ES2660114T3 - Canalrodopsinas para el control óptico de células - Google Patents

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Abstract

Polipéptido de canal iónico activado por luz aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de canal de Chlamydomonas noctigama activado por luz de tipo natural o modificado, en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido de canal iónico activado por luz comprende SEQ ID NO: 2 o la secuencia de aminoácidos del polipéptido de canal iónico activado por luz comprende una secuencia modificada de canal iónico de Chlamydomonas noctigama activado por luz que tiene una identidad de al menos el 70% con respecto a los aminoácidos 86-320 de SEQ ID NO: 2 y una identidad de al menos el 95% con respecto a los aminoácidos restantes en la secuencia expuesta como SEQ ID NO: 2, mediante lo cual una secuencia de ácido nucleico o polipéptido puede expresarse de manera natural en una célula u organismo de un miembro del género Chlamydomonas, pero siempre que la secuencia no sea parte de o esté incluida en una célula u organismo de Chlamydomonas, se considera aislado.

Description

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trazados con fijación de corriente a modo de ejemplo de una neurona individual que expresa ChR88 K176R. La figura 13A muestra que ChR88 K176R puede accionar de manera fiable disparos neuronales de desde 1 hasta 10 mW mm-2 a una estimulación de 625 nm, 5 Hz. La figura 13B muestra trenes de disparos neuronales accionados por luz roja (625 nm) a diversas frecuencias para ChR88 K176R. Se usa una potencia de luz de 1 mW mm-2 para todas
5 las frecuencias. La figura 13C muestra control de inyección de corriente para mostrar que en la neurona pueden producirse disparos neuronales a las frecuencias indicadas.
La figura 14 proporciona gráficos que muestran la selectividad iónica de canalrodopsina medida en células HEK293FT. ChR88 y ChR90 tienen selectividad iónica comparable a ChR2. Sin embargo, ChR87 tiene menos 10 corriente de sodio (Na) en comparación con la corriente de calcio (Ca), protones (H) y potasio (K).
Breve descripción de las secuencias
SEQ ID NO: 1 es una secuencia de aminoácidos de Chlamydomonas noctigama 15
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20 SEQ ID NO: 2: secuencia de aminoácidos que codifica para ChR88 que incluye los residuos 1-350 de SEQ ID NO: 1
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SEQ ID NO: 3 es una secuencia de ADN con codones optimizados de mamífero que codifica para el polipéptido de 25 canal iónico activado por luz ChR88
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SEQ ID NO: 4 es una región transmembrana de ChR88 que incluye los residuos 86-320 de SEQ ID NO: 2
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SEQ ID NO: 5 se deriva de ChR88 e incluye sustitución de K176R
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10 SEQ ID NO: 6 es una secuencia de aminoácidos de Stigeoclonium helveticum
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SEQ ID NO: 7 es una secuencia de aminoácidos que codifica para ChR90 que incluye los residuos 1-325 de SEQ ID NO: 6
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SEQ ID NO: 8 es una secuencia de ADN con codones optimizados de mamífero que codifica para el polipéptido de canal iónico activado por luz ChR90
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aminoácidos no naturales así como aminoácidos naturales. Un aminoácido no natural puede incluirse en un canal iónico activado por luz de la invención para potenciar una característica tal como fotocorriente, estabilidad, velocidad, compatibilidad, o para reducir la toxicidad, etc.
5 Según los principios de esta invención, el rendimiento de las moléculas o clases de moléculas de canales iónicos activados por luz puede ajustarse para uso óptimo, incluido en el contexto de su uso junto con otras moléculas o aparato óptico. Por ejemplo, con el fin de lograr un contraste óptimo para estimulación por múltiples colores, puede desearse o bien mejorar o bien disminuir el rendimiento de una molécula con respecto a otra, mediante la anexión de secuencias que potencian la circulación o creación de variantes genéticas mediante mutagénesis dirigida al sitio, evolución dirigida, transposiciones genéticas , o alteración del uso de codones. Las moléculas o clases de moléculas de canales iónicos activados por luz pueden tener una sensibilidad espectral inherentemente variable. Esto puede usarse ventajosamente in vivo (donde la dispersión y la absorción variarán con respecto a la longitud de onda, la coherencia y la polarización), ajustando la linealidad o no linealidad de la respuesta a la iluminación óptica con respecto al tiempo, la potencia y el historial de iluminación.
