JP2019522469A - チャネルロドプシンの変異型光誘導性イオンチャネル - Google Patents

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Abstract

本発明は、本明細書に記載されるような、親チャネルと比べて改善された特性を有する変異型光誘導性イオンチャネル、それをコードする核酸構築物、該核酸構築物を有する発現ベクター、前記核酸構築物または発現ベクターを含む細胞、及びそれらの各々の使用、並びに、変異型光誘導性イオンチャネル、核酸構築物、又は発現ベクターを含む非ヒト動物に関する。

Description

本発明は、特許請求の範囲にて規定されるような、改善された特性を有する変異光誘導性イオンチャネル、それをコードする核酸構築物、該核酸構築物を有する発現ベクター、前記核酸構築物または発現ベクターを含む細胞、及びそれらの各々の使用に関する。
ライトゲート型の内向き整流陽イオンチャネルであるチャネルロドプシン1（ChR1）とチャネルロドプシン2（ChR2）は、インビトロとインビボの両方で神経細胞の標的化光活性化に好ましいツールとなっている1-5。野生型（WT）ChR2は光誘導性脱分極に使用することができるが、将来的に可能性のある臨床応用のために、より迅速なキネティクスおよびより高い光感受性を有するChR2変異体の探索が進行中である（WO03/084994および6-8）。
2002年および2003年に初記載されて以来、赤色光吸収チャネルロドプシンを含むChR2の様々な変異体のセットが記載されている。様々な目的のために、ChRは、キネティクス、イオン選択性ならびに光吸収に関し改変されている。例としては、Chrimson由来の赤色光吸収チャネルロドプシン（WO2013/071231および9）、Volvox チャネルロドプシン（VChR1）10及びキメラReaChR（ChR2CV1, CV2, Red absorbing ChannelRhodopsin; US 8,759,492 B2,及び11）が挙げられる。また、当該分野では、チャネルロドプシン 2 のCa2+透過性変異体 L132C（CatCh; WO 2012/032103及び12）も記載される。これまでの研究により、それぞれヘリックス3及び4の位置C128及びD156における変異が、最長30分の開放寿命時間という著しく遅いチャネルキネティクスをもたらし、さらに500倍またはそれ以上の高い光感受性をもたらしたことが実証されている6,7。これらのC128及びD156変異体は、赤色光によって可変開放時間をオフに切り替えることができる。優れた光感受性にもかかわらず、それらの遅い閉鎖キネティクスは依然としてそれらの適用を制限する要因である。
光感受性はチャネルの開放時間によって調節されるため、ChR2のキネティクスが大きな問題となる。これは、単一チャネルコンダクタンス、開放確率、量子効率などの他のチャネルパラメータが不変であるためである。換言すれば、開放時間が長いチャネルでは低い光強度で最大の活性に達し、一方、寿命が短いチャネルでは、光飽和に関する飽和に達するためにより多くの光を必要とする。「高速」チャネルは活性化のためにより多くの光を必要とするが、様々な神経細胞の発火率の頻度が高いために、神経生物学における多くの用途には高速であることが不可欠である。これは例えば、最大1000 Hzの発火率に達する脳内の介在ニューロンの聴覚系における神経節細胞においていえる。
したがって、より迅速な応答キネティクスを示す変異型光誘導性イオンチャネルが依然として必要とされている。
本発明者らは7回膜貫通ヘリックスモチーフのヘリックス6における位置F219の改変によって様々なチャネルロドプシンについて系統的な研究を行った16。野生型ChR2のヘリックス6における位置F219の変異がチャネルの閉鎖時間（オフキネティクス，off-kinetics）を加速することを実証できた。また、Ca2+透過性変異体 L132C（CatCh）は、ヘリックス6の改変により加速され、そしてCa2+透過性の増加が観察された。この新たに発見された効果は、ChR2、Volvox チャネルロドプシン（VChR1; 受託番号EU622855）、及びキメラReaChR（ChR2CV1, CV2, 赤色吸収チャネルロドプシン; 受託番号KF448069）においても実証できた。重要なのは、考慮する位置が、様々なチャネルロドプシンのヘリックス6において同一であることに注意すべきことである。ヘリックス6の改変の概要を図1に示す。
本開示は、様々なチャネルロドプシンの特性を組み合わせることにより速度についてチャネルロドプシンを改変する一般的な方法を記載する。これらの新しい変異体を用いると、800〜1000Hzの限界まで神経細胞の光刺激がもたらされる。
また、この改変により、細胞膜および細胞内Caを貯蔵する膜、筋小胞体、小胞体、またはミトコンドリアにおいてサイトゾル内Ca2+濃度に影響を与えるための有用なツールとして用いることが想定されるCa2+透過性の増加がもたらされる。
マウスの脳から得たNG108-15細胞（神経芽腫細胞）、HEK293細胞、および海馬細胞において、速度が増加しCa2+透過性も増強したことを実験的に検証する試験をした。
細胞の内膜表面電位はCa2+の影響を強く受けることが知られているので、膜下細胞内Ca2+レベルを改変すると、膜の脱分極および神経細胞における電位ゲートによるNa+チャネルの活性化がもたらされる。比較的高い光ゲートによるCa2+流入は、内膜表面電位を上昇させ、そしてCa2+活性化大コンダクタンスカリウム（BK）チャネルを活性化する。[Ca2+]iの増加は、内部表面電位を上昇させ、電位ゲートによるNa+チャネルの活性化および間接的に光感受性の増加を促進する。Ca2+依存性BKチャネルの活性化により、光刺激後の再分極は著しく加速される。
従って、配列番号1（ChR-2）の全長配列に対し、少なくとも66%の類似性（similarlity）/相同性（homology）を有するアミノ酸配列を含む変異型光誘導性イオンチャネルであって、
該変異型光誘導性イオンチャネルは、親光誘導性イオンチャネルと、配列番号1のF219に相当する位置における置換のみ異なっており、
前記置換は、-60 mVのクランプ電位、140 mM NaCl、2mM CaCl2、2MgCl2、10 mM HEPES、pH 7.4のバス溶液、及び110 mM NaCl、2 mM MgCl2、10 mM EGTA、10 mM HEPES、pH 7.4のピペット溶液で、全細胞構成における（in the whole cell configuration）パッチクランプ測定により比較したとき、前記親チャネルと比べて、前記変異型チャネルのオフキネティクスを促進する、変異型光誘導性イオンチャネルを開示する。
更に、配列番号2（VChR1）の全長配列に対し少なくとも66%の類似性/相同性を有するアミノ酸配列を含む変異型光誘導性イオンチャネルであって、
該変異型光誘導性イオンチャネルは、親光誘導性イオンチャネルと、配列番号2の位置F214に相当する位置における置換のみ異なっており、
前記置換は、-60 mVのクランプ電位、140 mM NaCl、2mM CaCl2、2MgCl2、10 mM HEPES、pH 7.4のバス溶液、及び110 mM NaCl、2 mM MgCl2、10 mM EGTA、10 mM HEPES、pH 7.4のピペット溶液で、全細胞構成におけるパッチクランプ測定により比較したとき、前記親チャネルと比べて、前記変異型チャネルのオフキネティクスを促進する、変異型光誘導性イオンチャネルを開示する。
更に、配列番号3（ReaChR）の全長配列に対し少なくとも66%の類似性/相同性を有するアミノ酸配列を含む変異型光誘導性イオンチャネルであって、
該変異型光誘導性イオンチャネルは、親光誘導性イオンチャネルと、配列番号1の位置F259に相当する位置における置換のみ異なっており、
前記置換は、-60 mVのクランプ電位、140 mM NaCl、2mM CaCl2、2MgCl2、10 mM HEPES、pH 7.4のバス溶液、及び110 mM NaCl、2 mM MgCl2、10 mM EGTA、10 mM HEPES、pH 7.4のピペット溶液で、全細胞構成におけるパッチクランプ測定により比較したとき、前記親チャネルと比べて、前記変異型チャネルのオフキネティクスを促進する、変異型光誘導性イオンチャネルを開示する。
更に、本明細書に開示の光誘導性イオンチャネルをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を提供する。
また、本明細書に開示の光誘導性イオンチャネルをコードするヌクレオチド配列又は核酸構築物を含む発現ベクターを提供する。
加えて、本明細書に開示の核酸構築物又は発現ベクターを含む細胞を提供する。
更に別の態様では、本発明は、ハイスループットスクリーニングにおける、及び／又は神経細胞を光刺激するための、本明細書に開示の光誘導性イオンチャネルの使用を提供する。
図1は、ChR2、VChR1、及びReaChRのヘリックス6領域のアライメントを示す。また、ChR2の全長にわたるChR2（配列番号1）、VChR1（配列番号2）、及びReaChR（配列番号3）のパーセンテージ同一性およびパーセンテージ類似性/相同性も示す。
図２は、チャネルロドプシン変異体のオフキネティクスを示す。照明停止直後のA）ChR2-YFP（グラフ右）及びChR2-YFP F219Y（グラフ左）、B）VChR1-YFP（グラフ右）及びVChR1-YFP F214Y（グラフ左）、C）ReaChR-Citrine（グラフ右）及びReaChR-Citrine F259Y（グラフ左）の典型的な光電流を示す。0.5 sの光パルスは、23 mW/mm2の飽和光強度及びA）λ = 473 nm、B）λ = 532 nm、C）λ = 532 nmの波長を有していた。対応するチャネルロドプシン変異体を異種発現しているNG108-15細胞を、-60 mVのクランプ電位で全細胞構成におけるパッチクランプ測定により調べた。バス溶液は、140 mM NaCl、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2、10 mM HEPES、pH 7.4を含有し、ピペット溶液は、110 mM NaCl、2 mM MgCl2、10 mM EGTA、10 mM HEPES、pH 7.4を含有していた。電流は比較のために正規化した。
