫红质的载体。在某些方面中，所述载体为RNA载体。在其它方面中，所述载体为DNA载体。在一些方面中，所述载体为质粒、病毒载体或附加型载体。在某些方面中，所述载体进一步包含自杀基因的诱导型表达盒。
在某些方面中，编码阴离子传导的通道视紫红质的序列与异源启动子可操作地连接。在一些方面中，启动子为诱导型或阻抑型启动子。在某些方面中，启动子为组织或细胞类型特异性启动子。具体说来，启动子为神经元细胞特异性启动子。
如本文所用，就指定组分而言的“基本上不含”在本文中用于指示指定组分没有有意地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。由组合物的任何非预期污染产生的指定组分的总量因此远低于0.01％。最优选为一种组合物，其中用标准分析方法检测不到指定组分的量。
如本说明书中所用，“一个”或“一种”可意为一个/种或多个/种。如在权利要求书中所用，当与词语“包含(comprising)”连用时，词语“一个”或“一种”可意为一个/种或多于一个/种。
虽然本公开支持仅指替代项和“和/或”的定义，但是除非明确指出仅为替代项或替代项是互斥的，权利要求书中的术语“或”指“和/或”。如本文所用，“另一”可意指至少第二或更多。
本申请的通篇中，使用的术语“约”是指数值包括测定数值所用的设备、方法中所内在的误差变化，或者研究受试者之间存在的变化。
本发明的其它目标、特征和优点将由以下详细说明变得显而易见。然而，应理解，详细说明和具体的实施例虽然表示本发明的优选实施方案，但仅以示例的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种改变和修改在本领域技术人员阅读此详细说明之后将变得显而易见。
附图简述
以下附图形成本说明书的一部分并且被纳入以进一步说明本发明的某些方面。可结合本文提供的具体实施方案的详细说明参照这些附图中的一幅或多幅更透彻地理解本发明。专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在提出请求并交纳必要费用的情况下，可以由局方提供该具有彩图的专利或专利申请公报的副本。
图1A-F：蓝隐藻ACR的系统发生与感光性。(A)阳离子通道视紫红质(CCR)和阴离子传导的通道视紫红质(ACR)的系统发生树。(B和C)跨膜螺旋2(B)和3(C)的ClustalW比对。缩写的生物体名称是：Gt，蓝隐藻；Cr，莱茵衣藻；Ca，奥古斯都衣藻；Mv，淡水绿藻；Hs盐沼盐杆菌；Nm，Nonlabens marinus。最后一个残基编号在右侧示出。在螺旋2中的保守Glu残基以黄色突出显示，且在细菌视紫红质Asp85的位置中的Glu残基以红色突出显示。(D)(主图)在HEK293细胞中响应于-60mV下的饱和光脉冲的GtACR1、GtACR2及CrChR2的光电流。(插图)平均峰值振幅(实心柱)和稳态(阴影柱)电流(n＝18-20个细胞)。基于噪声分析，GtACR2的整体电导比针对最广泛使用的阳离子传导通道视紫红质CrChR2所报告的大25倍。(E)峰值和稳态电流振幅及升高速率对刺激强度的依赖性。(F)光电流的作用光谱。
图2A-D：ACR不传导阳离子。在从-60mV以20-mV步进变化的Eh下在HEK293细胞中由GtACR1(A)和GtACR2(B)生成的光电流(从下到上；对于液体接界电位(LJP)值(表1)。吸移管溶液为标准，而浴溶液如所示。(C)在不同的浴pH下测量的电流-电压关系。将数据(平均值±SEM，n＝4-6个细胞)针对LJP校正并针对在pH 7.4和-60mV下测量的值进行归一化。给出了CrChR2的代表性数据以供比较。(D)随着浴的阳离子组成变化而测量的Erev位移。数据为平均值±SEM(n＝3-6个细胞)。
图3A-D：ACR的阴离子选择性。在从-60mV以20-mV步进变化的Eh下在HEK293细胞中由GtACR1(A)和GtACR2(B)生成的光电流(从下到上；对于液体接界电位(LJP)值(表1)。吸移管溶液为标准，而浴溶液如所示。(C)在浴中在不同的Cl-浓度下测量的电流-电压关系。将数据(平均值±SEM，n＝4-6个细胞)针对LJP校正并针对在156mM Cl-和-60mV下测量的值进行归一化。竖直虚线展示在所用浴浓度下针对Cl-的能斯脱平衡电位。(D)随着浴的阴离子组成变化而测量的Erev位移。数据为平均值±SEM(n＝3-6个细胞)。
图4A-F：作为超极化工具的GtACR2。(A和C)在从-80mV以20-mV步进变化的Eh下在HEK293细胞(A)中及在吸移管中以低Cl-浓度和在浴中以高Cl-浓度培养的锥体细胞(C)中由GtACR2生成的光电流(从下到上；对于LJP值(表1和2)。(B)在20mV下在HEK293细胞中由GtACR2和古紫质-3(Arch)生成的光电流的光强度依赖性。关于慢Cl-传导的ChR变体的数据是来自J.Wietek等人，(2014)同上及A.Berndt，等人，(2014)同上。箭头指示感光性的差异。(D)在如(C)所示的神经元中测量的电流-电压关系。将数据(平均值±SEM，n＝5个细胞)针对LJP校正(表2)。竖直虚线指示静息电位(Erest)。关于Cl-传导的ChR变体的数据是来自J.Wietek等人，(2014)同上及A.Berndt，等人，(2014)同上。(E)在表达GtACR2的神经元中通过脉冲(10ms，10kHz)电流注入所诱发的尖峰形成的光抑制。光强度为8.5E-3mW/mm2。(F)电诱发的尖峰的光强度依赖性。在暗和明中在电诱发的信号之间的振幅差异如所示进行计算。
图5：蓝隐藻蛋白质模型的系统发生树。与微生物视紫红质同源的模型是在由联合基因组研究所(JGI)测序计划(参见万维网：genome.jgi.doe.gov/Guith1/Guith1.home.html)所预测的那些中选择并且使用ClustalW比对。该树是使用邻接法构建。GtR1、GtR2及GtR3为先前所鉴别的蛋白质。八个模型在共价连接到已知的视紫红质中的视黄醛上的第七跨膜螺旋中缺乏保守的Lys残基，且因此应被视为视蛋白相关蛋白。
图6A-B：在浴中不同的Cl-浓度下测量的GtACR1的电流-电压关系。(A)数据(平均值±SEM，n＝4-6个细胞)是针对液体接界电位并且针对在156mM Cl-和-60mV下测量的值进行归一化。竖直虚线展示在所用浴浓度下针对Cl-的能斯脱平衡电位。(B)在吸移管中用低Cl浓度和在浴中用高Cl浓度的HEK293细胞中由GtACR1(图6B)生成的光电流。该膜电位在放大器输出下从-80mV以20-mV步进变化。
图7A-7D：(A-C)示出了在响应于1-s光脉冲(520nm)的放大器输出(从下到上)下在从-60mV以20-mV步进变化的膜电位下在HEK293细胞中由PsuACR1生成的光电流。吸移管和浴溶液的Cl-浓度如所示。(D)用图例中所示的溶液测量的峰值电流(IE曲线)的电压依赖性。数据(平均值±SEM，n＝4-9个细胞)是针对用标准溶液在-60mV下测量的值来归一化并针对液体接界电位进行校正。
图8：示出了从由不渗透的Asp-(对于阴离子)或不渗透的NMG+(对于阳离子)得到的值，随着浴的阴离子(左)或阳离子(右)组成的变化而测量的PsuACR1光电流的Erev位移。数据为平均值±SEM(n＝3-9个细胞)
图9：PsuACR1光电流的作用光谱。
图10：(a)在放大器输出下，在指示电压下响应于激光光激发(6ns，532nm)由PsuACR1生成的典型光电流(黑色实线)。将电流衰减用三个指数拟合(虚线)，在绘图中示出的时间常数衍生于此。(b)作为峰值振幅减至50％所需的时间的倒数而计算出的三个已知ACR的通道关闭速率。(c)电流衰减分量的振幅的电压依赖性。(d)在用分别在520、515及470nm下饱和强度的5-ms光脉冲的双闪实验中测量的PsuACR1、GtACR1及GtACR2的峰值电流的暗恢复。绘图上的数字表示对于每种蛋白质50％峰值恢复所需的暗间隔时间。图b-d中的数据点为平均值±SEM(n＝3-8个细胞)。
图11：(a)在通道电流的逆转电位下从PsuACR1上记录的快速负电流(实线，左轴)及其上升和衰减的指数拟合(虚线)，以及在放大器输出下在-60mV下从同一细胞上记录的通道电流(虚线，右轴)。(b)在表达PsuACR1的典型细胞中的快速负电流(正方形和实线，左轴)和通道电流(圆形和虚线，右轴)的电压依赖性。(c)快速负电流对浴pH的依赖性。数据点为平均值±SEM(n＝3-5个细胞)
图12：ACR与莱茵哈德衣藻CCR的视紫红质域的ClustalW比对。左侧的数字示出了每个序列片段的最后一个残基编号。在CCR的螺旋2和3中保守的羧酸酯残基以红色突出显示；在ACR中相应的极性和非极性残基分别以绿色和黄色突出显示。
图13：PsuACR1电流衰减分量的时间常数的电压依赖性。数据点为平均值±SEM(n＝8个细胞)。
序列表说明
序列表展示了源自于编码蓝隐藻视蛋白的7TM结构域(295、291及288aa，分别对应于JGI蛋白质模型111593、146828及161302)的序列的阴离子通道视紫红质域的氨基酸和核酸序列是针对人类密码子使用而优化并合成。
SEQ ID NO：1为GtACR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2为编码GtACR1的核酸序列。
SEQ ID NO：3为GtACR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4为编码GtACR2的核酸序列。
SEQ ID NO：5为Gt161302的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6为编码Gt161302的核酸序列。
SEQ ID NO：7为CrChR1(莱茵衣藻通道视紫红质1，也称为衣藻属感觉视紫红质A：GenBank登录号AF508965)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8为CrChR2(莱茵衣藻通道视紫红质2，也称为衣藻属感觉视紫红质B：GenBank登录号AF508966)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9为CaChR1(奥古斯塔(augustae)衣藻(拟衣藻)通道视紫红质1：GenBank登录号JN596951)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10为MvChR1(淡水绿藻(Mesostigma viride)通道视紫红质1：GenBank登录号JF922293)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11为HsHR(盐沼盐杆菌嗜盐菌视紫红质：GenBank登录号WP_010902090.1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12为NmHR(Nonlabens marinus氯泵视紫红质：GenBank登录号BAO55276.1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13为PsuACR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：14为编码PsuACR1的合成核酸序列。
SEQ ID NO：15为编码PsuACR1的合成核酸序列。
SEQ ID NO：16为编码GtACR1的合成核酸序列。
SEQ ID NO：17为编码GtACR2的合成核酸序列。
SEQ ID NO：18为编码Gt161302的合成核酸序列。
SEQ ID NO：19为编码CrChR1的合成核酸序列。
SEQ ID NO：20为编码CrChR2的合成核酸序列。
SEQ ID NO：21为编码CaChR1的合成核酸序列。
SEQ ID NO：22为编码MChR1的合成核酸序列。
SEQ ID NO：23为编码HsHR的合成核酸序列。
SEQ ID NO：24为编码NmHR的合成核酸序列。
具体实施方式
直到最近才发现通道视紫红质为趋光性受体，其当转染到动物细胞中时用作光门控的阳离子通道，用于神经元激发的光活化。本文描述了一类新的光门控通道、阴离子通道视紫红质(ACR)，其通过光门控的氯离子传导提供高度敏感和有效的膜超极化和神经元沉默。ACR严格地传导阴离子，完全排除质子和更大的阳离子，并且与最有效的目前可用的光基因蛋白相比，以低3000倍的光强度在快100倍的动力学下使膜超极化。
通过筛选若干海藻物种中的趋光性受体电流，鉴别并表征具有快速动力学的高效ACR。在一些实施方案中，所公开的方法提供一种便于鉴别和表征来自藻类的特别有用的通道视紫红质的技术。
I.定义
在本公开中，除非另外特别陈述，单数的使用包括复数，词语“一个”或“一种”意指“至少一个/种”，且“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其它形式如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不受限制。还有，除非另外特别说明，术语如“元素”或“组分”包括含有一个单位的元素和组分以及含有一个以上单位的元素或组分这两种情况。
如本文所用，术语“约”当结合百分比或其它数值量使用时意指加上或减去10％的该百分比或其它数值量。例如，术语“约80％”应包括80％加上或减去8％。
文中使用的小节标题只是为了使结构清晰，而不是要限制其描述的主题。本申请中所引用的包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍及论文的所有文献或文献中的部分都特此出于所有目的以引用的方式明确地并入本文。如果并入的文献及相似材料中的一个或多个以与本申请中的术语的定义相抵触的方式定义该术语，那么以本申请为准。
如本文所用，且除非另外指出，术语涉及电活性细胞的病症如但不限于神经元功能障碍、神经元介导的病症、眼部病症或心脏病症(本发明的方法和组合物可用于所述病症)包括但不限于神经元功能障碍；脑、中枢神经系统、周围神经系统的病症；神经系统疾病、记忆障碍和学习障碍、心律失常、帕金森氏病、癫痫、眼部病症、脊髓损伤、与但不限于自身免疫疾病(例如多发性硬化症、格林巴利综合征、重症肌无力、狼疮及炎性肠病)有关的神经痛；癌症及用于治疗其的化疗和放射线；压迫/外伤(例如颈部的受压迫神经、挤压伤和腕管综合征)；糖尿病性神经病变；药物副作用；及有毒物质；运动神经元疾病(例如肌萎缩性侧索硬化、进行性延髓麻痹、进行性肌萎缩及原发性脊髓侧索硬化)；营养缺乏症(例如维生素B6和B12)；感染性疾病；与但不限于湿疹、特应性皮炎皮肤干燥及过敏性瘙痒有关的瘙痒感；改变交感神经活动的疾病和病症等。
如本文所用，且除非另外指出，术语眼部病症包括但不限于影响眼前段和后段的发育异常，本发明的方法和组合物可针对所述眼部病症改善视力的一个或多个参数。前段病症包括但不限于青光眼、白内障、角膜营养不良、圆锥形角膜。后段病症包括但不限于由光感受器功能失常所引起的致盲病症和/或由视网膜营养不良和变性引起的死亡。视网膜病症包括先天性静止性夜盲、年龄相关的黄斑变性、先天性锥体营养不良以及一大组色素性视网膜炎(RP)相关病症。
如本文所用，且除非另外指出，术语“治疗(treat)”、“处置(treating)”、“治疗(treatment)”和“疗法”包括在患者患有涉及电活性细胞的病症时发生的行为，所述病症如但不限于神经元功能障碍、神经元介导的病症、眼部病症或心脏病症，并且该行为降低一种或多种症状的严重性或这类病症的影响。在上下文允许时，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”还指的是为确保在涉及电活性细胞的病症(如但不限于神经元功能障碍、神经元介导的病症、眼部病症或心脏病症并且其降低严重性)的升高风险下的个体能够在涉及电活性细胞的病症(如但不限于神经元功能障碍、神经元介导的病症、眼部病症或心脏病症并且其降低严重性)发作之前接受合适的手术和/或其它医疗干预而采取的行为。如本文所用，且除非另外指出，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、和“预防(prevention)”包括在患者开始患上涉及电活性细胞的病症之前发生的行为，所述病症如但不限于神经元功能障碍、神经元介导的病症、眼部病症或心脏病症，所述行为延迟涉及电活性细胞的病症(如但不限于神经元功能障碍、神经元介导的病症、眼部病症或心脏病症)的发作、和/或抑制或降低其严重性。
如本文所用，且除非另外指出，术语“处置(manage)”、“处置(managing)”、和“处置(management)”包括在已患有涉及电活性细胞的病症(如但不限于神经元功能障碍、神经元介导的病症、眼部病症或心脏病症)的患者中预防、延迟或降低这类疾病、病症或病状的复发的严重性。该术语包括调节涉及电活性细胞的病症的阈值、发展和/或持续时间或改变患者对涉及电活性细胞的病症的反应情况或维持和/或建立跨过细胞膜的合乎需要的膜电位。
如本文所用，且除非另有规定，化合物的“治疗有效量”为足以在涉及电活性细胞的病症(如但不限于神经元功能障碍、神经元介导的病症、眼部病症或心脏病症)的治疗或处置中提供任何治疗益处或者延迟或最小化与涉及电活性细胞的病症(如但不限于神经元功能障碍、神经元介导的病症、眼部病症或心脏病症）有关的一种或多种症状的量。化合物的治疗有效量意指单独或以与一种或多种其它疗法和/或治疗剂组合形式的化合物在涉及电活性细胞的病症(如但不限于神经元功能障碍、神经元介导的病症、眼部病症或心脏病症)的治疗或处置中提供任何治疗益处的量。
