KR102471929B1 - 크림슨의 돌연변이 광-유도성 이온 채널 - Google Patents

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막스-플랑크-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 비쎈샤프텐 에.파우.
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Abstract

본 발명은 친 광-유도성 이온 채널과 비교하여 개선된 특성을 갖는 돌연변이 광-유도성 이온 채널, 이를 코딩하는 핵산 구조물, 핵산 구조물을 갖는 발현 벡터, 상기 핵산 구조물 또는 발현 벡터를 포함하는 세포, 및 이들 각각의 용도뿐 아니라, 본원에 개시된 돌연변이 광-유도성 이온 채널, 핵산 구조물 또는 발현 벡터를 포함하는 비인간 동물에 관한 것이다.

Description

크림슨의 돌연변이 광-유도성 이온 채널
본 발명은 청구항에 더 상세히 정의되어 있는, 친 (parent) 광-유도성 이온 채널과 비교하여 개선된 특성을 갖는 돌연변이 광-유도성 이온 채널, 이를 코딩하는 핵산 구조물, 핵산 구조물을 갖는 발현 벡터, 상기 핵산 구조물 또는 발현 벡터를 포함하는 세포, 및 이들의 용도에 관한 것이다.
광 개폐 내향 정류성 양이온 채널인 채널로돕신-1 (ChR1) 및 채널로돕신 2 (ChR2)는 시험관 내 및 생체 내 둘 다에서 뉴런의 표적화된 광 활성화에 바람직한 도구가 되었다1 -5. 야생형 (WT) ChR2가 광 유도성 탈분극에 사용될 수 있지만, 잠재적인 미래의 임상적 응용을 위해 더 빠른 키네틱스 및 증가된 광 민감성을 갖는 ChR2 돌연변이체에 대한 연구가 계속 진행되고 있다 (WO 03/084994 및 6-8).
2002년과 2003년의 최초 기술 이후 적색광 흡수 채널로돕신을 포함한 ChR2의 다양한 변이체 세트가 기술되었다. 상이한 목적을 위해 ChR은 키네틱스, 이온 선택성 및 광 흡수에 대해 변형되었다. 예로서는 Chlamydomonas 크림슨으로부터의 적색광 흡수 채널로돕신 (WO 2013/071231 및 9, 수탁 번호 KF992060), 크림슨 변이체 ChrimsonR (K176R) 및 CsChrimson (Chlamydomonas 크림슨으로부터의 아미노산 서열 및 Chloromonas 채널로돕신 CsChR로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 폴리펩티드)을 들 수 있다. 또한 US 2016/0039902의 서열 번호 1, 2 및 5 및 수탁 번호 KJ995863 참조. 적색광이 동물 조직에 침투하는 깊이가 더 낮은 파장의 광 침투 깊이보다 깊기 때문에, 적색광 활성화 채널로돕신이 유익하다 (3,8). 또한 적색광 활성화 채널로돕신의 사용은 광 독성의 위험을 감소시킨다.
광 민감성은 채널의 개방 시간을 통해 조절되기 때문에 키네틱스는 중요한 문제이다. 이것은 단일 채널 전도도, 개방 확률, 양자 효율과 같은 다른 채널 매개 변수의 불변량 때문이다. 즉, 긴 개방 시간을 갖는 채널은 낮은 광 강도에서 최대 활성에 도달하는 반면 짧은 생 채널은 광 포화에 대한 포화에 도달하기 위해 더 많은 광을 필요로 한다. '고속' 채널은 활성화를 위해 더 많은 광을 필요로 하지만, 다른 뉴런 세포의 고주파 발사 속도 때문에 신경생물학의 많은 응용 분야에서 고속은 반드시 필요하다. 이는 예를 들어, 최대 1000 Hz의 발사 속도에 도달하는 뇌 내 중간 뉴런에 대한 청각 시스템의 신경절 세포에서 그러하다. 따라서, 견고한 발현과 보다 빠른 키네틱스가 조합된 돌연변이 광-유도성 이온 채널에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
발명의 요약
본 발명자들은 7개의 막통과 나선 모티프의 나선 6에서의 변형에 의해 크림슨에 대한 체계적인 연구를 수행하였다. 광 활성화 동안 나선 6의 이동은 미생물 형 로돕신에서 공통적인 특징이다 (15, 17). 따라서, 채널의 폐쇄 시간을 변형시키기 위해 나선 6을 변형시켰다. 크림슨의 나선 6에서 261, 267 및 268 위치의 돌연변이가 채널의 폐쇄 시간 (오프-키네틱스 (off-kinetics))을 가속화하고 돌연변이의 조합이 오프-키네틱스를 더욱 가속화시킨다는 것이 입증될 수도 있다.
본 발명은 나선 6의 특정 점 돌연변이에 의한 속도에 관해서 크림슨을 변형시키기 위한 일반적인 방법을 기술한다. 이들 새로운 변이체의 사용은 800-1000Hz의 한계까지로 뉴런의 광 자극을 제공할 것이다.
증가된 속도에 대한 실험적 검증은 마우스 뇌 유래 NG108-15 세포 (신경모세포종 세포), HEK293 세포 및 해마 세포에서 시험하였다.
따라서, 서열 번호 1 (크림슨)의 전장 서열과 적어도 90% 유사성/상동성 및/또는 적어도 72% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 친 광-유도성 이온 채널과는 단지 서열 번호 1에서 Y261, Y268 및 S267에 상응하는 위치로부터 선택된 하나 이상의 위치(들)에서의 치환만이 상이하며, 이러한 치환(들)은 -60 mV의 클램프 전위 (clamp potential), 140 mM NaCl, 2mM CaCl2, 2 MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.4의 배쓰 용액, 및 110 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7.4의 피펫 용액에서 전세포 구성에서의 패치-클램프 측정에 의해 비교될 때, 친 채널에 비해 돌연변이 채널의 오프-키네틱스를 가속화시키는 돌연변이 광-유도성 이온 채널이 개시된다.
본원에 개시된 바와 같은 광-유도성 이온 채널을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구조물이 추가로 제공된다.
또한, 본원에 개시된 바와 같은 광-유도성 이온 채널 또는 핵산 구조물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터가 제공된다.
또한, 본원에 개시된 핵산 구조물 또는 발현 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 고속 대량 처리 스크리닝에서 및/또는 뉴런 자극을 위한, 본원에 개시된 광-유도성 이온 채널의 용도를 제공한다. 의약에서 돌연변이 광-유도성 이온 채널의 사용도 고려된다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명은 서열 번호 1 (크림슨)의 전장 서열과 적어도 90% 유사성/상동성 및/또는 적어도 72% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 그의 친 광-유도성 이온 채널과는 단지 서열 번호 1에서 Y261, Y268 및 S267에 상응하는 위치로부터 선택된 하나 이상의 위치(들)에서의 치환만이 상이하며, 이러한 치환(들)은 -60 mV의 클램프 전위, 140 mM NaCl, 2mM CaCl2, 2 MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.4의 배쓰 용액, 및 110 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7.4의 피펫 용액에서 전세포 구성에서의 패치-클램프 측정에 의해 비교될 때, 친 채널에 비해 돌연변이 채널의 오프-키네틱스를 가속화시키는 돌연변이 광-유도성 이온 채널에 관한 것이다. 돌연변이 및 친 채널의 오프-키네틱스는 각각 돌연변이 또는 친 채널을 이종적으로 발현하는 래트의 해마 세포 (하기 실시예 3 참조) 또는 NG108-15 신경모세포종 세포 (하기 실시예 1 참조)에서 측정할 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이 채널의 오프-키네틱스는 NG108-15 세포에서 측정된다. 성공적인 단백질 발현은 예를 들어 EGFP- 또는 YFP-매개 형광에 의해 입증될 수 있다. 일반적으로, 광전류는 23 mW/㎟의 강도와 594 nm의 파장을 갖는 3 ms 광 펄스 반응으로 측정된다. Toff 값은 단일 지수 함수에 대한 조명 중단 후 전류 적합도에 의해 결정되며, 자세한 내용은 이후 실시예에서 설명된다.
바람직한 구체예에서, 돌연변이 광-유도성 이온 채널은 위치 Y261에서의 치환을 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 치환은 Y261F이다.
대안적으로, 또는 위치 Y261에서의 치환에 추가하여, 돌연변이 광-유도성 이온 채널은 위치 Y268에서의 치환을 포함한다. 보다 바람직하게, 치환은 Y268F이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 돌연변이 광-유도성 이온 채널은 위치 S267에서 치환을 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 치환은 S267M이다. 보다 더 바람직하게는, 상기 치환은 위치 Y261, 위치 Y268 또는 위치 Y261 및 Y268 둘 다에서의 치환과 조합된다.
따라서, 바람직한 구체예에서, 돌연변이 광-유도성 이온 채널은 위치 Y261 및 위치 S267에서의 치환을 포함하며, 바람직하게는 위치 Y261에서의 치환은 Y261F이고, 바람직하게는 위치 S267에서의 치환은 S267M이다. 다른 바람직한 구체예에서, 돌연변이 광-유도성 이온 채널은 위치 Y268 및 위치 S267에서의 치환을 포함하며, 바람직하게는 위치 Y268에서의 치환은 Y268F이고, 바람직하게는 위치 S267에서의 치환은 S267M이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 돌연변이 광-유도성 이온 채널은 위치 Y261, 위치 Y268 및 위치 S267에서의 치환을 포함하며, 바람직하게는 위치 Y261에서의 치환은 Y261F이고, 바람직하게는 위치 Y268에서의 치환은 Y268F이고, 위치 S267에서의 치환은 S267M이다.
친 광-유도성 이온 채널은 요구되는 백분율 서열 동일성 및/또는 서열 상동성/유사성 내에 있는 한 어떤 크림슨 유사 채널이 될 수도 있다. 바람직한 일 구체예에서, 친 광-유도성 이온 채널은 이미 서열 번호 1의 위치 176에 상응하는 위치에 Arg를 포함한다. 상기 변이체는 ChrimsonR (K176R)로서 이미 공지되었다.
바람직하게는, 돌연변이 광-유도성 이온 채널은 서열 번호 1 (크림슨)의 전장과 적어도 91%, 바람직하게는 적어도 92%, 보다 바람직하게는 적어도 93%, 보다 바람직하게는 적어도 94%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96%, 바람직하게는 적어도 97%, 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%의 유사성/상동성을 가진다.
