CN109476720A - 通道视紫红质的突变型光诱导离子通道 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与亲本通道相比具有改善的性质的突变型光诱导离子通道，编码其的核酸构建体，携带所述核酸构建体的表达载体，包含所述核酸构建体或表达载体的细胞，及其各自的用途，以及包含本文公开的突变型光诱导离子通道、核酸构建体或表达载体的非人动物。

Description

通道视紫红质的突变型光诱导离子通道
本发明涉及具有改善的性质的突变型光诱导离子通道，编码其的核酸构建体，携带所述核酸构建体的表达载体，包含所述核酸构建体或表达载体的细胞，及其各自的用途，如权利要求中定义。
背景技术
光门控，内向整流阳离子通道，通道视紫红质-1(ChR1)和通道视紫红质2(ChR2)已成为体外和体内神经元靶向光激活的优选工具1-5。尽管野生型(WT)ChR2可用于光诱导去极化，但目前正在寻找具有更快动力学和增加光敏性的ChR2突变体，以用于未来潜在的临床应用(WO 03/084994和6-8)。
自2002年和2003年的第一次描述以来，描述了一组不同的ChR2变体，包括吸收红光的通道视紫红质。出于不同目的，ChR在动力学，离子选择性以及光吸收方面进行了修饰。实例是吸收红光的通道视紫红质Chrimson(WO2013/071231和9)，Volvox通道视紫红质(VChR1)10和嵌合体ReaChR(ChR2CV1，CV2，吸收红光的通道视紫红质(Red absorbingChannelRhodopsin)；US 8,759,492 B2，和11)。本领域还描述了通道视紫红质2的Ca2+可渗透突变体L132C(CatCh；WO2012/032103，和12)。先前的研究已经证明，螺旋3和4中位置C128和D156的突变分别导致通道动力学显著减慢，开放寿命长达30分钟或更长时间，产生500倍甚至更高的光敏感性6，7。这些C128和D156突变体可以通过红光在可变的开放时间关闭。尽管具有优异的光敏性，但它们的缓慢闭合动力学仍然是其适用性的限制因素。
ChR2动力学是一个主要问题，因为光敏感度是通过通道的开放时间来调节的。这是由于其他通道参数(如单通道电导，开放概率，量子效率)的不变性。换句话说，具有长开放时间的通道在低光强度下达到最大活动，而短活性通道需要更多光以相对于光饱和度达到饱和。虽然“快速”通道需要更多的光来激活，但由于不同神经元细胞的高频率放电，高速对于神经生物学中的许多应用是必不可少的。这是有根据的，例如对于大脑中间神经元的听觉系统中的神经节细胞，其达到高达1000Hz的放电速率。
因此，仍然需要展示更快响应动力学的突变型光诱导离子通道。
发明内容
发明人通过修饰7个跨膜螺旋基序16的螺旋6中的位置F219对不同的通道视紫红质进行了系统研究。可以证明WT ChR2中螺旋6中位置F219的突变加速了通道的关闭时间(关闭动力学)。通过螺旋6的修饰，Ca2+可渗透突变体L132C(CatCh)也被加速，并且观察到Ca2+渗透率的增加。所述新发现的效果可以在ChR2，Volvox通道视紫红质(VChR1；登录号EU622855)和嵌合体ReaChR(ChR2CV1，CV2，吸收红光的通道视紫红质；登录号KF448069)中证明。值得注意的是，所考虑的位置在不同通道视紫红质的螺旋6中是同源的。图1中给出了螺旋6中的修饰的概述。
本公开描述了通过组合不同的通道视紫红质的性质来修饰通道视紫红质的速度的一般方法。这些新变体的使用将提供对神经元的光刺激，直至其达到800至1000Hz的极限。
这些修饰也会增加Ca2+的渗透率，这应该被作为影响细胞质中Ca2+浓度的有用工具用于质膜和细胞内Ca储存器，肌浆网，内质网或线粒体的膜。
在NG108-15细胞(神经母细胞瘤细胞)，HEK293细胞和来自小鼠脑的海马细胞中测试了针对增加的速度和增强的Ca2+渗透率的实验验证。
由于已知细胞内膜表面电位受Ca2+的强烈影响，修饰膜下细胞内Ca2+水平将导致膜和神经元中的去极化，激活电压门控Na+通道。相对较高的光门控Ca2+-流入量提升了内膜表面电位并激活Ca2+激活的大电导钾(BK)通道。[Ca2+]j的增加提升了内部表面电位，促进了电压门控Na+通道的激活，并间接提高了光敏性。光刺激后的再极化明显加速了Ca2+依赖性BK通道激活。
因此，公开了突变型光诱导离子通道，其中所述突变型光诱导离子通道包含与SEQID NO：1(ChR-2)的全长序列具有至少66％相似性/同源性的氨基酸序列，其中所述突变型光诱导离子通道与其亲本光诱导离子通道的不同之处仅在于对应于SEQ ID NO：1中F219的位置处的置换，
当在钳位电位-60mV，浴溶液为140mM NaCl、2mM CaCl2、2MgCl2、10mM HEPES、pH7.4，和移液管溶液为110mM NaCl、2mM MgCl2、10mM EGTA、10mM HEPES，pH7.4下以全细胞模式通过膜片钳测量比较时，与所述亲本通道相比所述置换增加所述突变型通道的关闭动力学(off-kinetics)。
进一步公开了突变型光诱导离子通道，其中所述突变型光诱导离子通道包含与SEQ ID NO：2(VChRl)的全长序列具有至少66％相似性/同源性的氨基酸序列，其中所述突变型光诱导离子通道与其亲本光诱导离子通道的不同之处仅在于对应于SEQ ID NO：2中F214的位置处的置换，
当在钳位电位-60mV，浴溶液为140mM NaCl、2mM CaCl2、2MgCl2、10mM HEPES、pH7.4，和移液管溶液为110mM NaCl、2mM MgCl2、10mM EGTA、10mM HEPES，pH7.4下以全细胞模式通过膜片钳测量比较时，与所述亲本通道相比所述置换增加所述突变型通道的关闭动力学。
还公开了突变型光诱导离子通道，其中所述突变型光诱导离子通道包含与SEQ IDNO：3(ReaChR)的全长序列具有至少66％相似性/同源性的氨基酸序列，其中所述突变型光诱导离子通道与其亲本光诱导离子通道的不同之处仅在于对应于SEQ ID NO：1中F259的位置处的置换，
当在钳位电位-60mV，浴溶液为140mM NaCl、2mM CaCl2、2MgCl2、10mM HEPES、pH7.4，和移液管溶液为110mM NaCl、2mM MgCl2、10mM EGTA、10mM HEPES，pH7.4下以全细胞模式通过膜片钳测量比较时，与所述亲本通道相比所述置换增加所述突变型通道的关闭动力学。
还提供了核酸构建体，其包含编码本文公开的光诱导离子通道的核苷酸序列。
还提供了表达载体，其包含编码本文公开的光诱导离子通道或核酸构建体的核苷酸序列。
此外，提供了细胞，其包含本文公开的核酸构建体或表达载体。
在另一方面，本发明提供了本文公开的光诱导离子通道在高通量筛选和/或刺激神经元中的用途。
优选实施方案的详细描述
本公开涉及突变型光诱导离子通道，其中所述突变型光诱导离子通道包含与SEQID NO：1(ChR-2)的全长序列具有至少84％相似性/同源性和/或75％同一性的氨基酸序列，其中所述突变型光诱导离子通道与其亲本光诱导离子通道的不同之处仅在于对应于SEQID NO：1中F219的位置处的置换，
当在钳位电位-60mV，浴溶液为140mM NaCl、2mM CaCl2、2MgCl2、10mM HEPES、pH7.4，和移液管溶液为110mM NaCl、2mM MgCl2、10mM EGTA、10mM HEPES，pH7.4下以全细胞模式通过膜片钳测量比较时，与所述亲本通道相比所述置换加速所述突变型通道的关闭动力学，如在权利要求书中所定义。
优选地，在各自异源表达突变体或亲本通道的NG108-15细胞中测量突变体通道的关闭动力学。成功的蛋白质表达可以通过例如EGFP或YFP介导的荧光来证明。通常，响应于500ms光脉冲(强度23mW/mm2，波长594nm)测量光电流。τ关闭值是由照明停止后的电流与单指数函数的拟合确定的。
在优选的实施方案中，置换是F219Y。