术语“治疗有效量”可包括缓解涉及电活性细胞的病症(如但不限于神经元功能障碍、神经元介导的病症、眼部病症或心脏病症)、改善或减轻涉及电活性细胞的病症或改善总体疗法、或提高另一治疗剂的治疗功效的量。
如本文所用，且除非另有规定，化合物的“预防有效量”为足以预防或延迟涉及电活性细胞的病症(如但不限于神经元功能障碍、神经元介导的病症、眼部病症或心脏病症)或与涉及电活性细胞的病症有关的一种或多种症状的发作或预防或延迟其复发的量。化合物的预防有效量意指单独或以与一种或多种其它治疗和/或预防剂的组合形式的化合物在涉及电活性细胞的病症(如但不限于神经元功能障碍、神经元介导的病症、眼部病症或心脏病症)的预防中提供预防性益处的量。术语“预防有效量”可包括预防涉及电活性细胞的病症(如但不限于神经元功能障碍、神经元介导的病症、眼部病症或心脏病症)、改善总体预防、或提高另一预防剂的预防功效的量。“预防有效量”可在例如涉及电活性细胞的病症(如但不限于神经元功能障碍、神经元介导的病症、眼部病症或心脏病症)发展之前开出处方。
如本文所用，“患者”或“受试者”包括能够患有如本文所述的涉及电活性细胞的病症(如但不限于神经元功能障碍、神经元介导的病症、眼部病症或心脏病症)的哺乳动物生物体，如人和非人哺乳动物，例如但不限于啮齿动物、小鼠、大鼠、非人灵长类动物、伴侣动物如犬和猫，以及家畜，例如绵羊、母牛、马等。
如本文所用，术语“保守取代”一般是指保留蛋白质或多肽的结构和功能性质的氨基酸置换。这类功能等效(保守取代)肽氨基酸序列包括但不限于在由核苷酸序列编码的氨基酸序列内的氨基酸残基的添加或取代，借此造成沉默改变，从而产生功能等效的基因产物。保守氨基酸取代可以例如在涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性基础上进行。举例来说：非极性(疏水性）氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电的(碱性）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；并且带负电的(酸性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
如本文所用，“红移”为向更长波长的移位。相比之下，“蓝移”将为向较短波长的移位。这些术语适用于发光和吸光物体。
如本文所用，短语“视紫红质域”是指“视紫红质折叠”，即视紫红质的7-跨膜-螺旋(7TM)结构特征。如本文所用，通道视蛋白为载脂蛋白，而通道视紫红质为蛋白质和视黄醛。如本文所用，术语“通道视紫红质”描述用作光门控离子通道的亚视黄基蛋白(视紫红质)。
关于相关氨基酸序列的长度测定同一性或同源性百分比。因此，如果本发明多肽被包含在更大的多肽内，那么仅关于对应于本发明多肽的多肽部分而非更大多肽的全部同源性百分比来测定同源性百分比。参比核酸序列的“同一性百分比”或“同一性％”是指使用基本局部比对搜索工具(BLAST)引擎比对的至少两个多核苷酸序列之间的相同核苷酸的百分比。参见Tatusova等人(1999)FEMS Microbiol Lett.174：247-250。BLAST引擎是由theNational Center for Biotechnology Information(NCBI)，Bethesda，Md提供给公众。为了比对两个多核苷酸序列，使用采用“blastn”程序的BLAST。
参比多肽序列的“同一性百分比”或“同一性％”是指使用基本局部比对搜索工具(BLAST)引擎比对的至少两个多肽序列之间的相同氨基酸的百分比。参见Tatusova等人(1999)同上。BLAST引擎是由the National Center for Biotechnology Information(NCBI)，Bethesda，Md提供给公众。为了比对两个多肽序列，使用采用“blastp”程序的BLAST。
II.通道视紫红质
编码蓝隐藻视蛋白的7TM结构域(295、291及288aa，分别对应于联合基因组研究所(JGI)测序计划(http：//genome.jgi.doe.gov/Guith1/Guith1.home.html)蛋白质模型111593、146828及161302)的序列是针对人类密码子使用而优化并合成并且这两者已被鉴别和表征为具有快速动力学的高效ACR。本文所提供的一些实施方案为还在功能上表征的新型ACR的功能域的氨基酸和核酸序列。已被确定为通道视紫红质的高度敏感和有效的ACR结构域的若干这种ACR被克隆和鉴定为GtACR1(SEQ ID NO：1和2)、GtACR2(SEQ ID NO：3和4)或Gt161302(SEQ ID NO：5和6)，其来源于蓝隐藻的阴离子传导的通道视紫红质。来自111593的功能构建体经鉴定为GtACR1(SEQ ID NO：1和2)且来自146828的功能构建体经鉴定为GtACR2(SEQ ID NO：3和4)并且存放在GenBank(登录号KP171708和KP171709)。在一些实施方案中还提供了经鉴定为GtACR1、GtACR2或Gt161302(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5)的这些新型ACR结构域的用途和组合物。
在一些实施方案中，提供了GtACR(例如GtACR1或GtACR2)或其肽片段的保守变体。“保守”氨基酸取代是指用具有相似性质(如大小或电荷)的另一氨基酸对多肽中的一个氨基酸的取代。在某些实施方案中，包含保守氨基酸取代的多肽维持未被取代的多肽的至少一种活性。保守的氨基酸取代可包括非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而非通过在生物系统中合成而并入。这些包括但不限于肽模拟物和其它反向或倒置形式的氨基酸部分。
在一些实施方案中，提供任一种所公开的方法，其中高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域具有SEQ ID NO：1或3所有或一部分的氨基酸序列或其保留高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的所编码的视紫红质域的生物活性的生物活性片段或SEQ ID NO：1或3或所述片段的生物活性保守氨基酸取代变体。
A.通道视紫红质多肽
在一些实施方案中，提供分离的多肽，其编码高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域。在一些实施方案中，提供一种包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的氨基酸序列的分离的多肽。在一些实施方案中，所分离的多肽具有与SEQID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的氨基酸序列至少85％的同源性。在一些实施方案中，所分离的多肽具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的氨基酸序列介于85％-95％-100％之间的同源性。
在一些实施方案中，提供一种蛋白质组合物，其包含具有SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：13的氨基酸序列的多肽。
可在各种实施方案中使用的肽氨基酸序列包括本文所述的阴离子传导的通道视紫红质氨基酸序列(SEQ ID NO：1或3)以及其类似物和衍生物及功能片段，如但不限于视紫红质/7TM结构域。实际上，在一些实施方案中，可使用由特定的核苷酸序列编码的任何所需肽氨基酸序列，也可使用编码所有或任何一部分所需肽氨基酸序列的任何多核苷酸序列。遗传密码的简并性质是公知的，且相应地，每个编码阴离子传导的通道视紫红质肽氨基酸的核苷酸序列一般由公知的核酸“三联”密码子表示，或在很多情况下，由可编码氨基酸的密码子表示。因而，如本文所预期，本文所述的阴离子传导的通道视紫红质肽氨基酸序列当与遗传密码在一起时((参见，例如“Molecular Cell Biology”，表4-1第109页(Darnell等人编著，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1986))一般由可编码这种氨基酸序列的核酸序列的所有各种排列与组合表示。
这类功能等效肽氨基酸序列(保守取代)包括但不限于在由核苷酸序列编码的氨基酸序列内的氨基酸残基的添加或取代，但这造成了沉默改变，从而产生功能等效的基因产物。氨基酸取代可以在涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性基础上进行。举例来说：非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电的(碱性）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；并且带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
天然存在的残基可基于共同的侧链性质被分成以下类别：疏水性(Met、Ala、Val、Leu、Ile)；中性亲水性(Cys、Ser、Thr、Asn、Gln)；酸性(Asp、Glu)；碱性(His、Lys、Arg)；影响链取向的残基(Gly、Pro)；以及芳族(Trp、Tyr、Phe)。举例来说，非保守取代可包括这些类别中的一类的成员被来自另一类的成员更换。
在制造取代时，根据某些实施方案，可考虑氨基酸的亲水指数。已经基于其疏水性和电荷特征为每个氨基酸赋予亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸盐(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。
亲水氨基酸指数在某些情况下对蛋白质赋予互相作用生物功能中的重要性在本领域中可被理解(Kyte等人，J.Mol.Biol.，157：105-131(1982))。已知在某些情况下，某些氨基酸可被取代成具有类似的亲水指数或分数的其它氨基酸并且仍保留类似生物活性。在某些实施方案中，在基于亲水指数制造变化时，亲水指数在±2内的氨基酸取代包括在内。在某些实施方案中，在±1内的取代包括在内，且在某些实施方案中，在±0.5内的取代包括在内。
类似氨基酸的取代可有效地基于亲水性来制造，特别是当由此生成的生物功能蛋白或肽是打算用于免疫学实施方案中时，如在当前情况下。在某些实施方案中，如受其邻近氨基酸的亲水性支配的蛋白质的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性有关，即与蛋白质的生物学性质有关。
已将以下亲水性值赋予氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)以及色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值制造改变时，在某些实施方案中，包括亲水性值在±2范围内的氨基酸的取代，在某些实施方案中，包括在±1范围内的那些，且在某些实施方案中，包括在±0.5内的那些。
熟练技术人员使用熟知的技术将能够确定如本文列举的多肽的合适变体。在某些实施方案中，本领域技术人员通过对确信为非活性重要区域的定位来鉴别出可以改变而不破坏活性的分子的合适区域。在某些实施方案中，可以鉴别在类似多肽中保守的分子的残基和部分。
在某些实施方案中，甚至对于生物活性或结构来说重要的区域也可能受到保守氨基酸取代而不会破坏生物活性或不会不利地影响多肽结构。
另外，在某些实施方案中，本领域技术人员可以回顾结构-功能研究，这些研究鉴定相似的多肽中对于活性或结构重要的残基。考虑到这样的比较，在某些实施方案中，人们能预测蛋白质中对应于相似蛋白质中对于活性或结构重要的氨基酸残基的氨基酸残基的重要性。在某些实施方案中，本领域技术人员对于这样预测的重要的氨基酸残基可以选择化学上相似的氨基酸取代。
在某些实施方案中，本领域技术人员也可以分析与相似多肽中的结构相关的三维结构和氨基酸序列。在某些实施方案中，考虑到这些信息，本领域技术人员可以对多肽预测关于其三维结构的氨基酸残基的比对。在某些实施方案中，本领域技术人员可选择不对预测出现在蛋白质表面上的氨基酸残基进行根本改变，因为这种残基可能涉及到与其它分子的重要相互作用中。
此外，在某些实施方案中，本领域技术人员可以制备在每个需要的氨基酸残基上包括单一氨基酸取代的测试变体。在某些实施方案中，接着可使用本领域技术人员已知的活性测定来筛选变体。在某些实施方案中，这样的变体也可被用来收集关于合适的变体的信息。例如，在某些实施方案中，如果发现特定氨基酸残基的改变导致被破坏的、不希望地降低的或者不合适的活性，那么可以避免具有这种改变的变体。换言之，在某些实施方案中，基于从这类常规实验收集的信息，本领域技术人员可以容易地确定其中应该单独或以与其它突变组合形式避免进一步取代的氨基酸位置。
大量的科学出版物一直致力于二级结构的预测。参见，例如Moult J.，Curr.Op.inBiotech.，7(4)：422-427(1996)；Chou等人，Biochemistry，13(2)：222-245(1974)；Chou等人，Biochemistry，113(2)：211-222(1974)；Chou等人，Adv.Enzymol.Relat.AreasMol.Biol.，47：45-148(1978)；Chou等人，Ann.Rev.Biochem.，47：251-276以及Chou等人，Biophys.J.，26：367-384(1979)。此外，目前可利用计算机程序来帮助预测二级结构。预测二级结构的一种方法是基于同源性建模。例如，具有大于30％的序列同一性或大于40％的相似性的两个多肽或蛋白质常常具有相似的结构拓扑。蛋白质结构数据库(PDB)的生长提供了二级结构的提高的可预测性，包括多肽结构内的可能的折叠数目。参见，例如Holm等人，Nucl.Acid.Res.，27(1)：244-247(1999)。已经提出(Brenner等人，Curr.Op.Struct.Biol.，7(3)：369-376(1997))，在给出的多肽或蛋白质中存在有限数目的折叠并且一旦解决结构的临界数目，结构预测将变得显著更准确。
预测二级结构的其它方法包括“穿透”(参见，例如Jones，D.，Curr.Opin.Struct.Biol.，7(3)：377-87(1997)；Sippl等人，Structure，4(1)：15-19(1996))、“概况分析”(参见，例如Bowie等人，Science，253：164-170(1991)；Gribskov等人，Meth.Enzym.，183：146-159(1990)；Gribskov等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，84(13)：4355-4358(1987))、以及“进化连锁”(参见，例如Holm等人，Nucl.Acid.Res.，27(1)：244-247(1999)及Brenner等人，Curr.Op.Struct.Biol.，7(3)：369-376(1997))。
在某些实施方案中，参照的通道视紫红质或视紫红质域(GtACR)的变体包括糖基化变体，其中糖基化位点的数量和/或类型已相对于参照的阴离子传导的通道视紫红质或视紫红质域(GtACR)的氨基酸序列而改变。在某些实施方案中，多肽变体与天然多肽相比包含更多或更少数量的N-连接的糖基化位点。N-连接的糖基化位点的特征为以下序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中指定为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸外的任何氨基酸残基。取代氨基酸残基生成此序列提供用于添加N-连接的糖链的潜在新位点。或者，排除此序列的取代将除去现存的N-连接的糖链。在某些实施方案中，提供N-连接的糖链的重排，其中一个或多个N-连接的糖基化位点(通常天然存在的那些)被排除并且制造了一个或多个新的N-连接位点。示例性变体包括半胱氨酸变体，其中相对于参照的通道视紫红质或视紫红质域(GtACR)的氨基酸序列，一个或多个半胱氨酸残基缺失或被另一个氨基酸(例如丝氨酸)取代。在某些实施方案中，当多肽和蛋白质必须重折叠成生物活性构象时，如在不溶性包涵体分离之后，半胱氨酸变体可为有用的。在某些实施方案中，半胱氨酸变体具有比天然多肽更少的半胱氨酸残基。在某些实施方案中，半胱氨酸变体具有偶数的半胱氨酸残基以便由不成对的半胱氨酸产生的相互作用最小化。
根据某些实施方案，氨基酸取代为以下那些：(1)降低对蛋白质水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)为了形成蛋白质复合物改变结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和/或(4)赋予或修改这类多肽的其它生理化学或功能性质。根据某些实施方案，单个或多个氨基酸取代(在某些实施方案中，保守氨基酸取代)可在天然存在的序列中(在某些实施方案中，在形成分子间接触的结构域外的多肽部分中)制造。在某些实施方案中，保守的氨基酸取代通常基本上不改变参照序列的结构特征(例如，在某些实施方案中，置换氨基酸不应倾向于使参照序列中出现的螺旋断裂或破坏表征参照序列的其它类型的二级结构)。
