CN109790209A - Chrimson的突变型光诱导离子通道 - Google Patents

Chrimson的突变型光诱导离子通道 Download PDF

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Abstract

本发明涉及与亲本通道相比具有改善的性质的突变型光诱导离子通道，编码其的核酸构建体，携带所述核酸构建体的表达载体，包含所述核酸构建体或表达载体的细胞，及其各自的用途，以及包含本文公开的突变型光诱导离子通道、核酸构建体或表达载体的非人动物。

Description

Chrimson的突变型光诱导离子通道
本发明涉及突变型光诱导离子通道(其与亲本光诱导离子通道相比具有改善的性质)，编码其的核酸构建体，携带所述核酸构建体的表达载体，包含所述核酸构建体或表达载体的细胞，及其各自的用途，如权利要求中进一步定义。
背景技术
光门控、内向整流阳离子通道，通道视紫红质-1(ChR1)和通道视紫红质2(ChR2)已成为体外和体内神经元靶向光激活的优选工具1-5。尽管野生型(WT)ChR2可用于光诱导去极化，但目前正在寻找具有更快动力学和增加光敏性的ChR2突变体，以用于未来潜在的临床应用(WO 03/084994和6-8)。
自2002年和2003年的第一次描述以来，描述了一组不同的ChR2变体，包括吸收红光的通道视紫红质。出于不同目的，ChR在动力学，离子选择性以及光吸收方面进行了修饰。实例是来自Chlamydomonas Chrimson的吸收红光的通道视紫红质(WO2013/071231和9；登录号KF992060)，Chrimson变体ChrimsonR(K176R)和CsChrimson，包含来自ChlamydomonasChrimson的氨基酸序列的嵌合多肽，和衍生自Chloromonas channelrhodopsin CsChR的氨基酸序列，也参见US 2016/0039902的SEQ ID NO：1，2和5，和登录号KJ995863。红光激活型通道视紫红质是有益的，因为红光进入动物组织的穿透深度比低波长光的穿透深度更深(3 ，8)。此外，红光激活型通道视紫红质的使用降低了光毒性的风险.
动力学是一个主要问题，因为光敏感度是通过通道的开放时间来调节的。这是由于其他通道参数(如单通道电导，开放概率，量子效率)的不变性。换句话说，具有长开放时间的通道在低光强度下达到最大活动，而短活性通道需要更多光以相对于光饱和度达到饱和。虽然“快速”通道需要更多的光来激活，但由于不同神经元细胞的高频率放电，高速对于神经生物学中的许多应用是必不可少的。这是有根据的，例如对于大脑中间神经元的听觉系统中的神经节细胞，其达到高达1000Hz的放电速率。因此，仍然需要结合稳健表达和更快响应动力学的突变型光诱导离子通道。
发明内容
发明人通过修饰七个跨膜螺旋基序的螺旋6对Chrimson进行了系统研究。光激活期间的螺旋6运动是微生物型视紫红质的常见特征(15，17).因此，修改螺旋6以改变通道的关闭时间。可以证明，Chrimson中螺旋6中位置261，267和268的突变加速了通道的关闭时间(关闭动力学)，并且突变的组合导致了关闭动力学(off-kinetics)的进一步加速。
本公开描述了通过螺旋6中的具体定点突变修饰Chrimson的速度的一般方法。这些新变体的使用将提供对神经元的光刺激，直至其达到800至1000Hz的极限。
在NG108-15细胞(神经母细胞瘤细胞)，HEK293细胞和来自小鼠脑的海马细胞中测试了针对增加的速度的实验验证。
因此，公开了突变型光诱导离子通道，其中所述突变型光诱导离子通道包含与SEQID NO：1(Chrimson)的全长序列具有至少90％相似性/同源性和/或至少72％同一性的氨基酸序列，其中所述突变型光诱导离子通道与其亲本光诱导离子通道的不同之处仅在于选自SEQ ID NO：1中对应于Y261，Y268和S267的位置的一个或多个位置处的置换，
当在钳位电位-60mV，浴溶液为140mM NaCl、2mM CaCl2、2MgCl2、10mM HEPES、pH7.4，和移液管溶液为110mM NaCl、2mM MgCl2、10mM EGTA、10mM HEPES，pH7.4下以全细胞模式通过膜片钳测量比较时，与所述亲本通道相比所述置换加速所述突变型通道的关闭动力学。
还提供了核酸构建体，其包含编码本文公开的光诱导离子通道的核苷酸序列。
还提供了表达载体，其包含编码本文公开的光诱导离子通道或核酸构建体的核苷酸序列。
此外，提供了细胞，其包含本文公开的核酸构建体或表达载体。
在另一方面，本发明提供了本文公开的光诱导离子通道在高通量筛选和/或刺激神经元中的用途。还考虑了所述突变型光诱导离子通道在医药中的用途。
优选实施方案的详细描述
本公开涉及突变型光诱导离子通道，其中所述突变型光诱导离子通道包含与SEQID NO：1(Chrimson)的全长序列具有至少90％相似性同源性和/或至少72％同一性的氨基酸序列，其中所述突变型光诱导离子通道与其亲本光诱导离子通道的不同之处仅在于选自SEQ ID NO：1中对应于Y261，Y268和S267的位置的一个或多个位置处的置换
当在钳位电位-60mV，浴溶液为140mM NaCl、2mM CaCl2、2MgCl2、10mM HEPES、pH7.4，和移液管溶液为110mM NaCl、2mM MgCl2、10mM EGTA、10mM HEPES，pH7.4下以全细胞模式通过膜片钳测量比较时，与所述亲本通道相比所述置换加速所述突变型通道的关闭动力学。突变体和亲本通道的关闭动力学可以在大鼠海马细胞(参见下面的实施例3)或NG108-15神经母细胞瘤细胞(参见下面的实施例1)(每者异源表达突变体或亲本通道)中测量。优选地，在NG108-15细胞中测量突变体通道的关闭动力学。成功的蛋白质表达可以通过例如EGFP或YFP介导的荧光来证明。通常，响应于3ms光脉冲(强度23mW/mm2，波长594nm)测量光电流。τ关闭值由照明停止后的电流与单指数函数的拟合确定，如下面的例子中进一步描述。
在优选的实施方案中，突变型光诱导离子通道包含在位置Y261处的置换。在特别优选的实施方案中，置换是Y261F。
或者，或除了在位置Y261处的置换之外，突变型光诱导离子通道进一步包含在位置Y268处的置换。更优选地，置换是Y268F。
在另一个优选的实施方案中，突变型光诱导离子通道包含在位置S267处的置换。在特别优选的实施方案中，置换是S267M。甚至更优选地，所述置换与位置Y261，位置Y268或位置Y261和Y268处的置换相组合。