15 En algunas realizaciones, la invención incluye el uso de mutagénesis dirigida al sitio direccionada en residuos de aminoácido específicos de canalrodopsinas de Chlamydomonas noctigama. Pueden identificarse ubicaciones específicas para mutaciones individuales y pueden situarse solas, o en combinación con dos o más mutaciones adicionales en una secuencia de canalrodopsina y someterse a prueba con respecto a su amplitud de fotocorriente y activación. Por tanto, las secuencias de los canales iónicos activados por luz de la invención, y/o secuencias de canalrodopsina similares pueden modificarse y pueden someterse a prueba los polipéptidos resultantes usando métodos dados a conocer en el presente documento.
Otro aspecto de la invención proporciona secuencias de ácido nucleico que codifican para un canal iónico activado
25 por luz de la invención. Un experto en la técnica entenderá que los polipéptidos de canales iónicos activados por luz de la presente invención pueden codificarse por diversos ácidos nucleicos. Cada aminoácido en la proteína está representado por uno o más conjuntos de 3 ácidos nucleicos (codones). Debido a que muchos aminoácidos están representados por más de un codón, no hay una única secuencia de ácido nucleico que codifique para una proteína dada. Los expertos en la técnica entienden bien cómo obtener un ácido nucleico que puede codificar para los polipéptidos de los canales iónicos activados por luz de la invención conociendo la secuencia de aminoácidos de la proteína. Una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido o proteína es el “gen” de ese polipéptido
o proteína. Un gen puede ser ARN, ADN u otro ácido nucleico que codificará para el polipéptido o proteína.
Se entiende en la técnica que los sistemas de codones en diferentes organismos pueden ser ligeramente diferentes,
35 y que, por tanto, cuando se desea la expresión de una proteína dada de un organismo dado, puede modificarse la secuencia de ácido nucleico para la expresión dentro de ese organismo. Por tanto, en algunas realizaciones, un polipéptido de canal iónico activado por luz de la invención está codificado por una secuencia de ácido nucleico con codones optimizados de mamífero que, en algunas realizaciones, puede ser una secuencia de ácido nucleico con codones optimizados de ser humano. Un aspecto de la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica para un canal iónico activado por luz que está optimizado para la expresión con una célula de mamífero. En algunas realizaciones de la invención, un ácido nucleico que codifica para un canal iónico activado por luz de la invención incluye una secuencia de ácido nucleico optimizada para la expresión en una célula humana.
Administración de canales iónicos activados por luz
45 La administración de un polipéptido de canal iónico activado por luz a una célula y/o la expresión de un canal iónico activado por luz en una célula puede realizarse usando medios de administración conocidos en la técnica.
Un polipéptido de canal iónico activado por luz de la invención puede incluirse en una proteína de fusión. Se conoce bien en la técnica cómo preparar y utilizar proteínas de fusión que comprenden una secuencia de polipéptido. En determinadas realizaciones de la invención, puede usarse una proteína de fusión para administrar un canal iónico activado por luz a una célula y también puede usarse en algunas realizaciones para dirigir un canal iónico activado por luz de la invención a células específicas o a células, tejidos o regiones específicos en un sujeto. Puede usarse direccionamiento y secuencias de direccionamiento adecuadas para administrar a una célula, tejido o región
55 deseados usando procedimientos conocidos en la técnica.
Un polipéptido de canal iónico activado por luz de la invención puede ser no tóxico, o sustancialmente no tóxico, en células en las que se expresa. En ausencia de luz, un canal iónico activado por luz de la invención no altera significativamente la salud celular o la actividad eléctrica en curso en la célula en la que se expresa.