某些本领域公知的多肽二级和三级结构的实例描述于例如Proteins，Structuresand Molecular Principles(Creighton编著，W.H.Freeman and Company，New York(1984))；Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze编著，GarlandPublishing，New York，N.Y.(1991))；以及Thornton等人Nature 354：105(1991)中。
在其它实施方案中，描述了提供具有改进的性质和特征的ACR的方法和组合物，所述性质和特征增强组合物在尤其是光基因技术中的应用。改进的性质包括但不限于适于人类密码子使用和合成。这些实施方案通过光门控氯离子传导提供更大敏感性和有效的膜超极化和神经元沉默。
B.融合蛋白
融合蛋白的用途，其中多肽或肽、或截短或突变形式的肽融合至不相关或同源的蛋白质、多肽或肽并且可基于本文所述的所需肽编码核酸和/或氨基酸序列来设计。这种融合蛋白包括但不限于：IgFc融合物，其稳定化蛋白质或肽并且延长体内半衰期；与任何氨基酸序列的融合物，其允许融合蛋白锚定至细胞膜；或与酶、荧光蛋白或发光蛋白的融合物，其提供标记功能。与同源蛋白的融合蛋白包括但不限于由基因产生的那些，该基因被工程化以编码融合至具有相同相关功能的同源(直系同源或旁系同源)蛋白的一部分的阴离子传导的通道视紫红质的一部分。例如，可制造介于不同通道视紫红质之间的嵌合体以合并单独存在于每个中的有益性质。在一些方面中，实施方案的嵌合通道视紫红质包含约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的来自第一通道视紫红质的序列及来自第二通道视紫红质的其余序列。在一些方面中，嵌合通道视紫红质包含第一通道视紫红质的视紫红质域及来自第二通道视紫红质的其余序列。在又一些方面中，嵌合通道视紫红质可包含1、2、3、4、5或6个来自第一通道视紫红质的其跨膜结构域及来自第二通道视紫红质的其余跨膜结构域。
在某些实施方案中，融合蛋白可容易通过利用选择性地结合至所表达的融合蛋白的抗体来纯化。在替代实施方案中，融合蛋白可通过将肽编码核酸序列亚克隆到重组质粒或其一部分中来纯化，在翻译水平上融合至由六个组氨酸残基组成的氨基末端(N端)或羧基末端(C端)标签(“His-标签”；参见，例如Janknecht等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8972-8976，1991)。将来自表达这种构建体的细胞的提取物装载到Ni2+次氨基乙酸-琼脂糖柱上，并且用含有咪唑的缓冲液选择性地洗脱组氨酸标记的蛋白。
C.编码通道视紫红质的核酸
在一些实施方案中，一种与异源启动子序列可操作地连接的重组核酸，所述重组核酸包含：编码与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的氨基酸序列有至少85％同源性的肽的序列；或编码包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的225个连续氨基酸的肽的序列；或与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4的核苷酸序列或其互补序列杂交的序列。
在一些实施方案中，提供分离的核酸分子，其包含编码来源于藻类的高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的核苷酸序列。在一些实施方案中，视紫红质域编码其序列描述于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13中的肽。在一些实施方案中，提供分离的核酸分子，其包含编码示于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，提供表达载体，其包含编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：13的氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方案中，提供包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列的核酸序列或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的核酸序列的其部分的核酸序列片段。
在一些实施方案中，提供分离的核酸分子，其包含来源于cDNA并且编码ACR的视紫红质域的核苷酸序列。在一些实施方案中，视紫红质域编码其序列描述于SEQ ID NO：1、SEQID NO：3或SEQ ID NO：13中的肽。在一些实施方案中，提供来源于cDNA的分离的核酸分子，其包含编码示于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13中的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，提供表达载体，其包含编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：13的氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方案中，提供包含重组表达载体的宿主细胞，所述重组表达载体包含来源于cDNA并且编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的氨基酸序列的核酸序列。
在一些实施方案中，提供包含由源自cDNA的核酸序列的至少一部分编码的氨基酸序列的分离的肽，所述核酸序列编码高效且敏感的ACR的7TM或视紫红质域。在一些实施方案中，提供包含由源自cDNA的核酸序列编码的氨基酸序列的分离的肽，所述核酸序列编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供包含由核酸序列编码的连续序列的分离的肽，所述核酸序列编码高效且敏感的阴离子传导的通道视紫红质的阴离子视紫红质域。在一些实施方案中，提供分离的肽，其包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，提供分离的肽，其包含被由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6组成的组的核酸序列的至少一部分编码并且用作阴离子视紫红质或阴离子传导的通道视紫红质的氨基酸序列。
在一些实施方案中，提供分离的肽，其包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：13的氨基酸序列或由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的源自cDNA的核酸序列编码并用作阴离子传导的通道视紫红质的7TM结构域/视紫红质域。
在一些实施方案中，提供分离的核酸分子，其包含编码高效且敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质的核苷酸序列。在一些实施方案中，视紫红质编码其序列示于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13中的肽。在一些实施方案中，提供分离的核酸分子，其包含编码示于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13中的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，提供表达载体，其包含编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：13的氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方案中，提供包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方案中，提供包含编码高效且敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域的序列的肽。在一些实施方案中，提供分离的肽，其包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQID NO：13的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述分离的肽包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的氨基酸序列或其片段。
在一些实施方案中，提供分离的核酸分子，其中所述核酸分子具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：14-15的序列。在其它实施方案中，提供表达载体，其包含选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：14-15中所示的核酸序列及编码在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13中示出的氨基酸序列的那些核酸序列。在一些实施方案中，提供包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ IDNO：14-15中所示的核酸序列及编码在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13中的氨基酸序列的那些核酸序列。在一些实施方案中，分离的核酸包含编码高效且敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列编码SEQID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的至少16个连续氨基酸。在一些实施方案中，核苷酸序列编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的至少20个连续氨基酸。在一些实施方案中，核苷酸序列编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的至少35个连续氨基酸。在一些实施方案中，核苷酸序列编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的至少50个连续氨基酸。在一些实施方案中，核苷酸序列编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的至少75个连续氨基酸。在一些实施方案中，核苷酸序列编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的至少33个连续氨基酸。在一些实施方案中，核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的任何连续部分的肽。
在一些实施方案中，提供包含核苷酸序列的分离的核酸，所述核苷酸序列编码来源于蓝隐藻的新型阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域。在一些实施方案中，核苷酸序列编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的至少16个连续氨基酸。在一些实施方案中，核苷酸序列编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的至少20个连续氨基酸。在一些实施方案中，核苷酸序列编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的至少35个连续氨基酸。在一些实施方案中，核苷酸序列编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：13的至少50个连续氨基酸。在一些实施方案中，核苷酸序列编码SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：13的至少75个连续氨基酸。在一些实施方案中，核苷酸序列编码SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的至少33个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的肽。
在一些实施方案中，提供分离的核酸，其包含编码蓝隐藻的阴离子传导的通道视紫红质的功能域的核苷酸序列。在一些实施方案中，提供分离的核酸，其编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、75、100、125、150、175、200、205、210、215、220、225、228、229、230、235、240250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、296个或更多个连续氨基酸或其片段。此外，在一些实施方案中，包括可从上述整数的任意两个之间导出的任何范围。
在其它实施方案中，本发明提供一种分离的多肽或编码多肽的分离的核酸，所述多肽在一些实施方案中具有介于约70％与约75％之间；在其它实施方案中介于约75％与约80％之间；在另一些实施方案中介于约80％与90％之间；或甚至更进一步介于约90％与约99％之间的与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的氨基酸或其片段同一(或同源)的氨基酸(例如95％)。
在其它实施方案中，本发明提供一种编码多肽的分离的核酸，所述多肽具有介于约70％与约75％之间；或更优选介于约75％与约80％之间；或更优选介于约80％与90％之间；或甚至更优选介于约90％与约99％之间的与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的氨基酸或其片段同一的氨基酸。
在一些实施方案中，核酸区段(不考虑编码序列本身的长度)可与以下其它DNA序列组合，如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多重克隆位点、其它编码区段等等。在一些实施方案中，例如，提供重组核酸，其包含与异源启动子可操作地连接的编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3的氨基酸或其片段的核苷酸序列。
在某些实施方案中，本发明提供一种分离的核酸，其是通过使用选自合适的引物的引物由模板核酸进行扩增而获得，所述引物可与SEQ ID NO：2或SEQ D NO：4一起使用。
在一些实施方案中，提供所公开方法中的任一种，其中表达载体包括但不限于AAV病毒载体。在一些实施方案中，提供所公开方法中的任一种，其中启动子为组成型启动子。在一些实施方案中，提供所公开方法中的任一种，其中组成型启动子包括但不限于CMV启动子或杂合CMV增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子。在一些实施方案中，提供所公开方法中的任一种，其中启动子包括但不限于诱导型和/或细胞类型特异性启动子。
在一些实施方案中，提供一种源自cDNA的核酸，其包含编码含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方案中，提供一种源自cDNA的核酸，其包含编码选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的氨基酸序列的核酸序列，其中源自cDNA的核酸包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：14-15的核酸序列。在其它实施方案中，提供一种包含源自cDNA的核酸的表达载体，所述源自cDNA的核酸包含编码含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的氨基酸序列的核酸序列。
用于所公开的方法和组合物中的通道视紫红质核酸序列包括但不限于本公开的源自海藻的阴离子传导的通道视紫红质GtACR1(氨基酸SEQ ID NO：1和核酸序列SEQ IDNO：2)和GtACR2(氨基酸SEQ ID NO：3和核酸序列SEQ ID NO：4)的活性部分，包括但不限于所描述的那些，如但不限于编码视紫红质域的核酸序列，即本公开的源自海藻的阴离子传导的通道视紫红质的活性部分，如但不限于所公开的视紫红质域(SEQ ID NO：1)。