优选地，所述突变型光诱导离子通道与SEQ ID NO：1(ChR-2)的全长具有至少86％，优选至少88％，更优选至少90％，更优选至少92％，更优选至少94％，更优选至少96％，更优选至少98％，更优选至少99％的相似性/同源性。
另外地或者备选地，突变型光诱导离子通道与SEQ ID NO：1(ChR-2)的全长具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的同一性。
与SEQ ID NO：1的全长具有至少66％的相似性/同源性或至少52％的同一性的光诱导离子通道的实例是嵌合体ReaChR(登录号KF448069，SEQ ID NO：3)，Volvox通道视紫红质VChR1(登录号EU622855，SEQ ID NO：2)，及其任何其他直向同源物或等位基因变体。
还考虑了光诱导离子通道的交换突变体，其中螺旋6已被SEQ ID NO：4的螺旋-6基序(例如，Chrimson(SEQ ID NO：6)或Chrimson CS(SEQ ID NO：7)，其中螺旋6分别被包含F219Y置换的ChR-2的螺旋6(参见SEQ ID NO：8和9)替换)替换。
这种交换突变体与SEQ ID NO：1(ChR-2)的全长通常具有至少56％的同源性/相似性，与SEQ ID NO：1(ChR-2)的全长具有优选至少58％，更优选至少60％，更优选至少62％，甚至更优选至少64％的同源性/相似性。
另外，或者备选地，这种交换突变体通常与SEQ ID NO：1(ChR-2)的全长具有至少42％，优选至少44％，更优选至少46％，更优选至少48％，更优选至少50％，更优选至少52％，更优选至少54％，更优选至少56％的同一性。
因此，本公开还描述了突变型光诱导离子通道，其中所述突变型光诱导离子通道包含与SEQ ID NO：2(VChRl)的全长序列具有至少66％相似性/同源性的氨基酸序列，其中所述突变型光诱导离子通道与其亲本光诱导离子通道的不同之处仅在于对应于SEQ IDNO：2中F214的位置处的置换，
当在钳位电位-60mV，浴溶液为140mM NaCl、2mM CaCl2、2MgCl2、10mM HEPES、pH7.4，和移液管溶液为110mM NaCl、2mM MgCl2、10mM EGTA、10mM HEPES，pH7.4下以及如以上另外所述以全细胞模式通过膜片钳测量比较时，与所述亲本通道相比所述置换增加所述突变型通道的关闭动力学。优选地，置换是F214Y。
优选地，所述突变型光诱导离子通道与SEQ ID NO：2(VChR1)的全长具有至少70％，优选至少72％，更优选至少74％，更优选至少76％，更优选至少78％，更优选至少80％，更优选至少82％，更优选至少84％，更优选至少86％，更优选至少88％，更优选至少90％，更优选至少92％，更优选至少94％，更优选至少96％，更优选至少98％，更优选至少99％的相似性/同源性。
另外地或可备选地，突变型光诱导离子通道与SEQ ID NO：2(VChR1)的全长具有至少52％，优选至少54％，更优选至少56％，更优选至少58％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的同一性。
进一步考虑了光诱导离子通道的交换突变体，其中螺旋6已被SEQ ID NO：4的螺旋-6基序(例如，Chrimson(SEQ ID NO：6)或Chrimson CS(SEQ ID NO：7)，其中螺旋6分别被包含F214Y置换的VChR1的螺旋6替换)替换。
这种交换突变体与SEQ ID NO：2(VChR1)的全长通常具有至少61％的同源性/相似性，与SEQ ID NO：2(VChR1)的全长具有优选至少62％，更优选至少64％，甚至更优选至少66％的同源性/相似性。
另外，或者备选地，这种交换突变体通常与SEQ ID NO：2(VChR1)的全长具有至少45％，优选至少46％，更优选至少48％，更优选至少50％的同一性。
还公开了突变型光诱导离子通道，其中所述突变型光诱导离子通道包含与SEQ IDNO：3(ReaChR)的全长序列具有至少66％相似性/同源性的氨基酸序列，其中所述突变型光诱导离子通道与其亲本光诱导离子通道的不同之处仅在于对应于SEQ ID NO：3中F259的位置处的置换，
当在钳位电位-60mV，浴溶液为140mM NaCl、2mM CaCl2、2MgCl2、10mM HEPES、pH7.4，和移液管溶液为110mM NaCl、2mM MgCl2、10mM EGTA、10mM HEPES，pH7.4下以及如以上另外所述以全细胞模式通过膜片钳测量比较时，与所述亲本通道相比所述置换增加所述突变型通道的关闭动力学。优选地，置换是F259Y。
优选地，所述突变型光诱导离子通道与SEQ ID NO：3(ReaChR)的全长具有至少70％，优选至少72％，更优选至少74％，更优选至少76％，更优选至少78％，更优选至少80％，更优选至少82％，更优选至少84％，更优选至少86％，更优选至少88％，更优选至少90％，更优选至少92％，更优选至少94％，更优选至少96％，更优选至少98％，更优选至少99％的相似性/同源性。
另外地或可备选地，突变型光诱导离子通道与SEQ ID NO：3(ReaChR)的全长具有至少52％，优选至少54％，更优选至少56％，更优选至少58％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的同一性。
进一步考虑了光诱导离子通道的交换突变体，其中螺旋6已被SEQ ID NO：4的螺旋-6基序(例如，Chrimson(SEQ ID NO：6)或Chrimson CS(SEQ ID NO：7)，其中螺旋6分别被包含F259Y置换的ReaChR的螺旋6替换)替换。
这种交换突变体与SEQ ID NO：3(ReaChR)的全长通常具有至少59％的同源性/相似性，与SEQ ID NO：3(ReaChR)的全长具有优选至少60％，更优选至少62％，甚至更优选至少64％的同源性/相似性。
另外，或者备选地，这种交换突变体通常与SEQ ID NO：3(ReaChR)的全长具有至少46％，优选至少48％，更优选至少50％，更优选至少52％，更优选至少54％，更优选至少56％，更优选至少58％，更优选至少60％的同一性。
通常，当氨基酸序列与另一氨基酸序列(例如上述SEQ ID NO：1)之间的序列同一性在所述另一氨基酸序列(例如上述SEQ ID NO：1)的全长上至少为x％时，所述氨基酸序列与所述另一氨基酸序列(例如上述SEQ ID NO：1)具有“至少x％同一性”。类似地，当氨基酸序列与另一氨基酸序列(例如上述SEQ ID NO：1)之间的序列同源性/相似性在所述另一氨基酸序列(例如上述SEQ ID NO：1)的全长上至少为x％时，所述氨基酸序列与所述另一氨基酸序列(例如上述SEQ ID NO：1)具有“至少x％相似性/同源性”。
这种比对可以使用例如公众可获得的计算机同源程序(例如在EMBL主页http：//www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/上提供的“EMBOSS”程序，使用其中提供的默认设置)进行。计算氨基酸酸序列组的序列同一性或序列相似性/同源性百分比的其他方法是本领域已知的。
本公开的光诱导离子通道是具有至少5个跨膜螺旋的膜蛋白，其能够结合光敏多烯。具有6或7个跨膜螺旋的跨膜蛋白是优选的。然而，还包括具有超过7个螺旋的跨膜蛋白，例如8，9或10个跨膜螺旋。此外，本发明涵盖跨膜蛋白，其除了跨膜部分外还包括C末端和/或N末端序列，其中C末端序列可以延伸到由膜包围的腔内部(例如细胞的细胞质)或脂质体内部，或也可以排列在膜外表面上。这同样适用于任选存在的N末端序列，其同样可以布置在腔内并且也可以布置在膜的外表面上。C末端和/或N末端序列的长度原则上不受限制；然而，优选具有未包埋在膜中的C末端序列(具有1-1000个氨基酸，优选1-500个氨基酸，特别优选5-50个氨基酸)的光诱导离子通道。独立于C末端序列的长度，未包埋在膜中的N末端定位序列优选包含1-500个氨基酸，特别优选5-50个氨基酸。跨膜螺旋的概念是本领域技术人员公知的。这些通常是α-螺旋蛋白质结构，其通常包含20至25个氨基酸。然而，取决于膜的性质，其可以是天然膜，例如细胞膜或质膜，或者也可以是合成膜，跨膜片段也可以更短或更长。例如，人造膜中的跨膜区段可包含多达30个氨基酸，但另一方面也可仅包含少量氨基酸，例如12至16个氨基酸。