Un canal iónico activado por luz de la invención puede introducirse genéticamente en una membrana celular, y se proporcionan reactivos y métodos para la expresión genéticamente dirigida del polipéptido de canal iónico activado por luz (ChR88 o un derivado del mismo). Puede usarse direccionamiento genético para administrar polipéptidos de canales iónicos activados por luz a tipos de células específicos, a subtipos de células específicos, a regiones
65 espaciales específicas dentro de un organismo, y a regiones subcelulares dentro de una célula. Direccionamiento genético también se refiere al control de la cantidad de polipéptido de canal iónico activado por luz expresado, y al
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de la invención también incluyen etapas y ensayos adicionales para caracterizar adicionalmente un cambio identificado en la célula, tejido o sujeto cuando la célula se pone en contacto con el compuesto candidato. En algunas realizaciones, las pruebas en una célula, tejido o sujeto también pueden incluir una o más células que tienen un canal iónico activado por luz de la invención, y que también tienen uno, dos, tres o más canales iónicos activados
5 por luz diferentes adicionales, en el que al menos uno, dos, tres, cuatro o más de los canales iónicos activados por luz adicionales se activan por contacto con luz que tiene una longitud de onda diferente que la usada para activar el canal iónico activado por luz de la invención de Chrimson o derivado del mismo.
En un ejemplo no limitativo de un método de identificación de fármaco candidato que se describe, pero no se reivindica, las células que incluyen un canal iónico activado por luz de la invención se despolarizan, desencadenando de ese modo la liberación de un neurotransmisor de la célula, y luego se aplican fármacos que modulan la respuesta de la célula a la despolarización (determinada usando, por ejemplo, métodos de pinzamiento zonal u otros medios conocidos en la técnica adecuados). Tales métodos permiten nuevos tipos de selección de fármaco usando sólo luz para activar los canales de interés, y usando sólo luz para leer los efectos de un fármaco
15 sobre los canales y células que contienen canales de interés.
En algunas realizaciones, los polipéptidos de canales iónicos activados por luz de la invención pueden usarse en sistemas y ensayos de prueba para evaluar la circulación de proteínas de membrana y la función fisiológica en sistemas expresados de manera heteróloga y el uso de canales activados por luz para despolarizar una célula.
En algunos aspectos que se describen pero no se reivindican, pueden realizarse ensayos de dos colores. Por ejemplo, Chronos (para activación con luz azul) y Chrimson (para activación con luz roja) pueden expresarse en células de conjuntos separadas que representan poblaciones neuronales no solapantes. Tras la expresión, la población de células puede exponerse a la luz y pueden optimizarse la longitud de onda y el momento y la “dosis” de
25 luz. Tal como se usa en el presente documento, el término “dosis” en referencia a la luz, puede considerar la longitud de onda, la longitud de pulso, la intensidad, de la luz con la que se pone en contacto un canal iónico activado por luz de la invención.
Se proporciona un ejemplo no limitativo de un procedimiento para optimizar el uso de poblaciones de células activadas por dos colores, que se describe, pero no se reivindica, tal como sigue. Se pone en contacto una población que tiene Chronos y Chrimson expresadas en diferentes subpoblaciones con luz azul que tiene una longitud de onda de entre 400 nm y 500 nm, o entre 450 nm y 500 nm, y que tiene un ancho de pulso de entre 1 y 5 ms para la activación. Un ancho de pulso de 5 ms proporciona una diafonía subumbral mínima en la luz azul, que se define como <15 mV, <10 mV, y de manera óptima como <5 mV. La potencia de luz azul máxima que puede usarse 35 se determina usando células que expresan Chrimson mediante pinzamiento zonal, iluminando con luz azul y midiendo la desviación de voltaje. Se usa de manera óptima la potencia de luz azul de manera que la desviación de voltaje máxima es <10 mV, que en algunas realizaciones puede ser de 0,4 a 0,6 mW/mm2. La potencia de luz azul óptima que puede usarse para accionar Chronos se determina usando las mismas condiciones que antes, excepto porque se usa una potencia de luz menor, tal como de 50 µW/mm2 a 0,4 mW/mm2, que en algunas realizaciones puede ser de 0,2 mW/mm2. La potencia depende del sistema de expresión y del tipo de célula usados para preparar la población. La población puede ponerse en contacto con luz roja que tiene una longitud de onda de entre 600 nm y 700 nm, o entre 620 nm y 640 nm, y con un ancho de pulso de entre 1 y 5 ms para la activación, que en algunas realizaciones puede optimizarse a 5 ms. En determinadas realizaciones de la invención, la potencia de luz óptima para accionar Chrimson en el rojo puede determinarse aumentando las potencias de luz desde por ejemplo, 0,1
45 mW/mm2 hasta 100 mW/mm2, o desde 0,5 mW/mm2 hasta 10 mW/mm2. El método puede optimizarse de manera que se usa una potencia de luz roja mínima para lograr disparos neuronales del 100% para Chrimson.