在一些实施方案中，本公开的阴离子传导的通道视紫红质(如但不限于视紫红质域)的活性部分的使用包括所有或部分本文所述的序列(及包含其的表达载体)，且另外涵盖以下的使用：编码本公开的阴离子传导的通道视紫红质(如但不限于视紫红质域)的连续活性部分的任何核苷酸序列；在高度严格条件下与本文所述的阴离子传导的通道视紫红质或通道视蛋白序列的互补序列杂交的开放阅读框(ORF)，例如，在65℃下在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中与滤膜结合的DNA杂交，并且在68℃下在0.1x SSC/0.1％SDS中洗涤(“Current Protocols in Molecular Biology”，第1和2卷(Ausubel等人编著，Green Publishing Associates，Incorporated，和John Wiley & Sons，Incorporated，New York，NY，1989))，并且编码功能等效的阴离子传导的通道视紫红质(或其活性部分，如但不限于视紫红质域)基因产物或其活性部分。另外涵盖在中等严格条件(例如在42℃下在0.2x SSC/0.1％SDS中洗涤(“Current Protocols in MolecularBiology”，同上))下与编码阴离子传导的通道视紫红质氨基酸序列的DNA序列的互补序列杂交但仍编码功能等效的阴离子传导的通道视紫红质产物的任何核苷酸序列的使用。阴离子传导的通道视紫红质的功能等效物包括但不限于存在于其它或相同物种(直系同源物、旁系同源物且更通常同源物)中的天然存在形式的阴离子传导的通道视紫红质、及不管是天然存在抑或工程化的突变形式的阴离子传导的通道视紫红质(通过定点诱变、基因改组或直接进化，如例如美国专利号5,837,458中所述)或其活性部分，如但不限于视紫红质域。本公开还包括所鉴别的通道视紫红质多核苷酸序列的简并核酸变体(归因于遗传密码的冗余)的使用。
另外涵盖编码阴离子传导的通道视紫红质ORF或其功能等效物的多核苷酸的使用，所述功能等效物是由与本文所述的阴离子传导的通道视紫红质序列的相应区域约99、95、90或约85％相似的多核苷酸序列编码(如使用例如采用默认参数的University ofWisconsin GCG序列分析包(SEQUENCHER 3.0，Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)，通过BLAST序列比较分析所测量)。
在某些实施方案中，本发明涉及分离的核酸区段和重组载体，其编码在其氨基酸序列内包括通道视紫红质的氨基酸序列或其功能部分或变体的蛋白质或肽，如所鉴别和克隆的那些：GtACR1和GtACR2(SEQ ID NO：1和3)及PsuACR1(SEQ ID NO：13)。在一些实施方案中，通道视紫红质的一部分并且具有与全长通道视紫红质的氨基酸不同的相对较少氨基酸、或全长通道视紫红质的氨基酸的生物功能等效物。术语“功能等效物”正如本领域所公知。相应地，序列具有介于约70％与约80％之间；或更优选介于约85％与约90％之间；或甚至更优选介于约90与95％与约99％之间的与所鉴别和克隆的以下氨基酸同一或功能等效的氨基酸：GtACR1(SEQ ID NO：1)、GtACR2(SEQ ID NO：3)或PsuACR1(SEQ ID NO：13)。
本发明的核酸区段(不考虑编码序列本身的长度)可与其它序列组合，如启动子、多腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多重克隆位点、其它编码区段等，以便其整个长度可相当大地变化。因此，预期可采用几乎任何长度的核酸片段，其中总长度优选受到在预定的重组DNA方案中制备和使用的便利性的限制。例如，可制备包括与编码SEQ ID NO：1和3的多肽的核酸互补的短序列段的核酸片段，如约10至15或20、30或40个左右的核苷酸，且其长度高达2000个左右的碱基对。具有长度约8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000、1000、500、200、100及约50个碱基对的总长度的DNA区段也预期是有用的。
在一些实施方案中，提供编码通道视紫红质的氨基酸或其片段的分离的核酸和并入核酸序列的重组载体，所述核酸序列编码通道视紫红质蛋白或肽并且根据SEQ ID NO：1和3的氨基酸序列包括在其氨基酸序列内。在一些实施方案中，一种编码蛋白质(其编码通道视紫红质或其片段)的纯化的核酸区段，所述重组载体可进一步被定义为包含与所述通道视紫红质编码核酸区段可操作连接的启动子的表达载体。
在另外的实施方案中，提供一种宿主细胞，其与包含编码通道视紫红质的核酸区段的重组载体重组产生。重组宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。如本文所用，术语“工程化”或“重组”细胞意图是指其中已引入重组基因(如编码通道视紫红质的基因)的细胞。因此，工程化细胞可与不合重组引入的基因的天然存在的细胞相区分。工程化的细胞因此为具有人工引入的一个或多个基因的细胞。重组引入的基因将呈基因组基因或cDNA基因的拷贝形式，或者将包括邻近不与特别引入的基因天然相关的启动子定位的基因。在一些实施方案中，核酸分子具有由约14、15-20、30、40、50或甚至约100至约200个左右的核苷酸的连续核苷酸序列段组成的序列区域，其与通道视紫红质编码核酸序列同一或互补。
在一些实施方案中，可使用簇有规律间隔的短回文重复(CRISPR)及CRISPR相关(Cas)蛋白将本文所述的通道视紫红质编码核酸序列靶向宿主细胞的基因组。参见Sander和Joung，Nature Biotechnology，32(4)：347-355，其以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统包括非编码RNA分子(引导)RNA，其序列特异性地结合至DNA；和Cas蛋白(例如Cas9)，其具有核酸酶官能团(例如，两个核酸酶结构域)。在一些实施方案中，将Cas核酸酶和gRNA(包括对靶序列有特异性的crRNA与固定tracrRNA的融合物)引入细胞中。一般说来，在gRNA的5′端处的靶位点使用互补碱基配对将Cas核酸酶靶向靶位点，例如基因。在一些实施方案中，基于其紧邻原型间隔区相邻基序(PAM)序列(如通常NGG或NAG)的5′的位置选择靶位点。就此而言，gRNA通过修饰引导RNA的开头20个核苷酸以对应于靶DNA序列来靶向所需序列。
在一些实施方案中，CRISPR系统在靶位点处诱导DSB，然后如本文所论述进行破坏。在其它实施方案中，被视为“切口酶”的Cas9变体用于在靶位点处切刻单链。在一些方面中，使用配对的切口酶，例如以改善特异性，每个由一对不同的gRNA靶序列引导以便一旦引入切口，也同时引入5′突出。
在一些方面中，一个或多个引导RNA(核糖核酸)将由细胞表达的具有核酸酶活性的酶(如具有核酸酶活性的DNA结合蛋白)引导向DNA(脱氧核糖核酸)上的靶位置，其中所述酶切割DNA并且将本文所述的外源供体核酸插入DNA中，如通过同源重组。示例性方法描述于例如美国专利公布号20140357530和国际公布号WO2015006290中，两者皆以引用的方式并入本文。
因此，本公开的某些实施方案是基于以下的使用：外源性DNA(编码通道视紫红质的核酸序列)、核酸酶如DNA结合蛋白和引导RNA以便共同定位至DNA并且利用外源性DNA的插入来消化或切割DNA，如通过同源重组。这种DNA结合蛋白为本领域技术人员容易知晓，其出于各种目的结合至DNA。这种DNA结合蛋白可为天然存在的。包括在本公开范围内的DNA结合蛋白包括可由RNA(在本文中称为引导RNA)引导的那些蛋白。根据此方面，引导RNA与RNA引导的DNA结合蛋白在DNA水平下形成共同定位复合体。具有核酸酶活性的这种DNA结合蛋白为本领域技术人员所知，并且包括具有核酸酶活性的天然存在的DNA结合蛋白，如存在于例如II型CRISPR系统中的Cas9蛋白。这种Cas9蛋白和II型CRISPR系统在本领域中充分记载。参见Makarova等人，Nature Reviews，Microbiology，第9卷，2011年6月，第467-477页，包括所有补充信息，其据此以引用的方式整体并入。
具有核酸酶活性的示例性DNA结合蛋白用于切刻或切割双链DNA。这种核酸酶活性可由具有一个或多个展现核酸酶活性的多肽序列的DNA结合蛋白产生。这种示例性DNA结合蛋白可具有两个分离的核酸酶结构域，其中每个结构域负责切割或切刻双链DNA的特定的链。本领域技术人员已知的具有核酸酶活性的示例性多肽序列包括McrA-HNH核酸酶相关结构域和RuvC样核酸酶结构域。因此，示例性DNA结合蛋白是在自然界含有一个或多个McrA-HNH核酸酶相关结构域和RuvC样核酸酶结构域的那些结合蛋白。
D.重组表达
虽然所述的所需肽氨基酸序列可以化学方法合成(参见，例如“Proteins：Structures and Molecular Principles”(Creighton编著，W.H.Freeman & Company，NewYork，NY，1984))，但大的多肽序列可使用本领域中公知的用于表达含有编码所需肽的核酸序列的核酸的技术，通过重组DNA技术有利地产生。这种方法可用于构建含有肽编码核苷酸序列及合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术及体内遗传重组(参见，例如“Molecular Cloning，A Laboratory Manual”，同上，及“Current Protocols in Molecular Biology”，同上)。或者，编码所需肽编码核苷酸序列的RNA和/或DNA可使用例如合成器以化学方式合成(参见，例如“OligonucleotideSynthesis：A Practical Approach”(Gait编著，IRL Press，Oxford，United Kingdom，1984))。
可利用多种宿主表达载体系统来表达肽编码核苷酸序列。当所需肽或多肽为可溶性或可溶性衍生物时，肽或多肽可从宿主细胞培养物中回收，即如果不分泌肽或多肽，那么从宿主细胞中回收，且如果肽或多肽是由宿主细胞分泌，那么从培养基中回收。然而，合适的表达系统还包括工程化的宿主细胞，其表达锚定在细胞膜中的所需多肽或功能等效物。所需肽从这种表达系统中的纯化或富集可使用合适的去污剂和脂质胶束以及本领域技术人员公知的方法实现。此外，这种工程化的宿主细胞本身可在以下情况下使用：不仅需要保留肽的结构和功能特征，而且需要评价例如在某些药物筛选测定中的生物活性。
在某些应用中，瞬时表达系统为需要的。然而，对于重组蛋白质或肽的长期高产率生产，稳定表达一般是优选的。例如，稳定表达所需蛋白质、多肽、肽或融合蛋白的细胞系可被工程化。代替使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可用由合适的表达控制元件(例如，启动子、增强子序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)和可选择的标记物控制的DNA转化。在引入外源DNA之后，允许工程化细胞在富集培养基中生长约1-2天，然后转入选择培养基中。重组质粒中的可选择标记物对该选择具有抗性，并且允许细胞将质粒稳定地整合到其染色体中，并生长以形成集落，该集落又能被克隆并扩增为细胞系。此方法可有利地用于将表达所需基因产物或其部分的细胞系工程化。这种工程化的细胞系尤其在筛选和评价影响所需蛋白质、多肽或肽的内源性活性的化合物方面有用。
可使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell11：223-232，1977)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：2026-2034，1962)、及腺嘌呤转磷酸核糖基酶(Lowy等人，Cell 22：817-823，1980)基因，其可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞中。抗代谢物抗性也可用作以下基因选择的基础：二氢叶酸还原酶(dhfr)，其对氨甲蝶呤具有抗性(Wigler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：3567-3570，1980，及O’Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：1527-1531，1981)；鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(gpt)，其对霉酚酸具有抗性(Mulligan和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072-2076，1981)；新霉素磷酸转移酶(neo)，其对氨基糖苷类G-418具有抗性(Colbere-Garapin等人，J.Mol.Biol.150：1-14，1981)；以及潮霉素B磷酸转移酶(hpt)，其对潮霉素具有抗性(Santerre等人，Gene 30：147-156，1984)。
可用于提供在所公开方法中使用的组合物之目的的宿主细胞/表达系统包括但不限于：微生物如细菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)，用含有所需肽编码核苷酸序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化；酵母(例如酿酒酵母、巴斯德毕赤氏酵母)，用含有所需肽编码核苷酸序列的重组酵母表达载体转化；昆虫细胞系统，其感染了含有所需肽编码核苷酸序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)；植物细胞系统，其感染了重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)或用含有所需肽编码核苷酸序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化；或哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、293、3T3)，其载有含有所需肽编码核苷酸序列及来源于哺乳动物细胞(例如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子)的基因组的启动子的重组表达构建体。
在细菌系统中，可有利地依据被表达的所需基因产物的预期用途选择许多不同的表达载体。例如，当有待产生大量这种蛋白质时，如为了生成包含所需肽的药物组合物或为了培养针对所述蛋白质的抗体，指导高水平的容易纯化的融合蛋白产物的表达的载体可为合乎需要的。这种载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther和Müller-Hill，EMBO J.2：1791-1794，1983)，其中所需肽编码序列可个别地与lacZ编码区同框连接到载体中以便产生融合蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye，Nucleic Acids Res.13：3101-3110，1985，及Van Heeke和Schuster，J.Biol.Chem.264：5503-5509，1989)；等等。pGEX载体(GEHealthcare，Piscataway，NJ)也可用于将所需肽部分表达为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。一般说来，这种融合蛋白为可溶的并且可通过吸附到谷胱甘肽-琼脂糖珠粒上，然后在游离的谷胱甘肽存在下洗脱而轻易从溶解的细胞中纯化。pGEX载体被设计为包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点以便克隆的所需肽编码基因产物可从GST部分上释放。
在示例性昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核多角体病病毒(AcNPV)被用作载体以表达所需的肽编码序列。所述病毒生长在草地夜蛾细胞中。所需肽编码序列可个别地克隆到病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)，并且在AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制之下放置。所需肽编码序列的成功插入将造成多角体蛋白基因的失活和非封闭重组病毒(即，缺乏由多角体蛋白基因编码的蛋白包衣的病毒)的产生。接着将该重组病毒用于感染其中表达了插入的多核苷酸的草地夜蛾细胞(参见，例如Smith等人，J.Virol.46：584-593，1983，及美国专利号4,215,051)。
在哺乳动物宿主细胞中，可利用许多基于病毒的表达系统。当腺病毒用作表达载体时，所需的肽编码核苷酸序列可连接到腺病毒转录/翻译控制复合体，例如晚期启动子和三联前导序列。此嵌合序列可随后通过体外或体内重组插入腺病毒基因组中。在病毒基因组的非必需区(例如，区域E1或E3)中的插入将产生活的并能够在受感染宿主中表达所需肽产物的重组病毒(参见，例如Logan和Shenk，Proc.Natl.Acatd.Sci.USA 81：3655-3659，1984)。特异的起始信号也是插入的所需肽编码核苷酸序列有效翻译所需要的。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在一些情况下，可提供外源性翻译控制信号，包括或许ATG起始密码子。此外，起始密码子应与所需肽编码序列的阅读框同相以确保整个插入物的翻译。这些外源性翻译控制信号和起始密码子可有多种来源，天然的与合成的。表达效率可通过纳入合适的转录增强子元件、转录终止子等来提高(参见，例如Nevins，CRCCrit.Rev.Biochem.19：307-322，1986)。