因此，在优选的实施方案中，突变型光诱导离子通道包含位置Y261和位置S267处的置换，优选其中位置Y261处的置换是Y261F，以及优选其中位置S267处的置换是S267M。在另一个优选的实施方案中，突变型光诱导离子通道包含位置Y268和位置S267处的置换，优选其中位置Y268处的置换是Y268F，以及优选其中位置S267处的置换是S267M。在另一个优选的实施方案中，突变型光诱导离子通道包含位置Y261，位置Y268和位置S267处的置换，优选其中位置Y261处的置换是Y261F，优选其中位置Y268处的置换是Y268F，以及优选其中位置S267处的置换是S267M。
亲本光诱导离子通道可以是任何Chrimson样通道，只要它落在所要求的百分比序列同一性和/或序列同源性/相似性内。在一个优选的实施方案中，亲本光诱导离子通道在对应于SEQ ID NO：1的位置176的位置处已经包含Arg。所述变体已知为ChrimsonR(K176R)。
优选地，突变型光诱导离子通道与SEQ ID NO：1(Chrimson)的全长具有至少91％，优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的相似性/同源性。
另外地或可备选地，突变型光诱导离子通道与SEQ ID NO：1(Chrimson)的全长具有至少74％，优选至少75％，更优选至少76％，更优选至少78％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的同一性。
与SEQ ID NO：1的全长具有至少70％相似性/同源性或至少70％同一性的光诱导离子通道的实例是ChrimsonR变体K176R，或嵌合体CsChrimson(SEQ ID NO：2，登录号KJ995863)，以及其任何其他直向同源物或等位基因变体。Chrimson和CsChrimson在Chrimson的全长(SEQ ID NO：1)上具有74％的同一性和76.4％的同源性/相似性。
优选地，突变型光诱导离子通道是吸收红光的通道视紫红质。
还考虑了光诱导离子通道的交换突变体，其中螺旋6已经被SEQ ID NO：3的螺旋-6基序(其中螺旋6被分别包括Y268F，Y261F和S267M置换Chrimson的螺旋6(参见SEQ ID NO：8，9和10)替换)(例如，ChR-2(SEQ ID NO：5)，VChRl(SEQ ID NO：6)或ReaChR(SEQ ID NO：7))替换。
这种交换突变体与SEQ ID NO：1(Chrimson)的全长通常具有至少56％的同源性/相似性，与SEQ ID NO：1(Chrimson)的全长具有优选至少58％，更优选至少60％，更优选至少62％，甚至更优选至少64％的同源性/相似性。
另外，或者备选地，这种交换突变体通常与SEQ ID NO：1(Chrimson)的全长具有至少42％，优选至少44％，更优选至少46％，更优选至少48％，更优选至少50％，更优选至少52％，更优选至少54％，更优选至少56％的同一性。
通常，当氨基酸序列与另一氨基酸序列(例如上述SEQ ID NO：1)之间的序列同一性在所述另一氨基酸序列(例如上述SEQ ID NO：1)的全长上至少为x％时，所述氨基酸序列与所述另一氨基酸序列(例如上述SEQ ID NO：1)具有“至少x％同一性”。类似地，当氨基酸序列与另一氨基酸序列(例如上述SEQ ID NO：1)之间的序列相似性/同源性在所述另一氨基酸序列(例如上述SEQ ID NO：1)的全长上至少为x％时，所述氨基酸序列与所述另一氨基酸序列(例如上述SEQ ID NO：1)具有“至少x％相似性/同源性”。
这种比对可以使用例如公众可获得的计算机同源程序(例如在EMBL主页http：//www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/上提供的“EMBOSS”程序，使用其中提供的默认设置)进行。计算氨基酸酸序列组的序列同一性或序列相似性/序列同源性百分比的其他方法是本领域已知的。
然而，在特别优选的实施方案中，突变型光诱导离子通道包含SEQ ID NO：1(Chrimson)的氨基酸序列，更优选由其组成，其中如以上另外公开的以下除外：位置Y261，Y268和S267处的置换，以及任选地对应于SEQ ID NO：1的位置176的位置处的Arg。
本公开的光诱导离子通道是具有至少5个跨膜螺旋的膜蛋白，其能够结合光敏多烯。具有6或7个跨膜螺旋的跨膜蛋白是优选的。然而，还包括具有超过7个螺旋的跨膜蛋白，例如8，9或10个跨膜螺旋。此外，本发明涵盖跨膜蛋白，其除了跨膜部分外还包括C末端和/或N末端序列，其中C末端序列可以延伸到由膜包围的腔内部(例如细胞的细胞质)或脂质体内部，或也可以排列在膜外表面上。这同样适用于任选存在的N末端序列，其同样可以布置在腔内并且也可以布置在膜的外表面上。C末端和/或N末端序列的长度原则上不受限制；然而，优选具有未包埋在膜中的C末端序列(具有1-1000个氨基酸，优选1-500个氨基酸，特别优选5-50个氨基酸)的光诱导离子通道。独立于C末端序列的长度，未包埋在膜中的N末端定位序列优选包含1-500个氨基酸，特别优选5-50个氨基酸。跨膜螺旋的概念是本领域技术人员公知的。这些通常是α-螺旋蛋白质结构，其通常包含20至25个氨基酸。然而，取决于膜的性质，其可以是天然膜，例如细胞膜或质膜，或者也可以是合成膜，跨膜片段也可以更短或更长。例如，人造膜中的跨膜区段可包含多达30个氨基酸，但另一方面也可仅包含少量氨基酸，例如12至16个氨基酸。
此外，与SEQ ID NO：1相比，光诱导离子通道包含进一步的(半)保守置换。保守置换是在与其侧链和化学性质相关的氨基酸家族中发生的置换。这类家族的实例是具有碱性侧链，具有酸性侧链，具有非极性脂肪族侧链，具有非极性芳族侧链，具有不带电荷的极性侧链，具有小侧链，具有大侧链等的氨基酸。典型的半保守和保守置换是：
氨基酸 保守置换 半保守置换
A G；S；T N；V；C
C A；V；L M；I；F；G
D E；N；Q A；S；T；K；R；H
E D；Q；N A；S；T；K；R；H
F W；Y；L；M；H I；V；A
G A S；N；T；D；E；N；Q
H Y；F；K；R L；M；A
I V；L；M；A F；Y；W；G
K R；H D；E；N；Q；S；T；A
L M；I；V；A F；Y；W；H；C
M L；I；V；A F；Y；W；C；
N Q D；E；S；T；A；G；K；R
P V；I L；A；M；W；Y；S；T；C；F
Q N D；E；A；S；T；L；M；K；R
R K；H N；Q；S；T；D；E；A
S A；T；G；N D；E；R；K
T A；S；G；N；V D；E；R；K；I
V A；L；I M；T；C；N
W F；Y；H L；M；I；V；C
Y F；W；H L；M；I；V；C