此外，与SEQ ID NO：1相比，光诱导离子通道包含进一步的(半)保守置换。保守置换是在与其侧链和化学性质相关的氨基酸家族中发生的置换。这类家族的实例是具有碱性侧链，具有酸性侧链，具有非极性脂肪族侧链，具有非极性芳族侧链，具有不带电荷的极性侧链，具有小侧链，具有大侧链等的氨基酸。典型的半保守和保守置换是：
此外，技术人员将理解，在空间要求的位置的甘氨酸不应被置换，并且不应将脯氨酸引入具有α螺旋或β折叠结构的蛋白质部分。
优选地，突变型通道包含SEQ ID NO：4的基序：
Cys-Arg-Xaa3-Xaa4-Val-Xaa6-Xaa7-Met-Ala-Trp-Xaa11-Tyr-Phe-Val-Xaa15-Trp-Gly-Met-Phe-Pro-Xaa21-Leu-Phe-Xaa24-Leu，
其中Xaa3是Gln或Glu，优选其中Xaa3是Gln；
其中Xaa4是Val或Leu，优选其中Xaa4是Val；
其中Xaa6是Thr或Arg，优选其中Xaa6是Thr；
其中Xaa7是Gly，Val或Ala，优选其中Xaa7是Gly；
其中Xaa11是Leu或Thr，优选其中Xaa11是Leu；
其中Xaa15是Ser或Ala，优选其中Xaa15是Ser；
其中Xaa21是Ile或Val，优选其中Xaa21是Ile；和
其中Xaa24是Ile或Leu，优选其中Xaa24是Ile。
进一步优选的是，光诱导离子通道包含共有基序L(I，A，C)DxxxKxxW(F，Y)(SEQ IDNO：5)。括号中给出的氨基酸可以在每种情况下替代前面的氨基酸。该共有序列是围绕视黄醛结合氨基酸赖氨酸的基序。
通常，光诱导离子通道功能所必需的视黄醛或视黄醛衍生物由待用所述离子通道转染的细胞产生。根据其构象，视黄醛可以是全反式视黄醛，11-顺式-视黄醛，13-顺式-视黄醛或9-顺式-视黄醛。然而，还预期本发明的突变型光诱导离子通道可以掺入囊泡，脂质体或其他人造细胞膜中。因此，还公开了一种通道视紫红质，其包含本公开的光诱导离子通道和视黄醛或视黄醛衍生物。优选地，视黄醛衍生物选自3，4-脱氢视黄醛，13-乙基视黄醛，9-dm-视黄醛，3-羟基视黄醛，4-羟基视黄醛，萘基视黄醛；3，7，11-三甲基-十二-2，4，6，8，10-五烯醛；3，7-二甲基-癸-2，4，6，8-四烯醛；3，7-二甲基-辛-2，4，6-三烯醛；和6-7个旋转受阻的视黄醛，8-9个旋转受阻的视黄醛和10-11个旋转受阻的视黄醛。
如上所述，突变型光诱导离子通道可另外包含其他置换。在一个优选的实施方案中，突变型光诱导离子通道可以在对应于SEQ ID NO：1的位置132的位置处另外包含Cys，Ser，Glu，Asp或Thr，优选Cys。已显示所述残基增加光诱导离子通道的钙渗透率。
前述置换是特别令人感兴趣的，因为本公开在对应于SEQ ID NO：1中的位置219，SEQ ID NO：2中的位置214或SEQ ID NO：3中的位置259的位置处的置换与亲本相比在此显示进一步增加突变型光诱导离子通道的钙渗透率。
例如，这可以通过评估钙离子相对于钠离子渗透率(PCa/PCa)的渗透率(通过测量光电流-电压关系和确定反转电位)来测量。相对钙渗透率优选在HEK293细胞或NG108-15细胞中确定。细胞内溶液含有110mM NaCl，10mM EGTA，2mM MgCl2和10mM Tris(pH＝7.4)，细胞外溶液含有140mM NaCl，2mM MgCl2和10mM Tris(pH＝9)。为了确定PCa/PNa值，用90mMCaCl2交换外部140mM NaCl。渗透率比率根据Goldman-Hodgkin-Katz方程计算。15
或者，如通过HEK293细胞的Fura-2成像所确定的，当与亲本通道相比时，本发明的突变型光诱导离子通道的钙电导率增加。为了确定钙电导率，将diflunisalFura-2AM(5mM；Invitrogen)在室温下加载30分钟至1小时。装载后，将细胞在不含Ca2+的140mM NaCl溶液(140mM NaCl，7mM EGTA，2mM MgCl2和10mM HEPES)中回收。使用460/40nm过滤器(VisitronSystems，Puchheim，Germany)通过500ms暴露于光来激发黄色荧光蛋白，以从其YFP荧光估计每个细胞的表达水平。然后用细胞外Ca2+溶液(其由90mM CaCl2，7mM EGTA，2mM MgCl2和10mM HEPES组成)代替所述溶液。在黑暗中15分钟后，用蓝光(460/40nm)刺激光门控通道10秒。用340nm(340/20)和380nm(380/20)激发Fura-2，用CCD照相机(所有过滤器来自VisitronSystems，Puchheim，Germany)检测发射光(540/80nm)。
此外，突变型光诱导离子通道可另外包含下列氨基酸残基中的至少一种：在对应于SEQ ID NO：1的位置253的位置处的天冬氨酸；在对应于SEQ ID NO：1的位置257的位置处的赖氨酸；在对应于SEQ ID NO：1的位置260的位置处的色氨酸；在对应于SEQ ID NO：1的位置123的位置处的谷氨酸；在对应于SEQ ID NO：1的位置134的位置处的组氨酸或精氨酸，优选精氨酸；在对应于SEQ ID NO：1的位置128的位置处的苏氨酸，丝氨酸或丙氨酸；和/或在对应于SEQ ID NO：1的位置156的位置处的丙氨酸。因此，突变型光诱导离子通道可在指定的位置(所述位置对应于SEQ ID NO：1)处另外包含下列氨基酸残基组合之一：
Cys 132+Asp 253；Cys 132+Lys 257；Cys 132+Trp 260；Cys 132+Glu 123；Cys132+His 134；Cys 132+Arg 134；Cys 132+Thr 128；Cys 132+Ser 128；Cys 132+Ala 128；Cys 132+Ala 156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257；Cys 132+Asp 253+Trp 260；Cys 132+Asp 253+Glu123；Cys 132+Asp 253+His 134；Cys 132+Asp 253+Arg 134；Cys132+Asp 253+Thr 128；Cys 132+Asp 253+Ser 128；Cys 132+Asp 253+Ala 128；Cys 132+Asp 253+Ala 156；
Cys 132+Lys 257+Trp 260；Cys 132+Lys 257+Glu 123；Cys 132+Lys 257+His134；Cys 132+Lys 257+Arg 134；Cys 132+Lys 257+Thr 128；Cys 132+Lys 257+Ser 128；Cys 132+Lys 257+Ala 128；Cys 132+Lys 257+Ala 156；
Cys 132+Trp 260+Glu 123；Cys 132+Trp 260+His 134；Cys 132+Trp 260+Arg134；Cys 132+Trp 260+Thr 128；Cys 132+Trp 260+Ser 128；Cys 132+Trp 260+Ala128；Cys 132+Trp 260+Ala 156；
Cys 132+Glu 123+His 134；Cys 132+Glu 123+His 134；Cys 132+Glu 123+Arg134；Cys 132+Glu 123+Thr 128；Cys 132+Glu 123+Ser 128；Cys 132+Glu 123+Ala 128；Cys 132+Glu 123+Ala 156；