本開示は、変異型光誘導性イオンチャネルに関し、該変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号1（ChR-2）の全長配列に対し少なくとも84%の類似性/相同性及び／又は75%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該変異型光誘導性イオンチャネルは、親光誘導性イオンチャネルと、配列番号1のF219に相当する位置における置換のみ異なっており、
前記置換は、特許請求の範囲にて規定されるような、-60 mVのクランプ電位、140 mM NaCl、2mM CaCl2、2MgCl2、10 mM HEPES、pH 7.4のバス溶液、及び110 mM NaCl、2 mM MgCl2、10 mM EGTA、10 mM HEPES、pH 7.4のピペット溶液で、全細胞構成におけるパッチクランプ測定により比較したとき、前記親チャネルと比べて、前記変異型チャネルのオフキネティクスを促進する。
好ましくは、変異型チャネルのオフキネティクスは、それぞれ変異体又は親チャネルを異種発現するNG108-15細胞において測定される。タンパク質発現の成功は、例えば、EGFPまたはYFPによる蛍光によって証明できる。一般に、光電流は、23mW/mm 2の強度および594nmの波長を有する500msの光パルスに応答させて測定される。τoff値は、照明の停止後の電流を単一指数関数にフィットすることによって決定される。
好ましい実施形態では、置換は、F219Yである。
好ましくは、前記変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号1（ChR-2）の全長に対し、少なくとも86%、好ましくは少なくとも88%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも92%、より好ましくは少なくとも94%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%の類似性/相同性を有する。
追加的に又は代替的に、前記変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号1（ChR-2）の全長に対し、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%の同一性を有する。
配列番号1の全長に対し少なくとも66%の類似性/相同性又は少なくとも52%の同一性を有する光誘導性イオンチャネルの例として、キメラReaChR（受託番号KF448069、配列番号3）、Volvox チャネルロドプシン VChR1（受託番号EU622855、配列番号2）、およびそれらの任意の他のオルソログ又はアリル変異体が挙げられる。
ヘリックス6が配列番号4のヘリックス6モチーフによって置換された、例えば、ヘリックス6がF219Yの置換を含むChR-2のヘリックス6によって置換されたChrimson（配列番号6）又はChrimson CS（配列番号7）の光誘導性イオンチャネルのスワップ変異体（それぞれ、配列番号8及9）も企図される。
このようなスワップ変異体は、典型的には、配列番号1（ChR-2）の全長に対し、少なくとも56%の相同性/類似性を有する、好ましくは、配列番号1（ChR-2）の全長に対し、少なくとも58%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも62%、そして更に好ましくは少なくとも64%の相同性/類似性を有する。
追加的に又は代替的に、このようなスワップ変異体は、典型的には、配列番号1（ChR-2）の全長に対し、少なくとも42%、好ましくは少なくとも44%、より好ましくは少なくとも46%、より好ましくは少なくとも48%、より好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも52%、より好ましくは少なくとも54%、より好ましくは少なくとも56%の同一性を有する。
従って、本開示は、配列番号2（VChR1）の全長配列に対し少なくとも66%の類似性/相同性を有するアミノ酸配列を含む変異型光誘導性イオンチャネルであって、
該変異型光誘導性イオンチャネルは、親光誘導性イオンチャネルと、配列番号2の位置F214に相当する位置における置換のみ異なっており、
前記置換は、-60 mVのクランプ電位、140 mM NaCl、2mM CaCl2、2MgCl2、10 mM HEPES、pH 7.4のバス溶液、及び110 mM NaCl、2 mM MgCl2、10 mM EGTA、10 mM HEPES、pH 7.4のピペット溶液で、全細胞構成におけるパッチクランプ測定により比較したとき、前記親チャネルと比べて、前記変異型チャネルのオフキネティクスを促進する、変異型光誘導性イオンチャネルも記載する。好ましくは、前記置換は、F214Yである。
好ましくは、前記変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号2の全長（VChR1）に対し少なくとも70%、好ましくは少なくとも72%、より好ましくは少なくとも74%、より好ましくは少なくとも76%、より好ましくは少なくとも78%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも82%、より好ましくは少なくとも84%、より好ましくは少なくとも86%、より好ましくは少なくとも88%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも92%、より好ましくは少なくとも94%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%の類似性/相同性を有する。
追加的に又は代替的に、前記変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号2の全長（VChR1） に対し少なくとも52%、好ましくは少なくとも54%、より好ましくは少なくとも56%、より好ましくは少なくとも58%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%の同一性を有する。
更に、ヘリックス6が配列番号4のヘリックス6モチーフによって置換された、例えば、ヘリックス6がF214Yの置換を含むVChR1のヘリックス6によってそれぞれ置換されたChrimson（配列番号6）又はChrimson CS（配列番号7）の光誘導性イオンチャネルのスワップ変異体も企図される。
このようなスワップ変異体は、典型的には、配列番号2（VChR1）の全長に対し、少なくとも61%の相同性/類似性を有する、好ましくは、配列番号2（VChR1）の全長に対し、少なくとも62%、より好ましくは少なくとも64%、そして更に好ましくは少なくとも66%の相同性/類似性を有する。
追加的に又は代替的に、このようなスワップ変異体は、典型的には、配列番号2（VChR1）の全長に対し、少なくとも45%、好ましくは少なくとも46%、より好ましくは少なくとも48%、より好ましくは少なくとも50%の同一性を有する。
また、配列番号3（ReaChR）の全長配列に対し少なくとも66%の類似性/相同性を有するアミノ酸配列を含む変異型光誘導性イオンチャネルであって、
該変異型光誘導性イオンチャネルは、親光誘導性イオンチャネルと、配列番号3の位置F259に相当する位置における置換のみ異なっており、
前記置換は、-60 mVのクランプ電位、140 mM NaCl、2mM CaCl2、2MgCl2、10 mM HEPES、pH 7.4のバス溶液、及び110 mM NaCl、2 mM MgCl2、10 mM EGTA、10 mM HEPES、pH 7.4のピペット溶液で、全細胞構成におけるパッチクランプ測定により比較したとき、前記親チャネルと比べて、前記変異型チャネルのオフキネティクスを促進する、変異型光誘導性イオンチャネルも開示する。好ましくは、前記置換は、F259Yである。
好ましくは、前記変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号3の全長（ReaChR）に対し少なくとも70%、好ましくは少なくとも72%、より好ましくは少なくとも74%、より好ましくは少なくとも76%、より好ましくは少なくとも78%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも82%、より好ましくは少なくとも84%、より好ましくは少なくとも86%、より好ましくは少なくとも88%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも92%、より好ましくは少なくとも94%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%の類似性/相同性を有する。
追加的に又は代替的に、前記変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号3の全長（ReaChR）に対し少なくとも52%、好ましくは少なくとも54%、より好ましくは少なくとも56%、より好ましくは少なくとも58%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%の同一性を有する。
更に、ヘリックス6が配列番号4のヘリックス6モチーフによって置換された、例えば、ヘリックス6がF259Yの置換を含むReaChRのヘリックス6によってそれぞれ置換されたChrimson（配列番号6）又はChrimson CS（配列番号7）の光誘導性イオンチャネルのスワップ変異体も企図される。
このようなスワップ変異体は、典型的には、配列番号3（ReaChR）の全長に対し、少なくとも59%の相同性/類似性を有する、好ましくは、配列番号3（ReaChR）の全長に対し、少なくとも60%、より好ましくは少なくとも62%、そして更に好ましくは少なくとも64%の相同性/類似性を有する。
追加的に又は代替的に、このようなスワップ変異体は、典型的には、配列番号3（ReaChR）の全長に対し、少少なくとも46%、好ましくは少なくとも48%、より好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも52%、より好ましくは少なくとも54%、より好ましくは少なくとも56%、より好ましくは少なくとも58%、より好ましくは少なくとも60%の同一性を有する。