此外，技术人员将理解，在空间要求的位置的甘氨酸不应被置换，并且不应将脯氨酸引入具有α螺旋或β折叠结构的蛋白质部分。
优选地，突变型通道包含SEQ ID NO：3的螺旋6-基序：
Cys-Arg-Met-Val-Val-Lys-Leu-Met-Ala-Tyr-Ala-Xaa12-Phe-Ala-Ser-Trp-Gly-Xaa18-Xaa19-Pro-Ile-Leu-Trp-Ala-Val，
其中Xaa12是Phe或Tyr，优选其中Xaa12是Phe；
其中Xaa18是Met或Ser，优选其中Xaa18是Met；和
其中Xaa19是Phe或Tyr，优选其中Xaa19是Phe。
进一步优选的是，光诱导离子通道包含共有基序L(I，A，C)DxxxKxxW(F，Y)(SEQ IDNO：4)。括号中给出的氨基酸可以在每种情况下替代前面的氨基酸。该共有序列是围绕视黄醛结合氨基酸赖氨酸的基序。
通常，光诱导离子通道功能所必需的视黄醛或视黄醛衍生物由待用所述离子通道转染的细胞产生。根据其构象，视黄醛可以是全反式视黄醛，11-顺式-视黄醛，13-顺式-视黄醛或9-顺式-视黄醛。然而，还预期本发明的突变型光诱导离子通道可以掺入囊泡，脂质体或其他人造细胞膜中。因此，还公开了一种通道视紫红质，其包含本公开的光诱导离子通道和视黄醛或视黄醛衍生物。优选地，视黄醛衍生物选自3，4-脱氢视黄醛，13-乙基视黄醛，9-dm-视黄醛，3-羟基视黄醛，4-羟基视黄醛，萘基视黄醛；3，7，11-三甲基-十二-2，4，6，8，10-五烯醛；3，7-二甲基-癸-2，4，6，8-四烯醛；3，7-二甲基-辛-2，4，6-三烯醛；和6-7个旋转受阻的视黄醛，8-9个旋转受阻的视黄醛和10-11个旋转受阻的视黄醛。
本公开还描述了核酸构建体，其包含编码本文以上公开的突变型光诱导离子通道的核苷酸序列。
为了确保最佳表达，还可以例如通过添加合适的调节序列和/或靶向序列和/或通过将编码DNA序列与所选宿主的优选密码子使用相匹配来适当地修饰编码DNA。靶向序列可编码C末端延伸，其将光诱导离子通道至细胞内的特定位点或区室，例如靶向突触或突触后位点，靶向轴突-小丘或内质网。核酸可以与其他元件组合，例如启动子和转录起始和终止信号以及翻译起始和终止信号和多腺苷酸化信号，以提供本公开的突变型光诱导离子通道序列的表达。启动子可以是诱导型或组成型，一般或细胞特异性启动子。细胞特异性启动子的实例是对双极细胞特异的mGlu6启动子。启动子，载体和其他元件的选择是本领域普通技术水平的常规设计的问题。许多这样的元件在文献中描述并且可通过商业供应商获得。
还公开了表达载体，其包含编码本文公开的突变型光诱导离子通道或核酸构建体的核苷酸序列。在优选的实施方案中，载体适用于基因治疗，特别是其中载体适合于病毒介导的基因转移。术语“适合于病毒介导的基因转移”在本文中是指所述载体可以包装在病毒中并因此被递送至目标位点或细胞。适用于基因治疗的病毒的实例是逆转录病毒，腺病毒，腺相关病毒，慢病毒，痘病毒，甲病毒，狂犬病病毒，semliki森林病毒和疱疹病毒。这些病毒的不同之处在于它们将基因转移到它们识别并能够感染的细胞的程度，以及它们是永久性地还是暂时地改变细胞的DNA。然而，基因疗法还包括非病毒方法，例如裸DNA，脂质复合物和polyplexes，以及树枝状大分子的应用。
如上所述，可以例如使用病毒作为载体或通过转染(包括例如通过化学转染子(如Lipofectamine，Fugene等)，电穿孔，磷酸钙共沉淀和DNA的直接扩散)将得到的核酸序列引入细胞。用于转染细胞的方法在实施例中详述，并且可以适应各自的受体细胞。如果转染的DNA整合到基因组中，则用DNA转染产生稳定的细胞或细胞系，或在其中转染的DNA以染色体外形式存在的情况下，产生不稳定的(瞬时)细胞或细胞系。此外，通过使用附加型复制质粒可以获得稳定的细胞系，这意味着染色体外质粒的遗传受到整合到细胞基因组中的控制元件的控制。通常，合适的载体或质粒的选择取决于预期的宿主细胞。
因此，本公开还涉及包含本文公开的核酸构建体或表达载体的细胞。
将突变型光诱导离子通道掺入到自然不表达相应通道的细胞膜中可以例如简单地实现：使用已知的重组DNA技术方法，首先将编码该离子通道的DNA整合到合适的表达载体(例如，质粒，粘粒或病毒)中，然后用此转化靶细胞，并在该宿主中表达蛋白质。接下来，以合适的方式(例如用视黄醛)处理细胞，以使在蛋白质和视黄醛之间形成Schiffs碱键接。
本公开的光诱导离子通道的表达可以有利地在某些哺乳动物细胞系统中实现。因此，在优选的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。使用游离载体优选在神经母细胞瘤细胞(例如，NG108-15-细胞)，黑素瘤细胞(例如，BLM细胞系)，COS细胞(由“非洲绿猴肾CVl”细胞的感染产生)或HEK细胞(“人胚胎肾细胞”，例如HEK293细胞)，或BHK细胞(“幼仓鼠肾细胞”)中作为瞬时表达来实现表达，或在CHO细胞(“中国仓鼠卵巢细胞”)，骨髓瘤细胞或MDCK细胞(“Madine-Darby犬肾细胞”)或杆状病毒感染的额Sf9昆虫细胞中以稳定表达(通过整合到基因组中)的形式来实现表达。因此，在更优选的实施方案中，哺乳动物细胞是COS细胞；BHK细胞；HEK293细胞；CHO细胞；骨髓瘤细胞；或MDCK细胞。
在优选的实施方案中，哺乳动物细胞是可电兴奋的细胞。进一步优选细胞是海马细胞，感光细胞，视网膜视杆细胞，视网膜视锥细胞，视网膜神经节细胞，双极神经元，神经节细胞，假单极神经元，多极神经元，锥体神经元，浦肯野细胞或颗粒细胞。
神经元是可电兴奋的细胞，其通过电和化学信号传导处理和传递信息，其中化学信号传导通过与其他细胞的专门连接的突触发生。存在许多特殊类型的神经元，例如响应触摸，声音，光和影响感觉器官细胞的许多其他刺激的感觉神经元，运动神经元(接收来自脑和脊髓的信号并引起肌肉收缩和影响腺体)，以及中间神经元(将神经元连接到脑或脊髓的同一区域内的其他神经元)。通常，神经元具有本体，树突和轴突。树突是从细胞体产生的细丝，通常延伸数百微米并且多次分枝。轴突是一种特殊的细胞细丝，它从细胞体的称为轴突小丘的部位处产生。神经元的细胞体经常产生多个树突，但从不会超过一个轴突，尽管轴突可能在其终止前分支数百次。在大多数突触中，信号从一个神经元的轴突发送到另一个神经元的树突。但是，这些规则有许多例外：缺乏树突的神经元，没有轴突的神经元，将轴突连接到另一个轴突或将树突连接到另一个树突的突触等。大多数神经元可进一步在解剖学上表征为单极或假单极(树突和轴突从同一突起中出现)，双极(在本体两端的轴突和单个树突)，多极(具有两个以上的树突并且可以进一步分类为(i)具有长突出轴突突起的高尔基体I神经元，例如锥体细胞，浦肯野细胞和前角细胞，和(ii)高尔基体II神经元，其轴突突起局部突出到例如颗粒细胞。