在酵母中，可使用许多含有组成型或诱导型启动子的载体。为了回顾，参见，例如“Current Protocols in Molecular Biology”，同上，Ch.13，Bitter等人，Meth.Enzymol.153：516-544，1987，“DNA Cloning”，第II卷，第3章(Glover编著，IRLPress，Washington，D.C.，1986)；Bitter，Meth.Enzymol.152：673-684，1987，“TheMolecular Biology of the Yeast Saccharomyces：Life Cycle and Inheritance”(Strathern等人编著，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1981)以及“The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces：Metabolism and GeneExpression”(Strathern等人编著，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY，1982)。
在植物中，可使用多种不同的植物表达载体，并且所需肽编码序列的表达可由许多启动子中的任一个来驱动。例如，可使用病毒启动子，如CaMV的35S RNA或19S RNA启动子(Brisson等人，Nature 310：511-514，1984)、或TMV的外壳蛋白启动子(Takamatsu等人，EMBO J.6：307-311，1987)。或者，可使用植物启动子，如RUBISCO的小亚基启动子(Coruzzi等人，EMBO J.3：1671-1679，1984，及Broglie等人，Science 224：838-843，1984)、或热休克启动子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley等人，Mol.Cell.Biol.6：559-565，1986)。这些构建体可使用例如Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射或电穿孔而引入植物细胞中。对于此项技术的回顾，参见，例如Weissbach和Weissbach，“Methods inPlant Molecular Biology”，第VIII节(Schuler和Zielinski编著，Academic Press，Inc.，New York，NY，1988)及“Plant Molecular Biology”，第2版，Ch.7-9(Grierson和Covey编著，Blackie & Son，Ltd.，Glasgow，Scotland，United Kingdom，1988)。
另外，可选择调节插入的所需肽编码序列的表达或以所需方式修饰并加工所需肽编码核酸序列的宿主细胞菌株。蛋白质产物的这类修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)影响蛋白质的某些功能。不同的宿主细胞具有针对蛋白质和肽的翻译后加工和修饰的特征性和特异性机制。合适的细胞系或宿主系统可被选出以确保所表达的所需蛋白质、多肽或肽的正确或所需修饰和加工。为此，使用具有针对初级转录物的所需加工及所需肽编码核酸序列的糖基化和/或磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。这类哺乳动物宿主细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)、VERO、幼仓鼠肾(BHK)、HeLa、猴肾(COS)、MDCK、293、3T3、WI38、人肝细胞癌(例如Hep G2)及U937细胞。
在一些实施方案中，描述了包含其中一个核酸序列的重组宿主细胞。在一些实施方案中，描述了包含其中一个多肽的蛋白质组合物。
III.使用方法
在一些实施方案中，描述了分子工程化变体(一些具有提高的活性)，其通过位点特异性诱变和嵌合体构造具有高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质。在一些实施方案中，通道视紫红质充当趋光性和避光反应的受体。它们的光激发引发细胞膜的去极化。
在一些实施方案中，若干阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域当在哺乳动物HEK293细胞中表达时被克隆并确定具有通道活性。使用这些方法，确定新型阴离子传导的通道视紫红质变体尤其关于光基因应用具有改进的性质。
对于光基因应用(尤其是在活的动物中)的一个主要挑战是刺激光被生物组织的散射和其被血红蛋白的吸收。具有长波长吸收的光基因工具将展现来自这些影响的最小光衰减，但大多数微生物视紫红质不属于此类别。举例来说，ChR2的最大吸收值为470nm，ChR2具有若干其它有用的性质且因此最常用作光基因中的去极化工具。
一般需要光基因工具的长波吸收以便通过使组织散射减到最少及通过血红蛋白的吸收增加刺激光的穿透深度。在一些实施方案中，使用3，4-脱氢视黄醛(A2视黄醛)提高光基因微生物视紫红质的长波敏感度。A2视黄醛(3，4-脱氢视黄醛)为天然的类视色素，它的11-顺式见于某些无脊椎动物、鱼和两栖动物的感光细胞中，其中它可构成唯一的视黄醛或A1视黄醛的另外的发色团。额外的双键在发色团的β-紫罗酮环中的存在产生与用A1(常例)视黄醛所形成的相比吸收更长波长的光的色素。A1/A2比率的变化在对外部条件的适应期间造成生物体中视力的光谱灵敏度的天然自适应调节。在体外用全反式3，4-脱氢视黄醛(A2视黄醛)重构漂白的微生物视紫红质(细菌视紫红质、盐细菌视紫红质、感觉视紫红质I和II)也使其吸收光谱向更长波长移位。在一些实施方案中，通过掺入全反式A2视黄醛来修改光基因工具的光谱性质。A2视黄醛(离子泵和通道视紫红质两种)的添加形成具有显著红移吸收的功能性色素。
在一些实施方案中，使用A2视黄醛提高了光基因微生物视紫红质的长波灵敏度。在一些实施方案中，发色团取代提供了提高光基因工具的效率的补充策略。由A2视黄醛取代A1视黄醛使所测试的视紫红质的光谱灵敏度显著地向更长波长移位，而通常不会改变其功能的其它方面。
光基因技术涉及光激活通道和酶的引入，由此允许神经活动的操控和神经元功能的控制。因此，在一些实施方案中，所公开的方法和组合物可引入细胞中并促进细胞活性和功能的操控。参见，例如US申请序列号13/622,809的US公布20130090454，以及Mattis，J.，Tye，K.M.，Ferenczi，E.A.，Ramakrishnan，C.，O’Shea，D.J.，Prakash，R.，Gunaydin，L.A.，Hyun，M.，Fenno，L.E.，Gradinaru，V.，Yizhar，O.和Deisseroth，K.(2012)Principles forapplying optogenetic tools derived from direct comparative analysis ofmicrobial opsins.Nat.Methods 9，159-172；及Zhang，F.，Vierock，J.，Yizhar，O.，Fenno，L.E.，Tsunoda，S.，Kianianmo-meni，A.，Prigge，M.，Berndt，A.，Cushman，J.，Polle，J.，Magnuson，J.，Hege-mann，P.和Deisseroth，K.(2011)The microbial opsin family ofoptogenetic tools.Cell 147，1446-1457)。
光基因技术及由此所公开的方法和组合物可用于表征正常脑中和各种神经系统疾病期间复杂的神经回路和信息处理的功能；在功能上映射(map)大脑皮层；表征并操控学习和记忆的过程；表征并操控突触传递和可塑性的过程；提供基因表达的光控诱导；提供细胞运动性及其它活性的光控制。
所公开的方法和组合物的临床应用包括(但不限于)光基因治疗方法，如：为了年龄依赖性黄斑变性、糖尿病性视网膜病和色素性视网膜炎以及导致感光细胞丧失的其它病状的眼病基因治疗而在视网膜的受体后神经元中引入通道视紫红质来恢复视力；通过使用并入房室束(希氏束)的易兴奋心肌细胞中的通道视紫红质以控制心搏节律而非电学起搏器装置来控制心脏功能；恢复帕金森神经机能障碍患者中的多巴胺相关运动功能障碍；改善抑郁症；恢复脊髓损伤之后的呼吸；提供干细胞分化的非侵入式控制并且评价移植细胞对组织和网络功能的特殊作用。电活性细胞的任何组都能经受ACR抑制，包括但不限于以上列举的那些和心肌细胞。这种ACR还潜在地适用于心肌细胞动作电位的有效光抑制，由此实现心脏功能障碍(包括但不限于心动过速)的治疗。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于促进心脏细胞和组织的光刺激而对当前的心脏抗心律失常疗法无负面的电生理学影响并且通过刺激或使心脏或脑中具有异常兴奋的特定区域沉默来减轻症状。在一些实施方案中，这种基于光基因的技术可用于沉默、恢复或重调患者中的不规则心跳，其中一些患者现正接受可植入装置。
在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于通过直接病毒基因递送(如但不限于AAv)或通过递送在培养中生成或转化的携带ACR的供体细胞(如但不限于心肌细胞、浦肯野(Purkinje)及希司(His)束细胞等)影响心脏细胞或区域。
在一些实施方案中，一种使患有神经元介导病症的受试者中的细胞膜超极化的方法，所述方法包括：向所述受试者的细胞递送包含编码选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13组成的组的氨基酸序列的多核苷酸的表达载体，其编码可在所述细胞中表达的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域；以及在所述细胞中表达所述载体，其中视紫红质的表达造成膜超极化。
在一些实施方案中，一种使患有神经元介导病症的受试者中的神经元沉默的方法，所述方法包括：向所述受试者的靶神经元递送包含编码选自由SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：13组成的组的氨基酸序列的多核苷酸的表达载体，其编码可在所述靶神经元中表达的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域；以及在所述靶神经元中表达所述载体，其中视紫红质的表达使来自靶神经元的信号沉默。
在一些实施方案中，一种使患有视力受损或失明的受试者的视网膜感光性恢复的方法，所述方法包括：向所述受试者的视网膜递送包含编码选自由SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：13组成的组的氨基酸序列的多核苷酸的表达载体，其编码可在视网膜神经元中表达的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域；以及在所述视网膜神经元中表达所述载体，其中所述表达的视紫红质在所述视网膜神经元中造成高水平的膜电位。
因此，在一些实施方案中，提供高度敏感和有效的膜超极化的阴离子传导的通道视紫红质、即光门控阴离子通道作为来源于蓝隐藻的阴离子传导的通道视紫红质的GtACR1(SEQ ID NO：1)和GtACR2(SEQ ID NO：3)而提供并且可用于增强光基因技术和光基因治疗方法。
阴离子传导的通道视紫红质、其功能性或活性部分(如但不限于视紫红质域和功能等效物)包括但不限于天然存在形式的ACR及作为直系同源物和同源物的那些；以及突变形式的ACR，不管是天然存在的抑或工程化的(通过定点诱变、基因改组或直接进化，如例如美国专利号5,837,458中所述)。还包括所公开的源自藻类ACR的多核苷酸序列的简并核酸变体(归因于遗传密码的冗余)的使用。
在一些实施方案中，提供治疗神经元病症的方法，所述方法包括：(a)向靶神经元递送编码可在所述靶神经元中表达的高效且敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域的核酸表达载体，所述载体包含编码高效且敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域并与启动子序列可操作连接的开放阅读框及任选的转录调控序列；以及(b)在所述靶神经元中表达所述载体，其中所述表达的视紫红质一旦暴露于光便造成所述靶神经元的高度敏感和有效的膜超极化及神经元沉默。在一些实施方案中，视紫红质域是由SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：3编码。
在一些实施方案中，提供治疗神经元病症的方法，所述方法包括：(a)向靶神经元递送编码可在所述靶神经元中表达的来源于藻类的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域的核酸表达载体，所述载体包含编码阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域并与启动子序列可操作连接的开放阅读框、及任选的转录调控序列；以及(b)在所述靶神经元中表达所述载体，其中所述表达的视紫红质一旦暴露于光便使所述靶神经元沉默。在一些实施方案中，所述视紫红质域是由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13编码。
在一些实施方案中，提供使视网膜感光性恢复的方法，所述方法包括：(a)向视网膜神经元递送编码可在视网膜神经元中表达的高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域的核酸表达载体；所述载体包含编码高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域并与启动子序列可操作连接的开放阅读框、和任选的转录调控序列；以及(b)在所述视网膜神经元中表达所述载体，其中所述表达的视紫红质赋予所述视网膜神经元以感光性，由此恢复所述视网膜或其一部分的感光性。在一些实施方案中，所述视紫红质域是由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13编码。
在一些实施方案中，提供使视网膜感光性恢复的方法，所述方法包括：(a)向视网膜神经元递送编码可在视网膜神经元中表达的高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域的核酸表达载体；所述载体包含编码高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域并与启动子序列可操作连接的开放阅读框、和任选的转录调控序列；以及(b)在所述视网膜神经元中表达所述载体，其中所述表达的视紫红质赋予所述视网膜神经元以感光性，由此恢复所述视网膜或其一部分的感光性。在一些实施方案中，所述视紫红质域是由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13编码。
在一些实施方案中，提供恢复患有视力受损或失明的受试者视网膜的感光性的方法，所述受试者的视网膜感光细胞变性或已变性并死亡，所述方法包括：(a)向所述受试者的视网膜递送编码可在视网膜神经元中表达的高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域的核酸载体；所述载体包含编码高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域并与启动子序列可操作连接的开放阅读框、和任选的转录调控序列；以及(b)在所述视网膜神经元中表达所述载体，其中所述表达的视紫红质赋予所述视网膜神经元以感光性，由此恢复所述视网膜或其一部分的感光性。在一些实施方案中，所述视紫红质域是由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13编码。
在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于促进心脏细胞和组织的光刺激而对当前的心脏抗心律失常疗法无负面的电生理学影响并且通过刺激或使心脏或脑中具有异常兴奋的特定区域沉默来减轻症状。在一些实施方案中，这种基于光基因的技术可用于沉默、恢复或重调患者中的不规则心跳，其中一些患者现正接受可植入装置。
在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于通过直接病毒基因递送(如但不限于AAV)或通过递送在培养中生成或转化的携带ACR的供体细胞(如但不限于心肌细胞、浦肯野及希司束细胞等)影响心脏细胞或区域。
在一些实施方案中，提供一种治疗患有涉及电活性细胞的病症的受试者中的电活性细胞障碍的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者的细胞递送包含编码可在所述细胞中表达的选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的氨基酸序列的多核苷酸的表达载体；以及(b)在所述电活性细胞中表达所述载体，其中所述表达的视紫红质使来自所述电活性细胞的信号沉默。