Se entenderá que pueden expresarse otros conjuntos de 2, 3, 4 o más canales iónicos activados por luz en subpoblaciones separadas de una población de células y luego exponerse a dosis de luz de una manera tal como se describe en este documento para optimizar su uso en ensayos y tratamientos. Un ejemplo no limitativo de un procedimiento para preparar y usar una población de células activadas por múltiples luces es tal como sigue. Se expresa un primer canal iónico activado por luz en una primera subpoblación de una población de células; se expresa un segundo canal iónico activado por luz en una segunda subpoblación de la población de células, en el que las subpoblaciones primera y segunda son subpoblaciones no solapantes, y el primer canal iónico activado por 55 luz y el segundo canal iónico activado por luz tienen intervalos de longitudes de onda de luz de activación que no se solapan completamente. La población de células se pone en contacto con una pluralidad de primeras dosis de prueba de luz que comprenden combinaciones de longitud de onda, ancho de pulso y potencia que activan la primera subpoblación, y se mide la desviación de voltaje transmembrana en una célula de la segunda subpoblación de células puestas en contacto con las primeras dosis de prueba de luz. Se determina la primera dosis de prueba de luz que incluye una potencia de luz máxima que activa el canal iónico activado por luz en la primera subpoblación de células y da como resultado una desviación de voltaje transmembrana subumbral mínima en la segunda subpoblación de células. La población de células se pone entonces en contacto con una pluralidad de primeras dosis de luz de prueba que comprenden una potencia menor que la potencia de primera luz máxima que se determinó, y se determinan una primera dosis de prueba de luz que activa el primer canal iónico activado por luz (a menores 65 potencias). La población de células se pone entonces en contacto con una pluralidad de segundas dosis de prueba de luz que incluyen combinaciones de longitud de onda, ancho de pulso y potencia de luz que activan la segunda
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subpoblación, y se determina una segunda dosis de prueba de luz que comprende una segunda potencia de luz que activa la segunda subpoblación de células. Pueden realizarse ensayos usando una población de células de este tipo, que incluye poner en contacto la población de células con la primera dosis de prueba de luz y la segunda dosis de prueba de luz determinadas usando las etapas anteriores. El procedimiento descrito anteriormente de optimización
5 de los parámetros de dosis de luz para canales iónicos activados por múltiples luces puede usarse para diseñar e implementar ensayos que incluyen los canales iónicos activados por luz de la invención, así como otros canales iónicos activados por luz que se conocen en la técnica.