感光细胞是在视网膜中发现的能够光转导的特化神经元。两个经典的光感受器是视杆和视锥细胞，每个都提供视觉系统使用的信息。视网膜神经节细胞是一种位于眼睛视网膜内表面附近的神经元。这些细胞具有突出到保护区(protectum)(中脑)，下丘脑中的视交叉上核和外侧膝状体(丘脑)的树突和长轴突。一小部分对视力贡献很少或根本没有，但它们本身是光敏的。它们的轴突形成视网膜下丘脑束并有助于昼夜节律和瞳孔光反射，瞳孔的大小调整。他们通过以下两种中间神经元类型从光感受器接收视觉信息：双极细胞和无长突细胞。无长突细胞是视网膜中的中间神经元，负责视网膜神经节细胞输入的70％。双极细胞负责另外30％的视网膜神经节输入，受到无长突细胞的调节。作为视网膜的一部分，双极细胞存在于光感受器(视杆细胞和视锥细胞)和神经节细胞之间。它们直接或间接地将信号从光感受器传递到神经节细胞。
可以在合适的温度和气体混合物(通常，37℃，5％CO2)下(任选地在本领域技术人员已知的细胞培养箱中并且如针对某些细胞系或细胞类型所例示的)分离(和遗传修饰)，维持和培养细胞。每种细胞类型的培养条件可能不同，并且特定细胞类型的条件变化可导致不同的表型。除温度和气体混合物外，细胞培养系统中最常见的变化因素是生长培养基。生长培养基的配方可以在pH，葡萄糖浓度，生长因子和其他营养成分的存在等方面变化。生长培养基可商购获得，或可根据组合物制备，所述组合物可从美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection，ATCC)获得。用于补充培养基的生长因子通常来自动物血液，例如小牛血清。另外，可以将抗生素添加到生长培养基中。对培养细胞进行的常见操作包括培养基更换和传代细胞。
本公开进一步涉及突变型光诱导离子通道或根据本公开的细胞在高通量筛选中的用途。高通量筛选(HTS)是一种用于科学实验的方法，尤其用于药物发现并且与生物学和化学领域相关。HTS允许研究人员通过现代机器人，数据处理和控制软件，液体处理设备和敏感检测器的组合，在短时间内有效地进行数百万次生化，遗传或药理学测试。通过该过程，可以快速鉴定调节特定生物分子途径的活性剂；特别是修饰离子通道的物质，例如根据本发明的光诱导离子通道，Ca++-诱导钾通道或BK通道。例如，人们可能在宿主细胞中共同表达Ca++诱导钾通道和的光诱导离子通道。在光刺激下，光诱导通道将打开，细胞内Ca++浓度将增加，从而激活钾通道。因此，人们将获得膜电位的变化，其可通过潜在敏感染料例如RH421(N-(4-磺基丁基)-4-(4-(4-(二苯基氨基)苯基)丁二烯基)吡啶鎓，内盐)监测。因此，这种HTS可以包括以下步骤：(i)使表达Ca++诱导(钾)通道与根据本发明的光诱导离子通道的细胞与针对Ca++诱导通道的候选试剂接触，(ii)施加光刺激以诱导光诱导通道，(iii)确定膜电位的改变(混合信号)，和(iv)将步骤(iii)中确定的信号与在仅表达根据本发明的光诱导离子通道的经受步骤(ii)的细胞中确定的信号(单信号)进行比较。膜电位变化的减少将表明Ca++诱导(钾)通道的有希望的调节剂。这种方法应该产生大约5∶1的信噪比，与仅在表达Ca++诱导通道的细胞上进行的直接测量相比，这种方法得到了很大改善。由于改善的信噪比，所述方法(特别是通过使用光诱导离子通道)可特别适用于HTS。
实质上，HTS使用一种方法在相对较短的时间内收集有关大量物质对特定靶标的影响的大量实验数据。在这种情况下，筛选是大型的实验(具有单个目标(通常测试科学假设))，随后可以向其应用所有这些数据。对于根据本发明的HTS细胞，可以是组织板(例如多孔板，例如96孔板)中的种细胞。然后将板中的细胞与测试物质接触足够的时间以与靶向的离子通道相互作用。测试物质可能在整个板上从孔到孔不同。在孵育时间过去之后，通过手动或通过机器对所有板孔进行测量，并任选地与未与测试物质接触的细胞的测量值进行比较。当研究人员使用膜片钳时，可能需要手动测量，寻找尚未在自动化程序中实现的效果。在其他方面，专门的自动分析机器可以对孔进行许多实验(例如分析特定频率的光或高通量膜片钳测量)。在这种情况下，机器输出每个实验的例如作为数值网格的结果，其中每个数字映射到从单个孔获得的值。根据第一次测定的结果，研究人员可以通过以下在同一筛选内进行后续测定：使用与鉴定为活性物质(即修饰细胞内环核苷酸水平)相似的物质进入新的测定板，然后重新运行实验收集进一步的数据，优化化学试剂的结构，以改善试剂对细胞的作用。自动化是HTS有用性的重要要素。从创建到最终分析，专门的机器人通常负责单个分析板在整个生命周期内的大部分过程。HTS机器人通常可以同时准备和分析多个版，进一步加快数据收集过程。适用于根据本发明的HTS的装置的实例包括荧光成像板读数器(Fluorometric Imaging Plate Reader，FLIPRTM；Molecular Devices)，FLEXstationTM(Molecular Devices)，电压离子探针读数器(Voltage Ion Probe Reader，VIPR，AuroraBiosciences)，Vision(ATTO)。
因此，本发明公开的突变型光诱导离子通道特别可用作研究工具，例如用于可电兴奋细胞，特别是神经细胞的光刺激的非治疗用途。关于海马神经元培养和来自海马神经元的电生理学记录以及HEK293细胞的电生理记录的进一步指导可以在WO2012/032103中找到。
最后，存在许多疾病，其中例如天然视觉细胞不再起作用，但是所有神经连接都能够继续运行。今天，各种研究中心正在尝试在视网膜上植入具有人造陶瓷感光器的薄膜。这些感光器旨在使视网膜的次级的仍然完整的细胞去极化，从而触发神经冲动(仿生眼)。在这些神经节细胞，无长突细胞或双极细胞中有意表达根据本发明的突变型光控离子通道将是非常讲究的解决方案并且能够实现更大的三维视觉分辨率。因此，本公开还预期根据本公开的光诱导离子通道用于医药。
原理验证已经在下面的例子中得到证明，并且可以很容易地适应各自的目的。鉴于这些数据，预期本发明公开的光诱导离子通道可用于恢复聋人受试者的听觉活动，或盲人受试者的视力恢复。更具体地，如以下实施例中所证明的，本公开的突变型光诱导离子通道提供足够的时间保真度。它们的红移光谱有利于更深的光穿透和更少的组织散射以及更低的光毒性风险。因此，预期本发明公开的突变型光诱导离子通道将成为用于光遗传学听觉恢复和听觉研究的有价值的工具。
在另一个实施方案中，预期本发明公开的光诱导离子通道可用于传入反馈，以改善肢体(例如手臂或腿)的感觉-运动假体。传入反馈是指从身体周围神经发送到脑或脊髓的神经信号。进一步预期本发明公开的光诱导离子通道可用于治疗疼痛，特别是幻肢痛或慢性疼痛。