Cys 132+His 134+Thr 128；Cys 132+His 134+Ser 128；Cys 132+His 134+Ala128；Cys 132+His 134+Ala 156；
Cys 132+Arg 134+Thr 128；Cys 132+Arg 134+Ser 128；Cys 132+Arg 134+Ala128；Cys 132+Arg 134+Ala 156；
Cys 132+Thr 128+Ala 156；Cys 132+Ser 128+Ala 156；Cys 132+Ala 128+Ala156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Glu 123；Cys132+Asp 253+Lys 257+His 134；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Arg 134；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Thr 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Ser 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Ala128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Ala 156；Cys 132+Lys 157+Trp 260+Glu 123；Cys 132+Lys 157+Trp 260+His 134；Cys 132+Lys 157+Trp 260+Arg 134；Cys 132+Lys 157+Trp260+Thr 128；Cys 132+Lys 157+Trp 260+Ser 128；Cys 132+Lys 157+Trp 260+Ala 128；Cys 132+Lys 157+Trp 260+Ala 156；
Cys 132+Trp 260+Glu 123+His 134；Cys 132+Trp 260+Glu 123+Arg 134；Cys132+Trp 260+Glu 123+Thr 128；Cys 132+Trp 260+Glu 123+Ser 128；Cys 132+Trp 260+Glu 123+Ala 128；Cys 132+Trp 260+Glu 123+Ala 156；Cys 132+Glu 123+His 134+Thr128；Cys 132+Glu 123+His 134+Ser 128；Cys 132+Glu 123+His 134+Ala 128；Cys 132+Glu 123+His 134+Ala 156；Cys 132+Glu 123+Arg 134+Thr 128；Cys 132+Glu 123+Arg134+Ser 128；Cys 132+Glu 123+Arg 134+Ala 128；Cys 132+Glu 123+Arg 134+Ala 156；
Cys 132+His 134+Ｔhr 128+Ala 156；Cys 132+His 134+Ser 128+Ala 156；Cys132+His 134+Ala 128+Ala 156；
Cys 132+Arg 134+Thr 128+Ala 156；Cys 132+Arg 134+Ser 128+Ala 156；Cys132+Arg 134+Ala 128+Ala 156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp260+His 134；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Arg 134；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Thr 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Ser 128；Cys 132+Asp 253+Lys257+Trp 260+Ala 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Ala 156；
Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu123+Arg134；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Thr 128；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Ser 128；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Ala 128；Cys 132+Lys 257+Trp260+Glu 123+Ala 156；
Cys 132+Trp 260+Glu 123+His 134+Thr 128；Cys 132+Trp 260+Glu 123+His134+Ser 128；Cys 132+Trp 260+Glu 123+His 134+Ala 128；Cys 132+Trp 260+Glu 123+His 134+Ala 156；
Cys 132+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Thr 128；Cys 132+Trp 260+Glu 123+Arg134+Ser 128；Cys 132+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ala 128；Cys 132+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ala 156；
Cys 132+Glu 123+Arg 134+Thr 128+Ala 156；Cys 132+Glu 123+Arg 134+Ser128+Ala 156；Cys 132+Glu 123+Arg 134+Ala 128+Ala 156；
Cys 132+Glu 123+His 134+Thr 128+Ala 156；Cys 132+Glu 123+His 134+Ser128+Ala 156；Cys 132+Glu 123+His 134+Ala 128+Ala 156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134；Cys 132+Asp 253+Lys257+Trp 260+Glu 123+Arg 134；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Thr 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Ser 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp260+Glu 123+Ala 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Ala 156；
Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Thr 128；Cys 132+Lys 257+Trp260+Glu 123+His 134+Ser 128；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Ala 128；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Ala 156；
Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Thr 128；Cys 132+Lys 257+Trp260+Glu 123+Arg 134+Ser 128；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ala 128；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ala 156；
Cys 132+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Thr 128+Ala 156；Cys 132+Trp 260+Glu123+Arg 134+Ser 128+Ala 156；Cys 132+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ala 128+Ala 156；
Cys 132+Trp 260+Glu 123+His 134+Thr 128+Ala 156；Cys 132+Trp 260+Glu123+His 134+Ser 128+Ala 156；Cys 132+Trp 260+Glu 123+His 134+Ala 128+Ala 156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Thr 128；Cys 132+Asp253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Ser 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Ala 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Ala156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Thr 128；Cys 132+Asp253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ser 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ala 128；Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ala156；
Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Thr 128+Ala 156；Cys 132+Lys257+Trp 260+Glu 123+His 134+Ser 128+Ala 156；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Ala 128+Ala 156；
Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Thr 128+Ala 156；Cys 132+Lys257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ser 128+Ala 156；Cys 132+Lys 257+Trp 260+Glu123+Arg 134+Ala 128+Ala 156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Thr 128+Ala 156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His134+Ser 128+Ala 156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+His 134+Ala 128+Ala 156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Thr 128+Ala 156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ser 128+Ala 156；
Cys 132+Asp 253+Lys 257+Trp 260+Glu 123+Arg 134+Ala 128+Ala 156。
然而，在上面的列表中，Cys 132也可以被Ser 132，Glu 132，Asp 132或Thr 132置换。
在优选的实施方案中，所述突变型光诱导离子通道包含SEQ ID NO：1(ChR-2)的氨基酸序列，优选由其组成，以下除外：在位置F219处的所述置换，和任选地在SEQ ID NO：1的位置132处的氨基酸。
同样，在另一个优选的实施方案中，所述突变型光诱导离子通道包含SEQ ID NO：2(VChR1)的氨基酸序列，优选由其组成，以下除外：在位置F214处的所述置换，和任选地在对应于SEQ ID NO：1中的L132的SEQ ID NO：2中的位置处的氨基酸。
在又另一个优选的实施方案中，所述突变型光诱导离子通道包含SEQ ID NO：3(ReaChR)的氨基酸序列，优选由其组成，以下除外：在位置F259的所述置换，和任选地在对应于SEQ ID NO：1中的L132的SEQ ID NO：3中的位置处的氨基酸。
本公开还描述了核酸构建体，其包含编码本文以上公开的突变型光诱导离子通道的核苷酸序列。
为了确保最佳表达，还可以例如通过添加合适的调节序列和/或靶向序列和/或通过将编码DNA序列与所选宿主的优选密码子使用相匹配来适当地修饰编码DNA。靶向序列可编码C末端延伸，其将光诱导离子通道至细胞内的特定位点或区室，例如靶向突触或突触后位点，靶向轴突-小丘或内质网。核酸可以与其他元件组合，例如启动子和转录起始和终止信号以及翻译起始和终止信号和多腺苷酸化信号，以提供本公开的突变型光诱导离子通道序列的表达。启动子可以是诱导型或组成型，一般或细胞特异性启动子。细胞特异性启动子的实例是对双极细胞特异的mGlu6启动子。启动子，载体和其他元件的选择是本领域普通技术水平的常规设计的问题。许多这样的元件在文献中描述并且可通过商业供应商获得。
还公开了表达载体，其包含编码本文公开的突变型光诱导离子通道或核酸构建体的核苷酸序列。在优选的实施方案中，载体适用于基因治疗，特别是其中载体适合于病毒介导的基因转移。术语“适合于病毒介导的基因转移”在本文中是指所述载体可以包装在病毒中并因此被递送至目标位点或细胞。适用于基因治疗的病毒的实例是逆转录病毒，腺病毒，腺相关病毒，慢病毒，痘病毒，甲病毒，狂犬病病毒，semliki森林病毒和疱疹病毒。这些病毒的不同之处在于它们将基因转移到它们识别并能够感染的细胞的程度，以及它们是永久性地还是暂时地改变细胞的DNA。然而，基因疗法还包括非病毒方法，例如裸DNA，脂质复合物和polyplexes，以及树枝状大分子的应用。
如上所述，可以例如使用病毒作为载体或通过转染(包括例如通过化学转染子(如Lipofectamine，Fugene等)，电穿孔，磷酸钙共沉淀和DNA的直接扩散)将得到的核酸序列引入细胞。用于转染细胞的方法在实施例中详述，并且可以适应各自的受体细胞。如果转染的DNA整合到基因组中，则用DNA转染产生稳定的细胞或细胞系，或在其中转染的DNA以染色体外形式存在的情况下，产生不稳定的(瞬时)细胞或细胞系。此外，通过使用附加型复制质粒可以获得稳定的细胞系，这意味着染色体外质粒的遗传受到整合到细胞基因组中的控制元件的控制。通常，合适的载体或质粒的选择取决于预期的宿主细胞。
因此，本公开还涉及包含本文公开的核酸构建体或表达载体的细胞。
将突变型光诱导离子通道掺入到自然不表达相应通道的细胞膜中可以例如简单地实现：使用已知的重组DNA技术方法，首先将编码该离子通道的DNA整合到合适的表达载体(例如，质粒，粘粒或病毒)中，然后用此转化靶细胞，并在该宿主中表达蛋白质。接下来，以合适的方式(例如用视黄醛)处理细胞，以使在蛋白质和视黄醛之间形成Schiffs碱键接。