Métodos de tratamiento
La invención reivindicada proporciona un polipéptido de canal iónico activado por luz para su uso en un método de tratamiento médico de un sujeto, tal como se define en la reivindicación 9. La invención reivindicada también proporciona un polipéptido de canal iónico activado por luz, un ácido nucleico o un vector para su uso en un método de tratamiento de un trastorno en un sujeto, tal como se define en la reivindicación 11. Tales métodos de tratamiento
15 pueden incluir administrar a un sujeto que necesita tal tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de un canal iónico activado por luz de la invención para tratar el trastorno. Se entenderá que un tratamiento puede ser un tratamiento profiláctico o puede ser un tratamiento administrado tras el diagnóstico de una enfermedad o estado. Un tratamiento de la invención puede reducir o eliminar un síntoma o característica de un trastorno, enfermedad o estado o puede eliminar el trastorno, enfermedad o estado por sí mismo. Se entenderá que un tratamiento de la invención puede reducir o eliminar el avance de una enfermedad, trastorno o estado y en algunos casos puede dar como resultado la regresión de la enfermedad, trastorno o estado. No es necesario que un tratamiento elimine completamente la enfermedad, trastorno o estado para ser eficaz. En algunas realizaciones de la invención, uno o más canales iónicos activados por luz de la invención (ChR88 o un derivado del mismo) pueden expresarse en una población de células y usarse para tratar un trastorno o estado.
25 La administración de un canal iónico activado por luz de la invención puede incluir la administración de una composición farmacéutica que incluye una célula, en la que la célula expresa el canal iónico activado por luz. La administración de un canal iónico activado por luz de la invención puede incluir la administración de una composición farmacéutica que incluye un vector, en la que el vector comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para el canal iónico activado por luz y la administración del vector da como resultado la expresión del canal iónico activado por luz en una célula en el sujeto.
Una cantidad eficaz de un canal iónico activado por luz es una cantidad que aumenta el nivel del canal iónico activado por luz en una célula, tejido o sujeto hasta un nivel que es beneficioso para el sujeto. Una cantidad eficaz 35 también puede determinarse evaluando los efectos fisiológicos de la administración en una célula o sujeto, tal como una disminución en los síntomas tras la administración. Un experto habitual en la técnica conocerá otros ensayos y estos pueden emplearse para medir el nivel de respuesta a un tratamiento. La cantidad de un tratamiento puede variar, por ejemplo, aumentando o disminuyendo la cantidad del canal iónico activado por luz administrado, cambiando la composición terapéutica en la que se administra el canal iónico activado por luz, cambiando la vía de administración, cambiando el momento de dosificación, cambiando cantidades y parámetros de activación de un canal iónico activado por luz de la invención, y así sucesivamente. La cantidad eficaz variará con el estado particular que está tratándose, la edad y el estado físico del sujeto que está tratándose; la gravedad del estado, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia coincidente (si la hay), la vía específica de administración, y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del profesional sanitario. Por ejemplo, una cantidad eficaz puede
45 depender de la ubicación y el número de células en el sujeto en el que va a expresarse el canal iónico activado por luz. Una cantidad eficaz también puede depender de la ubicación del tejido que va a tratarse.
Las cantidades eficaces también dependerán, por supuesto, del estado particular que está tratándose, la gravedad del estado, los parámetros del paciente individual incluyendo edad, estado físico, estatura y peso, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia coincidente (si la hay), la vía específica de administración y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del profesional sanitario. Estos factores los conocen bien los expertos habituales en la técnica y pueden abordarse únicamente con experimentación de rutina. Se prefiere generalmente que se use una dosis máxima de una composición para aumentar el nivel de un canal iónico activado por luz, y/o para alterar la duración o el momento de activación de un canal iónico activado por luz en un sujeto (solo o en
55 combinación con otros agentes terapéuticos), es decir, la dosis o cantidad más alta segura según una opinión médica razonable. Sin embargo, los expertos habituales en la técnica entenderá que un paciente puede insistir en una dosis menor o dosis tolerable por razones médicas, razones psicológicas o prácticamente por cualquier otra razón.