一般に、あるアミノ酸配列が、他のアミノ酸配列、例えば上述の配列番号1と、「少なくともx%の同一性」を有するとは、アラインされた配列に対するこれらの間の配列同一性が、前記他のアミノ酸配列、例えば配列番号1の全長にわたって少なくともx%であるときに言う。同様に、あるアミノ酸配列が、他のアミノ酸配列、例えば上述の配列番号1と、「少なくともx%の類似性/相同性」を有するとは、アラインされた配列に対するこれらの間の配列相同性/配列類似性が、前記他のアミノ酸配列、例えば配列番号1の全長にわたって少なくともx%であるときに言う。
このようなアラインメントは、例えば、公的に利用可能なコンピューター相同性プログラム、例えば、EMBLホームページ（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/）で提供されている「EMBOSS」プログラムをそのデフォルトの設定を使用して実施できる。一連のアミノ酸配列の配列同一性または配列類似性/相同性パーセンテージを計算するさらなる方法は、当技術分野で公知である。
本開示の光誘導性イオンチャネルは、少なくとも5回の膜貫通ヘリックスを有する膜タンパク質であり、感光性ポリエンに結合することができる。6回又は7回の膜貫通ヘリックスを有する膜タンパク質が好ましい。しかし、7回以上の膜貫通ヘリックスを有する膜タンパク質、例えば、8、9又は10回膜貫通ヘリックスも包含される。さらに、本発明は、膜貫通部分に加えてC末端および/またはN末端配列を含む膜貫通タンパク質も包含し、ここで、C末端配列は膜によって囲まれた内腔の内部、例えば、細胞の細胞質またはリポソームの内部へと延伸でき、あるいは、膜の外面に配置されてもよい。場合により存在するN末端配列についても同様であり、同様に内腔内部や膜外面のいずれに配置できる。C末端および/またはN末端配列の長さは原則として限定されないが、1〜1000個のアミノ酸、好ましくは1〜500個、特に好ましくは5〜50個のアミノ酸を有し膜に埋め込まれていないC末端配列を有する光誘導性イオンチャネルが好ましい。C末端配列の長さとは独立して、膜に埋め込まれていないN末端に位置する配列は、好ましくは1〜500個のアミノ酸、特に好ましくは5〜50個のアミノ酸を含む。膜貫通ヘリックスの概念は、当業者に周知である。これらは、一般に、αヘリックスタンパク質構造であり、一般に20〜25個のアミノ酸を含む。しかし、膜貫通セグメントは、天然の膜、例えば細胞または原形質膜、または合成膜であってもよい膜の性質に依存して、より短くても長くてもよい。例えば、人工膜中の膜貫通セグメントは、最大30個のアミノ酸を含んでもよく、一方、例えば12〜16個といった少ない数のアミノ酸を含んでもよい。
加えて、光誘導性イオンチャネルは、配列番号1と比較して更なる（半）保存的置換を含む。保存的置換は、側鎖および化学的性質に関連するアミノ酸のファミリー内で起こる。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖を有するアミノ酸、酸性側鎖を有するアミノ酸、非極性脂肪族側鎖を有するアミノ酸、非極性芳香族側鎖を有するアミノ酸、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、小さい側鎖を有するアミノ酸、大きい側鎖を有するアミノ酸などである。典型的な半保存的および保存的置換は、以下のとおりである。
Figure 2019522469
さらに、当業者であれば、立体的な必要性がある位置でグリシンを置換すべきではなく、αヘリックスまたはβシート構造を有するタンパク質の部分にプロリンを導入してはならないことを理解するであろう。
好ましくは、変異型チャネルは、配列番号4:
Cys-Arg-Xaa3-Xaa4-Val-Xaa6-Xaa7-Met-Ala-Trp-Xaa11-Tyr-Phe-Val-Xaa15-Trp-Gly-Met-Phe-Pro-Xaa21-Leu-Phe-Xaa24-Leu
のモチーフ、
ここでXaa3はGln又はGluである、好ましくはここでXaa3はGlnである；
ここでXaa4はVal又はLeuである、好ましくはここでXaa4はValである；
ここでXaa6はThr又はArgである、好ましくはここでXaa6はThrである；
ここでXaa7はGly、Val又はAlaである、好ましくはここでXaa7はGlyである；
ここでXaa11はLeu又はThrである、好ましくはここでXaa11はLeuである；
ここでXaa15はSer又はAlaである、好ましくはここでXaa15はSerである；
ここでXaa21はIle又はValである、好ましくはここでXaa21はIleである；および
ここでXaa24はIle又はLeuである、好ましくはここでXaa24はIleである、
を含む。
光誘導性イオンチャネルがコンセンサスモチーフL（I,A,C）DxxxKxxW（F,Y）（配列番号5）を含むことがさらに好ましい。各場合において、括弧内のアミノ酸は前出のアミノ酸で置換することができる。このコンセンサス配列は、レチナール結合性アミノ酸リジンを取り巻くモチーフである。
一般に、光誘導性イオンチャネルの機能に必要なレチナールまたはレチナール誘導体は、前記イオンチャネルでトランスフェクションされる細胞によって産生される。そのコンフォメーションに応じて、レチナールは、オールトランスレチナール、11-cis-レチナール、13-cis-レチナール、又は9-cis-レチナールであってもよい。しかし、本発明の変異型光誘導性イオンチャネルは、小胞、リポソームまたは他の人工細胞膜に組み込むこともできると考えられる。従って、本開示の光誘導性イオンチャネル及びレチナールまたはレチナール誘導体を含むチャネルロドプシンも開示される。好ましくは、レチナール誘導体は、3,4-デヒドロレチナール、13-エチルレチナール、9-dm-レチナール、3-ヒドロキシレチナール、4-ヒドロキシレチナール、ナフチルレチナール；3,7,11-トリメチル-ドデカ-2,4,6,8,10-ペンタエナール；3,7-ジメチル-deca-2,4,6,8-テトラエナール；3,7-ジメチル-オクタ-2,4,6-トリエナール；及び6-7回転ブロック（rotation-blocked）レチナール、8-9回転ブロックレチナール、及び10-11回転ブロックレチナールからなる群から選択される。
上述のように、変異型光誘導性イオンチャネルは、追加的に更なる置換を含んでもよい。１実施形態では、変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号1の位置L132に相当する位置においてCys、Ser、Glu、Asp、又はThr、好ましくはCysを追加的に更に含んでもよい。これらの残基は、光誘導性イオンチャネルのカルシウム透過性を増加させることが示された。
上述の置換は特に興味深い、というのは、配列番号1の位置219に相当する位置、配列番号2の位置214に相当する位置、配列番号３の位置259に相当する位置における本開示の置換は、親と比べて、変異型光誘導性イオンチャネルのカルシウム透過性を更に増加することが本明細書において示されたからである。
例えば、カルシウム透過性の増加は、光電流-電圧関係を測定し反転電位を求めることにより、ナトリウムイオンの透過性に対するカルシウムイオンの相対透過性（PCa/PNa）を評価することによって測定できる。相対カルシウム透過性は、好ましくはHEK293細胞、又はNG108-15細胞において決定される。細胞内溶液は、110 mM NaCl、10 mM EGTA、2 mM MgCl2及び10 mM Tris（pH = 7.4）を含有し、細胞外溶液は、140 mM NaCl、2 mM MgCl2及び10 mM Tris（pH = 9）を含有する。PCa/PNa値の決定のために、外部の140 mM NaClを90 mM CaCl2と交換する。透過率はGoldman-Hodgkin-Katz の式15に従って計算する。
あるいは、本発明の変異型光誘導性イオンチャネルのカルシウム伝導率（calcium conductivity）は、HEK293細胞におけるFura-2イメージングによる決定にて、親チャネルと比較して増加する。カルシウム伝導率を決定するために、ジフルニサルFura-2 AM（5mM; Invitrogen）を室温で30分から1時間かけてロードする。ロード後、細胞をCa2+を含まない140 mM NaCl溶液（140 mM NaCl、7 mM EGTA、2 mM MgCl2及び10 mM HEPES）内に回収する。黄色蛍光タンパク質は、460/40 nmフィルター（Visitron Systems, Puchheim, Germany）を用いて500 msの露光で励起させ、そのYFP蛍光から各細胞の発現レベルを推定する。その後、溶液を90 mM CaCl2、7 mM EGTA、2 mM MgCl2及び10 mM HEPESから構成される細胞外Ca2+溶液に交換する。暗所で15分後、光ゲートチャネルを10秒間青色光（460/40 nm）で刺激する。Fura-2を340 nm（340/20）および380 nm（380/20）で励起させ、発光された光（540/80 nm）をCCDカメラ（すべてのフィルターはVisitron Systems, Puchheim, Germany製）で検出する。
加えて、変異型光誘導性イオンチャネルは、以下のアミノ酸残基の少なくとも１つ: 配列番号1の位置253に相当する位置におけるアスパラギン酸；配列番号1の位置257に相当する位置におけるリジン；配列番号1の位置260に相当する位置におけるトリプトファン；配列番号1の位置123に相当する位置におけるグルタミン酸；配列番号1の位置134に相当する位置におけるヒスチジン又はアルギニン、好ましくはアルギニン；配列番号1の位置128に相当する位置におけるスレオニン、セリン、又はアラニン；及び／又は配列番号1の位置156に相当する位置におけるアラニン；の少なくとも１つを追加的に含んでもよい。従って、変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号1の各位置に相当する以下に指定の位置におけるアミノ酸残基の以下の組み合わせを追加的に含んでもよい：
Cys 132 + Asp 253; Cys 132 + Lys 257; Cys 132 + Trp 260; Cys 132 + Glu 123; Cys 132 + His 134; Cys 132 + Arg 134; Cys 132 + Thr 128; Cys 132 + Ser 128; Cys 132 + Ala 128; Cys 132 + Ala 156;