也如本公开的细胞所述，进一步描述了表达根据本发明的功能性光诱导离子通道的非人动物，例如，在可电兴奋细胞例如神经元中，特别是在螺旋神经节神经元中表达。同样，还考虑了包含根据本发明的细胞的非人动物。
非人动物可以是除人之外的任何动物。在优选的实施方案中，非人动物是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选啮齿动物，例如小鼠或大鼠，或灵长类动物。
特别地，一些模式生物是优选的，例如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)，Arbacia punctulata，Ciona intestinalis，果蝇(Drosophila)，通常是黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)，夏威夷短尾鱿鱼(Euprymna scolopes)，水螅(Hydra)，大西洋枪乌贼(Loligo pealei)，Pristionchus pacificus，紫海胆(Strongylocentrotuspurpuratus)，Symsagittifera roscoffensis和赤拟谷盗(Tribolium castaneum)。在脊椎动物中，这些是若干种啮齿类动物，例如豚鼠(Cavia porcellus)，仓鼠，小鼠(小家鼠(Musmusculus))和大鼠(褐家鼠(Rattus norvegicus))，以及其他物种例如鸡(家鸡(Gallusgallus domesticus))，猫(Felis cattus)，狗(家犬(Canis lupus familiaris))，七鳃鳗(Lamprey)，日本米鱼(青鳉(Oryzias latipes))，恒河猴(Rhesus macaque)，刚毛棉花鼠(Sigmodon hispidus)，斑胸草雀(Taeniopygia guttata)，河豚(Takifugu rubripres)，非洲爪蛙(Xenopus laevis)和斑马鱼(Danio rerio)。还优选的是非人类灵长类动物，即灵长目的所有非人动物物种，例如恒河猴，黑猩猩，狒狒，狨猴和绿猴。然而，这些实施例不旨在限制本发明的范围。
值得注意的是，以下动物被排除在外，这些动物不太可能对人或动物产生实质性的医疗利益，因此根据相应的专利法或管辖权不具有可专利性。此外，技术人员将采取适当的措施，例如在国际动物福利准则中规定的，以确保对人或动物的实质性医疗利益将超过任何动物的痛苦。
在下文中，通过附图和实施例说明本发明，这些附图和实施例不意图限制本发明的范围。
附图说明
图1：Chrimson和Chrimson Y261F的关闭动力学。显示了在停止照射后立即的Chrimson-YFP和Chrimson-YFP Y261F的典型光电流。将电流标准化以进行比较。
图2：Chrimson和Chrimson突变体的光电流。显示的是典型的光电流，它是响应于3ms光脉冲(波长594nm，饱和光强度为23mW/mm-2)进行测量的。如以下实施例所描述的，以全细胞模式通过膜片钳测量研究了异源表达以下的NG108-15细胞：Chrimson-YFP(——)，Chrimson-YFP K176R(——)，Chrimson-YFP S267M(——)，Chrimson-YFP Y268F(——)，Chrimson-YFP Y261F(——)，Chrimson-YFP S267M/Y268F(——)，Chrimson-YFP Y261F/S267M(——)，Chrimson-YFP K176R/S267M/Y268F(——)，Chrimson-YFP Y261F/S267M/Y268F(——)，Chrimson-YFP K176R/Y261F/S267M(——)或Chrimson-YFP K176R/Y261F/S267M/Y268F(——)。将电流标准化以进行比较。
图3：Chrimson和Chrimson突变体的作用光谱。示出了响应于指示波长的ns光脉冲的标准峰值电流。如以下实施例所进一步描述的，以全细胞模式通过膜片钳测量研究了异源表达以下的NG108-15细胞：Chrimson-YFP(n＝6)，Chrimson-YFP S267M/Y268F(n＝3)，Chrimson-YFP S267M(n＝3)，Chrimson-YFP Y261F(n＝4)，Chrimson-YFP Y268F(n＝5)，Chrimson-YFP K176R/Y261F/S267M(n＝4)或Chrimson-YFP Y261F/S267M(n＝4)。
图4：在不同的光脉冲频率下尖峰迹线。如以下实施例所进一步描述的，以全细胞模式通过膜片钳实验研究了异源表达A)Chrimson-YFP，B)Chrimson-YFP K176R/Y261F/S267M和C)Chrimson-YFP Y261F/S267M的大鼠海马神经元。
图5：用AAV2/6-hSyn-Chrimson-YFP Y261F/S267M对SGNs的出生后转导是高效的并且对注射的耳朵大多特异。A：共聚焦图像显示为螺旋神经节的三个不同区域中YFP和钙视网膜蛋白免疫荧光的最大强度投影(Z-步长：1μm)。比例尺：50μm。B：以与钙视网膜蛋白的比率计算的SGN中YFP表达的定量+SGN(左图)和显示为细胞/104μm2的SGN生存力(右图)。符号标记来自个体动物的结果。灰色和黑色条代表左侧(注射)和右侧(对照)耳蜗的平均值。在两个定量中，在同一组(注射或对照)内未发现统计学显著性差异，在细胞生存力定量中对于相同耳蜗区域的组之间均也未发现统计学显著性差异(t检验，p＞0.05)。
图6：Chrimson-YFP Y261F/S267M能够以每秒数百个的生理速率对信息进行光遗传编码。A：使用594nm光刺激以最大强度(11mW，10Hz下1ms)，用AAV6-Chrimson-YFP Y261F/S267M注射的4只小鼠的oABR迹线(0-2.5ms)。B：以增加的激光强度(1ms，10Hz)记录的用AAV6-Chrimson-YFP Y261F/S267M注射的示例性小鼠的oABR迹线(0-8ms)。符号在oABR迹线(A，B)上标记P1和N1(响应定量的标志)，并帮助鉴定来自通过A-F的同一只小鼠的数据点。C：随着激光强度的增加(10Hz下1ms)，P1-N1幅度增加(针对最大幅度标准化)。组平均值以黑色显示。D：随着光脉冲持续时间的增加(对于标记为实心圆的动物，10Hz下5.5mW，其余为20Hz下11mW)，P1-N1振幅增加(针对最大幅度标准化)。组平均值以黑色显示。E：随着激光强度的增加(10Hz下1ms)，P1潜伏期减少。组平均值以黑色显示。F：随着刺激频率的增加(对于标记为方块和空心圆的动物，5.5mW，1ms，其余为6.6mW，1ms)，P1-N1振幅减小(针对最大幅度标准化)。组平均值以黑色显示。C-F中的阴影区域表示+/-标准偏差。