Un canal iónico activado por luz de la invención (ChR88, o un derivado del mismo) puede administrarse usando métodos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, se administra un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de canal iónico activado por luz de la invención a un sujeto y en determinadas realizaciones se administra un polipéptido de canal iónico activado por luz a un sujeto. La manera y la dosificación administra pueden ajustarse por el médico o veterinario individual, particularmente en el caso de cualquier complicación. La cantidad 65 absoluta administrada dependerá de una variedad de factores, incluyendo el material seleccionado para la administración, si la administración es en dosis individuales o múltiples, y los parámetros de un sujeto individual
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(g) Registro de la conductancia de iones
Se realizaron registros de pinzamiento zonal de células completas en células HEK293FT aisladas para medir con exactitud parámetros de células individuales. Se realizaron todos los registros usando un amplificador Axopatch 5 200B y un digitalizador Digidata 1440 (Molecular Devices) a temperatura ambiente. Con el fin de permitir el registro de células aisladas, se sembraron las células en placas a una densidad menor de 15.000 células por pocillo en placas de 24 pocillos que contenían cubreobjetos de vidrio redondos (0,15 mm de grosor, 25 mm de diámetro, recubiertos con Matrigel reducido con factor del crecimiento al 2% en DMEM durante 1 h a 37ºC). Para la mayoría de registros, se usó Tyrode como disolución extracelular, y la disolución intracelular consistió en (en mM) K-gluconato
10 125, NaCl 8, CaCl2 0,1, MgCl2 0,6, EGTA 1, HEPES 10, MgATP 4, NaGTP 0,4, pH 7,3 (ajustado con KOH), con 295300 mOsm (ajustado con sacarosa). En la tabla 1 se enumeran las disoluciones extracelulares e intracelulares usadas para someter a prueba la permeabilidad de iones.
Tabla 1. Composiciones de disoluciones usadas en experimentos de permeabilidad de iones
Disolución
[Na] (mM) [K] (mM) [Ca] (mM) [H] (mM) pH Otros
Intracelular
0 140 0 5,10E-05 7,4 EGTA 5 mM, MgCl2 2 mM, HEPES 10 mM
NaCl 145 mM
145 5 1 5,10E-05 7,4 HEPES 10 mM, glucosa 5 mM, MgCl2 2 mM
KCl 145 mM
0 145 1 5,10E-05 7,4 HEPES 10 mM, glucosa 5 mM, MgCl2 2 mM
CaCl2 90 mM
0 5 91 5,10E-05 7,4 HEPES 10 mM, glucosa 5 mM, MgCl2 2 mM
NaCl 5 mM
5 5 1 5,10E-04 6,4 NMDG 135 mM, HEPES 10 mM, glucosa 5 mM, MgCl2 2 mM
15 Se midieron los potenciales de unión líquida usando procedimientos convencionales para que fueran de 5,8 mV para las disoluciones extracelulares de CaCl2 90 mM y 4,9 mV para las de NaCl 5 mM, que se corrigieron durante el registro, las otras tuvieron un potencial de unión < 1 mV.
20 En todos los registros de pinzamiento zonal, se aplicó un punto de corte estricto de resistencia de acceso de menos de 25 MΩ y una corriente de retención de menos de ± 50 pA con el fin de garantizar una medición precisa. La resistencia de membrana típica era de entre 500 MΩ -2GΩ y la resistencia de pipeta era de entre 4 -10 MΩ.
Se llevó a cabo fotoestimulación de células con pinzamiento zonal mediante un LED de 470 nm (Thorlabs) a 10
25 mW/mm2 a menos que se indique lo contrario. Para la mayoría de experimentos, se administró iluminación de 1 s para medir fotocorrientes transitorias y en estado estacionario.
(h) Construcción de plásmido y mutagénesis dirigida al sitio.
30 Se obtuvieron opsinas con codones optimizados de mamífero y se sintetizaron mediante Genscript (Genscript Corp., NJ). Se fusionaron opsinas en marco, sin codones de terminación, por delante de GFP (usando BamHI y Angel) en un vector de lentivirus que contenía el promotor CaMKII, permitiendo la transfección de neuronas directa, la transfección de células HEK (la expresión en células HEK se permite por un promotor ubicuo aguas arriba del casete de lentivirus), y la producción y transfección de lentivirus. Las secuencias de aminoácidos de algunas opsinas que se
35 sometieron a prueba fueron tal como sigue: ChR88 (SEQ ID NO: 2); ChR90 (SEQ ID NO: 7); ChR87 (SEQ ID NO: 11); ChR62 (SEQ ID NO: 14), ChR93 (SEQ ID NO: 16) y ChR2 (SEQ ID NO: 19), ChR88 K176R (SEQ ID NO: 5).