Cys 132 + Asp 253 + Lys 257; Cys 132 + Asp 253 + Trp 260; Cys 132 + Asp 253 + Glu 123; Cys 132 + Asp 253 + His 134; Cys 132 + Asp 253 + Arg 134; Cys 132 + Asp 253 + Thr 128; Cys 132 + Asp 253 + Ser 128; Cys 132 + Asp 253 + Ala 128; Cys 132 + Asp 253 + Ala 156;
Cys 132 + Lys 257 + Trp 260; Cys 132 + Lys 257 + Glu 123; Cys 132 + Lys 257 + His 134; Cys 132 + Lys 257 + Arg 134; Cys 132 + Lys 257 + Thr 128; Cys 132 + Lys 257 + Ser 128; Cys 132 + Lys 257 + Ala 128; Cys 132 + Lys 257 + Ala 156;
Cys 132 + Trp 260 + Glu 123; Cys 132 + Trp 260 + His 134; Cys 132 + Trp 260 + Arg 134; Cys 132 + Trp 260 + Thr 128; Cys 132 + Trp 260 + Ser 128; Cys 132 + Trp 260 + Ala 128; Cys 132 + Trp 260 + Ala 156;
Cys 132 + Glu 123 + His 134; Cys 132 + Glu 123 + His 134; Cys 132 + Glu 123 + Arg 134; Cys 132 + Glu 123 + Thr 128; Cys 132 + Glu 123 + Ser 128; Cys 132 + Glu 123 + Ala 128; Cys 132 + Glu 123 + Ala 156;
Cys 132 + His 134 + Thr 128; Cys 132 + His 134 + Ser 128; Cys 132 + His 134 + Ala 128; Cys 132 + His 134 + Ala 156;
Cys 132 + Arg 134 + Thr 128; Cys 132 + Arg 134 + Ser 128; Cys 132 + Arg 134 + Ala 128; Cys 132 + Arg 134 + Ala 156;
Cys 132 + Thr 128 + Ala 156; Cys 132 + Ser 128 + Ala 156; Cys 132 + Ala 128 + Ala 156;
Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Glu 123; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + His 134; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Arg 134; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Thr 128; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Ser 128; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Ala 128; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Ala 156;
Cys 132 + Lys 157 + Trp 260 + Glu 123; Cys 132 + Lys 157 + Trp 260 + His 134; Cys 132 + Lys 157 + Trp 260 + Arg 134; Cys 132 + Lys 157 + Trp 260 + Thr 128; Cys 132 + Lys 157 + Trp 260 + Ser 128; Cys 132 + Lys 157 + Trp 260 + Ala 128; Cys 132 + Lys 157 + Trp 260 + Ala 156;
Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 + His 134; Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 +Arg 134; Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 + Thr 128; Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 + Ser 128; Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 + Ala 128; Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 + Ala 156;
Cys 132 + Glu 123 + His 134 + Thr 128; Cys 132 + Glu 123 + His 134 + Ser 128; Cys 132 + Glu 123 + His 134 + Ala 128; Cys 132 + Glu 123 + His 134 + Ala 156;
Cys 132 + Glu 123 + Arg 134 + Thr 128; Cys 132 + Glu 123 + Arg 134 + Ser 128; Cys 132 + Glu 123 + Arg 134 + Ala 128; Cys 132 + Glu 123 + Arg 134 + Ala 156;
Cys 132 + His 134 + Thr 128 + Ala 156; Cys 132 + His 134 + Ser 128 + Ala 156; Cys 132 + His 134 + Ala 128 + Ala 156;
Cys 132 + Arg 134 + Thr 128 + Ala 156; Cys 132 + Arg 134 + Ser 128 + Ala 156; Cys 132 + Arg 134 + Ala 128 + Ala 156;
Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + His 134; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Arg 134; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Thr 128; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Ser 128; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Ala 128; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Ala 156;
Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + His 134; Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134; Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Thr 128; Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Ser 128; Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Ala 128; Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Ala 156;
Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Thr 128; Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Ser 128; Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Ala 128; Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Ala 156;
Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Thr 128; Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Ser 128; Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Ala 128; Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Ala 156;
Cys 132 + Glu 123 + Arg 134 + Thr 128 + Ala 156; Cys 132 + Glu 123 + Arg 134 + Ser 128 + Ala 156; Cys 132 + Glu 123 + Arg 134 + Ala 128 + Ala 156;
Cys 132 + Glu 123 + His 134 + Thr 128 + Ala 156; Cys 132 + Glu 123 + His 134 + Ser 128 + Ala 156; Cys 132 + Glu 123 + His 134 + Ala 128 + Ala 156;
Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + His 134; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Thr 128; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Ser 128; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Ala 128; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Ala 156;
Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Thr 128; Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Ser 128; Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Ala 128; Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Ala 156;
Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Thr 128; Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Ser 128; Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Ala 128; Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Ala 156;
Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Thr 128 + Ala 156; Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Ser 128 + Ala 156; Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Ala 128 + Ala 156;
Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Thr 128 + Ala 156; Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Ser 128 + Ala 156; Cys 132 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Ala 128 + Ala 156;
Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Thr 128; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Ser 128; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Ala 128; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Ala 156;
Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Thr 128; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Ser 128; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Ala 128; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Ala 156;
Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Thr 128 + Ala 156; Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Ser 128 + Ala 156; Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Ala 128 + Ala 156;
Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Thr 128 + Ala 156; Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Ser 128 + Ala 156; Cys 132 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Ala 128 + Ala 156;
Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Thr 128 + Ala 156; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Ser 128 + Ala 156; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + His 134 + Ala 128 + Ala 156;
Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Thr 128 + Ala 156; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Ser 128 + Ala 156; Cys 132 + Asp 253 + Lys 257 + Trp 260 + Glu 123 + Arg 134 + Ala 128 + Ala 156。
しかしながら、上記リストにおいて、Cys 132は、Ser 132、Glu 132、Asp 132、又はThr 132のいずれかにより置換されてもよい。
好ましい実施形態では、変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号1（ChR-2）のアミノ酸配列を含む、好ましくは配列番号1（ChR-2）のアミノ酸配列からなる、但し、位置F219における前記置換及び場合により配列番号1の位置132におけるアミノ酸を除く。
同様に、別の好ましい実施形態では、変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号2（VChR1）のアミノ酸配列を含む、好ましくは配列番号2（VChR1）のアミノ酸配列からなる、但し、位置F214における前記置換及び場合により配列番号1のL132に相当する配列番号２の位置におけるアミノ酸を除く。
さらに別の好ましい実施形態では、変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号3（ReaChR）のアミノ酸配列を含む、好ましくは配列番号3（ReaChR）のアミノ酸配列からなる、但し、位置F259における前記置換及び場合により配列番号1のL132に相当する配列番号3の位置におけるアミノ酸を除く。
本開示は、上述の本明細書に開示の変異型光誘導性イオンチャネルをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物も開示する。
最適な発現を確実にするために、コードDNAは、例えば、適切な調節配列および/または標的配列を追加することによって、および/または選択された宿主の好ましいコドン使用にコードDNA配列を適合させることによって、適切に改変することもできる。標的配列は、細胞内の特定の部位または区画、例えばシナプスまたはシナプス後部位、軸索小丘、または小胞体に光誘導性イオンチャネルを標的とするC末端伸長をコードすることができる。本開示の変異型光誘導性イオンチャネルの配列を発現させるために、核酸を、例えば、プロモーターおよび転写開始および停止シグナル、並びに翻訳開始および停止シグナル、並びにポリアデニル化シグナルなどのさらなるエレメントと組み合わせてもよい。プロモーターは、誘導性または構成的、一般的または細胞特異的プロモーターであり得る。細胞特異的プロモーターの例は、双極細胞に特異的なmGlu6プロモーターである。プロモーター、ベクターおよび他のエレメントの選択は、当業者の通常の設計の範囲内である。多くのそのようなエレメントが文献に記載されており、市場の供給元から入手可能である。
また、本明細書に開示の光誘導性イオンチャネルをコードするヌクレオチド配列又は核酸構築物を含む発現ベクターを開示する。好ましい実施形態では、ベクターは遺伝子治療に適しており、特にウイルスによる遺伝子導入に適している。「ウイルスによる遺伝子導入に適している」という用語は、本明細書では、前記ベクターがウイルス内にパッキングできるので、目的の部位または細胞に送達されることを意味する。遺伝子治療に適しているウイルスの例は、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、狂犬病ウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびヘルペスウイルスである。これらのウイルスは、認識した感染可能細胞にどれほど良好に遺伝子を導入するか、並びに細胞のDNAを永久にまたは一時的に改変するのかが異なる。しかし、遺伝子治療は、裸のDNA、リポプレックスおよびポリプレックス、およびデンドリマーの適用といった非ウイルス的な方法も包含する。
上記のように、得られた核酸配列は、例えば、ウイルスを担体として使用するか、あるいは例えば化学的トランスフェクタント（例えば、Lipofectamine, Fugene等）を含むトランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈降や、DNAの直接拡散によって、細胞内に導入してもよい。細胞をトランスフェクトする方法は、実施例に詳述されているが、それぞれのレシピエント細胞に適合させてよい。DNAのトランスフェクションは、トランスフェクトされたDNAがゲノムに組み込まれている場合、安定した細胞または細胞株をもたらし、あるいは、トランスフェクトされたDNAが染色体外の形態で存在する場合、不安定な（一過性の）細胞または細胞系をもたらす。さらに、エピソーム複製プラスミドを使用することにより、安定な細胞株を得ることができ、これは、染色体外プラスミドの遺伝形質が、細胞ゲノムに組み込まれた制御エレメントによって制御されることを意味する。一般に、適切なベクターまたはプラスミドの選択は、対象の宿主細胞に依存する。
よって、本開示は、本明細書に開示の核酸構築物又は発現ベクターを含む細胞に関する。