序列描述
SEQ ID NO：1(Chrimson；登录号KF992060；螺旋6以粗体突出显示)
SEQ ID NO：2(CsChrimson；登录号KJ995863；螺旋6以粗体突出显示)
SEO ID NO：3(螺旋6共有基序)
Cys-Arg-Met-Val-Val-Lys-Leu-Met-Ala-Tyr-Ala-Xaa12-Phe-Ala-Ser-Trp-Gly-Xaa18-Xaa19-Pro-Ile-Leu-Trp-Ala-Val，
其中Xaa12是Phe或Tyr，优选其中Xaa12是Phe；
其中Xaa18是Met或Ser，优选其中Xaa18是Met；和
其中Xaa19是Phe或Tyr，优选其中Xaa19是Phe。
SEQ ID NO：4(视黄醛结合位点共有基序)
Xaa1-Asp-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Lys-Xaa7-Xaa8-Xaa9
其中Xaa1是Leu，Ile，Ala或Cys；
其中Xaa3，Xaa4，Xaa5，Xaa7和Xaa8独立地是任何氨基酸；
其中Xaa9是Thr，Phe或Tyr。
SEQ ID NO：5(通道视紫红质2；ChR2；315aa；螺旋6以粗体突出显示)
SEQ ID NO：6(VChR1；登录号EU622855；300aa；螺旋6以粗体突出显示)
SEQ ID NO：7(ReaChR；登录号KF448069；352aa；螺旋6以粗体突出显示)
SEQ ID NO：8(ChR2；螺旋6交换突变体)
SEQ ID NO：9(VChR1螺旋6交换突变体)
SEQ ID NO：10(ReaChR；螺旋6交换突变体)
实施例
发明人的目的是鉴定Chrimson的第六跨膜结构域内的残基，其突变能够加速关闭动力学。
实施例1-在NG108-15细胞中的Chrimson突变体的光电流
以全细胞模式通过膜片钳测量在-60mV的钳夹电位研究了瞬时表达Chrimson-YFP和Chrimson-YFP突变体的NGl08-15细胞。浴溶液含有140mM NaCl，2mM CaCl2，2mM MgCl2，10mM HEPES，pH 7.4，移液管溶液含有110mM NaCl，2mM MgCl2，10mM EGTA，10mM HEPES，pH7.4。响应于3ms光脉冲(强度23mW/mm2，波长594nm)测量光电流。τ关闭值是由照明停止后的电流与单指数函数的拟合确定的。电流密度(J-60mV)是通过将响应于500ms光脉冲(强度23mW/mm2，波长594nm)的稳定电流除以细胞电容来确定的。
结果显示在图1和2中，并总结在下表1中。
Chrimson变体 τ<sub>关闭</sub>[ms] J<sub>-60mV</sub>[pA/pF]
Wt 24.6±0.9 24.0±6.8
K176R 12.2±0.8 10.1±6.9
S267M 12.1±1.5 22.6±13.3
Y268F 11.3±10 3.5±1.6
Y261F 9.7±1.5 33.3±8.6
S267M/Y268F 6.3±1.0 10.8±5.9
Y261F/S267M 5.7±0.5 34.2±12.7
K176R/S267M/Y268F 4.9±0.5 4.7±2.7
Y261F/S267M/Y268F 3.5±0.5 6.0±4.7
K176R/Y261F/S267M 2.7±0.3 8.3±5.3
K176R/Y261F/S267M/Y268F 2.8±0.3 2.6±0.9
表1：在NG108-15细胞中异源表达的Chrimson和Chrimson突变体的关闭动力学(τ关闭)和电流密度(J-60mV)。显示的是平均τ关闭值(n＝3-7)，平均电流密度(n＝7-11)和相应的标准偏差。
从上述数据可以看出，对应于位置267，268和261的位置的突变能够加速Chrimson的关闭动力学(τ关闭)。这些突变的组合导致了Chrimson的关闭动力学(τ关闭)的进一步加速。突变可以有利地彼此组合或与已知的K176R突变组合。
实施例2-Chrimson突变体在NG108-15细胞中的作用光谱
以全细胞模式通过膜片钳测量在-60mV的钳夹电位研究了Chrimson和Chrimson突变体的作用光谱。浴溶液含有140mM NaCl，2mM CaCl2，2mM MgCl2，10mM HEPES，pH 7.4，移液管溶液含有110mM NaCl，2mM MgCl2，10mM EGTA，10mM HEPES，pH 7.4。使用Opolette 355可调谐激光系统(OPTOPRIM)生成脉冲长度为7ns的光脉冲。对于作用光谱的记录，将不同波长的脉冲能量设定为对应于Chrimson wt的1018光子/m2和Chrimson突变体的1019光子/m2的相等光子计数的值。
结果如图3所示。Y268F突变产生了作用光谱的蓝移(γ最大＝580nm)。值得注意的是，与野生型Chrimson的作用光谱(γ最大＝590nm)相比，未携带Y268F突变的测试Chrimson突变体的作用光谱没有显著转移。
实施例3-Chrimson突变体在大鼠海马神经元中显示出增加的尖峰频率
为了测试Chrimson突变体对神经元应用的适合性，构建体在培养的大鼠海马神经元中表达。
海马神经元培养。从出生后的P1 Sprague-Dawley大鼠()分离出海马，并用木瓜蛋白酶(20U ml-1)在37℃下处理20分钟。用补充有10％胎牛血清的DMEM(Invitrogen/Gibco，高葡萄糖)洗涤海马，并在少量该溶液中研磨。将约75,000个细胞接种在24孔板中的聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白涂覆的玻璃盖玻片上。3小时后，用培养基(含有2％B-27补充剂，2mMGlutamaxI的Neurobasal A)替换平板培养基。
以全细胞模式通过膜片钳实验在-70mV的钳夹电位研究了异源表达Chrimson-YFP，Chrimson-YFP Y261F/S267M和Chrimson-YFP K176R/Y261F/S267M的大鼠海马神经元。野生型Chrimson或相应的Chrimson突变体的异源表达通过在测量前14至21天用腺相关病毒转导完成。
简言之，在接种后4-9天，向每个孔中加入1×109基因组拷贝/ml(GC/ml)病毒。转导后5天表达变得可见。在培养物的寿命期间(约5周)未观察到神经毒性。对于本文所述的任何实验，没有将全反式视黄醛添加到培养基或记录培养基中。