추가적으로 또는 대안적으로, 돌연변이 광-유도성 이온 채널은 서열 번호 1 (크림슨)의 전장과 적어도 74%, 바람직하게는 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 76%, 보다 바람직하게는 적어도 78%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 91%, 보다 바람직하게는 적어도 92%, 보다 바람직하게는 적어도 93%, 보다 바람직하게는 적어도 94%, 보다 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 96%, 보다 바람직하게는 적어도 97%, 보다 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%의 동일성을 가진다.
서열 번호 1의 전장과 적어도 70%의 유사성/상동성 또는 적어도 70%의 동일성을 가지는 광-유도성 이온 채널의 예는 ChrimsonR 변이체 K176R, 또는 키메라 CsChrimson (서열 번호 2, 수탁 번호 KJ995863), 및 그의 임의의 다른 이종상동체 또는 대립 변이체를 포함한다. 크림슨과 CsChrimson은 크림슨의 전장 (서열 번호 1)에 대해 74%의 동일성 및 76.4%의 상동성/유사성을 공유한다.
바람직하게는, 돌연변이 광-유도성 이온 채널은 적색 광 흡수 채널로돕신이다.
나선 6이 서열 번호 3의 나선-6 모티프로 대체된 광-유도성 이온 채널의 스왑 돌연변이체, 예를 들어 나선 6이 각각 Y268F, Y261F 및 S267M 치환을 포함하는 크림슨의 나선 6에 의해 대체된 (참조: 서열 번호 8, 9 및 10) ChR-2 (서열 번호 5), VChR1 (서열 번호 6), 또는 ReaChR (서열 번호 7)도 고려된다.
이러한 스왑 돌연변이체는 전형적으로 서열 번호 1 (크림슨)의 전장과 적어도 56%의 상동성/유사성, 바람직하게는 서열 번호 1 (크림슨)의 전장과 적어도 58%, 보다 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 62% 및 보다 더 바람직하게는 적어도 64%의 상동성/유사성을 갖는다.
추가적으로 또는 대안적으로, 이러한 스왑 돌연변이체는 전형적으로 서열 번호 1 (크림슨)의 전장과 적어도 42%, 바람직하게는 적어도 44%, 보다 바람직하게는 적어도 46%, 보다 바람직하게는 적어도 48%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 52%, 보다 바람직하게는 적어도 54%, 보다 바람직하게는 적어도 56%의 동일성을 가진다.
일반적으로, 정렬된 서열에 대한 것 간 서열 동일성이 상기 다른 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 1의 전장에 걸쳐 적어도 x%인 경우, 아미노산 서열은 다른 아미노산 서열, 예를 들어 상기 서열 번호 1과 "적어도 x%의 동일성"을 가진다. 유사하게, 정렬된 서열에 대한 것 간 서열 유사성/상동성이 상기 다른 아미노산 서열, 예를 들어 서열 번호 1의 전장에 걸쳐 적어도 x%인 경우, 아미노산 서열은 다른 아미노산 서열, 예를 들어 상기 서열 번호 1과 "적어도 x%의 유사성/상동성"을 가진다.
이러한 정렬은 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 상동성 프로그램, 예를 들어, http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/의 EMBL 홈페이지에서 제공되는 "EMBOSS" 프로그램을 사용하고 그곳에 제공된 기본 설정을 사용하여 수행될 수 있다. 일련의 아미노산 서열 세트의 서열 동일성 또는 서열 유사성/서열 상동성 백분율을 계산하는 추가의 방법은 당 업계에 공지되어 있다.
그러나, 특히 바람직한 구체예에서, 돌연변이 광-유도성 이온 채널은 위치 Y261, Y268 및 S267에서의 상기 치환(들), 및 임의로 서열 번호 1의 위치 176에 상응하는 위치에 Arg을 제외하고 서열 번호 1 (크림슨)의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 이로 이루어지며, 이는 상술되었다.
본 발명의 광-유도성 이온 채널은 광 민감성 폴리엔과 결합할 수 있는 적어도 5개의 막통과 나선을 갖는 막 단백질이다. 6 또는 7개의 막통과 나선을 가진 막통과 단백질이 바람직하다. 그러나, 7개 초과의 나선, 예를 들어 8, 9 또는 10개의 막통과 나선을 갖는 막통과 단백질도 또한 포함된다. 또한, 본 발명은 막통과 부분 이외에 C-말단 서열이 막에 의해 둘러싸인 루멘의 내부, 예를 들어 세포의 세포질 또는 리포솜의 내부로 연장될 수 있거나, 막의 외부 표면상에 배열될 수 있는 C- 및/또는 N-말단 서열을 포함하는 막통과 단백질을 포괄할 수 있다. 마찬가지로 이것은 루멘 내 및 또한 막의 외부 표면 모두에 배열될 수 있는 임의로 존재하는 N-말단 서열에도 동일하게 적용된다. C- 및/또는 N-말단 서열의 길이는 원칙적으로 제한이 없다; 그러나, 1 내지 1000개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 500개의 아미노산, 특히 바람직하게는 5 내지 50개의 아미노산을 갖는, 막에 내입되지 않은 C-말단 서열을 갖는 광-유도성 이온 채널이 바람직하다. C-말단 서열의 길이와 무관하게, 막에 내입되지 않은 N-말단 위치 서열은 바람직하게는 1 내지 500개의 아미노산, 특히 바람직하게는 5 내지 50개의 아미노산을 포함한다. 막통과 나선의 개념은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들은 일반적으로 알파-나선형 단백질 구조이며, 일반적으로 20 내지 25개의 아미노산을 포함한다. 그러나, 천연 막, 예를 들어 세포 또는 원형질 막 또는 합성 막일 수 있는 막의 성질에 따라, 막통과 분절은 더 짧거나 더 길 수 있다. 예를 들어, 인공 막의 막통과 분절은 30개까지의 아미노산을 포함할 수 있지만, 다른 한편으로는 단지 몇개의 아미노산, 예를 들어 12 내지 16개까지만 포함할 수도 있다.
또한, 광-유도성 이온 채널은 서열 번호 1과 비교하여 추가 (반-)보존적 치환을 포함한다. 보존적 치환은 측쇄 및 화학적 성질과 관련된 아미노산 패밀리 내에서 일어나는 것이다. 그러한 패밀리의 예로는 염기성 측쇄, 산성 측쇄, 비극성 지방족 측쇄, 비극성 방향족 측쇄, 비하전 극성 측쇄, 작은 측쇄, 큰 측쇄 등을 갖는 아미노산이 있다. 전형적인 반-보존적 및 보전적 치환은 다음과 같다:
Figure 112018131257563-pct00001
또한, 당업자는 입체적으로 요구되는 위치에서의 글리신이 치환되면 안되고, 알파-나선형 또는 베타-시트 구조를 갖는 단백질 부분에 프롤린이 도입되어서는 안된다는 것을 이해할 것이다.
바람직하게는, 돌연변이 채널은 다음 서열 번호 3의 나선 6-모티프를 포함한다:
Lys-Leu-Met-Ala-Tyr-Ala-Xaa12-Phe-Ala-Ser-Trp-Gly-Xaa18-Xaa19-Pro-Ile-Leu-Trp-Ala-Val
상기에서, Xaa12는 Phe 또는 Tyr이고, 바람직하게는 Xaa12는 Phe이고;
Xaa18은 Met 또는 Ser이고, 바람직하게는 Xaa18은 Met이고;
Xaa19는 Tyr 또는 Phe이고, 바람직하게는 Xaa19는 Phe이다.
광-유도성 이온 채널이 공통 모티프 L(I,A,C)DxxxKxxW(F,Y) (서열 번호 4)를 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 괄호 안에 주어진 아미노산은 각각의 경우 선행 아미노산을 대체할 수 있다. 이 공통 서열은 레티날-결합 아미노산 리신을 둘러싼 모티프이다.
일반적으로, 광-유도성 이온 채널의 기능화에 필요한 레티날 또는 레티날 유도체는 세포를 상기 이온 채널로 형질감염시켜 생성된다. 그의 형태에 따라 레티날은 all-트랜스 레티날, 11-시스-레티날, 13-시스-레티날 또는 9-시스-레티날일 수 있다. 그러나, 본 발명의 돌연변이 광-유도성 이온 채널은 소포, 리포솜 또는 다른 인공 세포막에 혼입될 수 있다는 것도 또한 고려된다. 따라서, 본 개시의 광-유도성 이온 채널 및 레티날 또는 레티날 유도체를 포함하는 채널로돕신이 또한 개시된다. 바람직하게는, 레티날 유도체는 3,4-데하이드로레티날, 13-에틸레티날, 9-dm-레티날, 3-하이드록시레티날, 4-하이드록시레티날, 나프틸레티날; 3,7,11-트리메틸-도데카-2,4,6,8,10-펜타에날; 3,7-디메틸-데카-2,4,6,8-테트라에날; 3,7-디메틸-옥타-2,4,6-트리에날; 및 6-7 회전 차단 레티날, 8-9 회전 차단 레티날 및 10-11 회전 차단 레티날로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 개시는 또한 상술한 바와 같은 돌연변이 광-유도성 이온 채널을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구조물을 기술한다.
최적의 발현을 보장하기 위해, 코딩 DNA는 또한 예를 들어 적합한 조절 서열 및/또는 표적 서열을 첨가함으로써 및/또는 코딩된 DNA 서열을 선택된 숙주의 바람직한 코돈 사용과 일치시킴으로써 적절하게 변형시킬 수 있다. 표적화 서열은 광-유도성 이온 채널을 세포 내의 특정 부위 또는 구획 (예컨대 시냅스 또는 시냅스 후 부위, 축삭-둔덕, 또는 소포체 등)으로 표적화하는 C-말단 연장을 코딩할 수 있다. 핵산은 본 개시의 돌연변이 광-유도성 이온 채널의 서열의 발현을 제공하기 위해 추가의 요소, 예를 들면 프로모터 및 전사 개시 및 정지 신호 및 번역 개시 및 정지 신호 및 폴리아데닐화 신호와 조합될 수 있다. 프로모터는 유도성 또는 구성성, 일반 또는 세포 특이적 프로모터일 수 있다. 세포 특이적 프로모터의 일례는 양극 세포에 특이적인 mGlu6 프로모터이다. 프로모터, 벡터 및 다른 요소의 선택은 당업자의 수준 내에서 일상적인 설계의 일이다. 이러한 많은 요소들은 문헌에 기술되어 있으며 상업적 공급업체를 통해 구할 수 있다.