天然の状態で対応するチャネルを発現しない細胞の膜への変異型光誘導性イオンチャネルの組み込みは、例えば、組換えDNA技術の既知の手順を使用して、このイオンチャネルをコードするDNAを最初に適切な発現ベクター、例えばプラスミド、コスミドまたはウイルスに組み込んで、その後これを用いて標的細胞を形質転換し、タンパク質を宿主内で発現させることによって可能である。次に、細胞は、タンパク質とレチナールとの間のシッフ塩基の連結を可能にするためにレチナールを用いるといった適切な様式で処理される。
本開示の光誘導性イオンチャネルの発現は、ある種の哺乳類細胞系において有利に行うことができる。したがって、好ましい実施形態では、細胞は哺乳類細胞である。発現は、一過性発現としてのエピソームベクター、好ましくは神経芽腫細胞（例えば、NG108-15細胞）、メラノーマ細胞（例えば、BLM細胞株）、COS細胞（「アフリカミドリザル腎臓CV1細胞」より産生される）、HEK細胞（「ヒト胚性腎臓細胞」、例えば、HEK293細胞）、又はBHK-細胞（「ベビーハムスター腎臓細胞」）を用いて、あるいは、CHO細胞（「チャイニーズハムスター卵巣細胞」）、骨髄腫細胞またはMDCK細胞（「Madby-Darbyイヌ腎臓細胞」）における安定発現の形態において（ゲノムへの組込みによる）、あるいはバキュロウイルスを感染させたSf9昆虫細胞内で可能である。従って、より好ましい実施形態では、哺乳類細胞は、COS細胞；BHK細胞；HEK293細胞；CHO細胞；骨髄腫細胞；又はMDCK細胞である。
好ましい実施形態では、哺乳類細胞は、電気的に興奮性の細胞である。より好ましくは、細胞は、海馬細胞、光受容体細胞；網膜桿状細胞；網膜錐状細胞；網膜神経節細胞；双極神経細胞；神経節細胞；偽単極性神経細胞；多極神経細胞；錐体神経細胞、プルキンエ細胞；又は顆粒細胞である。
神経細胞は、電気的および化学的シグナル伝達によって情報を処理および伝達する電気的に興奮性の細胞であり、ここで、化学的シグナル伝達は他の細胞との特殊な接合であるシナプスを介して起こる。接触、音、光および感覚器官の細胞に影響を及ぼすその他多くの刺激に応答する感覚神経細胞、脳および脊髄からシグナルを受けて筋肉収縮を引き起こしたり腺に影響する運動神経細胞、ならびに脳または脊髄の同じ領域内で神経細胞同士を接続する介在神経細胞などの数多くの特殊なタイプの神経細胞が存在する。一般に、神経細胞は体細胞、樹状突起、および軸索を有する。樹状突起は、細胞体から生じ、しばしば数百ミクロンに広がり、複数回分岐するフィラメントである。軸索は、軸索小丘と呼ばれる部位で細胞体から生じる特殊な細胞性フィラメントである。神経細胞の細胞体はしばしば複数の樹状突起を生じるが、1つより多い軸索にはつながらない。しかし、軸索は終結する前に何百回も分枝することがある。ほとんどのシナプスでは、シグナルは、ある神経細胞の軸索から別の神経細胞の樹状突起に送られる。しかし、これらのルールは多くの例外があり、樹状突起を欠く神経細胞、軸索を持たない神経細胞、軸索を別の軸索に連結するシナプス、または樹状突起を別の樹状突起に連結するシナプスなどがある。ほとんどの神経細胞は、単極性または偽単極性（同じプロセスから現れる樹状突起および軸索）、双極性（軸索および体細胞の反対側にある単一の樹状突起）、多極性（2つ以上の樹状突起を有し、さらに（i）長く突出した軸索を有するゴルジI型神経細胞、例えば錐体神経細胞、プルキンエ細胞、前角細胞など、および（ii）軸索が局部的であるゴルジII型神経細胞、例えば顆粒細胞として分類される）として、更に解剖学的に特徴づけることができる。
光受容体細胞は、網膜に見られる光伝達が可能な特殊な神経細胞である。2つの古典的な光受容体は、桿体と錐体であり、それぞれが視覚系によって使用される情報に寄与する。網膜神経節細胞は、眼の網膜の内面の近くに位置する一種の神経細胞である。これらの細胞は、樹状突起、並びに保護層（中脳）、視床下部の視交叉上核、および外側膝状突起（視床）に突出する長い軸索を有する。視覚への寄与はほとんど又は全くないが、そられ自体は感光性である。それらの軸索は網膜視床下部路を形成し、そして概日リズム及び瞳孔の光反射、瞳孔のサイズ変更に寄与する。それらは2つの中間神経細胞型：双極細胞及びアマクリン細胞を介して光受容体から視覚的情報を受け取る。アマクリン細胞は網膜にある介在神経細胞であり、網膜神経節細胞への入力の70%を担う。網膜神経節への入力の残りの30%を担う双極細胞は、アマクリン細胞によって調節されている。網膜の一部として、双極細胞は光受容体（桿状細胞及び錐状細胞）と神経節細胞の間に存在する。それらは、直接または間接的に、光受容体から神経節細胞に信号を伝達するように作用する。
細胞は単離され（そして遺伝的に改変され）、適切な温度及びガス混合物（典型的には37℃、5% CO2）、場合により、当業者に知られているような細胞インキュベーター内や実施例における特定の細胞株や細胞型について例示されているような細胞インキュベーター内、で維持及び培養されてもよい。培養条件は細胞型によって異なってよく、また特定の細胞型に対する条件が変わると表現型が異なる場合がある。温度およびガス混合物の他に、細胞培養システムにおいて最も一般的に変化する因子は、増殖培地である。増殖培地の製法は、pH、グルコース濃度、増殖因子、および他の栄養成分の存在などがとりわけ様々である。増殖培地は市販されているかあるいはAmerican Tissue Culture Collection（ATCC）から入手可能な組成に従って調製することができる。補助培地に使用される増殖因子は、子牛血清などの動物の血液に由来することが多い。さらに、抗生物質を増殖培地に添加してもよい。培養細胞に対して行われる一般的な操作には、培地の交換および細胞の継代がある。
本開示は、更に、ハイスループットスクリーニングにおける、本明細書に開示の光誘導性イオンチャネル又は細胞の使用に関する。ハイスループットスクリーニング（HTS）は、特に創薬に使用され、科学的実験のための生物学および化学の分野に関連する方法である。HTSは、多くの場合、現代のロボット工学、データ処理および制御ソフトウェア、液体取り扱い装置や、高感度の検出器と組み合わせて、研究者が数百万の生化学的、遺伝学的または薬理学的試験を短時間で効果的に行うことを可能にする。このプロセスにより、特に、本発明に係る光誘導性イオンチャネル、Ca+誘導性カリウムチャネル、またはBKチャネルなどのイオンチャネルを改変する物質といった特定の生体分子経路を調節する活性薬剤を迅速に同定することができる。例えば、ある薬剤は、Ca+誘導性カリウムチャネルおよび光誘導性イオンチャネルを宿主細胞中で同時発現させることができる可能性もある。光により刺激すると、光誘導性チャネルが開き、細胞内Ca+濃度が上昇し、それによってカリウムチャネルを活性化する。したがって、膜電位の変化を受けるものがあり、この変化はRH421（N-（4-スルホブチル）-4-（4-（4-（ジペンチルアミノ）フェニル）ブタジエニル）ピリジニウム、内部塩）によりモニターできる。このようなHTSは、以下の工程を含んでもよい：（i）Ca+誘導性（カリウム）チャネルおよび本発明に係る光誘導性イオンチャネルを発現する細胞を、Ca+誘導性チャネルに対する候補薬剤に接触させること、（ii）光刺激を与え光誘導性チャネルを誘導すること、（iii）膜電位（混合シグナル）の変化を決定すること、および（iv）工程（iii）で決定されたシグナルを工程（ii）に供された本発明に係る光誘導性イオンチャネルのみを発現する細胞において決定されたシグナル（単一シグナル）と比較すること。膜電位の変化の減少は、Ca+誘導性（カリウム）チャネルの有望なモジュレーターの指標となるであろう。そのようなアプローチは、約5：1のシグナル対ノイズ比を生じさせると考えられ、Ca+誘導性チャネルのみを発現する細胞に対して行われる直接的な測定と比較してかなり改善されている。シグナル対ノイズ比が改善されるので、前記方法は、特に、光誘導性イオンチャネルを使用することによって、HTSに特に適する可能性がある。
本質的に、HTSは、比較的短時間に特定の標的に対する数多くの物質の効果に関する大量の実験データを収集するアプローチを使用する。この文脈では、スクリーンはより大規模な実験であり、単一の目標（通常は科学的な仮説を検証する）を有し、このデータすべてを適用可能である。本発明に係るHTS細胞は、例えば96ウェルプレートといったマルチウェルプレート等の組織プレートに播種してもよい。次いで、プレート内の細胞を、標的イオンチャネルと相互作用するのに十分な時間、試験物質と接触させる。試験物質は、プレートにわたってウェル毎に異なってもよい。インキュベーション時間が経過した後、手動または機械のいずれかで、そして場合により試験物質と接触していない細胞の測定値との比較により、すべてのプレートのウェルにわたって測定を行う。研究者がパッチクランプを使用し、未だ自動化ルーティーンで実施されない効果を検査する際は、手動による測定が必要な場合がある。さもなければ、専門の自動化分析装置を用いて、ウェル上で多数の実験（例えば、特定の周波数の光を解析する、または高スループットのパッチクランプ測定など）を行うことができる。この場合、装置は、数値のグリッドとして、1つのウェルから得られた値にマッピングする各数値を用いて各実験の結果を出力する。この最初のアッセイの結果に応じて、活性である（すなわち、細胞内環状ヌクレオチドレベルを改変する）と同定されたものと同様の物質を新しいアッセイプレートに使用し、同じスクリーン内でフォローアップアッセイを実施し、実験を再び行いさらなるデータを収集し、細胞に対する化学薬剤の効果を改善するために該薬剤の構造を最適化することができる。自動化はHTSの有用性において重要な要素である。１つの専門のロボットが、１つのアッセイプレートの寿命にわたって、作成から最終分析までほとんどのプロセスを担当することが多い。HTSロボットは、通常、多数のプレートを同時に調製し分析できるので、データ収集プロセスをさらに高速化することができる。本発明に係るHTSに適した装置の例は、蛍光イメージングプレートリーダー（Fluorometric Imaging Plate Reader：FLIPRTM; Molecular Devices）、FLEXstation TM（Molecular Devices）、電圧イオンプローブリーダー（Voltage Ion Probe Reader：VIPR; Aurora Biosciences）、Attofluor（登録商標）Ratio Vision（登録商標）（ATTO）が挙げられる。