La secuencia señal “ss” del antígeno del CMH de clase I truncado se correspondía con la secuencia de aminoácidos (M)VPCTLLLLLAAALAPTQTRA (SEQ ID NO: 21), secuencia de ADN
40 gtcccgtgcacgctgctcctgctgttggcagccgccctggctccgactcagacgcgggcc (SEQ ID NO: 20). La secuencia de exportación del RE ’”ER2’” se correspondía con la secuencia de aminoácidos FCYENEV (SEQ ID NO: 23), secuencia de ADN ttctgctacgagaatgaagtg (SEQ ID NO: 22). La secuencia señal “KGC” se correspondía con la secuencia de aminoácidos KSRITSEGEYIPLDQIDINV (SEQ ID NO: 25), secuencia de ADN de secuencia señal KGC: aaatccagaattacttctgaaggggagtatatccctctggatcaaatagacatcaatgtt. (SEQ ID NO: 24).
45 Se generaron mutantes puntuales para las pruebas de células HEK usando el kit QuikChange [Stratagene, (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)] en el gen de fusión de opsina-GFP insertado entre los sitios BamHI y Agel en una versión modificada de la estructura principal de pEGFP-N3 [Invitrogen, (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA)]. Se verificaron todos los constructos mediante secuenciación.
50
(i) Preparación de lentivirus
Se transfectaron células HEK293FT [Invitrogen (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA)] con el plásmido de lentivirus, el plásmido viral auxiliar pΔ8.74, y el plásmido de pseudotipado pMD2.G. Entonces se recogió el
55 sobrenadante de células HEK transfectadas que contenían virus 48 horas después de la transfección, se purificó y
27
entonces se sedimentó mediante ultracentrifugación. Se volvió a suspender el sedimento de lentivirus en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se almacenó a -80ºC hasta el uso adicional in vitro o in vivo. El título final estimado es de aproximadamente 109 unidades infecciosas/ml.
5 Ejemplo 2
Se expresaron los canales iónicos activados por luz VChR1, ChR1, ChR2, ChR87, ChR90 y ChR88 en neuronas del hipocampo cultivadas usando los métodos de cultivo, transfección, infección y obtención de imágenes de neuronas descritos en el ejemplo 1. Se llevaron a cabo estimulación óptica y registro de pinzamiento zonal de células completas in vitro en las neuronas usando los métodos descritos en el ejemplo 1. La figura 1 muestra fotocorrientes de canalrodopsina medidas en las neuronas del hipocampo cultivadas. La figura 1A muestra resultados usando fotocorriente pico de luz roja (660 nm) a 10 mW mm-2 durante iluminación de 1 s. ChR88 es la única canalrodopsina sensible a la luz roja con una fotocorriente significativa a 660 nm. La figura 1B muestra resultados usando fotocorriente pico de luz azul (4,23 mW mm-2) o verde (3,66 mW mm-2) a igual flujo de fotones para iluminación de 5
15 ms. ChR87, ChR88 y ChR90 tienen todas una fotocorriente mayor que o comparable a ChR2. Las barras negras indican luz azul, las barras de rayas horizontales indican luz verde.
Ejemplo 3
Se transfectaron células HEK 293FT para expresar los canales iónicos activados por luz ChR2, ChR90, VChR1, ChR88 y ChR87 usando los métodos del ejemplo 1. Se llevaron a cabo estimulación óptica y registro de pinzamiento zonal de células completas in vitro en las células transfectadas y cultivadas usando los métodos descritos en el ejemplo 1. La figura 2 muestra el espectro de acción a igual dosis de fotones en todas las longitudes de onda registradas en células HEK293FT. ChR2 (pico a 470 nm) y VChR1 (pico a 545 nm) representan el intervalo de
25 sensibilidad de color de canalrodopsina existente. ChR87 (pico a 515 nm) y ChR90 (pico a 500 nm) son canalrodopsinas sensibles a la luz azul y verde. Mientras que ChR88 (pico a 590 nm) es la primera canalrodopsina natural sensible a la luz roja.