또한 본원에 개시된 돌연변이 광-유도성 이온 채널 또는 핵산 구조물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터가 개시된다. 바람직한 구체예에서, 벡터는 유전자 요법에 적합하고, 특히 벡터는 바이러스-매개 유전자 전달에 적합하다. "바이러스-매개 유전자 전달에 적합한"이란 용어는 본원에서 상기 벡터가 바이러스에 패킹되어 해당 부위 또는 세포에 전달될 수 있음을 의미한다. 유전자 치료에 적합한 바이러스의 예는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 렌티바이러스, 수두 바이러스, 알파바이러스, 광견병 바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스 및 헤르페스 바이러스이다. 이들 바이러스는 인식한 세포에 유전자를 잘 전달하고 감염시킬 수 있는지, 그리고 세포의 DNA를 영구적으로 또는 일시적으로 변형시키는지에 차이가 있다. 그러나, 유전자 요법은 또한 네이키드 DNA, 리포플렉스 및 폴리플렉스 및 덴드리머의 응용과 같은 비-바이러스 방법도 포함한다.
전술한 바와 같이, 생성된 핵산 서열은 예를 들어, 담체로서 바이러스를 사용하여, 또는 예컨대 화학 형질감염체 (리포펙타민, 푸겐 등)에 의한 것을 포함한 형질감염, 전기천공법, 인산칼슘 공침전법 및 DNA의 직접적인 확산을 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 세포를 형질감염시키는 한가지 방법이 실시예에서 상세히 설명되었으며 각각의 수용 세포에 적용될 수 있다. 형질감염된 DNA가 게놈 또는 불안정한 (일시적인) 세포 또는 세포주에 통합되는 경우, DNA로의 형질감염은 안정한 세포 또는 세포주를 생성하며, 이때 형질감염된 DNA는 염색체 외의 형태로 존재한다. 또한, 에피솜 복제 플라스미드를 사용함으로써 안정한 세포주를 얻을 수 있는데, 이는 염색체 외 플라스미드의 유전이 세포 게놈에 통합된 조절 요소에 의해 제어됨을 의미한다. 일반적으로, 적합한 벡터 또는 플라스미드의 선택은 의도된 숙주 세포에 따라 달라진다.
따라서, 본 개시는 또한 본원에 개시된 핵산 구조물 또는 발현 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다.
실제로 상응하는 채널을 발현하지 않는 세포의 막 내로의 돌연변이 광-유도성 이온 채널의 도입은, 예를 들어, 재조합 DNA 기술의 공지된 절차를 사용하여, 이 이온 채널을 코딩하는 DNA가 우선 적합한 발현 벡터, 예를 들어 플라스미드, 코스미드 또는 바이러스로 도입되고, 이어 표적 세포가 이로 형질전환되고, 이 숙주에서 단백질이 발현된다는 점에서 간단히 수행될 수 있다. 다음으로, 세포가 예를 들어 단백질과 레티날 사이의 쉬프 (Schiffs) 염기의 연결을 가능하게 하기 위해 레티날에 의해 적당한 방식으로 처리된다.
본 개시의 광-유도성 이온 채널의 발현은 특정 포유동물 세포 시스템에서 유리하게 수행될 수 있다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 세포는 포유동물 세포이다. 발현은 일시적 발현으로서 에피솜 벡터로, 바람직하게는 신경모세포종 세포 (예: NG108-15-세포), 흑색종 세포 (예: BLM 세포주), COS 세포 ("아프리카 사바나 원숭이 신장 CV1" 세포의 감염으로 생성), HEK 세포 ("인간 배아 신장 세포", 예컨대 HEK293 세포), 또는 BHK 세포 ("아기 햄스터 신장 세포"), 또는 CHO 세포에서 안정한 발현 (게놈으로의 통합에 의해)의 형태로, 골수종 세포 또는 MDCK 세포 ("Madine-Darby 개 신장 세포") 또는 바큘로바이러스로 감염된 Sf9 곤충 세포에서 수행된다. 따라서, 보다 바람직한 구체예에서 포유동물 세포는 COS 세포; BHK 세포; HEK293 세포; CHO 세포; 골수종 세포; 또는 MDCK 세포이다.
바람직한 구체예에서, 포유동물 세포는 전기 흥분 세포이다. 세포가 해마 세포, 광수용체 세포; 망막 간상 세포; 망막 추체 세포; 망막절 세포; 양극성 뉴런; 신경절 세포; 가성 단극 뉴런; 다극 뉴런; 피라미드 (pyramidal) 뉴런, 푸르키네 (Purkinje) 세포; 또는 과립 세포인 것이 더 바람직하다.
뉴런은 전기 및 화학 신호전달에 의해 정보를 처리하고 전달하는 전기 흥분 세포로서, 여기서 화학 신호전달은 다른 세포와의 특수 연결체인 시냅스를 통해 발생한다. 접촉, 소리, 빛 및 감각 기관의 세포에 영향을 미치는 수많은 다른 자극에 반응하는 감각 뉴런, 뇌 및 척수로부터의 신호를 수신하고 근육 수축 및 땀샘에 영향을 미치는 운동 뉴런 및 뇌 또는 척수의 동일한 영역 내의 다른 뉴런에 뉴런을 연결하는 중간 뉴런과 같이 다수의 특수 형태의 뉴런이 존재한다. 일반적으로, 뉴런은 체세포, 수상 돌기 및 축색 돌기를 가지고 있다. 수상 돌기는 세포 체에서 발생하는 필라멘트이며, 종종 수백 마이크론으로 확장되고 여러 번 분기된다. 축색 돌기는 축삭 둔덕이라고 불리는 부위의 세포체에서 발생하는 특수 세포 필라멘트이다. 축색 돌기가 종결 전에 수백 번 분기할 수 있다 하더라도, 뉴런의 세포체는 흔히 여러 개의 수상 돌기를 생성하나 결코 하나를 초과하여 축색 돌기를 생성하지는 않는다. 대부분의 시냅스에서 신호는 한 뉴런의 축색 돌기에서 다른 것의 수상 돌기로 보내진다. 그러나 이러한 규칙에는 다음과 같은 많은 예외가 있다: 수상 돌기가 없는 뉴런, 축색 돌기가 없는 뉴런, 축색 돌기를 다른 축색 돌기로 또는 수상 돌기를 또 다른 수상 돌기로 연결시키는 시냅스 등. 대부분의 뉴런은 해부학적으로 단극 (unipolar) 또는 가성단극 (pseudounipolar) (동일한 과정에서 출현하는 수상 돌기 및 축색 돌기), 양극성 (체세포의 반대편 끝에 있는 단일 수상 돌기 및 축색 돌기), 다극성 (2개 초과의 수상 돌기가 있고 (i) 피라미드 세포, 푸르키네 세포 및 전방 각 세포와 같은 장기 진행 프로젝트 축삭 과정을 갖는 골지 I 뉴론, 및 (ii) 골지 II: 과립 세포와 같이 축삭 과정이 국소적으로 뉴런으로 추가 분류될 수 있다)로서 추가로 특정화될 수 있다.
광수용체 세포는 광변환할 수 있는 망막에서 발견되는 특수 뉴런이다. 두 가지 고전적인 광수용체는 간체 및 원뿔체로서, 각각 시각계에 의해 이용되는 정보에 기여한다. 망막 신경절 세포는 눈의 망막 내부 표면 근처에 위치한 일종의 뉴런이다. 이 세포는 피개 (중뇌), 시상하부 내 시교차상 핵 및 가쪽무릎 (시상)에 돌출하는 긴 축색 돌기와 수상 돌기를 가지고 있다. 작은 비율은 시력에 거의 또는 전혀 기여하지 않지만 자체가 광 민감성이다. 그의 축색 돌기는 망막 시상하부의 통로를 형성하고 일주율과 대광반사, 즉 동공의 크기 조정에 기여한다. 이들은 두 개의 중간 뉴런 유형, 즉 양극성 세포와 무축삭 세포를 통해 광 수용체로부터 시각 정보를 수신한다. 무축삭 세포는 망막 내 중간 뉴런으로서, 망막 신경절 세포에 대한 입력의 70%를 담당한다. 망막 신경절에 대한 입력의 나머지 30%를 담당하는 양극 세포는 무축삭 세포에 의해 조절된다. 망막의 일부로서, 양극성 세포는 광수용체 (간상 세포와 원뿔 세포)와 신경절 세포 사이에 존재한다. 그들은 직접적으로 또는 간접적으로 광수용체로부터 신경절 세포로 신호를 전달한다.
당업자에게 공지되어 있고 실시예에서 특정 세포주 또는 세포 유형에 대해 예시된 바와 같이 세포를 적절한 온도 및 기체 혼합물 (전형적으로, 37 ℃, 5% CO2), 임의로 세포 배양기에서 단리 (및 유전자 변형), 유지 및 배양할 수 있다. 배양 조건은 각 세포 유형에 따라 다를 수 있으며, 특정 세포 유형에 대한 조건의 변화는 다른 표현형을 초래할 수 있다. 온도와 기체 혼합물을 제외하고, 세포 배양 시스템에서 가장 일반적으로 변화하는 요인은 성장 배지이다. 성장 배지를 위한 처리법은 특히 pH, 글루코스 농도, 성장 인자 및 다른 영양소 성분의 존재 여부에 따라 달라질 수 있다. 성장 배지는 상업적으로 입수할 수 있거나, ATCC (American Tissue Culture Collection)에서 입수할 수 있는 조성물에 따라 제조될 수 있다. 보충 배지에 사용되는 성장 인자는 보통 송아지 혈청과 같은 동물 혈액에서 유래된다. 또한, 항생제가 성장 배지에 첨가될 수 있다. 배양 세포에서 수행되는 일반적인 조작 중에는 배지 변형과 세포 계대가 있다.