腺相关病毒(AAV2/1)。rAAV2/1病毒由Botond Roska博士(FMI，Basel)实验室使用含有Chrimson-YFP野生型或Chrimson-YFP突变体的具有人突触蛋白启动子(16)的pAAV2载体制备。病毒滴度名义上是1×1012-1×1013GC/ml
来自海马神经元的电生理记录。对于培养的海马神经元中的全细胞记录，将电阻为3-8Mω的钳移液管填充129mM葡萄糖酸钾，10mM HEPES，10mM Kcl，4mM MgATP和0.3mMNa3GTP，滴定至pH 7.2。使用Tyrodes溶液作为细胞外溶液(125mM NaCl，2mM Kcl，2mMCaCl2，1mM MgCl2，30mM葡萄糖和25mM HEPES，滴定至pH7.4)。记录在兴奋性突触传递阻断剂1，2，3，4-四氢-6-硝基-2，3-二氧代-苯并[f]喹喔啉-7-磺酰胺(NBQX，10μM，Sigma)和D(-)-2-氨基-5-膦酰戊酸(AP-5，50μM，Sigma)存在下进行。为了测定τ关闭和J-70mV，还在1μM TTX存在下进行测量。
使用Axopatch 200B放大器(Axon Instruments，Union City，CA)扩大电生理信号，在10kHz过滤，用Axon Digidata 1322A(50Hz)数字化，并使用pClamp9软件(AxonInstruments)获取和分析。
动作电位由指定频率的40个光脉冲触发。光脉冲的脉冲宽度为3ms，波长λ＝594nm，饱和强度11-30mW/mm2。
τ关闭值是由照明停止后的电流与单指数函数的拟合确定的。电流密度(J-70mV)是通过将响应于500ms光脉冲(饱和强度20-40mW/mm2波长594nm)的稳定电流除以细胞电容来确定的。为了确定以100％概率(J100)诱发动作电位所需的最低光强度，应用不同光强度的40个脉冲(λ＝594nm，脉冲宽度＝3ms，v＝10Hz)。通过将光触发尖峰的数量除以光脉冲的总数来计算尖峰概率。
结果如图4所示。虽然表达野生型Chrimson的大鼠海马神经元不能在10Hz以上的频率下以100％的概率诱导动作电位(参见图4A)，但是Chrimson突变体Y261F/S267M(未显示)和K176R/Y261F/S267M(参见图4B)能够在20Hz和40Hz下适当地诱导动作电位。此外，Chrimson突变体K176R/Y261F/S267M(未显示)和Y261F/S267M(参见图4C)甚至能够在高达80-100Hz的频率下适当地诱导动作电位。这些测量清楚地证明本公开的快速Chrimson突变体能够实现快速神经光刺激。
与野生型Chrimson相比，在大鼠海马神经元中异源表达的Chrimson突变体K176R/Y261F/S267M和Chrimson突变体Y261F/S267M的测量特征显示在下表2中。
表2：关闭动力学(τ关闭)，电流密度(J-70mV)和以100％概率(J100)诱导动作电位所需的最低光强度。显示的是平均τ关闭(n＝3-11)，平均J-70mV(n＝10-14)，平均J100(n＝7)和相应的标准偏差。
如表2所示，与野生型相比，Chrimson突变体K176R/Y261F/S267M和Chrimson突变体Y261F/S267M的关闭动力学(τ关闭)显著加速。因此，与野生型Chrimson相比，ChrimsonY261F/S267M和Chrimson K176R/Y261F/S267M的电流密度(J-70mV)仅略微降低。大鼠海马神经元中的强烈表达使得能够在低光强度下进行神经光刺激。这些数据证实了在NG108-15细胞中观察到的更快的动力学(表1)并解释了在高频下精确诱导动作电位的能力，如本文图4所示。
实施例4-听觉途径的光遗传学刺激
听觉神经的光遗传学刺激有望在通过诸如人工耳蜗和听觉脑干植入物之类的听觉假体进行声音编码方面具有较大优势。由于光可以方便地聚焦，因此光学听觉假体可以大大提高编码的频率分辨率。目前可用的光遗传学工具的一个局限性是相对于听觉信号处理速度的慢动力学。在此，应用先前在Hernandez等.J Clin Invest.2014；124(3)：1114-29中描述的系统，使用出生后AAV介导的小鼠SGN转导测试了快速门控Chrimson-YFP Y261F/S267M用于耳蜗光遗传学的潜力。通过p3小鼠中的圆窗将AAV2/6-hSyn-Chrimson-YFPY261F/S267M注射到鼓阶中，并在注射后4-8周分析表达和功能。注射的小鼠在群体中没有显示任何明显的表型。使用注射和未注射的耳朵的冷冻切片免疫组织化学和YFP共焦成像和钙视网膜蛋白免疫荧光分析Chrimson-YFP Y261F/S267M表达和SGN密度(图5A，5B)。每只注射的耳朵显示Chrimson-YFP Y261F/S267M，在注射的耳中在所有耳蜗转弯中，接近90％的SGN被转导(相比之下未注射的耳朵中小于5％)并且SGN密度美国有显著改变(图1B)。转导率远远高于我们之前使用AAV2/6-hSyn-CatCh-YFP的经子宫注射(Hernandez等人，2014)进行的研究所达到的转导率，并且与此不同，独立于频率排布位置。进行后鼓室切开术，并通过圆窗插入50μm光纤，以将595nm连续波激光的光投射到基底转弯的SGN上。我们可以很容易地引出光学听觉脑干响应(oABR，图6A)，其振幅和波形与声学ABR(aABR)相似。随着光强度的增加，oABR振幅增加，oABR潜伏期缩短(图6B，6E)。刺激低至0.5mW(图6C，刺激持续时间：1ms，刺激频率：10s-1)并且短至80μs(图6D，刺激强度：11mW，刺激频率：10s-1)足以驱动oABR。oABR的振幅和波形在不同动物之间变化(图6A)，但通常随着超过一个数量级的光强度变化而变化(图6C，输出动态范围＞20dB)。当减少刺激持续时间(图6D)或提高刺激频率时，oABR振幅减小，但发现高达200Hz的oABR(图6F)。值得注意的是，oABR反映在5-7毫秒内延伸的群体响应，因此假设响应可能已被后续刺激之间的相互作用减弱。结论是Chrimson-YFP Y261F/S267M介导的耳蜗光遗传学可以在175Hz或更高驱动SGN，这在生理声音驱动的SGN激发频率率范围内(Liberman，M.C.，J.Acoust.Soc.Am.63，442-455(1978)；Winter，等.，Hear.Res.45，191-202(1990))。总之，已经有效地建立了SGN的出生后转导，并且在低光强度和短暂刺激下实现了SGN激发。预计Chrimson-YFP Y261F/S267M(可提供足够的时间保真度，并且在更深入的光线穿透，减少组织中的散射，并降低光毒性风险方面优于蓝色通道视紫红质)将成为光遗传学听觉恢复和听觉研究的宝贵工具。