本公开的光诱导离子通道的表达可以有利地在某些哺乳动物细胞系统中实现。因此，在优选的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。使用游离载体优选在神经母细胞瘤细胞(例如，NG108-15-细胞)，黑素瘤细胞(例如，BLM细胞系)，COS细胞(由“非洲绿猴肾CV1”细胞的感染产生)或HEK细胞(“人胚胎肾细胞”，例如HEK293细胞)，或BHK细胞(“幼仓鼠肾细胞”)中作为瞬时表达来实现表达，或在CHO细胞(“中国仓鼠卵巢细胞”)，骨髓瘤细胞或MDCK细胞(“Madine-Darby犬肾细胞”)或杆状病毒感染的额Sf9昆虫细胞中以稳定表达(通过整合到基因组中)的形式来实现表达。因此，在更优选的实施方案中，哺乳动物细胞是COS细胞；BHK细胞；HEK293细胞；CHO细胞；骨髓瘤细胞；或MDCK细胞。
在优选的实施方案中，哺乳动物细胞是可电兴奋的细胞。进一步优选细胞是海马细胞，感光细胞，视网膜视杆细胞，视网膜视锥细胞，视网膜神经节细胞，双极神经元，神经节细胞，假单极神经元，多极神经元，锥体神经元，浦肯野细胞或颗粒细胞。
神经元是可电兴奋的细胞，其通过电和化学信号传导处理和传递信息，其中化学信号传导通过与其他细胞的专门连接的突触发生。存在许多特殊类型的神经元，例如响应触摸，声音，光和影响感觉器官细胞的许多其他刺激的感觉神经元，运动神经元(接收来自脑和脊髓的信号并引起肌肉收缩和影响腺体)，以及中间神经元(将神经元连接到脑或脊髓的同一区域内的其他神经元)。通常，神经元具有本体，树突和轴突。树突是从细胞体产生的细丝，通常延伸数百微米并且多次分枝。轴突是一种特殊的细胞细丝，它从细胞体的称为轴突小丘的部位处产生。神经元的细胞体经常产生多个树突，但从不会超过一个轴突，尽管轴突可能在其终止前分支数百次。在大多数突触中，信号从一个神经元的轴突发送到另一个神经元的树突。但是，这些规则有许多例外：缺乏树突的神经元，没有轴突的神经元，将轴突连接到另一个轴突或将树突连接到另一个树突的突触等。大多数神经元可进一步在解剖学上表征为单极或假单极(树突和轴突从同一突起中出现)，双极(在本体两端的轴突和单个树突)，多极(具有两个以上的树突并且可以进一步分类为(i)具有长突出轴突突起的高尔基体I神经元，例如锥体细胞，浦肯野细胞和前角细胞，和(ii)高尔基体II神经元，其轴突突起局部突出到例如颗粒细胞。
感光细胞是在视网膜中发现的能够光转导的特化神经元。两个经典的光感受器是视杆和视锥细胞，每个都提供视觉系统使用的信息。视网膜神经节细胞是一种位于眼睛视网膜内表面附近的神经元。这些细胞具有突出到保护区(protectum)(中脑)，下丘脑中的视交叉上核和外侧膝状体(丘脑)的树突和长轴突。一小部分对视力贡献很少或根本没有，但它们本身是光敏的。它们的轴突形成视网膜下丘脑束并有助于昼夜节律和瞳孔光反射，瞳孔的大小调整。他们通过两种中间神经元类型从光感受器接收视觉信息：双极细胞和无长突细胞。无长突细胞是视网膜中的中间神经元，负责视网膜神经节细胞输入的70％。双极细胞负责另外30％的视网膜神经节输入，受到无长突细胞的调节。作为视网膜的一部分，双极细胞存在于光感受器(视杆细胞和视锥细胞)和神经节细胞之间。它们直接或间接地将信号从光感受器传递到神经节细胞。
可以在合适的温度和气体混合物(通常，37℃，5％CO2)下(任选地在本领域技术人员已知的细胞培养箱中并且如针对某些细胞系或细胞类型所例示的)分离(和遗传修饰)，维持和培养细胞。每种细胞类型的培养条件可能不同，并且特定细胞类型的条件变化可导致不同的表型。除温度和气体混合物外，细胞培养系统中最常见的变化因素是生长培养基。生长培养基的配方可以在pH，葡萄糖浓度，生长因子和其他营养成分的存在等方面变化。生长培养基可商购获得，或可根据组合物制备，所述组合物可从美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection，ATCC)获得。用于补充培养基的生长因子通常来自动物血液，例如小牛血清。另外，可以将抗生素添加到生长培养基中。对培养细胞进行的常见操作包括培养基更换和传代细胞。
本公开进一步涉及突变型光诱导离子通道或根据本公开的细胞在高通量筛选中的用途。高通量筛选(HTS)是一种用于科学实验的方法，尤其用于药物发现并且与生物学和化学领域相关。HTS允许研究人员通过现代机器人，数据处理和控制软件，液体处理设备和敏感检测器的组合，在短时间内有效地进行数百万次生化，遗传或药理学测试。通过该过程，可以快速鉴定调节特定生物分子途径的活性剂；特别是修饰离子通道的物质，例如根据本发明的光诱导离子通道，Ca2+-诱导钾通道或BK通道。例如，人们可能在宿主细胞中共同表达Ca2+诱导钾通道和的光诱导离子通道。在光刺激下，光诱导通道将打开，细胞内Ca2+浓度将增加，从而激活钾通道。因此，人们将获得膜电位的变化，其可通过潜在敏感染料例如RH421(N-(4-磺基丁基)-4-(4-(4-(二苯基氨基)苯基)丁二烯基)吡啶鎓，内盐)监测。因此，这种HTS可以包括以下步骤：(i)使表达Ca2+诱导(钾)通道与根据本发明的光诱导离子通道的细胞与针对Ca2+诱导通道的候选试剂接触，(ii)施加光刺激以诱导光诱导通道，(iii)确定膜电位的改变(混合信号)，和(iv)将步骤(iii)中确定的信号与在仅表达根据本发明的光诱导离子通道的经受步骤(ii)的细胞中确定的信号(单信号)进行比较。膜电位变化的减少将表明Ca2+诱导(钾)通道的有希望的调节剂。这种方法应该产生大约5：1的信噪比，与仅在表达Ca2+诱导通道的细胞上进行的直接测量相比，这种方法得到了很大改善。由于改善的信噪比，所述方法(特别是通过使用光诱导离子通道)可特别适用于HTS。
实质上，HTS使用一种方法在相对较短的时间内收集有关大量物质对特定靶标的影响的大量实验数据。在这种情况下，筛选是大型的实验(具有单个目标(通常测试科学假设))，随后可以向其应用所有这些数据。对于根据本发明的HTS细胞，可以是组织板(例如多孔板，例如96孔板)中的种细胞。然后将板中的细胞与测试物质接触足够的时间以与靶向的离子通道相互作用。测试物质可能在整个板上从孔到孔不同。在孵育时间过去之后，通过手动或通过机器对所有板孔进行测量，并任选地与未与测试物质接触的细胞的测量值进行比较。当研究人员使用膜片钳时，可能需要手动测量，寻找尚未在自动化程序中实现的效果。在其他方面，专门的自动分析机器可以对孔进行许多实验(例如分析特定频率的光或高通量膜片钳测量)。在这种情况下，机器输出每个实验的例如作为数值网格的结果，其中每个数字映射到从单个孔获得的值。根据第一次测定的结果，研究人员可以通过以下在同一筛选内进行后续测定：使用与鉴定为活性物质(即修饰细胞内环核苷酸水平)相似的物质进入新的测定板，然后重新运行实验收集进一步的数据，优化化学试剂的结构，以改善试剂对细胞的作用。自动化是HTS有用性的重要要素。从创建到最终分析，专门的机器人通常负责单个分析板在整个生命周期内的大部分过程。HTS机器人通常可以同时准备和分析多个版，进一步加快数据收集过程。适用于根据本发明的HTS的装置的实例包括荧光成像板读数器(Fluorometric Imaging Plate Reader，FLIPRTM；Molecular Devices)，FLEXstationTM(Molecular Devices)，电压离子探针读数器(Voltage Ion Probe Reader，VIPR，AuroraBiosciences)， Ratio (ATTO)。
因此，本发明公开的突变型光诱导离子通道特别可用作研究工具，例如用于可电兴奋细胞，特别是神经细胞的光刺激的非治疗用途。关于海马神经元培养和来自海马神经元的电生理学记录以及HEK293细胞的电生理记录的进一步指导可以在WO2012/032103中找到。