본 개시는 또한 돌연변이 광-유도성 이온 채널 또는 본 개시에 따른 세포의 고속 대량 처리 스크리닝에서의 용도에 관한 것이다. 고속 대량 처리 스크리닝 (HTS)은 특히 약물 발견에 사용되며 생물학 및 화학 분야와 관련된 과학 실험을 위한 방법이다. HTS를 사용하면 연구원은 보통 최신 로봇공학, 데이터 처리 및 제어 소프트웨어, 액체 처리 장치 및 민감한 검출기를 조합하여 단기간 내에 수백만 건의 생화학적, 유전학적 또는 약리학적 테스트를 효과적으로 수행할 수 있다. 이 과정에 의해 특정 생체 분자 경로를 조절하는 활성제; 특히 이온 채널, 예컨대 본 발명에 따른 광-유도성 이온 채널, Ca++-유도성 칼륨 채널 또는 BK 채널을 변형시키는 물질을 신속하게 동정할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포에서 Ca++-유도성 칼륨 채널 및 광-유도성 이온 채널을 공동 발현시킬 수 있다. 광 자극시, 광-유도성 채널이 열리고 세포 내 Ca++ 농도가 증가하여 칼륨 채널을 활성화시킬 것이다. 따라서, 막 전위의 변화를 수신하게 될 것이고, 이는 RH 421 (N-(4-설포부틸)-4-(4-(4-(디펜틸아미노)페닐)부타디에닐)피리디늄, 내부 염)과 같은 전위-민감성 염료로 모니터링할 수 있다. 따라서, 이러한 HTS는 다음 단계를 포함할 수 있다: (i) 본 발명에 따른 Ca++-유도성 (칼륨) 채널 및 광-유도성 이온 채널을 발현하는 세포를 Ca++-유도성 채널에 대한 후보 약제와 접촉시키는 단계; (ii) 광-유도성 채널을 유도하기 위해 광 자극을 인가하는 단계; (iii) 막 전위 (혼합 신호)의 변화를 결정하는 단계; 및 (iv) 단계 (iii)에서 결정된 신호를 단계 (ii)를 거친 본 발명에 따른 광-유도성 이온 채널만을 발현하는 세포에서 결정된 신호 (단일 신호) 와 비교하는 단계. 막 전위의 변화 감소는 Ca++-유도성 (칼륨) 채널의 유망한 조절 인자의 지표일 것이다. 이러한 접근법은 Ca++-유도성 채널만을 발현하는 세포에서 수행된 직접 측정과 비교하여 상당히 개선된 약 5:1의 신호 대 잡음비를 산출할 것으로 예상된다. 개선된 신호-대-잡음비로 인해, 상기 방법은 특히 광-유도성 이온 채널을 사용함으로써 HTS에 특히 적합할 수 있다.
본질적으로, HTS는 상대적으로 짧은 시간에 특정 표적에 수많은 물질이 미치는 영향에 대해 많은 양의 실험 데이터를 수집하는 접근법을 사용한다. 이러한 맥락에서 스크린은 단일 목표 (대개 과학적 가설을 시험하는 것)를 가진 대규모 실험이며, 이 모든 데이터는 이후에 적용될 수 있다. 본 발명에 따른 HTS 세포의 경우, 멀티 웰 플레이트, 예를 들어 96-웰 플레이트와 같은 조직 플레이트에 시드 (seed)될 수 있다. 그 후, 플레이트 내의 세포를 표적 이온 채널과 상호 작용하기에 충분한 시간동안 시험 물질과 접촉시킨다. 시험 물질은 플레이트를 통해 웰마다 다를 수 있다. 배양 시간이 경과한 후, 수동으로 또는 기계적으로 모든 플레이트의 웰에 대해 측정이 행해지며, 임의로 시험 물질과 접촉되지 않은 세포의 측정치와 비교된다. 연구자가 패치 클램프를 사용하여 자동화 루틴에서 아직 구현되지 않은 효과를 찾는 경우에 수동 측정이 필요할 수 있다. 그렇지 않으면, 특수 자동화 분석 기계가 웰에 대해 여러 가지 실험을 실행할 수 있다 (예컨대, 특정 주파수의 광 분석 또는 고속 대량 처리 패치 클램프 측정). 이 경우, 기계는 각 실험의 결과를 예를 들어 수치값의 그리드로서 출력하며, 각 수치는 단일 웰로부터 얻은 값으로 맵핑된다. 이 첫 번째 분석 결과에 따라 연구원은 새로운 분석 플레이트에서 활성인 것으로 확인된 것과 유사한 물질을 사용하여 (즉 세포 내 사이클릭 뉴클레오티드 수준 변형) 동일한 스크린 내에서의 분석을 후속 수행한 후, 실험을 다시 실행하여 추가 데이터를 수집하고, 세포에 대한 약제의 효과를 향상시키기 위해 화학 제제의 구조를 최적화할 수 있다. 자동화는 HTS의 유용성에서 중요한 요소이다. 전문 로봇이 보통 생성에서부터 최종 분석에 이르기까지 단일 분석 플레이트의 수명 동안 많은 과정을 담당한다. HTS 로봇은 대개 많은 플레이트를 동시에 준비하고 분석할 수 있으므로 데이터 수집 프로세스가 더욱 빨라진다. 본 발명에 따른 HTS에 적합한 장치의 예로서는 형광 이미징 플레이트 판독기 (FLIPRTM; Molecular Devices), FLEXstationTM (Molecular Devices), 전압 이온 프로브 판독기 (VIPR, Aurora Biosciences), Attofluor® Ratio Vision® (ATTO)을 들 수 있다.
따라서, 본 개시의 돌연변이 광-유도성 이온 채널은 전기 흥분 세포, 특히 뉴런 세포의 광 자극을 위한 비치료 용도에서와 같은 연구 도구로서 특히 유용하다. 예를 들어, 해마 뉴런 배양 및 해마 뉴런으로부터의 전기생리학적 기록 및 HEK293 세포에 대한 전기생리학적 기록과 같은 추가 지침은 WO 2012/032103에서 찾을 수 있다.
마지막으로, 예를 들어, 자연 시세포는 더 이상 기능하지 않지만, 모든 신경 연결은 계속해서 작동할 수 있는 다수의 질병이 있다. 현재, 망막에 인공 세라믹 포토셀 박막을 주입하려는 시도가 여러 연구 센터에서 진행되고 있다. 이러한 포토셀은 망막의 2차적인 손상되지 않은 세포를 탈분극시켜 신경 충동 (생체공학적 눈)을 유발하기 위한 것이다. 이러한 신경절 세포, 무축삭 세포 또는 양극성 세포에서 본 개시에 따른 돌연변이 광 제어 이온 채널의 계획적인 발현은 훨씬 더 우아한 해법이며, 더 큰 3차원 시각 해상도를 가능하게 할 것이다. 따라서, 본 개시는 또한 의약에 사용하기 위한 본 발명에 따른 광-유도성 이온 채널을 고려한다.
원리의 증명은 아래의 실시예에서 이미 입증되었으며 각 목적에 맞게 용이하게 조정될 수 있다. 이들 데이터의 관점에서, 본 개시의 광-유도성 이온 채널은 청각 장애 대상에서 청각 활동을 복원하거나, 시각 장애 대상에서 시력 회복을 위해 사용될 수 있다고 생각된다. 보다 구체적으로, 하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 개시의 돌연변이 광-유도성 이온 채널은 충분한 일시적 충실도를 제공한다. 그들의 적색 편이 스펙트럼은 광독성의 위험이 적을 뿐만 아니라 조직 내에 더 깊은 빛의 침투와 적은 산란에 유리하다. 따라서, 본 개시의 돌연변이 광-유도성 이온 채널은 광발생학적 청력 회복 및 청각 연구에 유용한 도구가 될 것으로 예상된다.
또 다른 구체예에서, 본 개시의 광-유도성 이온 채널은 팔 또는 다리와 같은 팔다리의 감각-운동 인공기관을 개선하기 위한 구심성 피드백에 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 구심성 피드백은 신체의 말초 신경에서 뇌 또는 척수로 전달되는 신경 신호를 의미한다. 본 개시의 광-유도성 이온 채널은 통증, 특히 환상성 사지 통증 또는 만성 통증의 치료에 사용될 수 있음이 또한 고려된다.
본 발명에 따라, 본 개시의 세포에 대해 기술된 바와 같이, 예를 들어 뉴런과 같은 전기 흥분 세포, 특히 나선형 신경절 뉴런에서 본 개시에 따른 광-유도성 이온 채널을 기능적으로 발현하는 비인간 동물이 추가로 기재된다. 마찬가지로, 본 발명에 따른 세포를 포함하는 비인간 동물도 고려된다.
비인간 동물은 인간 이외의 동물일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 비인간 동물은 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 마우스 또는 래트와 같은 설치류 또는 영장류이다.
특히 Caenorhabditis elegans, Arbacia punctulata, Ciona intestinalis, Drosophila, 일반적으로 Drosophila melanogaster, Euprymna scolopes, Hydra, Loligo pealei, Pristionchus pacificus, Strongylocentrotus purpuratus, Symsagittifera roscoffensis, 및 Tribolium castaneum과 같은 일부 모델 유기체가 바람직하다. 척추동물 중의 기니아 피그 (Cavia porcellus), 햄스터, 마우스 (Mus musculus), 래트 (Rattus norvegicus)와 같은 다수의 설치류 종뿐만 아니라 닭 (Gallus gallus domesticus), 고양이 (Felis cattus), 개 (Canis lupus familiaris), 칠성장어, 송사리 (Oryzias latipes), 히말라야 원숭이, Sigmodon hispidus, 금화조 (Taeniopygia guttata), 복어 (Takifugu rubripres), 아프리카 발톱 개구리 (Xenopus laevis) 및 제브라 피쉬 (Danio rerio)와 같은 다른 종들도 있다. 또한 인간 이외의 영장류, 즉 호모 속에 속하지 않는 모든 영장류의 동물 종, 예를 들어 히말라야 원숭이, 침팬지, 개코 원숭이, 마모셋 및 녹색 원숭이가 바람직하다. 그러나, 이들 예는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
그러나, 인간이나 동물에게 실질적인 의학적 이익을 줄 수 없어 해당 특허법이나 관할권에 따라 특허 가능성이 적용되지 않는 동물은 제외된다는 것에 유의바란다. 또한, 당업자는 인간이나 동물에 대한 실질적인 의료 혜택이 동물의 고통보다 중요하다는 것을 보장하기 위해 동물 복지의 국제 지침에 명시되어 있는 것과 같은 적절한 조치를 취할 것이다.
이하, 본 발명을 도면과 실시예로 설명하지만, 본 발명의 범위를 이로 한정하려는 것은 아니다.