従って、現在開示されている変異型光誘導性イオンチャネルは、電気的に興奮性の細胞、特に神経細胞の光刺激のための非治療的使用などの研究ツールとして特に有用である。例えば、海馬ニューロンの培養および海馬ニューロンからの電気生理学的な記録ならびにHEK293細胞における電気生理学的な記録に関するさらなる指針は、WO2012/032103号に見ることができる。
最後に、例えば、天然の視覚細胞がもはや機能していないのに全ての神経の接続が動作し続けてしまう多くの疾患がある。今日、網膜に人工セラミック光細胞を有する薄膜を埋め込むために様々な研究センターで試みが行われている。これらの光細胞は、網膜のまだ損なわれていない二次的な細胞を脱分極させ、それによって神経インパルス（バイオニック・アイ）を引き起こすことを意図している。これらの神経節細胞、アマクリン細胞または双極細胞における本開示による変異型光制御イオンチャネルを意図的に発現させることは、非常に優れた解決策であり、より大きな三次元的な視覚分解能を可能にする。したがって、本開示はまた、医薬における使用のための本開示に係る光誘導性イオンチャネルも企図する。以下の実施例で示すように、原理の証明はすでに当該分野において実証されており、本開示の光誘導性イオンチャネルに容易に適合可能である。これらのデータを考慮すると、本開示の光誘導性イオンチャネルは、聴覚障害者の聴覚活動の回復、または視覚障害者の視力の回復に使用できると考えられる。
さらに、例えば、本開示の細胞についても記載されているように、神経細胞、特に螺旋神経節細胞などの電気的に興奮性の細胞において、本開示に係る光誘導性イオンチャンネルを機能的に発現する非ヒト動物についても開示する。同様に、本開示に係る細胞を含む非ヒト動物も企図される。
非ヒト動物は、ヒト以外の任意の動物であってよい。好ましい実施形態では、非ヒト動物は、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはマウスまたはラットなどのげっ歯類、あるいは霊長類である。
特に、以下のようなモデル生物が好ましい；カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）、アスナロウニ（Arbacia punctulata）、カタユウレイボヤ（Ciona intestinalis）、ショウジョウバエ（Drosophila）、通常、キイロショウジョウバエ種（Drosophila melanogaster）、ダンゴイカ（Euprymna scolopes）、ヒドラ（Hydra）、アメリカケンサキイカ（Loligo pealei）、プリスティオンクス・パキフィクス（Pristionchus pacificus）、アメリカムラサキウニ（Strongylocentrotus purpuratus）、Symsagittifera roscoffensis、及びコクヌストモドキ（Tribolium castaneum）。脊椎動物の中では、モルモット（Cavia porcellus）、ハムスター、マウス（Mus musculus）、及びラット（Rattus norvegicus）といったいくつかのげっ歯類の種、ならびにニワトリ（Gallus gallus domesticus）、ネコ（Felis cattus）、イヌ（Canis lupus familiaris）、ヤツメウナギ、ミナミメダカ（Oryzias latipes）、アカゲザル（Rhesus macaque）、シマウマヒツジ（Sigmodon hispidus）、ゼブラフィンチ（Taeniopygia guttata）、フグ（Takifugu rubripres）、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）、及びゼブラフィッシュ（Danio rerio）といったその他の種がある。非ヒト霊長類、すなわちヒト属のメンバーでない霊長目に属するすべての種の動物、例えば、アカゲザル、チンパンジー、ヒヒ、マーモセット、およびミドリザルも好ましい。しかしながら、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
しかしながら、ヒトまたは動物に実質的な医学的利益をもたらさない可能性があることによって特許法または管轄下で特許性の対象にはならない動物は排除されていることに留意されたい。さらに、当業者は、人間や動物に対する実質的な医学的利益が動物の苦しみを越えることを確実にするために、例えば、動物福祉の国際的ガイドラインに定められている適切な措置を講じる。以下、本発明の範囲を限定する意図ではない図面および実施例によって本発明を説明する。
配列の表記
配列番号1（チャネルロドプシン 2; ChR2; 315 aa; ヘリックス6 は太字で強調されている）
Figure 2019522469
配列番号2（VChR1; 受託番号EU622855; 300 aa; ヘリックス6 は太字で強調されている）
Figure 2019522469
配列番号3（ReaChR; 受託番号KF448069; 352 aa; ヘリックス6 は太字で強調されている）
Figure 2019522469
配列番号4（ヘリックス6 コンセンサスモチーフ）
Cys-Arg-Xaa3-Xaa4-Val-Xaa6-Xaa7-Met-Ala-Trp-Xaa11-Tyr-Phe-Val-Xaa15-Trp-Gly-Met-Phe-Pro-Xaa21-Leu-Phe-Xaa24-Leu、
ここでXaa3はGln又はGluである、好ましくはここでXaa3はGlnである；
ここでXaa4はVal又はLeuである、好ましくはここでXaa4はValである；
ここでXaa6はThr又はArgである、好ましくはここでXaa6はThrである；
ここでXaa7はGly、Val又はAlaである、好ましくはここでXaa7はGlyである；
ここでXaa11はLeu又はThrである、好ましくはここでXaa11はLeuである；
ここでXaa15はSer又はAlaである、好ましくはここでXaa15はSerである；
ここでXaa21はIle又はValである、好ましくはここでXaa21はIleである；かつ
ここでXaa24はIle又はLeuである、好ましくはここでXaa24はIleである。
配列番号5（網膜結合部位コンセンサスモチーフ）
Xaa1-Asp-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Lys-Xaa7-Xaa8-Xaa9
ここでXaa1は、Leu、Ile、Ala、又はCysである；
ここでXaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa7、及びXaa8 は、独立して任意のアミノ酸である；
ここでXaa9 は、Thr、Phe、又はTyrである。
配列番号6（Chrimson; 受託番号KF992060; ヘリックス6 は太字で強調されている）
Figure 2019522469
配列番号7（CsChrimson; 受託番号KJ995863; ヘリックス6 は太字で強調されている）
Figure 2019522469
配列番号8（Chrimson ヘリックス6 スワップ変異体（F219Yを含む））
Figure 2019522469
配列番号9（CsChrimson; ヘリックス6 スワップ変異体（F219Yを含む））
Figure 2019522469
実施例1：オフキネティクスを加速する変異の同定
本発明者らの目的は、変異によりオフキネティクスを更に加速することができるChR-2の第6膜貫通ドメイン内の残基を同定することであった。本発明者らは、第6膜貫通ドメインに焦点を当てた。
ChR2-YFP、ChR2-YFP F219Y、ReaChR-Citrine、ReaChR-Citrine F259Y、VChR1-YFP及びVChR1-YFP F214Yを異種発現するNG108-15細胞を、-60mVのクランプ電位で全細胞構成におけるパッチクランプ測定によって調べた。バス溶液は、140 mM NaCl、2 mM CaCl2、2 mM MgCl2、10 mM HEPES、pH 7.4を含有し、ピペット溶液は、110 mM NaCl、2 mM MgCl2、10 mM EGTA、10 mM HEPES、pH 7.4を含有していた。光電流は、23mW/mm 2の強度および594nmの波長を有する500 ms光パルスに応答させて測定した。τoff値は、照明の停止後の電流を単指数関数へフィットさせることによって決定した。
ナトリウムイオンの透過性に対するカルシウムイオンの相対透過性（PCa/PNa）を評価するために、光電流-電圧関係を測定し、反転電位を求めた。細胞内溶液は、110 mM NaCl、10 mM EGTA、2 mM MgCl2及び10 mM Tris（pH = 7.4）を含有し、細胞外溶液は、140 mM NaCl、2 mM MgCl2及び10 mM Tris（pH = 9）を含有していた。PCa/PNa値の決定のために、外部の140 mM NaClを90 mM CaCl2と交換した。透過率はGoldman-Hodgkin-Katz の式（Jan, L.Y. and Jan, Y. N. J. Physiol. 262, 215-236（1976））に従って計算した。
結果を図1および2に示し、以下の表２に要約する。
Figure 2019522469
表2: チャネルロドプシン変異体のオフキネティクス（τoff）及び相対カルシウム透過性（PCa/PNa）。平均τoff値（n=3-9）、平均相対カルシウム透過性（n=3-5）、及びそれらの標準偏差を示す。a相対カルシウム透過性は、HEK293細胞において決定した。b相対カルシウム透過性は、NG108-15細胞において決定した。
実施例2：聴覚経路の光遺伝学的刺激
Hernandez et al. J Clin Invest. 2014;124(3):1114-29は、げっ歯類において聴覚経路の光遺伝学的刺激のための戦略を示した。特に、この著者らは、光ゲートされたイオンチャネルチャネルロドプシン-2（ChR2）を発現するように遺伝子操作された神経細胞の光刺激となる光遺伝学的刺激を特徴付けるための動物モデルについて説明している。螺旋神経節細胞（ＳＧＮ）の光遺伝学的刺激は、単一の神経細胞及び神経細胞の集団応答の記録により実証されるように、聴覚経路を活性化する。さらに、ＳＧＮの光遺伝学的刺激は、聴覚障害マウスにおける聴覚活性を回復させる。閾値を超える光学的、音響的、および電気的刺激（光遺伝学的刺激を示す）に応答する下丘内の局所電場電位（local field potentials：ＬＦＰ）を記録することによる蝸牛の興奮の空間的広がりを近似することにより、単極電気刺激よりも良好な周波数分解能が達成される。