最后，存在许多疾病，其中例如天然视觉细胞不再起作用，但是所有神经连接都能够继续运行。今天，各种研究中心正在尝试在视网膜上植入具有人造陶瓷感光器的薄膜。这些感光器旨在使视网膜的次级的仍然完整的细胞去极化，从而触发神经冲动(仿生眼)。在这些神经节细胞，无长突细胞或双极细胞中有意表达根据本发明的突变型光控离子通道将是非常讲究的解决方案并且能够实现更大的三维视觉分辨率。因此，本公开还预期根据本公开的光诱导离子通道用于医药。如以下实施例中所示，原理验证已经在本领域中得到证明，并且可以容易地适应于本发明公开的光诱导离子通道。鉴于这些数据，预期本发明公开的光诱导离子通道可用于恢复聋人受试者的听觉活动，或盲人受试者的视力恢复。
也如本公开的细胞所述，进一步描述了表达根据本发明的功能性光诱导离子通道的非人动物，例如，在可电兴奋细胞例如神经元中，特别是在螺旋神经节神经元中表达。同样，还考虑了包含根据本发明的细胞的非人动物。
非人动物可以是除人之外的任何动物。在优选的实施方案中，非人动物是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选啮齿动物，例如小鼠或大鼠，或灵长类动物。
特别地，一些模式生物是优选的，例如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)，Arbacia punctulata，Ciona intestinalis，果蝇(Drosophila)，通常是黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)，夏威夷短尾鱿鱼(Euprymna scolopes)，水螅(Hydra)，大西洋枪乌贼(Loligo pealei)，Pristionchus pacificus，紫海胆(Strongylocentrotuspurpuratus)，Symsagittifera roscoffensis和赤拟谷盗(Tribolium castaneum)。在脊椎动物中，这些是若干种啮齿类动物，例如豚鼠(Cavia porcellus)，仓鼠，小鼠(小家鼠(Musmusculus))和大鼠(褐家鼠(Rattus norvegicus))，以及其他物种例如鸡(家鸡(Gallusgallus domesticus))，猫(Felis cattus)，狗(家犬(Canis lupus familiaris))，七鳃鳗(Lamprey)，日本米鱼(青鳉(Oryzias latipes))，恒河猴(Rhesus macaque)，刚毛棉花鼠(Sigmodon hispidus)，斑胸草雀(Taeniopygia guttata)，河豚(Takifugu rubripres)，非洲爪蛙(Xenopus laevis)和斑马鱼(Danio rerio)。还优选的是非人类灵长类动物，即灵长目的所有非人动物物种，例如恒河猴，黑猩猩，狒狒，狨猴和绿猴。然而，这些实施例不旨在限制本发明的范围。
然而，值得注意的是，以下动物被排除在外，这些动物不太可能对人或动物产生实质性的医疗利益，因此根据相应的专利法或管辖权不具有可专利性。此外，技术人员将采取适当的措施，例如在国际动物福利准则中规定的，以确保对人或动物的实质性医疗利益将超过任何动物的痛苦。在下文中，通过附图和实施例说明本发明，这些附图和实施例不意图限制本发明的范围。
附图说明
图1：ChR2，VChR1和ReaChR的螺旋6区域的比对。还显示了在ChR2的全长上ChR2(SEQ ID NO：1)，VChR1(SEQ ID NO：2)和ReaChR(SEQ ID NO：3)的百分比同一性和百分比相似性/同源性。
图2：通道视紫红质变体的关闭动力学。示出了在停止照明后即刻的A)ChR2-YFP(右图)和ChR2-YFP F219Y(左图)，B)VChR1-YFP(右图)和VChRl-YFP F214Y(左图)，C)ReaChR-Citrine(右图)和ReaChR-Citrine F259Y(左图)的典型的光电流。0.5S光脉冲具有23mW/mm2的饱和光强度和波长A)λ＝473nm B)λ＝532nm C)λ＝532nm。以全细胞模式通过膜片钳测量在-60mV的钳夹电位研究了异源表达相应的通道视紫红质变体的NG108-15细胞。浴溶液含有140mM NaCl，2mM CaCl2，2mM MgCl2，10mM HEPES，pH 7.4，移液管溶液含有110mMNaCl，2mM MgCl2，10mM EGTA，10mM HEPES，pH 7.4。将电流标准化以进行比较。
序列描述
SEQ ID NO：1(通道视紫红质2；ChR2；315aa；螺旋6以粗体突出显示)
SEQ ID NO：2(VChR1；登录号EU622855；300aa；螺旋6以粗体突出显示)
SEQ ID NO：3(ReaChR；登录号KF448069；352aa；螺旋6以粗体突出显示)
SEQ ID NO：4(螺旋6共有基序)
Cys-Arg-Xaa3-Xaa4-Val-Xaa6-Xaa7-Met-Ala-Trp-Xaa11-Tyr-Phe-Val-Xaa15-Trp-Gly-Met-Phe-Pro-Xaa21-Leu-Phe-Xaa24-Leu，
其中Xaa3是Gln或Glu，优选其中Xaa3是Gln；
其中Xaa4是Val或Leu，优选其中Xaa4是Val；
其中Xaa6是Thr或Arg，优选其中Xaa6是Thr；
其中Xaa7是Gly，Val或Ala，优选其中Xaa7是Gly；
其中Xaa11是Leu或Thr，优选其中Xaa11是Leu；
其中Xaa15是Ser或Ala，优选其中Xaai5是Ser；
其中Xaa21是Ile或Val，优选其中Xaa21是Ile；和
其中Xaa24是Ile或Leu，优选其中Xaa24是Ile。
SEQ ID NO：5(视黄醛结合位点共有基序)
Xaa1-Asp-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Lys-Xaa7-Xaa8-Xaa9
其中Xaa1是Leu，Ile，Ala或Cys；
其中Xaa3，Xaa4，Xaa5，Xaa7和Xaa8独立地是任何氨基酸；
其中Xaa9是Thr，Phe或Tyr。
SEQ ID NO：6(Chrimson；登录号KF992060；螺旋6以粗体突出显示)
SEQ ID NO：7(CsChrimson；登录号KJ995863；螺旋6以粗体突出显示)
SEQ ID NO：8(包括F219Y的Chrimson螺旋6交换突变体)
SEQ ID NO：9(CsChrimson；包括F219Y的螺旋6交换突变体)
实施例
实施例1-鉴定加速关闭动力学的突变
发明人的目的是鉴定ChR-2内的残基，其突变进一步加速了关闭动力学。发明人关注于第六跨膜结构域。
以全细胞模式通过膜片钳测量在-60mV的钳夹电位研究了异源表达相ChR2-YFP，ChR2-YFP F219Y，ReaChR-Citrine，ReaChR-Citrine F259Y，VChR1-YFP和VChR1-YFP F214Y的NG108-15细胞。浴溶液含有140mM NaCl，2mM CaCl2，2mM MgCl2，10mM HEPES，pH7.4，移液管溶液含有110mM NaCl，2mM MgCl2，10mM EGTA，10mM HEPES，pH 7.4。响应于500ms光脉冲(强度23mW/mm2，波长594nm)测量光电流。τ关闭值是由照明停止后的电流与单指数函数的拟合确定的。
为了评估钙离子相对于钠离子渗透率(PCa/PNa)的渗透率，我们测量了光电流-电压关系并确定了反转电位。细胞内溶液含有110mM NaCl，10mM EGTA，2mM MgCl2和10mMTris(pH＝7.4)，细胞外溶液含有140mM NaCl，2mM MgCl2和10mM Tris(pH＝9)。为了确定PCa/PNa值，用90mM CaCl2交换外部140mM NaCl。渗透率比率根据Goldman-Hodgkin-Katz方程计算(Jan，L.Y.和Jan，Y.N.J.Physiol.262，215-236(1976))。
结果显示在图2中，并总结在下表1中。