도 1: 크림슨 및 크림슨 Y261F의 오프-키네틱스. 조명을 중단한 직후의 크림슨-YFP 및 크림슨-YFP Y261F의 전형적인 광전류가 표시된다. 전류는 비교를 위해 표준화되었다.
도 2 : 크림슨 및 크림슨 돌연변이체의 광전류. 파장이 594 nm이고 포화 광도가 23 mW/mm-2인 3 ms 광 펄스에 대한 반응으로 측정된 전형적인 광전류가 표시된다. 크림슨-YFP (
Figure 112018131257563-pct00002
), 크림슨-YFP K176R (
Figure 112018131257563-pct00003
), 크림슨-YFP S267M (
Figure 112018131257563-pct00004
), 크림슨-YFP Y268F (
Figure 112018131257563-pct00005
), 크림슨-YFP Y261F (
Figure 112018131257563-pct00006
), 크림슨-YFP S267M/Y268F (
Figure 112018131257563-pct00007
), 크림슨-YFP Y261F/S267M (
Figure 112018131257563-pct00008
), 크림슨-YFP K176R/S267M/Y268F (
Figure 112018131257563-pct00009
), 크림슨-YFP Y261F/S267M/Y268F (
Figure 112018131257563-pct00010
), 크림슨-YFP K176R/Y261F/S267M (
Figure 112018131257563-pct00011
) 또는 크림슨-YFP K176R/Y261F/S267M/Y268F (
Figure 112018131257563-pct00012
)를 이종적으로 발현하는 NG108-15 세포를 하기 실시예에 기재된 바와 같이 전세포 구성에서 패치-클램프 측정에 의해 조사하였다. 전류는 비교를 위해 표준화되었다.
도 3: 크림슨 및 크림슨 돌연변이체의 작용 스펙트럼. 제시된 파장의 ns 광 펄스에 대한 반응으로 표준 피크 전류가 표시된다. 크림슨-YFP (
Figure 112018131257563-pct00013
, n=6), 크림슨-YFP S267M/Y268F (
Figure 112018131257563-pct00014
, n=3), 크림슨-YFP S267M (
Figure 112018131257563-pct00015
, n=3), 크림슨-YFP Y261F (
Figure 112018131257563-pct00016
, n=4), 크림슨-YFP Y268F (
Figure 112018131257563-pct00017
, n=5), 크림슨-YFP K176R/Y261F/S267M (
Figure 112018131257563-pct00018
, n=4) 또는 크림슨-YFP Y261F/S267M (
Figure 112018131257563-pct00019
, n=4)를 이종적으로 발현하는 NG108-15 세포를 하기 실시예에 기재된 바와 같이 전세포 구성에서 패치-클램프 측정에 의해 조사하였다.
도 4: 상이한 광 펄스 주파수에서의 스파이킹 추적. A) 크림슨-YFP, B) 크림슨-YFP K176R/Y261F/S267M 및 C) 크림슨-YFP Y261F/S267M을 이종적으로 발현하는 래트의 해마 뉴런을 하기 실시예에 기재된 바와 같이 전세포 구성에서 패치-클램프 측정에 의해 조사하였다.
도 5: AAV2/6-hSyn-크림슨-YFP Y261F/S267M으로 SGN의 출생 후 형질도입은 매우 효율적이며 주로 주입된 귀에 특이적이다. A: 나선형 신경절의 상이한 세 영역에서 YFP 및 칼레티닌 면역형광의 최대 강도 투영 (Z-단계: 1 μm)으로 표시되는 공 초점 이미지. 스케일 바: 50 μm. B: 칼레티닌+ SGNs에 대한 비로서 계산된 SGNs에서 YFP 발현 (좌측 패널) 및 세포/104 μ㎡로서 나타낸 SGNs 생존성 (우측 패널)의 정량화. 기호는 개별 동물로부터의 결과를 표시한다. 회색 및 검은색 막대는 좌측 (주입) 및 우측 (대조) 달팽이관로부터의 평균값을 나타낸다. 동일한 그룹 (주입 또는 대조군) 내에서 양쪽 정량화에는 통계적으로 유의한 차이가 발견되지 않았으며, 세포 생존성 정량 (t-검정, p>0.05)에서도 동일한 달팽이관 영역에 대해 그룹 간 유의한 차이가 발견되지 않았다.
도 6: 크림슨-YFP Y261F/S267M은 초당 수백의 생리적 속도로 정보의 광유전학적 코딩을 가능하게 한다. A: 최대 강도 (11 mW, 10 Hz에서 1 ms)에서 594 nm 광 자극을 사용하여 AAV6-크림슨-YFP Y261F/S267M을 주입한 4 마리 마우스로부터의 oABR 추적 (0-2.5 ms). B: 증가된 레이저 강도 (10 Hz에서 1 ms)에서 기록된 AAV6-크림슨-YFP Y261F/S267M을 주입한 예시적인 마우스로부터의 oABR 추적 (0-8 ms). 기호는 oABR 추적 (A, B)에서 P1 및 N1 (반응 정량화를 위한 표식)을 표시하고, A-F를 통해 동일 마우스에서 데이터 지점을 식별하는 데 도움이 된다. C: 레이저 강도 증가에 따라 (10 Hz에서 1 ms) P1-N1 진폭 (최대 진폭에 대해 표준화됨)이 증가한다. 그룹 평균은 검은색으로 표시된다. D: 광 펄스 지속 시간이 증가 (채워진 원으로 표시된 동물의 경우 10 Hz에서 5.5 mW, 나머지는 20 Hz에서 11 mW)함에 따라 P1-N1 진폭 (최대 진폭에 대해 표준화됨)이 증가한다. 그룹 평균은 검은색으로 표시된다. E: 레이저 강도가 증가 (10 ms에서 1 ms)하면 P1 대기 시간이 감소한다. 그룹 평균은 검은색으로 표시된다. F: 자극 속도가 증가 (5.5 mW, 다이아몬드로 표시된 동물의 경우 1 ms; 나머지는 6.6 mW, 1 ms)함에 따라 P1-N1 진폭 (최대 진폭에 대해 표준화됨)이 감소한다. 그룹 평균은 검은색으로 표시된다. C-F의 음영 영역은 +/- 표준 편차를 나타낸다.
서열 설명
서열 번호 1 ( 크림슨 ; 수탁 번호 KF992060; 나선 6은 굵은 글씨로 강조됨)
Figure 112018131257563-pct00020
서열 번호 2 (CsChrimson, 수탁 번호 KJ995863; 나선 6은 굵은 글씨로 강조됨)
Figure 112018131257563-pct00021
서열 번호 3 (나선 6 공통 모티프)
Figure 112018131257563-pct00022
여기서,
Xaa12는 Phe 또는 Tyr이고, 바람직하게는 Xaa12는 Phe이고;
Xaa18은 Met 또는 Ser이고, 바람직하게는 Xaa18은 Met이고;
Xaa19는 Phe 또는 Tyr이고, 바람직하게는 Xaa19는 Phe이다
서열 번호 4 ( 레티날 결합 부위 공통 모티프)
Figure 112018131257563-pct00023
여기서,
Xaa1은 Leu, Ile, Ala 또는 Cys이고;
Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa7, 및 Xaa8은 독립적으로 임의의 아미노산이고;
Xaa9는 Thr, Phe 또는 Tyr이다.
서열 번호 5 ( 채널로돕신 2; ChR2 ; 315aa ; 나선 6은 굵은 글씨로 강조됨)
Figure 112018131257563-pct00024
서열 번호 6 ( VChR1 , 수탁 번호 EU622855, 300 aa, 나선 6은 굵은 글씨로 강조됨)
Figure 112018131257563-pct00025
서열 번호 7 (ReaChR; 수탁 번호 KF448069; 352aa ; 나선 6은 굵은 글씨로 강조됨)
Figure 112018131257563-pct00026
서열 번호 8 ( ChR2 ; 나선 6 스왑 돌연변이)
Figure 112018131257563-pct00027
서열 번호 9 ( VChR1 나선 6 스왑 돌연변이)
Figure 112018131257563-pct00028
서열 번호 10 (ReaChR; 나선 6 스왑 돌연변이)
Figure 112018131257563-pct00029
실시예
본 발명자들의 목적은 그의 돌연변이가 크림슨의 제6 막통과 도메인 내에서 오프-키네틱스를 가속화시킬 수 있는 잔기를 동정하는 것이었다.
실시예 1 - NG108-15 세포에서의 크림슨 돌연변이체의 광전류
크림슨-YFP 및 크림슨-YFP 돌연변이를 일시적으로 발현하는 NG108-15 세포를 -60 mV의 클램프 전위에서 전세포 구성에서의 패치-클램프 측정으로 조사하였다. 배쓰 용액은 140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.4를 함유하고 피펫 용액은 110 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7.4를 함유하고 있다. 광전류는 23 mW/㎟의 강도 및 594 nm의 파장을 갖는 3 ms 광 펄스에 대한 반응으로 측정되었다. Toff 값은 단일 지수 함수에 대한 조명 중지 후 전류의 적합성에 의해 결정되었다. 전류 밀도 (J-60 mV)는 23 mW/㎟의 강도 및 594 nm의 파장을 가진 500 ms 광 펄스에 대한 반응의 정상 전류를 셀의 정전 용량으로 나눔으로써 결정되었다.
그 결과를 도 1 및 2에 나타내었고 하기 표 1에 요약하였다.
Figure 112018131257563-pct00030
NG108-15 세포에서 이종적으로 발현된 크림슨 및 크림슨 돌연변이체의 오프 키네틱스 (Toff) 및 전류 밀도 (J-60mV). 평균 Toff 값 (n = 3-7), 평균 전류 밀도 (n = 7-11) 및 상응하는 표준 편차가 표시된다.
상기 데이터로부터 알 수 있듯이, 위치 267, 268, 및 261에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 크림슨의 오프-키네틱 (Toff)을 가속화시킬 수 있다. 돌연변이의 조합은 크림슨의 오프-키네틱 (Toff)을 더욱 가속화시킨다. 돌연변이는 서로에 대해 또는 공지 K176R 돌연변이와 유리하게 조합될 수 있다.