在一些实施方案中，提供一种治疗患有涉及电活性细胞的病症的受试者中的电活性细胞障碍的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者递送包含表达载体的转基因细胞，所述表达载体包含编码可在所述转基因细胞中表达的选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQID NO：13的氨基酸序列的多核苷酸；以及(b)在所述转基因细胞中表达所述载体，其中所述表达使来自电活性细胞的信号沉默。
在一些实施方案中，提供一种使患有电活性细胞介导的病症的受试者中的电活性细胞沉默的方法，所述方法包括：(a)向所述受试者的靶神经元递送包含编码选自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：13的氨基酸序列的多核苷酸的表达载体，其编码可在所述靶神经元中表达的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域；以及(b)在所述目标电活性细胞中表达所述载体，其中所述表达的视紫红质造成来自电活性细胞的信号沉默。在一些实施方案中，提供一种重组宿主细胞，其中所述宿主细胞为分离的电活性细胞。
在一些实施方案中，提供一种治疗神经元病症的方法，所述方法包括：(a)向靶神经元递送编码可在所述靶神经元中表达的高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域的核酸表达载体；所述载体包含编码高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域并与启动子序列可操作连接的开放阅读框、和任选的转录调控序列；以及(b)在靶神经元中表达所述表达载体，其中所述表达的阴离子传导的通道视紫红质一旦暴露于光便使靶神经元沉默。在一些实施方案中，上述表达载体还包含一个或多个与启动子和视紫红质域序列可操作地连接的转录调控序列。在一些实施方案中，高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域具有SEQ ID NO：1或3所有或一部分的氨基酸序列和SEQ ID NO：1或3的视紫红质域序列、或其保留通道视紫红质的所编码的视紫红质域的生物活性的生物活性片段或为SEQ ID NO：1或3或所述片段的生物活性保守氨基酸取代变体。在一些实施方案中，所述表达载体包括AAV病毒载体。在一些实施方案中，所述启动子为组成型启动子。在一些实施方案中，组成型启动子为CMV启动子或杂合CMV增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子。在一些实施方案中，启动子为诱导型和/或细胞类型特异性启动子。
在一些实施方案中，恢复视网膜感光性的方法包括(a)向受试者的视网膜神经元递送编码可在视网膜神经元中表达的高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域的核酸表达载体；所述表达载体包含编码高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域并与启动子序列可操作连接的开放阅读框、和任选的一个或多个转录调控序列；以及(b)在视网膜神经元中表达所述表达载体，其中所述表达的视紫红质赋予所述视网膜神经元以感光性，由此恢复视网膜或其一部分的感光性。在一些实施方案中，高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域具有SEQ ID NO：1或3所有或一部分的氨基酸序列和SEQ ID NO：1或3的视紫红质域序列、或其保留高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的所编码的视紫红质域的生物活性的生物活性片段或为SEQ ID NO：1、3或13或所述片段的生物活性保守氨基酸取代变体和SEQ ID NO：1、3或13或所述片段的视紫红质域序列。在一些实施方案中，所述表达载体包括AAV(例如，AAV2)病毒载体。在一些实施方案中，所述启动子为组成型启动子。在一些实施方案中，组成型启动子为CMV启动子或杂合CMV增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子。在一些实施方案中，启动子为诱导型和/或细胞类型特异性启动子。
在一些实施方案中，恢复患有视力受损或失明的受试者(其视网膜感光细胞变性或已变性并死亡)视网膜的感光性的方法包括：(a)向所述受试者的视网膜递送编码可在视网膜神经元中表达的高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域的核酸表达载体；所述表达载体包含编码高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域并与启动子序列可操作连接的开放阅读框、和任选的转录调控序列；以及(b)在所述视网膜神经元中表达所述表达载体，其中视紫红质的表达赋予所述视网膜神经元以感光性，由此恢复所述视网膜或其一部分的感光性。在一些实施方案中，高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域具有SEQ ID NO：1、3或13所有或一部分的氨基酸序列和SEQ ID NO：1、3或13的视紫红质域序列、或其保留高效和高度敏感的阴离子传导的通道视紫红质的所编码的视紫红质域的生物活性的生物活性片段或为SEQ ID NO：1、3或13或其片段的生物活性保守氨基酸取代变体和SEQ ID NO：1、3或13或其片段的视紫红质域序列。在一些实施方案中，所述表达载体包括AAV(例如，AAV2)病毒载体。在一些实施方案中，所述启动子为组成型启动子。在一些实施方案中，组成型启动子为CMV启动子或杂合CMV增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子。在其它实施方案中，启动子为诱导型和/或细胞类型特异性启动子。
A.作为治疗剂的组合物
通道视紫红质或其活性片段(如但不限于视紫红质域)作为治疗剂而使用。在某些实施方案中，本公开的组合物和用于改进光基因技术和应用并且还可用于帮助诊断、预防和/或治疗尤其是神经元介导的病症、神经系统疾病(如帕金森氏病)并作为眼部病症的疗法。
在某些实施方案中，本公开的组合物可与一种或多种额外的化合物或试剂（“额外的活性剂”)组合施用以治疗、处置和/或预防尤其是神经元介导的病症、神经系统疾病(如帕金森氏病)并作为眼部病症的疗法。这种疗法可以治疗或改善尤其是神经元介导的病症、神经系统疾病(如帕金森氏病)并作为眼部病症疗法的治疗有效剂量向患者施用。治疗有效剂量是指足以造成疾病症状的发作的任何延迟、改善或减缓的化合物的量。
此类组合物的毒性和治疗功效可通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序测定，例如，用于测定LD50(对50％群体致命的剂量)和ED50(对50％群体治疗有效的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比率为治疗指数、表示为比率LD50/ED50。展现大治疗指数的组合物是优选的。在某些实施方案中，可使用展现毒性副作用的化合物，然而，通常应谨慎设计递送系统，该系统将此类组合物优先靶向所影响组织的部位，以便使未受感染细胞的潜在损害减至最小，并由此减少副作用。
从细胞培养测定和动物研究处获得的数据可用于配制供人使用的剂量范围。此类组合物的剂量优选地落在循环浓度范围内，包括ED50，几乎没有或没有毒性。剂量可根据采用的剂型和所用的施用途径在此范围内变化。对于任何组合物，治疗有效剂量可最初由细胞培养测定来估算。可在动物模型中配制剂量以实现循环血浆浓度范围，包括如细胞培养中所测定的IC50(即，实现症状的一半最大抑制的测试组合物的浓度)。此类信息可用于更准确地测定人中的有用剂量。血浆水平可例如通过高效液相色谱法测量。
当涵盖尤其是神经系统疾病(如帕金森氏病)的治疗性治疗和眼部病症的治疗时，合适的剂量也可使用动物研究确定，以便确定生物活性剂每公斤测试受试者体重的最大耐受剂量或MTD。一般说来，至少一种所测试的动物物种为哺乳动物。本领域技术人员定期将实现功效并避免毒性的剂量外推至其它物种，包括人类。在进行人类功效研究之前，I期临床研究帮助建立安全剂量。
另外，生物活性剂可与多种广为接受的组合物或结构联合或复合，所述组合物或结构例如提高生物活性剂的稳定性、或另外增强其药物学性质(例如，增加体内半衰期、降低毒性等)。
这种治疗剂可通过本领域普通技术人员已知的许多方法施用，包括但不限于吸入、皮下(sub-q)、静脉内(I.V.)、腹膜内(I.P.)、肌内(I.M.)或鞘内注射、或局部施用(经皮、膏剂、霜剂、油膏剂、滴眼剂等)，如下文中更详细描述。
B.药物组合物
根据当前描述的组合物使用的药物组合物可使用一种或多种生理学上可接受的载体或赋形剂以常规方式配制。
药物组合物可包含用于改变、维持或保持，例如，pH、摩尔渗透压浓度、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速度、组合物的吸附或渗透的制剂材料。合适的制剂材料包括但不限于：氨基酸(例如，甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸)；抗微生物；抗氧化剂(例如，抗坏血酸、亚硫酸钠和亚硫酸氢钠)；缓冲剂(例如，硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐及其它有机酸)；填充剂(例如，甘露糖醇和甘氨酸)；螯合剂(例如，乙二胺四乙酸(EDTA))；复合剂(例如，咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精和羟基丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖、二糖及其它糖(例如，葡萄糖、甘露糖和糊精)；蛋白质(例如，血清白蛋白、明胶和免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(例如钠)；防腐剂(例如，苯扎氯铵、安息香酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸和过氧化氢)；溶剂(例如，甘油、丙二醇和聚乙二醇)；糖醇(例如，甘露糖醇和山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(例如，普朗尼克(pluronics)、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80)、triton、缓血酸胺、卵磷脂、胆固醇和泰洛沙泊(tyloxapal))；稳定性增强剂(例如，蔗糖和山梨糖醇)；张力增强剂(例如，碱金属卤化物(例如氯化钠或氯化钾)、甘露糖醇和山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂；以及药物佐剂(“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，第18版(Gennaro编著，Mack PublishingCompany，Easton，PA，1990))。
另外，所述治疗肽可连接到半衰期延长媒介物上。某些示例性半衰期延长媒介物在本领域中是已知的，并且包括但不限于Fc结构域、聚乙二醇及葡聚糖(参见，例如PCT专利申请公布号WO 99/25044)。
这些试剂可被配制以便通过注射，例如通过弹丸注射或连续输注进行胃肠外施用。用于注射的制剂可以单位剂型，例如在安瓿中或在多剂量容器中存在，其中附加有防腐剂。组合物可采用以下形式，如在油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳液，并且可含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可呈粉末形式以供在使用之前用合适的媒介物例如无菌无热原的水复原。
试剂还可被配制为用于直肠施用的组合物，如栓剂或滞留型灌肠剂，例如，含有常规的栓剂基料，如可可脂或其它甘油酯。
除先前描述的制剂之外，试剂还可被配制为贮库型制剂。这种长效制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用。例如，试剂可用合适的聚合或疏水性材料(例如，作为在可接受的油中的乳剂)、离子交换树脂或作为难溶性衍生物，例如作为难溶性盐来配制。如果需要的话，组合物可存在于包装或分配器装置中，其可含有一种或多种含有活性成分的单位剂型。所述包装可例如包括金属或塑料薄膜，如泡罩包装。所述包装或分配器装置可伴有施用的指示。
活性组合物可通过控制释放手段或通过本领域普通技术人员公知的递送装置来施用。实例包括但不限于在以下中所述的那些：美国专利号3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556及5,733,566。这类剂型可使用以下各物来提供一种或多种活性成分的缓慢或控制释放：例如羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体、微球体或其组合，以便提供变化比例的所需释放分布。示例性持续释放基质包括但不限于聚酯、水凝胶、聚交酯(参见，例如美国专利号3,773,919和欧洲专利申请公布号EP 058,481)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸盐的共聚物(参见，例如Sidman等人，Biopolymers 22：547-556，1983)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(参见，例如Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277，1981，及Langer，Chemtech 12：98-105，1982)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上)以及聚-D(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公布号EP 133,988)。持续释放组合物可包括脂质体，其可通过本领域中已知的若干方法中的任一种来制备(参见，例如Eppstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688-3692，1985，以及欧洲专利申请公布号EP 036,676、EP 088,046及EP 143,949)。本领域普通技术人员已知的合适的控制释放制剂(包括本文所述的那些)可容易选出以便与本公开的组合物一起使用。某些实施方案包括适于口服的单一单位剂型，如但不限于适合于控制释放的片剂、胶囊、软胶囊及囊片。
所有控制释放药物产品具有与通过它们的非控制对应物所实现的相比改善的疗法的共同目标。理想的是，最佳设计的控制释放制剂在医学治疗中的特征是：最少量的药物在最短的时间内用于治疗或控制病况。控制释放制剂的优点包括药物的活性延长、给药频率减少、患者依从性提高。另外，控制释放制剂可用于影响产生作用的时间或其它特征，如药物的血液水平，并且可以因此影响副(例如，不良)作用的出现。
大多数控制释放制剂被设计成最初释放快速产生所希望的治疗效果的一定量的活性成分，并且缓慢并持续地释放其它量的活性成分以长期保持该水平的治疗或预防效果。为了维持活性成分在体内的相对恒定水平，药物必须以一定的速度从剂型中释放出来以替代活性成分在体内被代谢和排泌的量。活性成分的控制释放可由包括但不限于以下的各种条件来刺激：pH、温度、酶、水或其它生理条件或组合物。
在一些情况下，所公开的方法和组合物的活性成分优选不同时或通过相同的施用途径向患者施用。因此，在一些实施方案中，提供试剂盒，当被执业医师使用时，其可简化合适量的活性成分向患者的施用。
典型试剂盒包含一种或多种所公开的治疗剂的单一单位剂型，单独或与可与所公开的组合物组合使用的另一试剂的单一单位剂型组合。所公开的试剂盒可进一步包括用于施用活性成分的装置。这种装置的实例包括但不限于注射器、滴注袋、贴片和吸入器。
所公开的试剂盒可进一步包含可用于施用一种或多种活性成分的药学上可接受的媒介物。例如，如果活性成分以必须复原用于胃肠外施用的固体形式提供，试剂盒可包括含有合适的媒介物的密封容器，活性成分能在该媒介物中溶解以形成适于胃肠外施用的不含微粒的无菌溶液。药学上可接受的媒介物的实例包括但不限于：注射用水USP；水性媒介物，如但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、及乳酸林格氏注射液；水可混溶的媒介物，如但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；以及非水性媒介物，如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯及苯甲酸苄酯。然而，在具体的实施方案中，所公开的制剂不含任何醇类或其它助溶剂、油类或蛋白质。
C.转基因动物