例如由Hernandez等描述将本文公开的螺旋6基序或任何其他突变引入如所述的构建体中代表常规实践。或者，可以通过本公开的光诱导离子通道的编码序列简单地替换结构中的通道视紫红质的编码序列。
实施例5-用于恢复视力的光遗传学方法
Macé等.Mol Ther.2015；23(1)：7-16是由发明人中一些撰写的早期出版物，其描述了由腺相关病毒(AAV)基因疗法介导的视网膜神经元的光遗传学再激活。大多数遗传性视网膜营养不良显示出进行性感光细胞变性，导致严重的视力损害。腺相关病毒(AAV)基因疗法介导的视网膜神经元的光遗传学再激活具有恢复视力的潜力，无论患者特异性突变如何。临床可译性的挑战是尽可能恢复视力接近自然视力，同时针对脆弱的变性视网膜使用手术安全的递送途径。为了保持内部视网膜的视觉处理，靶向ON双极细胞，其于疾病的晚期阶段仍然存在。对于安全的基因递送，使用最近工程化的AAV变体，其可以在注射到眼睛的容易接近的玻璃体液中之后转导双极细胞。结果表明，在ON双极细胞特异性启动子下的编码通道视紫红质的AAV介导玻璃体内施用后限于ON-双极细胞的长期基因递送。ON双极细胞中的通道视紫红质表达导致视网膜和皮质水平的ON和OFF响应的恢复。此外，在治疗的盲小鼠中光诱导的运动行为恢复。
例如由Macé等描述将本文鉴定的螺旋6基序引入构建体中代表常规实践。或者，可以通过本公开的光诱导离子通道的编码序列简单地替换结构中的通道视紫红质的编码序列。本发明的新的光诱导离子通道插入用于激活ON双极细胞的盒以及用于视网膜中的神经节细胞的盒中。
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Claims (16)

1.突变型光诱导离子通道，其中所述突变型光诱导离子通道包含与SEQ ID NO：1(Chrimson)的全长序列具有至少90％相似性和/或至少72％同一性的氨基酸序列，和其中所述突变型光诱导离子通道与其亲本光诱导离子通道的不同之处仅在于选自SEQ ID NO：1中对应于Y261，Y268和S267的位置的一个或多个位置处的置换，
当在钳位电位-60mV，浴溶液为140mM NaCl、2mM CaCl2、2MgCl2、10mM HEPES、pH 7.4，和移液管溶液为110mM NaCl、2mM MgCl2、10mM EGTA、10mM HEPES，pH 7.4下以全细胞模式通过膜片钳测量比较时，与所述亲本通道相比，所述一个或多个置换加速所述突变型通道的关闭动力学。
2.权利要求1所述的突变型光诱导离子通道，其中所述突变型光诱导离子通道与SEQID NO：1(Chrimson)的全长具有至少91％，优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的相似性；和/或
其中突变型光诱导离子通道与SEQ ID NO：1(Chrimson)的全长具有至少74％，优选至少75％，更优选至少76％，更优选至少78％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％的同一性。
3.前述权利要求中任一项所述的突变型光诱导离子通道，其中所述突变型光诱导离子通道包含
在位置Y261处的置换，优选其中所述置换是Y261F；或
在位置Y268处的置换，优选其中所述置换是Y268F；或
在位置S267处的置换，优选其中所述置换是S267M；
特别是其中所述突变型光诱导离子通道在对应于SEQ ID NO：1的位置176的位置处进一步包含Arg。
4.前述权利要求中任一项所述的突变型光诱导离子通道，其中所述突变型光诱导离子通道包含在位置Y261和在位置S267处的置换，优选其中在位置Y261处的置换是Y261F，以及优选其中在位置S267处的置换为S267M；或
其中所述突变型光诱导离子通道包含位置Y268和位置S267处的置换，优选其中位置Y268处的置换是Y268F，以及优选其中位置S267处的置换是S267M。
5.权利要求4所述的突变型光诱导离子通道，其中所述突变型光诱导离子通道包含位置Y261，位置Y268和位置S267处的置换，优选其中位置Y261处的置换是Y261F，优选其中位置Y268处的置换是Y268F，以及优选其中位置S267处的置换是S267M。
6.权利要求4-5中任一项所述的突变型光诱导离子通道，其在对应于SEQ ID NO：1的位置176的位置处进一步包含Arg。
7.前述权利要求中任一项所述的突变型光诱导离子通道，其中所述突变型通道包含SEQ ID NO：3的基序：
Cys-Arg-Met-Val-Val-Lys-Leu-Met-Ala-Tyr-Ala-Xaa12-Phe-Ala-Ser-Trp-Gly-Xaa18-Xaa19-Pro-Ile-Leu-Trp-Ala-Val，
其中Xaa12是Phe或Tyr，优选其中Xaa12是Phe；
其中Xaa18是Met或Ser，优选其中Xaa18是Met；和
其中Xaa19是Phe或Tyr，优选其中Xaa19是Phe。
8.前述权利要求中任一项所述的突变型光诱导离子通道，其中所述突变型光诱导离子通道包含SEQ ID NO：1(Chrimson)的氨基酸序列，优选由其组成，以下除外：位置Y261，Y268和S267处的所述一个或多个置换，以及任选地对应于SEQ ID NO：1的位置176的位置处的Arg。
9.前述权利要求中任一项所述的突变型光诱导离子通道，其中所述突变型光诱导离子通道是吸收红光的通道视紫红质。
10.核酸构建体，其包含编码权利要求1-9中任一项的突变型光诱导离子通道的核苷酸序列。
11.表达载体，其包含编码权利要求1-9中任一项的光诱导离子通道的核苷酸序列或权利要求9的核酸构建体。
12.细胞，其包含权利要求10的核酸构建体或权利要求11的表达载体；
特别地，其中所述细胞是哺乳动物细胞，优选其中所述细胞是
(a)海马细胞，感光细胞，视网膜视杆细胞，视网膜视锥细胞，视网膜神经节细胞，双极神经元，神经节细胞，假单极神经元，多极神经元，锥体神经元，浦肯野细胞或颗粒细胞；或
(b)神经母细胞瘤细胞，特别是NG108-15细胞，HEK293细胞；COS细胞；BHK细胞；CHO细胞；骨髓瘤细胞；或MDCK细胞。
13.权利要求1-9所述的光诱导离子通道或权利要求12所述的细胞在高通量筛选中的用途。
14.权利要求1-9所述的光诱导离子通道用于神经元细胞的光刺激的非治疗性用途。
15.权利要求1-8所述的光诱导离子通道，其用于医药中。
16.非人动物，其包含权利要求1-9的光诱导离子通道，权利要求10的核酸构建体，权利要求11的表达载体，或权利要求12的细胞。
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