실시예 2 - NG108-15 세포에서의 크림슨 돌연변이체의 작용 스펙트럼
크림슨 및 크림슨 돌연변이체의 작용 스펙트럼을 -60 mV의 클램프 전위에서 전세포 구성에서의 패치-클램프 측정으로 조사하였다. 배쓰 용액은 140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.4를 함유하고 피펫 용액은 110 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 10 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7.4를 함유하고 있다. Opolette 355 파장 가변 레이저 시스템 (OPTOPRIM)을 사용하여 7 ns의 펄스 길이를 갖는 광 펄스를 생성하였다. 작용 스펙트럼의 기록을 위해 서로 다른 파장에서의 펄스 에너지는 크림슨 wt의 경우 1018 광자/㎡ 및 크림슨 돌연변이의 경우 1019 광자/㎡의 동일한 광자 카운트에 해당하는 값으로 설정되었다.
결과는 도 3에 도시되었다. Y268F 돌연변이는 작용 스펙트럼 (Ymax = 580 nm)의 청색 이동을 생성한다. 주목할 것은, Y268F 돌연변이가 없는 시험된 크림슨 돌연변이의 작용 스펙트럼은 야생형 크림슨의 작용 스펙트럼 (Ymax = 590nm)과 비교하여 유의미하게 이동하지 않았다는 것이다.
실시예 3 - 크림슨 돌연변이체는 래트의 해마 뉴런에서 증가된 스파이킹 빈도를 나타낸다
뉴런 응용에 대한 크림슨 돌연변이의 적합성을 시험하기 위해 배양된 래트의 해마 뉴런에서 구조물을 발현시켰다.
해마 뉴런 배양. 해마를 출생 후 P1 스프라그-돌리 (Sprague-Dawley) 래트 (Jackson Laboratory)로부터 분리하고, 37 ℃에서 20분 동안 파파인 (20 U ml- 1)으로 처리하였다. 해마를 10% 소태아 혈청이 보충된 DMEM (Invitrogen/Gibco, 고 글루코스)으로 세척하고, 소량의 이 용액에서 연마하였다. ~ 75,000 세포를 24-웰 플레이트에서 폴리-D-리신/라미닌으로 코팅한 유리 커버 슬립에 도말하였다. 3시간 후에 플레이팅 배지를 배양 배지 (2% B-27 보충제, 2 mM GlutamaxI)를 함유하는 Neurobasal A)로 교체하였다.
크림슨-YFP, 크림슨-YFP Y261F/S267M 및 크림슨-YFP K176R/Y261F/S267M을 이종적으로 발현하는 래트의 해마 뉴런을 -70 mV의 클램프 전위에서 전세포 구성에서의 패치 클램프 실험으로 조사하였다. 측정 전 14 내지 21일 동안 아데노-관련 바이러스로 형질도입하여 야생형 크림슨 또는 각각의 크림슨 돌연변이체의 이종 발현을 달성하였다.
요약하면, 플레이팅 4 내지 9일 후 각 웰에 1×109 게놈 카피/ml (GC/ml)의 바이러스를 첨가하였다. 형질도입 5일 후 발현이 가시화되었다. 배양 내내 (~ 5주) 신경 독성은 관찰되지 않았다. 여기에 설명된 실험을 위해 all-트랜스 레티날은 배양 배지 또는 기록 배지에 첨가되지 않았다.
아데노 -관련 바이러스 ( AAV2 /1). 크림슨-YFP 야생형 또는 크림슨-YFP 돌연변이체를 함유한 인간 시냅신 프로모터 (16)를 갖는 pAAV2 벡터를 사용하여 FMI (Basel)의 Botond Roska 박사 연구실에서 rAAV2/1 바이러스를 준비하였다. 바이러스 역가는 명목상 1×1012 - 1×1013 GC/ml이었다.
해마 뉴런으로부터의 전기생리학적 기록. 배양된 해마 뉴런에서 전세포 기록을 위해 3-8 MΩ의 저항력을 갖는 패치 피펫을 129 mM 글루콘산칼륨, 10 mM HEPES, 10 mM KCl, 4 mM MgATP 및 0.3 mM Na3GTP (pH 7.2로 적정)로 채웠다. 타이로드 용액을 세포 외 용액 (125 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 30 mM 글루코스 및 25 mM HEPES, pH 7.4로 적정)으로서 사용하였다. 기록은 흥분 시냅스 전달 차단제, 1,2,3,4-테트라하이드로-6-니트로-2,3-디옥소-벤조[f]퀴녹살린-7-설폰아미드 (NBQX, 10 μM, Sigma) 및 D (-)-2-아미노-5-포스포노펜탄산 (AP-5, 50μM, Sigma)의 존재하에서 수행하였다. Toff의 결정 및 J-70 mV의 측정은 부가적으로 1 μM TTX의 존재하에 수행되었다.
전기생리학적 신호를 Axopatch 200B 증폭기 (Axon Instruments, Union City, CA)를 사용하여 증폭시키고 10 kHz에서 필터링한 후 Axon Digidata 1322A (50 Hz)로 디지털화하고 pClamp9 소프트웨어 (Axon Instruments)를 사용하여 수집 및 분석하였다.
활동 전위를 표시된 주파수에서 40 광 펄스로 촉발시켰다. 광 펄스는 3 ms의 펄스 폭, λ = 594 nm의 파장 및 11 내지 30 mW/㎟의 포화 강도를 갖는다.
Toff 값은 단일 지수 함수에 대한 조명 중지 후 전류의 적합성에 의해 결정되었다. 전류 밀도 (J-70 mV)는 포화 강도 20-40 mW/㎟ 및 파장 594 nm의 500 ms 광 펄스에 대한 반응의 정상 전류를 셀의 정전 용량으로 나눔으로써 결정되었다. 100%의 확률로 활동 전위를 유도하는데 필요한 최저 광 강도 (J100)를 결정하기 위해 다양한 광 강도의 40 펄스 (λ = 594 nm, 펄스 폭 = 3 ms, ν = 10 Hz)를 인가하였다. 스파이크 확률은 광에 의해 유발된 스파이크의 수를 총 광 펄스의 수로 나누어 계산하였다.
결과가 도 4에 도시되었다. 야생형 크림슨을 발현하는 래트의 해마 뉴런은 10 Hz 초과 주파수에서 100% 확률로 활동 전위를 유도할 수 없었지만 (도 4A 참조), 크림슨 돌연변이 Y261F/S267M (도시되지 않음) 및 K176R/Y261F/S267M (도 4B 참조)은 20 Hz 및 40 Hz에서 적절하게 활동 전위를 유도할 수 있었다. 또한 크림슨 돌연변이체 K176R/Y261F/S267M (도시되지 않음) 및 Y261F/S267M (도 4C 참조)도 80-100 Hz의 높은 주파수에서 활동 전위를 적절히 유도할 수 있었다. 이들 측정은 본 발명의 고속 크림슨 돌연변이가 신속한 신경 광 자극을 가능하게 한다는 것을 명확하게 증명한다.
야생형 크림슨과 비교하여 래트의 해마 뉴런에서 이종적으로 발현된 크림슨 돌연변이체 K176R/Y261F/S267M 및 크림슨 돌연변이체 Y261F/S267M의 측정된 특성을하기 표 2에 나타내었다.
Figure 112018131257563-pct00031
오프 키네틱스 (Toff), 전류 밀도 (J-70 mV) 및 100% 확률로 활동 전위를 유도하는 데 필요한 최저 광도 (J100). 평균 Toff (n = 3-11), 평균 J-70 mV (n = 10-14), 평균 J100 (n = 7) 및 해당 표준 편차가 표시된다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 야생형과 비교하여 크림슨 돌연변이 K176R/Y261F/S267M 및 크림슨 돌연변이 Y261F/S267M에서 오프 키네틱스 (Toff)가 상당히 가속화된다. 이로써 크림슨 Y261F/S267M 및 크림슨 K176R/Y261F/S267M의 전류 밀도 (J-70 mV)는 야생형 크림슨에 비해 약간 감소된다. 래트 해마 뉴런의 견고한 발현은 낮은 광 강도에서 뉴런의 광자극을 가능하게 한다. 이러한 데이터는 NG108-15 세포 (표 1)에서 관찰된 보다 빠른 키네틱스을 입증하고 도 4에 나타낸 바와 같이 고 주파수에서의 활동 전위를 정확하게 유도할 수 있는 능력을 설명한다.
실시예 4 - 청각 경로의 광유전학적 자극
청각 신경의 광유전학적 자극은 달팽이관 임플란트 및 청각 뇌간 임플란트와 같은 청각 인공기관의 사운드 코딩에서 커다란 진보를 약속한다. 광이 편리하게 집중될 수 있기 때문에, 광학 청각 인공기관은 코딩의 훨씬 개선된 주파수 해상능을 약속한다. 현재 이용가능한 광유전학적 도구의 한계 중 한가지는 청각 신호 처리의 속도에 대한 느린 키네틱스이다. 여기에서 급속 개폐 크림슨-YFP Y261F/S267M의 달팽이관 유전학기술에 대한 잠재력은 이전에 [Hernandez et al. J Clin Invest. 2014;124(3):1114-29]에 기술된 시스템을 적용하여 마우스에서 SGNs의 출생 후 AAV-매개 형질도입을 사용하여 시험되었다. AAV2/6-hSyn-크림슨-YFP Y261F/S267M을 p3 마우스에서 내창을 통해 고실계에 주입하고 주입 4 내지 8주 후에 발현 및 기능을 분석하였다. 주입된 마우스는 콜로니에서 어떤 명시적인 표현형도 나타내지 않았다. 주입 및 비주입 귀의 크리오섹션 (cryosection)에 대한 면역조직화학 및 YFP의 공 초점 이미징 및 칼레티닌 면역형광을 이용하여 크림슨-YFP Y261F/S267M 발현 및 SGN 밀도를 분석하였다 (도 5A, 5B). 주입된 모든 귀는 모든 달팽이관 회전에서 SGNs의 거의 90%가 주입된 귀에서 형질도입되었고 (비주입 귀에서는 5% 미만인 것에 비해), SGN 밀도는 크게 변형되지 않은 크림슨-YFP Y261F/S267M을 나타내었다 (도 1B). 형질도입률은 AAV2/6-hSyn-CatCh-YFP (Hernandez et al., 2014)의 유테린경유 (transuterine) 주입을 이용한 이전의 연구에서 얻은 것보다 훨씬 높았으며 거기에서와 달리 음위상 위치와 독립적이었다. 후방 고막절개술을 시행하고 50 μm 광섬유를 내창에 삽입하여 595 nm 연속파 레이저의 광을 기저 회전의 SGN에 투사하였다. 본 발명자들은 어쿠스틱 ABR (aABR)에 대한 진폭 및 파형이 비슷한 광학적 청성 뇌간 반응 (oABR, 도 6A)을 쉽게 유도할 수 있었다. 광 강도가 증가하면 oABR 대기 시간은 짧아지고 oABR 진폭은 증가한다 (도 6B, 6E). 0.5 mW 정도로 낮고 (도 6C, 자극 지속 시간: 1 ms, 자극 속도: 10 s-1), 80 μs 정도로 짧은 (도 6D, 자극 강도: 11 mW, 자극 속도: 10 s-1) 자극은 oABR을 유도하기에 충분하였다. oABR의 진폭과 파형은 서로 다른 동물에 따라 차이가 있지만 (도 6A), 전형적으로 1 초과 차수의 광도 변화에 따라 달라졌다 (도 6C, 출력 동적 범위 > 20dB). oABR 진폭은 자극 지속 시간을 줄이거나 (도 6D), 자극 속도를 올렸을 때 감소했지만, 최대 200 Hz까지의 oABR이 관찰되었다 (도 6F). oABR은 5 내지 7 ms 초과 시간에 걸친 집단 반응을 반영하므로 반응이 후속 자극 사이의 상호 작용에 의해 약화되었을 수 있음에 유의바란다. 크림슨-YFP Y261F/S267M이 매개하는 달팽이관 광유전학 기술은 175 Hz 이상에서 SGN을 유도할 수 있다고 결론지어졌으며 이는 생리적으로 소리에 의해 유도되는 SGN 발화 속도의 범위에 있다 (Liberman, M.C., J. Acoust. Soc. Am. 63, 442-455 (1978); Winter, et al., Hear. Res. 45, 191-202 (1990)). 요약하면, SGN의 출생 후 형질도입이 효율적으로 확립되었고, 저광도 및 짧은 자극에 대해 SGN 발화가 달성되었다. 충분한 시간적 충실도를 제공하고 또한 조직 내 더 깊은 광 침투 및 산란 감소뿐만 아니라 광독성의 위험성이 적은, 청색 채널로돕신보다 우월한 크림슨-YFP Y261F/S267M은 광유전학적 청력 복원 및 청각 연구를 위한 유용한 도구가 될 것으로 기대된다.