例えば、Hernandez et al.に記載されるように、本明細書に開示の変異を構築物に導入することは、ルーティーン作業である。あるいは、構築物におけるChR2のコーディング配列を、本開示の光誘導性イオンチャネルのコーディング配列に置換することは容易にできる。
実施例3：視力回復のための光遺伝学的アプローチ
Mace et al. Mol Ther. 2015;23（1）：7-16は、アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子治療による網膜神経細胞の光遺伝学的再活性化を記載する、本発明者らの一部によって執筆された初期の刊行物である。ほとんどの遺伝性網膜ジストロフィーでは、重度の視覚障害を引き起こす進行性の光受容体細胞変性を示す。アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子治療による網膜神経細胞の光遺伝学的再活性化は、患者特異的な変異にかかわらず視力を回復させる可能性がある。臨床的な翻訳可能性への挑戦は、脆弱な変性網膜のために外科的に安全な送達経路を用いながらできるだけ自然な視力に近い視力を回復することである。網膜内側の視覚処理を維持するために、疾患の後期の段階でも依然として存在するＯＮ双極細胞が標的とされる。安全な遺伝子送達のために、眼に容易にアクセス可能な硝子体液への注入後に双極細胞を形質導入することができる近年設計されたAAV変異体が使用される。ＯＮ双極細胞特異的プロモーター下でチャネルロドプシンをコードするAAVは、硝子体内投与後にＯＮ双極細胞に限定的な長期の遺伝子送達を仲介することが示されている。ＯＮ双極細胞におけるチャネルロドプシン発現は、網膜レベルおよび皮質レベルでのＯＮおよびＯＦＦ応答の回復をもたらす。さらに、光誘発性の運動器官の挙動が、治療を受けた盲目マウスにおいて回復される。
例えばMace et alによって記載されているように、本明細書で同定された変異を構築物に導入することは、ルーティーン作業である。あるいは、構築物におけるチャネルロドプシンのコーディング配列を、本開示の光誘導性イオンチャネルのコーディング配列に置換することは容易にできる。本開示の新規な光誘導性イオンチャネルは、網膜の神経節細胞と同様にＯＮ双極細胞の活性化のためにカセットに挿入される。
引用文献のリスト
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Claims (15)

  1. 配列番号1（ChR-2）の全長配列に対し少なくとも84%の類似性及び／又は少なくとも75%の同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型光誘導性イオンチャネルであって、
    該変異型光誘導性イオンチャネルは、親光誘導性イオンチャネルと、配列番号1のF219に相当する位置における置換のみ異なっており、
    前記置換は、-60 mVのクランプ電位、140 mM NaCl、2mM CaCl2、2MgCl2、10 mM HEPES、pH 7.4のバス溶液、及び110 mM NaCl、2 mM MgCl2、10 mM EGTA、10 mM HEPES、pH 7.4のピペット溶液で、全細胞構成におけるパッチクランプ測定により比較したとき、前記親チャネルと比べて、前記変異型チャネルのオフキネティクスを加速する、前記変異型光誘導性イオンチャネル。
  2. 前記変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号1（ChR-2）の全長に対し、少なくとも86%、好ましくは少なくとも88%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも92%、より好ましくは少なくとも94%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%の類似性を有する；及び／又は
    前記変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号1（ChR-2）の全長に対し、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%の同一性を有する、
    請求項１に記載の変異型光誘導性イオンチャネル。
  3. 前記置換はF219Yである、請求項１又は２に記載の変異型光誘導性イオンチャネル。
  4. 前記変異型チャネルは、配列番号4:
    Cys-Arg-Xaa3-Xaa4-Val-Xaa6-Xaa7-Met-Ala-Trp-Xaa11-Tyr-Phe-Val-Xaa15-Trp-Gly-Met-Phe-Pro-Xaa21-Leu-Phe-Xaa24-Leu
    のモチーフ、
    ここでXaa3はGln又はGluである、好ましくはここでXaa3はGlnである；
    ここでXaa4はVal又はLeuである、好ましくはここでXaa4はValである；
    ここでXaa6はThr又はArgである、好ましくはここでXaa6はThrである；
    ここでXaa7はGly、Val又はAlaである、好ましくはここでXaa7はGlyである；
    ここでXaa11はLeu又はThrである、好ましくはここでXaa11はLeuである；
    ここでXaa15はSer又はAlaである、好ましくはここでXaa15はSerである；
    ここでXaa21はIle又はValである、好ましくはここでXaa21はIleである；および
    ここでXaa24はIle又はLeuである、好ましくはここでXaa24はIleである、
    を含む、請求項３に記載の変異型光誘導性イオンチャネル。
  5. 前記変異型チャネルは、配列番号1の位置L132に相当する位置においてCys、Ser、Glu、Asp、又はThrを更に含む、特にここで、前記変異型チャネルは、配列番号1の位置L132に相当する位置においてCysを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異型光誘導性イオンチャネル。
  6. 前記変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号1（ChR-2）のアミノ酸配列を含む、好ましくは配列番号1（ChR-2）のアミノ酸配列からなる、但し、位置F219における前記置換及び場合により配列番号1の位置132におけるアミノ酸を除く；又は
    前記変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号2（VChR1）のアミノ酸配列を含む、好ましくは配列番号2（VChR1）のアミノ酸配列からなる、但し、位置F214における前記置換及び場合により配列番号1のL132に相当する配列番号２の位置におけるアミノ酸を除く；又は
    前記変異型光誘導性イオンチャネルは、配列番号3（ReaChR）のアミノ酸配列を含む、好ましくは配列番号3（ReaChR）のアミノ酸配列からなる、但し、位置F259における前記置換及び場合により配列番号1のL132に相当する配列番号3の位置におけるアミノ酸を除く、
    請求項１〜５のいずれか１項に記載の変異型光誘導性イオンチャネル。
  7. 前記光誘導性イオンチャネルは、以下のアミノ酸残基:配列番号1の位置253に相当する位置におけるアスパラギン酸；配列番号1の位置257に相当する位置におけるリジン；配列番号1の位置260に相当する位置におけるトリプトファン；配列番号1の位置123に相当する位置におけるグルタミン酸；配列番号1の位置134に相当する位置におけるヒスチジン又はアルギニン、好ましくはアルギニン；配列番号1の位置128に相当する位置におけるスレオニン、セリン、又はアラニン；及び／又は配列番号1の位置156に相当する位置におけるアラニン；の少なくとも１つを追加的に含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異型光誘導性イオンチャネル。
  8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の変異型光誘導性イオンチャネルをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物。
  9. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の光誘導性イオンチャネルをコードするヌクレオチド配列又は請求項８に記載の核酸構築物を含む発現ベクター。
  10. 請求項８に記載の核酸構築物又は請求項９に記載の発現ベクターを含む細胞。
  11. 前記細胞は哺乳類細胞であり、好ましくはここで前記細胞は、
    (a)海馬細胞、光受容体細胞、網膜桿体細胞、網膜錐体細胞、網膜神経節細胞、双極神経細胞、神経節細胞、偽単極性神経細胞、多極神経細胞、錐体神経細胞、プルキンエ細胞、又は顆粒細胞；あるいは、
    (b)神経芽腫細胞、特にNG108-15、HEK293細胞；COS細胞；BHK細胞；CHO細胞；骨髄腫細胞；又はMDCK細胞である、請求項10に記載の細胞。
  12. ハイスループットスクリーニングにおける、請求項１〜７のいずれか１項に記載の光誘導性イオンチャネルあるいは請求項１０又は１１に記載の細胞の使用。
  13. 神経細胞の光刺激のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の光誘導性イオンチャネルの非治療的使用。
  14. 医薬における使用のための請求項１〜７のいずれか１項に記載の光誘導性イオンチャネル。
  15. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の光誘導性イオンチャネル、請求項８に記載の核酸構築物、請求項９に記載の発現ベクター、あるいは請求項１０又は１１に記載の細胞、を含む非ヒト動物。
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