本公开提供了用于形成和使用在其全部细胞中携带藻类来源的阴离子传导的通道视紫红质转基因的人及非人转基因动物以及在一些而不是其全部细胞中(例如在某些电活性细胞中)携带藻类来源的阴离子传导的通道视紫红质转基因的非人转基因动物的方法和组合物。包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猪、微型猪(micro-pigs)、山羊和非人灵长类动物(例如狒狒、猴子和黑猩猩)的任何物种的人和非人哺乳动物都可用于生成携带藻类来源的阴离子传导的通道视紫红质多核苷酸(和/或表达藻类来源的多肽)的转基因动物，所述多核苷酸可作为单个转基因或以多联体(例如头对头或头尾串联)形式整合。藻类来源的阴离子传导的通道视紫红质转基因也可选择性地引入特定的细胞类型中并在其中激活(参见，例如Lakso等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6232-6236，1992)。这种细胞类型特异性激活所需的调控序列将取决于具体的目的细胞类型，且对本领域技术人员是显而易见的。
如果想要将藻类来源的阴离子传导的通道视紫红质或其片段转基因整合到哺乳动物阴离子传导的通道视紫红质基因的内源性拷贝的染色体位点中，那么基因靶向一般是优选的。简言之，当要使用这种技术时，设计包含一些与内源性阴离子传导的通道视紫红质基因同源的核苷酸序列的载体，用于通过与染色体序列的同源重组而整合并破坏内源性通道视紫红质基因(即“敲除”动物)的功能。以此方式，内源性通道视紫红质基因的表达也可通过将非功能序列插入到内源性通道视紫红质基因中来消除。也可将转基因选择性地引入特定的细胞类型中，由此仅使这个细胞类型中的内源性通道视紫红质基因失活(参见，例如Gu等人，Science 265：103-106，1994)。这种细胞类型特异性失活所需的调控序列将取决于具体的目的细胞类型，且对本领域技术人员是显而易见的。
本领域中已知的任何技术都可用于将通道视紫红质或其片段转基因引进到动物中以产生转基因动物的创始系。这类技术包括但不限于：原核显微注射(美国专利号4,873,191)；向种系中的逆转录病毒介导的基因转移(van der Putten等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：6148-6152，1985)；在胚胎干细胞中的基因靶向(Thompson等人，Cell 56：313-321，1989)；胚胎电穿孔(Lo，Mol.Cell.Biol.3：1803-1814，1983)；精子介导的基因转移(Lavitrano等人，Cell 57：717-723，1989)；以及正负选择，如美国专利号5,464,764中所述。这类技术的综述参见例如Gordon，Int.Rev.Cytol.115：171-229，1989。
一旦产生了转基因动物，便可利用标准技术测定重组通道视紫红质基因或其片段的表达。可通过DNA印迹分析或PCR技术对动物组织分析是否发生了通道视紫红质转基因的整合，如此进行初步筛选。也可使用包括但不限于以下的技术评价通道视紫红质转基因在转基因动物组织中的mRNA表达水平：获自动物的细胞类型样品的RNA印迹分析、原位杂交分析及RT-PCR。也可使用对通道视紫红质转基因产物有选择性的抗体在免疫细胞化学上评估藻类来源的通道视紫红质表达组织的样品。
D.基于转基因的疗法
在某些实施方案中，本公开的组合物和用于改进光基因技术和应用并且还可用于帮助诊断、预防和/或治疗神经系统疾病，如但不限于帕金森氏病，而且还用于眼部病症。
在一些实施方案中，方法和组合物用于鉴别和表征来源于藻类的多种通道视紫红质。通道视紫红质的视紫红质域的克隆和表达及在哺乳动物细胞中的表达表明这些通道视紫红质具有可用于光基因应用以及治疗剂的改进特征。
例如，所公开的方法和组合物可尤其用于哺乳动物的视网膜基因疗法(如尤其是美国专利号5,827,702、7824869和美国专利公布号20100015095以及WIPO公布WO 2000/15822和WO 1998/48097中所述)。遗传工程化的眼细胞通过使细胞在其中外源性核酸由细胞摄取以用于表达的条件下与外源性核酸接触而产生。外源性核酸被描述为逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或质粒。使用重组腺相关病毒(rAAV)的报道基因、绿色荧光蛋白(GFP)的视网膜基因转移显现于正常的灵长类动物中(Bennett，J等人1999Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，9920-25)。在使用RP65基因突变并用替代或代替突变基因的正常基因的替代疗法的光感受器快速变性模型中使用基因疗法恢复光感受器(参见，例如US专利公布2004/0022766)已用于治疗严重视网膜变性疾病的天然出现的犬模型-RPE65突变犬，其类似于人LCA。通过经由基于病毒的基因治疗方法在患病视网膜的存活视网膜神经元中表达感光性膜通道或分子，本发明可以用于恢复视力的高空间和时间分辨率产生视力受损或失明的永久治疗。
编码本公开的阴离子传导的通道视紫红质的活性部分的核酸序列包括但不限于编码SEQ ID NO：1、3及13中所鉴别的视紫红质域的核酸序列或SEQ ID NO：2的视紫红质域序列。
在一些实施方案中，提供一种修饰真核细胞(如神经元)中的靶多核苷酸的方法。在一些实施方案中，所述方法包括允许CRISPR复合体结合至靶多核苷酸以实现所述靶多核苷酸的裂解，由此修饰所述靶多核苷酸，其中CRISPR复合体包含与引导序列复合的CRISPR酶，所述引导序列在所述靶多核苷酸内杂交至靶序列，其中所述引导序列与tracr配偶序列连接，该tracr配偶序列又杂交至tracr序列。在一些实施方案中，所述裂解包括由所述CRISPR酶在靶序列的位置处裂解一条或两条链。在一些实施方案中，所述裂解造成靶基因的转录减少。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过与外源性模板多核苷酸的同源重组修复所述裂解的靶多核苷酸，其中所述修复造成一个或多个通道视紫红质编码核苷酸在所述靶多核苷酸中的插入。
示例性DNA结合蛋白为Ⅱ型CRISPR系统的RNA引导的DNA结合蛋白。示例性DNA结合蛋白为Cas9蛋白。根据一方面，提供一种工程化的Cas9-gRNA系统，如果需要的话，其能够以位点特异性方式进行RNA引导的基因组切割，并且通过本文所提供的外源性通道视紫红质编码核酸的插入进行基因组的修饰。引导RNA与靶位点互补或靶向DNA上的基因座。引导RNA可为crRNA-tracrRNA嵌合体。Cas9结合在靶基因组DNA处或附近。所述一个或多个引导RNA结合在靶基因组DNA处或附近。Cas9切割靶基因组DNA并且将外源性供体DNA插入切割位点处的DNA中。
因此，方法涉及使用引导RNA及Cas9蛋白和外源性通道视紫红质编码核酸将外源性通道视紫红质编码核酸多重插入到表达Cas9的细胞内的DNA中，这是通过使编码RNA的核酸和外源性供体核酸的插入循环，表达RNA、以切割DNA的方式共同定位RNA、Cas9和DNA，以及插入外源性供体核酸来实现。方法步骤可以任何所需次数循环以产生任何所需数目的DNA修饰。
在一些实施方案中，通道视紫红质(如本文所述的那些)在例如眼部神经元细胞中的引入和表达赋予这类视网膜以感光性并且恢复视觉响应的一个或多个方面及患有这种变性的受试者的功能性视力。通过恢复由于疾病而缺乏此能力的视网膜的感光性，提供一种为视力所需的最基本的光响应的机构。在一些实施方案中，阴离子传导的通道视紫红质如GtACR1和GtACR2的功能域可用于通过在内部视网膜神经元中体内表达通道视紫红质恢复经历视杆和视锥变性的视网膜的感光性。在一些实施方案中，这些通道视紫红质可使用包括但不限于以下的技术被引入：视网膜植入、皮层植入、外侧膝状体核植入或视神经植入
在一些实施方案中，单独或在表达载体内使用核酸转移将阴离子传导的通道视紫红质插入在受试者视网膜的一个区域或部分中的视杆和视锥死亡之后存活的视网膜神经元中。这种表达载体可例如通过将所需核酸序列引入到已知用于基因治疗应用的病毒系统(如但不限于AAV(例如AAV2)、逆转录病毒等等)中来构建。
在一些实施方案中，阴离子传导的通道视紫红质可插入视网膜中间神经元中。这些细胞随后可变为感光的并且经由视神经和更高级的视觉途径发送信号到其中出现视觉感的视觉皮层，如在小鼠中以电生理方式显示。在一些实施方案中，连同其它途径一道，玻璃体内和/或视网膜下注射液可用于递送通道视紫红质分子或表达它的病毒毒体。
在一些实施方案中，本公开的海藻来源的阴离子传导的通道视紫红质的活性部分(如但不限于这些阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域)可通过向视网膜神经元递送编码可在神经元中表达的海藻来源的阴离子传导的通道视紫红质(如但不限于这些阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域)的核酸表达载体用于恢复视网膜的感光性，所述载体包含编码视紫红质的开放阅读框、及可操作地连接于此的启动子序列、及任选的转录调控序列；以及在神经元中表达所述载体，由此恢复感光性。
在某些实施方案中，通道视紫红质可为海藻来源的阴离子传导的通道视紫红质，如但不限于阴离子传导的通道视紫红质的功能域，如但不限于GtACR1、GtACR2或Gt161302或其生物活性片段或保守氨基酸取代变体，如但不限于视紫红质域。载体系统可为重组AAV(例如AAV2)，启动子可为组成型启动子，如但不限于CMV启动子或杂合CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)。
IV.实施例
以下实施例被纳入以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当了解，在以下实施例中公开的技术代表发明人发现的可在实践本发明时充分发挥其功能的技术，且因此可被认为构成实施本发明的优选模式。然而，本领域技术人员应理解可以根据本说明书的公开内容对其公开的特定实施方案进行改变，且仍然可以获得相似或类似的结果，而不会脱离本发明的精神和范围。
实施例1-材料和方法
分子生物学方法：编码蓝隐藻视蛋白的7TM结构域(295、291及288aa，分别对应于JGI蛋白质模型111593、146828及161302)的序列是针对人密码子使用而优化并且合成(Genewiz，South Plainfield，NJ，USA)和与EYFP标签同框克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)中。编码功能性构建体111593(GtACR1)和146828(GtACR2)的序列信息将存放在GenBank(分别为登录号KP171708和KP171709)中。编码古紫质-3(Arch)的基因是由Dr.Edward S.Boyden(MassachusettsInstitute of Technology，Boston，MA，USA)友情提供。使用QuikChange XL定点诱变试剂盒(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)引入突变并且通过DNA测序验证。
HEK293记录方法：使用ScreenFectA转染试剂(Waco Chemicals USA，Richmond，VA，USA)转染HEK293(人胚肾)细胞。添加全反式视黄醛(Sigma，St Louis，MO，USA)作为在乙醇中的储备溶液，最终浓度为5μM。在用Axopatch 200B放大器(Molecular Devices，UnionCity，CA，USA)转染之后48-72h进行测量。使用pClamp 10软件(都来自Molecular Devices)用Digidata 1440A对信号进行数字化。电阻为2-5MΩ的膜片移液管是由硅酸硼玻璃制造。溶液的组成示于表S1中。4M盐桥用于所有实验中；使用ClampEx内置式LJP计算器计算液体接界电位(LJP)。连续光脉冲是由与机械快门(Uniblitz Model LS6，Vincent Associates，Rochester，NY，USA；半开时间0.5ms)组合的Polychrome Ⅳ光源(T.I.L.L.PhotonicsGMBH，Grafelfing，Germany)提供。用内置式Polychrome系统或用中性密度滤光片衰减光强度。在40x物镜的焦平面处的最大量子密度为8.5mW/mm2。
在目的为测试阳离子渗透性的实验中，通过用在150mM Na+(pH 5.4)、150mM Na+(pH 7.4)、150mM K+(pH 7.4)或75mM Ca2+(pH 7.4)下测量的值减去在浴中在150mM NMG+下测量的参考值来计算Erev位移。对于所有阳离子，浴中的Cl-浓度都为155.6mM。在阴离子渗透性测试中，通过用在75mM SO4 2-或150mM F-、Br-、I-或NO3-下测量的值减去在150mM Asp-下测量的参考值来计算Erev位移。对于除F-外的所有阴离子，浴中的Na+浓度为150mM(表1)。
表1：在用HEK293细胞的实验中吸移管和浴溶液的组成及液体接界电位。
Figure BPA0000249828060000501
所用缩写：Asp，天冬氨酸盐；EGTA，乙二醇四乙酸；HEPES，4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸；LJP，液体接界电位；NMG，N-甲基-D-葡糖胺。所有浓度都以mM为单位。
神经元记录：为了神经元表达，将GtACR2-EYFP构建体转移到由Carlos Lois博士(Massachusetts Institute of Technology，Boston，MA，USA)提供的pFUGW慢病毒载体中。慢病毒是通过使用脂转染胺2000(Invitrogen，Grand Island，NY，USA)用包膜质粒pCMV-VSVG、包装质粒pΔ8.9(都来自Lois博士)和pFUGW-GtACR2-EYFP质粒三重转染HEK293FT细胞(Invitrogen Grand Island，NY，USA)而产生。E18 Sprague Dawley大鼠的海马是作为来自BrainBits(Springfield，IL，USA)的试剂盒的部分而获得，并且使用由该公司提供的方案制备初级神经元培养物。将细胞在聚赖氨酸涂布的盖玻片上并补充有0.4μM全反式视黄醛(最终浓度，除存在于培养基中的视黄醇乙酸酯之外)的NbActiv4培养基中培养。在转染之后10到19天进行膜片钳测量。相同的光激发来源和测量装备如上所述用于HEK细胞。以电流钳模式测量尖峰形成。溶液的组成示于表2中。
表2：在用神经元的实验中吸移管和浴溶液的组成及液体接界电位。
Figure BPA0000249828060000511
所用缩写：HEPES，4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸；LJP，液体接界电位；NMDG，N-甲基-D-葡糖胺。所有浓度都以mM为单位。
实施例2-视紫红质的表征
在大约50种来自绿色植物的已知ChR中，所有已测试的ChR都排他地为阳离子通道。然而，已从这些生物体克隆的若干视紫红质序列没有展现通道活性。隐芽植物蓝隐藻的核基因组序列已被完全测序(B.A.Curtis等人，Nature 492，59(2012))。模型蛋白质的BLAST检索返回与微生物(I型)视紫红质具有同源性的53个命中。无一与ChR高度同源，但一个特定簇(图1A)的模型含有绿色植物ChR所特有的一些关键残基(图1B)。
编码蓝隐藻蛋白111593、146828和161302的7TM结构域的序列在HEK293细胞中良好表达。开头两个构建体产生光电流，而第三个则没有。如下所示，开头两个用作光门控阴离子通道；因此将它们命名为GtACR1和GtACR2(蓝隐藻阴离子通道视紫红质1和2)。
使用标准溶液(在吸移管中126mM KCl和在浴中150mM NaCl，pH 7.4；其它组分参见表1)，由GtACR1和GtACR2产生的电流在保持电位(Eh)-60mV下是内向的(图1D，主图)。来自GtACR1和GtACR2的平均固定电流分别比来自CrChR2的大8倍和6倍，CrChR2是最常用的光基因工具，具有显著较小的失活(图1，插图)。光电流的半衰期对于GtACR1和GtACR2分别是200和90ms。电流上升速率对于刺激强度的依赖性展现比振幅更高的饱和水平(图1E)且因此用于构成作用光谱。GtACR1对515nm光展现最大敏感性，其中在光谱的短波长斜坡上具有肩部(图1F)。GtACR2的敏感性在470nm处达到峰值，在445和415nm处有附加谱带(图1F)。
一旦膜去极化，便使用标准溶液(参见上文)将GtACR1和GtACR2光电流的符号反转(分别为图2A和B)。在-60至60mV的测试范围内，电流电压关系(IE曲线)为线性的(图2C)，不同于绿色植物ChR的那些(如D.Gradmann，A.Berndt，F.Schneider，P.Hegemann，Biophys.J.101，1057(2011)中所述。为了表征蓝隐藻视紫红质的离子渗透性，测量IE曲线并且一旦浴溶液的离子组成变化便测定Erev。与绿色植物ChR(其质子是最高度渗透的离子)相反，由GtACR1和GtACR2产生的电流的Erev不受pH的影响(图2C)。此外，当大的非渗透性有机阳离子N-甲基-葡糖胺(NMG+)用Na+、K+或Ca2+置换时，没有观察到Erev移位(图2D)。表明GtACR1和GtACR2对由绿色植物ChR传导的阳离子是可渗透的。