나선 6 모티프 또는 본원에 개시된 임의의 다른 돌연변이를 예를 들어 Hernandez 등에 의해 기술된 바와 같이 구조물로 도입하는 것은 통상적인 관행을 나타낸다. 대안적으로, 본 개시의 광-유도성 이온 채널에 대한 코딩 서열로 구조물 내 채널로돕신의 코딩 서열을 간단하게 대체시킬 수 있다.
실시예 5 - 시력 회복을 위한 광유전학적 접근법
문헌[Mace et al. Mol Ther. 2015;23(1):7-16]은 아데노-관련 바이러스 (AAV) 유전자 치료에 의해 매개되는 망막 뉴런의 광유전학적 재활성화를 기술한 몇몇 발명가에 의해 저술된 초기 논문이다. 대부분의 선천적인 망막 이상증은 진행성 광수용체 세포 변성을 나타내 심각한 시각 장애로 이어진다. 아데노-관련 바이러스 (AAV) 유전자 치료에 의해 매개되는 망막 뉴런의 광유전학적 재활성화는 환자 특이적 돌연변이에 관계없이 시력을 회복시킬 잠재력을 가지고 있다. 임상적 전환성에 대한 도전 과제는 가능한 한 자연스러운 시력에 가깝게 시력을 회복하는 한편 손상되기 쉬운 변성 망막에 수술적으로 안전한 전달 경로를 사용하는 것이다. 내망막의 시각 과정을 보존하기 위해, 질병의 후기 단계에서 여전히 존재하는 ON 양극성 세포가 표적화된다. 안전한 유전자 전달을 위해, 눈에 쉽게 접근가능한 유리체액으로 주입 후 양극성 세포를 형질도입할 수 있는 최근 조작된 AAV 변이체가 사용된다. ON 양극성 세포-특이적 프로모터 하에서 채널로돕신을 코딩하는 AAV는 유리체 내 투여 후 ON-양극성 세포로 제한된 장기간의 유전자 전달을 매개하는 것으로 나타났다. ON 양극성 세포에서 채널로돕신 발현은 망막 및 피질 수준에서 ON 및 OFF 반응의 회복으로 이어진다. 또한, 치료된 시각 상실 래트에서 광 유도된 이동 행동이 회복되었다.
본원에서 동정된 나선 6 모티프를, 예를 들어 상기 문헌[Mace et al.]에 기술된 바와 같이 구조물로 도입하는 것은 통상적인 관행을 나타낸다. 대안적으로, 본 개시의 광-유도성 이온 채널에 대한 코딩 서열로 구조물 내 채널로돕신의 코딩 서열을 간단하게 대체시킬 수 있다. 본 발명의 새로운 광-유도성 이온 채널은 망막 내 신경절 세포를 위해서 뿐만 아니라 ON 양극성 세포의 활성화를 위해 카세트에 삽입된다
참고문헌 목록
Figure 112018131257563-pct00032
Figure 112018131257563-pct00033
SEQUENCE LISTING <110> Max-Planck-Gesellschaft zur F?derung der Wissenschaften e.V. <120> Mutant light-inducible ion channels <130> 30A-139 708 <150> EP 16172984.3 <151> 2016-06-03 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 349 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Chrimson derived from Chlamydomonas noctigama <400> 1 Met Ala Glu Leu Ile Ser Ser Ala Thr Arg Ser Leu Phe Ala Ala Gly 1 5 10 15 Gly Ile Asn Pro Trp Pro Asn Pro Tyr His His Glu Asp Met Gly Cys 20 25 30 Gly Gly Met Thr Pro Thr Gly Glu Cys Phe Ser Thr Glu Trp Trp Cys 35 40 45 Asp Pro Ser Tyr Gly Leu Ser Asp Ala Gly Tyr Gly Tyr Cys Phe Val 50 55 60 Glu Ala Thr Gly Gly Tyr Leu Val Val Gly Val Glu Lys Lys Gln Ala 65 70 75 80 Trp Leu His Ser Arg Gly Thr Pro Gly Glu Lys Ile Gly Ala Gln Val 85 90 95 Cys Gln Trp Ile Ala Phe Ser Ile Ala Ile Ala Leu Leu Thr Phe Tyr 100 105 110 Gly Phe Ser Ala Trp Lys Ala Thr Cys Gly Trp Glu Glu Val Tyr Val 115 120 125 Cys Cys Val Glu Val Leu Phe Val Thr Leu Glu Ile Phe Lys Glu Phe 130 135 140 Ser Ser Pro Ala Thr Val Tyr Leu Ser Thr Gly Asn His Ala Tyr Cys 145 150 155 160 Leu Arg Tyr Phe Glu Trp Leu Leu Ser Cys Pro Val Ile Leu Ile Lys 165 170 175 Leu Ser Asn Leu Ser Gly Leu Lys Asn Asp Tyr Ser Lys Arg Thr Met 180 185 190 Gly Leu Ile Val Ser Cys Val Gly Met Ile Val Phe Gly Met Ala Ala 195 200 205 Gly Leu Ala Thr Asp Trp Leu Lys Trp Leu Leu Tyr Ile Val Ser Cys 210 215 220 Ile Tyr Gly Gly Tyr Met Tyr Phe Gln Ala Ala Lys Cys Tyr Val Glu 225 230 235 240 Ala Asn His Ser Val Pro Lys Gly His Cys Arg Met Val Val Lys Leu 245 250 255 Met Ala Tyr Ala Tyr Phe Ala Ser Trp Gly Ser Tyr Pro Ile Leu Trp 260 265 270 Ala Val Gly Pro Glu Gly Leu Leu Lys Leu Ser Pro Tyr Ala Asn Ser 275 280 285 Ile Gly His Ser Ile Cys Asp Ile Ile Ala Lys Glu Phe Trp Thr Phe 290 295 300 Leu Ala His His Leu Arg Ile Lys Ile His Glu His Ile Leu Ile His 305 310 315 320 Gly Asp Ile Arg Lys Thr Thr Lys Glu Ile Gly Gly Glu Glu Val Glu 325 330 335 Val Glu Glu Phe Val Glu Glu Glu Asp Glu Asp Thr Val 340 345 <210> 2 <211> 345 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CsChrimson <400> 2 Met Ser Arg Leu Val Ala Ala Ser Trp Leu Leu Ala Leu Leu Leu Cys 1 5 10 15 Gly Ile Thr Ser Thr Thr Thr Ala Ser Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ser 20 25 30 Thr Asp Gly Thr Ala Ala Ala Ala Val Ser His Tyr Ala Met Asn Gly 35 40 45 Phe Asp Glu Leu Ala Lys Gly Ala Val Val Pro Glu Asp His Phe Val 50 55 60 Cys Gly Pro Ala Asp Lys Cys Tyr Cys Ser Ala Trp Leu His Ser Arg 65 70 75 80 Gly Thr Pro Gly Glu Lys Ile Gly Ala Gln Val Cys Gln Trp Ile Ala 85 90 95 Phe Ser Ile Ala Ile Ala Leu Leu Thr Phe Tyr Gly Phe Ser Ala Trp 100 105 110 Lys Ala Thr Cys Gly Trp Glu Glu Val Tyr Val Cys Cys Val Glu Val 115 120 125 Leu Phe Val Thr Leu Glu Ile Phe Lys Glu Phe Ser Ser Pro Ala Thr 130 135 140 Val Tyr Leu Ser Thr Gly Asn His Ala Tyr Cys Leu Arg Tyr Phe Glu 145 150 155 160 Trp Leu Leu Ser Cys Pro Val Ile Leu Ile Lys Leu Ser Asn Leu Ser 165 170 175 Gly Leu Lys Asn Asp Tyr Ser Lys Arg Thr Met Gly Leu Ile Val Ser 180 185 190 Cys Val Gly Met Ile Val Phe Gly Met Ala Ala Gly Leu Ala Thr Asp 195 200 205 Trp Leu Lys Trp Leu Leu Tyr Ile Val Ser Cys Ile Tyr Gly Gly Tyr 210 215 220 Met Tyr Phe Gln Ala Ala Lys Cys Tyr Val Glu Ala Asn His Ser Val 225 230 235 240 Pro Lys Gly His Cys Arg Met Val Val Lys Leu Met Ala Tyr Ala Tyr 245 250 255 Phe Ala Ser Trp Gly Ser Tyr Pro Ile Leu Trp Ala Val Gly Pro Glu 260 265 270 Gly Leu Leu Lys Leu Ser Pro Tyr Ala Asn Ser Ile Gly His Ser Ile 275 280 285 Cys Asp Ile Ile Ala Lys Glu Phe Trp Thr Phe Leu Ala His His Leu 290 295 300 Arg Ile Lys Ile His Glu His Ile Leu Ile His Gly Asp Ile Arg Lys 305 310 315 320 Thr Thr Lys Met Glu Ile Gly Gly Glu Glu Val Glu Val Glu Glu Phe 325 330 335 Val Glu Glu Glu Asp Glu Asp Thr Val 340 345 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Helix 6 consensus motif <220> <221> VARIANT <222> (12)..(12) <223> wherein Xaa12 is Phe or Tyr, in particular wherein Xaa12 is Phe <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> wherein Xaa18 is Met or Ser, in particular wherein Xaa18 is Met <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> wherein Xaa19 is Phe or Tyr, in particular wherein Xaa19 is Phe <400> 3 Cys Arg Met Val Val Lys Leu Met Ala Tyr Ala Xaa Phe Ala Ser Trp 1 5 10 15 Gly Xaa Xaa Pro Ile Leu Trp Ala Val 20 25 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Retinal binding site consensus motif <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> wherein Xaa1 is Leu, Ile, Ala, or Cys <220> <221> VARIANT <222> (3)..