Ejemplo 4
Se expresaron los canales iónicos activados por luz ChR90 y ChR88 en neuronas del hipocampo cultivadas usando los métodos de cultivo, transfección, infección y obtención de imágenes de neuronas descritos en el ejemplo 1. Se llevaron a cabo estimulación óptica y registro de pinzamiento zonal de células completas in vitro en las neuronas usando los métodos descritos en el ejemplo 1. La figura 3 muestra disparos neuronales accionados ópticamente en
35 las neuronas del hipocampo cultivadas. La figura 3A muestra trenes de disparos neuronales accionados por luz roja a baja frecuencia para Ch88. Generalmente, ChR88 podía accionar de manera fiable disparos neuronales de hasta 5 Hz. Sin embargo, a una frecuencia mayor tal como 20 Hz, ChR88 desensibiliza y/o provoca bloqueo de despolarización. La figura 3B muestra trenes de disparos neuronales accionados por luz verde a alta frecuencia para Ch90. Debido a la rápida cinética de recuperación de fotocorriente pico y tau off de ChR90, pudo accionar temporalmente disparos neuronales precisos a la frecuencia más a alta que una neurona puede mediar.
Ejemplo 5
Se expresaron los canales iónicos activados por luz ChR88, Chr2, ChR87 y ChR90 en neuronas del hipocampo
45 cultivadas usando los métodos de cultivo, transfección, infección y obtención de imágenes de neuronas descritos en el ejemplo 1. Se llevaron a cabo estimulación óptica y registro de pinzamiento zonal de células completas in vitro en las neuronas usando los métodos descritos en el ejemplo 1. La figura 4 ilustra los resultados y muestra la cinética de canalrodopsina medida en el voltaje de cultivo de neuronas del hipocampo fijado a -65mV. La figura 4A muestra cinética de desactivación del canal exponencial único basada en un pulso de 5 ms. ChR90 tuvo la cinética de desactivación más rápida (3,5 ms) observada en todas las canalrodopsinas naturales. La figura 4B muestra la razón de recuperación de fotocorriente pico basada en la iluminación de 1 s. ChR87 y ChR90 tuvieron ambos una rápida recuperación de fotocorriente pico a aproximadamente el 70%. Sin embargo, ChR88 tuvo una cinética de recuperación lenta similar a ChR2.
55 Ejemplo 6
Se expresaron los canales iónicos activados por luz Chrimson (ChR88) en neuronas del hipocampo cultivadas usando los métodos de cultivo, transfección, infección y obtención de imágenes de neuronas descritos en el ejemplo
1. Se llevaron a cabo estimulación óptica y registro de pinzamiento zonal de células completas in vitro en las neuronas usando los métodos descritos en el ejemplo 1. La figura 5 muestra la caracterización de la diafonía de luz azul de Chrimson en neuronas cultivadas. La figura 5A muestra el espectro de acción de Chrimson y la longitud de onda de luz azul (470 nm) usada para iluminación. Se eligió la longitud de onda para minimizar la diafonía. La figura 5B muestra trazados representativos de una sola neurona en diversas condiciones de iluminación. Cuando se duplicó la potencia de luz azul desde 0,1 hasta 0,2 mW mm-2 mientras que el protocolo de estimulación se fijó como
65 5 ms 5 Hz, la desviación de voltaje también se duplicó. Sin embargo, cuando la potencia de luz azul se fijó a 0,1 mW mm -2 pero la duración del pulso cambió desde 5 ms hasta 1000 ms, la diafonía cambió desde <5 mV hasta disparo
28
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