当浴中的大部分Cl-被大有机阴离子天冬氨酸盐置换由此对Cl-(ECl)产生81mV的能斯脱平衡电位且Erev移位至80mV(图3A-C)时，只要由GtACR1和GtACR2产生的电流排他地归因于被动Cl-转运便如所预期。接着，通过在浴中用不同阴离子代替非渗透性的Asp-来比较所述阴离子的渗透性。对于两种蓝隐藻ACR，I-、NO3-或Br-产生比Cl-甚至更大的Erev位移。F-产生较小位移，而SO4 2-则是非渗透性的。对于ACR测定的渗透性顺序NO3 -＞I-＞Br-＞Cl-＞F-＞SO4 2-＝Asp-与来自动物细胞的许多经典Cl-通道的感胶离子序特征一致。
ACR的显著特点是在细菌视紫红质(BR)的质子受体Asp85的位置中的非羧酸残基，其中几乎所有阳离子选择性ChR都含有Glu残基(螺旋3的列5，在图1C中以红色突出显示)。用Glu的置换降低电流＞1000倍，而不会抑制表达。这些极小的保持电流的动力学显著改变。但最重要的是，此突变消除了ACR的阴离子选择性，如从在浴中用天冬氨酸盐取代氯离子之后实际不变的Erev可以明显看出(图6A)，与野生型形成显著对比。因此，羧酸酯残基在质子受体位置中的不存在似乎为ACR的阴离子选择性所需。在相应位置处的非离子化残基也是来自盐古菌和海洋产黄细菌的氯离子泵视紫红质所典型的(图1C)，其中残基在如对于盐古细菌(haloarchaeal)嗜盐菌视紫红质所示的非光化状态下形成氯离子结合位点的一部分。
在包括神经元的大多数动物细胞中的细胞质Cl-浓度较低。在这种条件(在移液管中的6mM Cl-和在浴中的156mM)下，蓝隐藻ACR在HEK293细胞中在超过ECl的Eh下产生超极化电流(图4A针对GtACR2，图6B针对GtACR1)。GtACR2光电流的振幅相似，但动力学比GtACR1电流更快，这对于控制神经元活性是有利的。光电流的高振幅使得ACR作为用于光诱发的超极化的光基因工具来说极有前景。GtACR2在10,000倍更低的光强度下产生与质子泵古紫质-3(Arch)相同振幅的超极化光电流，Arch是一种用于光基因尖峰抑制的普及工具(图4B)。最有效的Cl-传导的ChR突变的超极化光电流的最大振幅＜0.6nA、以显著减慢的动力学为代价。在GtACR2的情况下，在3000倍更低的光强度下观察到这种振幅的电流和100倍更快的动力学(图4B)。这些性质使得蓝隐藻ACR与先前可利用的相比成为更有效的超极化光基因工具。
在培养的大鼠锥体神经元中，GtACR2产生的超极化电流在超过-88mV的Eh下(图4C和D)。此值恰好对应于在我们的条件(表2)下的ECl，从而证实GtACR2在神经元中排他地传导阴离子。此严格选择性是ACR与先前报道的Cl-传导的ChR突变相比的第二个优点，其Erev为25-30mV，比ECl更正，这归因于残余阳离子渗透性。GtACR2使膜超极化的电位范围因此显著更宽并且延伸通过神经元静息电位典型的值(图4D)。在电流钳实验中，GtACR2在超过3x10-3mW/mm2的光强度下且以高时间精度完全抑制电诱发的尖峰(图4E和F)。
尽管不希望受具体机制限制，然而很明显在ACR中的阴离子传导机制不同于Cl-传导的ChR突变的机制，如从其较大的序列差异可能预期到。ACR含有对应于为CrChR2所述的阳离子选择性滤膜的Glu90的Glu残基。为了赋予此阳离子传导通道以Cl-渗透性，Glu90需要用不带电的(Ser(15))或阳离子(Lys或Arg(14))残基进行置换。然而，Glu90同源物在ACR中的存在表明它不是阴离子通道中阴离子渗透的屏障，这不同于阳离子通道。在系统发生和功能上，ACR包含不同类别的视紫红质，其在根本上不同于阳离子通道视紫红质(CCR)。作为天然的阴离子通道，ACR提供通过为极高感光性、绝对阴离子选择性和快速动力学进化而优化的超极化光基因工具。
实施例3-PsuACR1为光门控的阴离子通道(ACR)
另一ACR已在海洋隐芽植物Proteomonas sulcata中鉴别，其显示出与如上所述来源于蓝隐藻的那些ACR的紧密相似性。此序列已经鉴定为PsChR1(参见GenBank：KF992074，以引用的方式并入本文)并且已显示当在培养神经元中表达时产生光电流(Klapoetke NC，Murata Y，Kim SS，Pulver SR，Birdsey-Benson A，Cho YK，Morimoto TK，Chuong AS，Carpenter EJ，Tian Z，Wang J，Xie Y，Yan Z，Zhang Y，Chow BY，Surek B，Melkonian M，Jayaraman V，Constantine-Paton M，Wong GK，Boyden ES.Nat Methods.2014 Mar；11(3)：338-46))，但这些光电流没有被详细表征并且测量没有区分出阳离子与阴离子传导。在以下实施例中表明，相应的P.sulcata蛋白展现出类似于来自蓝隐藻的ACR的光门控的阴离子传导，虽然其在培养的哺乳动物细胞中的光电流振幅较小。因此，它在本文中被称为PsuACR1(SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14)，来自物种名称的第三字母被加入是因为缩写Ps比来自绿藻亚心形扁藻的CCR更早使用。
除此之外，PsuACR1一级蛋白序列展现见于如上所述蓝隐藻来源的ACR(SEQ IDNO：1和3)中的高的总相似性和若干特征要素。它含有对应于CrChR2的Glu-90的Glu残基(Glu-64)，该残基必须被中性或带正电的残基置换以将CrChR2转化为Cl-传导通道。质子受体在细菌视紫红质(Asp-85)中的位置被非羧酸残基占据，虽然在PsuACR1中它是Ala(Ala-93)而非Ser，如在蓝隐藻来源的ACR(SEQ ID NO：1和3)中。最终，根据C1C2嵌合体(Tyr-109、His-173和His-304)的晶体结构而预测形成内部阳离子通道门的三个残基中没有一个在PsuACR1 ACR(SEQ ID NO：13和14)或蓝隐藻来源的ACR(SEQ ID NO：1和3)中是保守的：Tyr-109在所有三种蛋白质中用Met置换；His-173(位置对应于细菌视紫红质中的Asp-96)在GtACR1中用Leu且在GtACR2(SEQ ID NO：3)和PsuACR1(SEQ ID NO：13)中用Gln(如在视紫红质钠泵中)置换；His-304在GtACR1中用Ala置换，在GtACR2中用Ser置换，且在PsuACR1(SEQID NO：13)中用Arg置换。
为了确定PsuACR1(SEQ ID NO：13和14)的电生理学性质，将其在人胚肾(HEK293)细胞中表达并且在电压钳条件下测量光电流并在图7中展示研究结果。将响应于饱和强度的光脉冲用标准溶液(在吸移管中126mMKCl和在浴中150mM NaCl，pH 7.4)记录的一系列电流迹线示于图7A中。在放大器输出下，在-60mV下的平均峰值振幅为707±184pA(平均值±SEM，n＝18个细胞)，其比在相同条件下由来源于蓝隐藻的ACR(SEQ ID NO：1和3)产生的电流大约小十倍。另一差异在于PsuACR1(SEQ ID NO：13和14)电流在连续光照下显示快速失活至56±2％的高峰水平(平均值±SEM，n＝18个细胞)，而由蓝隐藻来源的ACR(SEQ ID NO：1和3)产生的光电流的失活要小得多和慢得多。当膜电位移向更正的值时，使PsuACR1(SEQID NO：13和14)光电流的符号反转。其峰值振幅对保持电位(Eh)的依赖性(IE曲线)是线性的(图7D，黑线)，如对于蓝隐藻ACR(SEQ ID NO：1和3)来说，而与CCR所典型的外向校正形成对比。在标准溶液中记录的光电流的逆转电位(Erev)接近于零(图7D，黑色符号和线)。
当浴中的大部分Cl-用天冬氨酸盐置换时，Erev移至72±2mV(平均值±SEM，n＝5个细胞)。在这些条件下测量的典型系列的光电流示于图7B中，且IE曲线示于图7D(红色符号和线)中。当吸移管中的Cl-用Asp-置换，但浴溶液为标准时，Erev移至-70±2mV(平均值±SEM，n＝4个细胞)。针对这些条件的光电流和IE曲线分别示于图8C和D(蓝色符号和线)中。这些结果表明PsuACR1光电流是归因于被动Cl-转运。
浴中的Cl-用其它阴离子置换并测量IE曲线。用每个阴离子测量的Erev值距非渗透性Asp-的位移示于图8中。对于蓝隐藻ACR，I-为最可渗透的，且F为最不可渗透的卤离子，而二价硫酸根是实际上不渗透的。类似地，在浴中用Na+、K+或Ca2+代替非渗透性N-甲基-葡糖胺(NMG+)或当浴pH从7.4降至5.4时几乎没有测量到Erev的移位(图8)。这些结果证实PsuACR1为光门控阴离子通道。
在pH 7.4下测量的PsuACR1光电流的作用光谱在520nm处具有最大值且在550nm处具有肩部(图9)。降至pH 5.4没有移动光谱最大值的位置。
为了表征PsuACR1光电流在单一转换条件下的动力学，将激光闪光(6ns)用于光激发(图10a)。与先前表征的来自蓝隐藻的ACR相比，在pH 7.4下在PsuACR1中的通道关闭约8倍更快(图10b)。电流衰减用3个指数拟合。第三最慢分量对总振幅的贡献最少。PsuACR1光电流的三个衰减分量的振幅的电压依赖性(IE曲线)示于图10c中。所有分量的逆转电位在实验误差范围内相同。所有分量的时间常数(τ)仅有较弱的电压依赖性(图13)，与先前在GtACR1中的观察结果相反。峰值电流恢复速率是在双闪光实验中测量。对于PsuACR1，其比对于GtACR2约5倍更快，且比对于GtACR1约8倍更快(图10d)。
在对于通道电流的逆转电位下，记录快速负信号，其时程受到记录系统的时间分辨率的限制(图11a)。由PsuACR1记录的快速电流的内向方向对应于与视黄醛异构化有关的初始电荷传递。在PsuACR1中的此电流振幅不取决于在测试范围内的浴的Vh或pH(图11b和c)，这进一步表明此电流作为视黄醛异构化的起因。
＊ ＊ ＊
本文所公开和要求的所有方法可根据本公开通过正常的实验操作和实施。虽然本发明的组合物和方法已根据优选实施方案来描述，但对本领域技术人员显而易见的是，可在不背离本发明的概念、精神及范围的情况下对本文所述的方法及方法的步骤或步骤顺序进行改变。更具体地，很显然，某些化学和生理学上相关的试剂可以代替本文所述的试剂，与此同时将获得相同或相似的结果。对本领域技术人员来说显而易见的所有这类相似替代和修改被认为在如所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围及概念内。
参考文献
以下参考文献为本文阐述的内容提供了示例性操作或其它详细补充，因此特别以引用的方式并入本文。
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Claims (25)

1.编码可在细胞中表达的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域的包含编码SEQID NO: 1、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的多核苷酸的表达载体用于制备用于使患有神经元介导病症的受试者中的细胞膜超极化的药物的用途，其中所述药物配制成用于：
(a) 向所述受试者的细胞递送所述表达载体；以及
(b) 在所述细胞中表达所述载体，其中所述表达的视紫红质使得来自所述神经元的信号沉默。
2.编码可在靶神经元中表达的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域的包含编码SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的多核苷酸的表达载体用于制备用于使患有神经元介导病症的受试者中的神经元沉默的药物的用途，其中所述药物配制成用于：
(a) 向所述受试者的靶神经元递送所述表达载体；以及
(b) 在所述靶神经元中表达所述载体，其中所述表达的视紫红质造成来自所述靶神经元的信号沉默。
3.编码可在视网膜神经元中表达的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域的包含编码SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的多核苷酸的表达载体用于制备用于使患有视力受损或失明的受试者的视网膜的感光性恢复的药物的用途，其中所述药物配制成用于：
(a) 向所述受试者的视网膜递送所述表达载体；以及
(b) 在所述视网膜神经元中表达所述载体，其中所述表达的视紫红质在所述视网膜神经元中造成高水平的膜电位。
4.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述药物配制成用于：
(a) 向所述受试者的细胞递送编码视紫红质域的表达载体；所述载体包含编码选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 13的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域的开放阅读框，所述开放阅读框与启动子序列可操作地连接；以及
(b) 在所述细胞中表达所述载体，其中所述表达的视紫红质在所述细胞中造成高水平的膜电位。
5.如权利要求2所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物。
6.如权利要求2所述的用途，其中所述受试者为人。
7.如权利要求2所述的用途，其中所述递送包括药学上可接受的载剂。
8.包含编码可在细胞中表达的SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的多核苷酸的表达载体用于制备用于治疗患有涉及电活性细胞的病症的受试者中的电活性细胞障碍的药物的用途，其中所述药物配制成用于：
(a) 向所述受试者的细胞递送所述表达载体；以及
(b) 在所述电活性细胞中表达所述载体，其中所述表达的视紫红质使来自所述电活性细胞的信号沉默。
9.包含含有可在转基因细胞中表达的编码SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:13的氨基酸序列的多核苷酸的表达载体的转基因细胞用于制备用于治疗患有涉及电活性细胞的病症的受试者中的电活性细胞障碍的药物的用途，其中所述药物配制成用于：
(a) 向所述受试者递送所述转基因细胞；以及
(b) 在所述转基因细胞中表达所述载体，其中所述表达使来自电活性细胞的信号沉默。
10.编码可在靶神经元中表达的阴离子传导的通道视紫红质的视紫红质域的包含编码SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的多核苷酸的表达载体用于制备用于使患有电活性细胞介导的病症的受试者中的电活性细胞沉默的药物的用途，其中所述药物配制成用于：
(a) 向所述受试者的靶神经元递送所述表达载体；以及
(b) 在所述目标电活性细胞中表达所述载体，其中所述表达的视紫红质造成来自所述电活性细胞的信号沉默。
11.有效量的阴离子传导的通道视紫红质用于制备用于治疗患有涉及电活性细胞的病症的受试者的药物的用途，其中所述阴离子传导的通道视紫红质由SEQ ID NO: 1、3或13的氨基酸序列组成，并且其中所述药物配制成用于在所述受试者中在电活性细胞的位点处表达所述有效量的阴离子传导的通道视紫红质。
12.如权利要求11所述的用途，其中所述受试者患有神经性疼痛，所述药物配制成用于在所述受试者中在疼痛部位处表达有效量的阴离子传导的通道视紫红质。
13.如权利要求11所述的用途，其中所述表达包括向所述受试者施用阴离子传导的通道视紫红质。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述阴离子传导的通道视紫红质进一步包含细胞穿透肽(CPP)序列或细胞受体结合序列。
15.如权利要求11所述的用途，其中所述表达包括向所述受试者施用编码阴离子传导的通道视紫红质的载体。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述载体为RNA载体。
17.如权利要求15所述的用途，其中所述载体为DNA载体。
18.如权利要求17所述的用途，其中编码所述阴离子传导的通道视紫红质的序列与异源启动子可操作地连接。
19.如权利要求18所述的用途，其中所述启动子为诱导型或阻抑型启动子。
20.如权利要求18所述的用途，其中所述启动子为组织或细胞类型特异性启动子。
21.如权利要求20所述的用途，其中所述启动子为神经元细胞特异性启动子。
22.如权利要求17所述的用途，其中所述载体为质粒、病毒载体或附加型载体。
23.如权利要求17所述的用途，其中所述载体进一步包含自杀基因的诱导型表达盒。
24.如权利要求11所述的用途，其中所述受试者患有断肢、糖尿病、多发性硬化症或已经经历了手术。
25.如权利要求15所述的用途，其中所述阴离子传导的通道视紫红质是由根据SEQ IDNO: 2、4或14-17的序列编码。
CN201680023358.3A 2015-03-19 2016-03-18 阴离子通道视紫红质的组合物及其使用方法 Active CN107531765B (zh)

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