表1：通道视紫红质变体的关闭动力学(τ关闭)和相对钙渗透率(PCa/PNa)。显示的是平均τ关闭值(n＝3-9)，平均相对钙渗透率(n＝3-5)和相应的标准偏差。a在HEK293细胞中测定相对钙渗透率。b在NG108-15细胞中测定了相对钙的渗透率。
实施例2-听觉途径的光遗传学刺激
Hernandez等.J Clin Invest.2014；124(3)：1114-29展示了啮齿动物中听觉通路的光遗传学刺激策略。特别是，作者描述了动物模型来表征光遗传学刺激，这是对基因工程改造的神经元的光学刺激，以表达光门控离子通道通道视紫红质-2(ChR2)。螺旋神经节神经元(SGN)的光遗传学刺激激活听觉通路，如通过记录单个神经元和神经元群体响应所证明的。此外，SGN的光遗传学刺激恢复了聋小鼠的听觉活动。通过记录下丘响应超阈值光学，声学和电刺激的局部场电位(LFP)对耳蜗激发的空间扩散的近似法表明光遗传学刺激比单极电刺激实现更好的频率分辨率。
例如由Hernandez等描述将本文鉴定的突变引入构建体中代表常规实践。或者，可以通过本公开的光诱导离子通道的编码序列简单地替换结构中的ChR2的编码序列。
实施例3-用于恢复视力的光遗传学方法
Macé等.Mol Ther.2015；23(1)：7-16是由发明人中一些撰写的早期出版物，其描述了由腺相关病毒(AAV)基因疗法介导的视网膜神经元的光遗传学再激活。大多数遗传性视网膜营养不良显示出进行性感光细胞变性，导致严重的视力损害。腺相关病毒(AAV)基因疗法介导的视网膜神经元的光遗传学再激活具有恢复视力的潜力，无论患者特异性突变如何。临床可译性的挑战是尽可能恢复视力接近自然视力，同时针对脆弱的变性视网膜使用手术安全的递送途径。为了保持内部视网膜的视觉处理，靶向ON双极细胞，其于疾病的晚期阶段仍然存在。对于安全的基因递送，使用最近工程化的AAV变体，其可以在注射到眼睛的容易接近的玻璃体液中之后转导双极细胞。结果表明，在ON双极细胞特异性启动子下的编码通道视紫红质的AAV介导玻璃体内施用后限于ON-双极细胞的长期基因递送。ON双极细胞中的通道视紫红质表达导致视网膜和皮质水平的ON和OFF响应的恢复。此外，在治疗的盲小鼠中光诱导的运动行为恢复。
例如由Macé等描述将本文鉴定的突变引入构建体中代表常规实践。或者，可以通过本公开的光诱导离子通道的编码序列简单地替换结构中的通道视紫红质的编码序列。本发明的新的光诱导离子通道插入用于激活ON双极细胞的盒以及用于视网膜中的神经节细胞的盒中。
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Claims (15)

1.突变型光诱导离子通道，其中所述突变型光诱导离子通道包含与SEQ ID NO：1(ChR-2)的全长序列具有至少84％相似性和/或至少75％同一性的氨基酸序列，和其中所述突变型光诱导离子通道与其亲本光诱导离子通道的不同之处仅在于对应于SEQ ID NO：1中F219的位置处的置换，
当在钳位电位-60mV，浴溶液为140mM NaCl、2mM CaCl2、2MgCl2、10mM HEPES、pH 7.4，和移液管溶液为110mM NaCl、2mM MgCl2、10mM EGTA、10mM HEPES，pH7.4下以全细胞模式通过膜片钳测量比较时，与所述亲本通道相比所述置换加速所述突变型通道的关闭动力学。
2.权利要求1所述的突变型光诱导离子通道，其中所述突变型光诱导离子通道与SEQID NO：1(ChR-2)的全长具有至少86％，优选至少88％，更优选至少90％，更优选至少92％，更优选至少94％，更优选至少96％，更优选至少98％，更优选至少99％的相似性；和/或
其中突变型光诱导离子通道与SEQ ID NO：1(ChR-2)的全长具有至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的同一性。
3.前述权利要求中任一项所述的突变型光诱导离子通道，其中所述置换是F219Y。
4.权利要求3所述的突变型光诱导离子通道，其中所述突变型通道包含SEQ ID NO：4的基序：
Cys-Arg-Xaa3-Xaa4-Val-Xaa6-Xaa7-Met-Ala-Trp-Xaa11-Tyr-Phe-Val-Xaa15-Trp-Gly-Met-Phe-Pro-Xaa21-Leu-Phe-Xaa24-Leu，
其中Xaa3是Gln或Glu，优选其中Xaa3是Gln；
其中Xaa4是Val或Leu，优选其中Xaa4是Val；
其中Xaa6是Thr或Arg，优选其中Xaa6是Thr；
其中Xaa7是Gly，Val或Ala，优选其中Xaa7是Gly；
其中Xaa11是Leu或Thr，优选其中Xaa11是Leu；
其中Xaa15是Ser或Ala，优选其中Xaa15是Ser；
其中Xaa21是Ile或Val，优选其中Xaa21是Ile；和
其中Xaa24是Ile或Leu，优选其中Xaa24是Ile。
5.前述权利要求中任一项所述的突变型光诱导离子通道，所述突变型通道在对应于SEQ ID NO：1中的L132的位置处进一步包含Cys，Ser，Glu，Asp或Thr；特别地，其中所述突变型通道在对应于SEQ ID NO：1中的L132的位置处包含Cys。
6.前述权利要求中任一项所述的突变型光诱导离子通道，其中，
所述突变型光诱导离子通道包含SEQ ID NO：1(ChR-2)的氨基酸序列，优选由其组成，以下除外：在位置F219处的所述置换，和任选地在SEQ ID NO：1的位置132处的氨基酸；或者
其中所述突变型光诱导离子通道包含SEQ ID NO：2(VChR1)的氨基酸序列，优选由其组成，以下除外：在位置F214处的所述置换，和任选地在对应于SEQ ID NO：1中的L132的SEQID NO：2中的位置处的氨基酸；或者
其中所述突变型光诱导离子通道包含SEQ ID NO：3(ReaChR)的氨基酸序列，优选由其组成，以下除外：在位置F259的所述置换，和任选地在对应于SEQ ID NO：1中的L132的SEQID NO：3中的位置处的氨基酸。
7.前述权利要求中任一项所述的突变型光诱导离子通道，其中所述光诱导离子通道另外包含以下氨基酸残基中的至少一种：在对应于SEQ ID NO：1的位置253的位置处的天冬氨酸；在对应于SEQ ID NO：1的位置257的位置处的赖氨酸；在对应于SEQ ID NO：1的位置260的位置处的色氨酸；在对应于SEQ ID NO：1的位置123的位置处的谷氨酸；在对应于SEQ IDNO：1的位置134的位置处的组氨酸或精氨酸，优选精氨酸；在对应于SEQ ID NO：1的位置128的位置处的苏氨酸，丝氨酸或丙氨酸；和/或在对应于SEQ ID NO：1的位置156的位置处的丙氨酸。
8.核酸构建体，其包含编码权利要求1-7中任一项的突变型光诱导离子通道的核苷酸序列。
9.表达载体，其包含编码权利要求1-7中任一项的光诱导离子通道的核苷酸序列或权利要求8的核酸构建体。
10.细胞，其包含权利要求8的核酸构建体或权利要求9的表达载体。
11.权利要求10所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞，优选其中所述细胞是
(a)海马细胞，感光细胞，视网膜视杆细胞，视网膜视锥细胞，视网膜神经节细胞，双极神经元，神经节细胞，假单极神经元，多极神经元，锥体神经元，浦肯野细胞或颗粒细胞；或者
(b)神经母细胞瘤细胞，特别是NG108-15；HEK293细胞；COS细胞；BHK细胞；CHO细胞；骨髓瘤细胞；或MDCK细胞。
12.权利要求1-7所述的光诱导离子通道或权利要求10或11所述的细胞在高通量筛选中的用途。
13.权利要求1-7所述的光诱导离子通道用于神经元细胞的光刺激的非治疗性用途。
14.权利要求1-7所述的光诱导离子通道，其用于医药中。
15.非人动物，其包含权利要求1-7的光诱导离子通道，权利要求8的核酸构建体，权利要求9的表达载体，或权利要求10或11的细胞。
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