(5) <223> wherein Xaa3, Xaa4, and Xaa5 is independently any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (7)..(8) <223> wherein Xaa7 and Xaa8 is independently any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> wherein Xaa9 is Thr, Phe, or Tyr <400> 4 Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 5 <211> 315 <212> PRT <213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 5 Met Asp Tyr Gly Gly Ala Leu Ser Ala Val Gly Arg Glu Leu Leu Phe 1 5 10 15 Val Thr Asn Pro Val Val Val Asn Gly Ser Val Leu Val Pro Glu Asp 20 25 30 Gln Cys Tyr Cys Ala Gly Trp Ile Glu Ser Arg Gly Thr Asn Gly Ala 35 40 45 Gln Thr Ala Ser Asn Val Leu Gln Trp Leu Ala Ala Gly Phe Ser Ile 50 55 60 Leu Leu Leu Met Phe Tyr Ala Tyr Gln Thr Trp Lys Ser Thr Cys Gly 65 70 75 80 Trp Glu Glu Ile Tyr Val Cys Ala Ile Glu Met Val Lys Val Ile Leu 85 90 95 Glu Phe Phe Phe Glu Phe Lys Asn Pro Ser Met Leu Tyr Leu Ala Thr 100 105 110 Gly His Arg Val Gln Trp Leu Arg Tyr Ala Glu Trp Leu Leu Thr Cys 115 120 125 Pro Val Ile Leu Ile His Leu Ser Asn Leu Thr Gly Leu Ser Asn Asp 130 135 140 Tyr Ser Arg Arg Thr Met Gly Leu Leu Val Ser Asp Ile Gly Thr Ile 145 150 155 160 Val Trp Gly Ala Thr Ser Ala Met Ala Thr Gly Tyr Val Lys Val Ile 165 170 175 Phe Phe Cys Leu Gly Leu Cys Tyr Gly Ala Asn Thr Phe Phe His Ala 180 185 190 Ala Lys Ala Tyr Ile Glu Gly Tyr His Thr Val Pro Lys Gly Arg Cys 195 200 205 Arg Gln Val Val Thr Gly Met Ala Trp Leu Phe Phe Val Ser Trp Gly 210 215 220 Met Phe Pro Ile Leu Phe Ile Leu Gly Pro Glu Gly Phe Gly Val Leu 225 230 235 240 Ser Val Tyr Gly Ser Thr Val Gly His Thr Ile Ile Asp Leu Met Ser 245 250 255 Lys Asn Cys Trp Gly Leu Leu Gly His Tyr Leu Arg Val Leu Ile His 260 265 270 Glu His Ile Leu Ile His Gly Asp Ile Arg Lys Thr Thr Lys Leu Asn 275 280 285 Ile Gly Gly Thr Glu Ile Glu Val Glu Thr Leu Val Glu Asp Glu Ala 290 295 300 Glu Ala Gly Ala Val Asn Lys Gly Thr Gly Lys 305 310 315 <210> 6 <211> 300 <212> PRT <213> Volvox carteri <400> 6 Met Asp Tyr Pro Val Ala Arg Ser Leu Ile Val Arg Tyr Pro Thr Asp 1 5 10 15 Leu Gly Asn Gly Thr Val Cys Met Pro Arg Gly Gln Cys Tyr Cys Glu 20 25 30 Gly Trp Leu Arg Ser Arg Gly Thr Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ala Ile 35 40 45 Thr Leu Gln Trp Val Val Phe Ala Leu Ser Val Ala Cys Leu Gly Trp 50 55 60 Tyr Ala Tyr Gln Ala Trp Arg Ala Thr Cys Gly Trp Glu Glu Val Tyr 65 70 75 80 Val Ala Leu Ile Glu Met Met Lys Ser Ile Ile Glu Ala Phe His Glu 85 90 95 Phe Asp Ser Pro Ala Thr Leu Trp Leu Ser Ser Gly Asn Gly Val Val 100 105 110 Trp Met Arg Tyr Gly Glu Trp Leu Leu Thr Cys Pro Val Leu Leu Ile 115 120 125 His Leu Ser Asn Leu Thr Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser Lys Arg Thr 130 135 140 Met Gly Leu Leu Val Ser Asp Val Gly Cys Ile Val Trp Gly Ala Thr 145 150 155 160 Ser Ala Met Cys Thr Gly Trp Thr Lys Ile Leu Phe Phe Leu Ile Ser 165 170 175 Leu Ser Tyr Gly Met Tyr Thr Tyr Phe His Ala Ala Lys Val Tyr Ile 180 185 190 Glu Ala Phe His Thr Val Pro Lys Gly Ile Cys Arg Glu Leu Val Arg 195 200 205 Val Met Ala Trp Thr Phe Phe Val Ala Trp Gly Met Phe Pro Val Leu 210 215 220 Phe Leu Leu Gly Thr Glu Gly Phe Gly His Ile Ser Pro Tyr Gly Ser 225 230 235 240 Ala Ile Gly His Ser Ile Leu Asp Leu Ile Ala Lys Asn Met Trp Gly 245 250 255 Val Leu Gly Asn Tyr Leu Arg Val Lys Ile His Glu His Ile Leu Leu 260 265 270 Tyr Gly Asp Ile Arg Lys Lys Gln Lys Ile Thr Ile Ala Gly Gln Glu 275 280 285 Met Glu Val Glu Thr Leu Val Ala Glu Glu Glu Asp 290 295 300 <210> 7 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ReaChR <400> 7 Met Val Ser Arg Arg Pro Trp Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Val Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Gly Ser Ala Gly Ala Ser Thr Gly Ser Asp Ala Thr Val 20 25 30 Pro Val Ala Thr Gln Asp Gly Pro Asp Tyr Val Phe His Arg Ala His 35 40 45 Glu Arg Met Leu Phe Gln Thr Ser Tyr Thr Leu Glu Asn Asn Gly Ser 50 55 60 Val Ile Cys Ile Pro Asn Asn Gly Gln Cys Phe Cys Leu Ala Trp Leu 65 70 75 80 Lys Ser Asn Gly Thr Asn Ala Glu Lys Leu Ala Ala Asn Ile Leu Gln 85 90 95 Trp Val Val Phe Ala Leu Ser Val Ala Cys Leu Gly Trp Tyr Ala Tyr 100 105 110 Gln Ala Trp Arg Ala Thr Cys Gly Trp Glu Glu Val Tyr Val Ala Leu 115 120 125 Ile Glu Met Met Lys Ser Ile Ile Glu Ala Phe His Glu Phe Asp Ser 130 135 140 Pro Ala Thr Leu Trp Leu Ser Ser Gly Asn Gly Val Val Trp Met Arg 145 150 155 160 Tyr Gly Glu Trp Leu Leu Thr Cys Pro Val Ile Leu Ile His Leu Ser 165 170 175 Asn Leu Thr Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser Lys Arg Thr Met Gly Leu 180 185 190 Leu Val Ser Asp Val Gly Cys Ile Val Trp Gly Ala Thr Ser Ala Met 195 200 205 Cys Thr Gly Trp Thr Lys Ile Leu Phe Phe Leu Ile Ser Leu Ser Tyr 210 215 220 Gly Met Tyr Thr Tyr Phe His Ala Ala Lys Val Tyr Ile Glu Ala Phe 225 230 235 240 His Thr Val Pro Lys Gly Leu Cys Arg Gln Leu Val Arg Ala Met Ala 245 250 255 Trp Leu Phe Phe Val Ser Trp Gly Met Phe Pro Val Leu Phe Leu Leu 260 265 270 Gly Pro Glu Gly Phe Gly His Ile Ser Pro Tyr Gly Ser Ala Ile Gly 275 280 285 His Ser Ile Leu Asp Leu Ile Ala Lys Asn Met Trp Gly Val Leu Gly 290 295 300 Asn Tyr Leu Arg Val Lys Ile His Glu His Ile Leu Leu Tyr Gly Asp 305 310 315 320 Ile Arg Lys Lys Gln Lys Ile Thr Ile Ala Gly Gln Glu Met Glu Val 325 330 335 Glu Thr Leu Val Ala Glu Glu Glu Asp Lys Tyr Glu Ser Ser Leu Glu 340 345 350 <210> 8 <211> 315 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ChR2 helix 6 swap mutant <400> 8 Met Asp Tyr Gly Gly Ala Leu Ser Ala Val Gly Arg Glu Leu Leu Phe 1 5 10 15 Val Thr Asn Pro Val Val Val Asn Gly Ser Val Leu Val Pro Glu Asp 20 25 30 Gln Cys Tyr Cys Ala Gly Trp Ile Glu Ser Arg Gly Thr Asn Gly Ala 35 40 45 Gln Thr Ala Ser Asn Val Leu Gln Trp Leu Ala Ala Gly Phe Ser Ile 50 55 60 Leu Leu Leu Met Phe Tyr Ala Tyr Gln Thr Trp Lys Ser Thr Cys Gly 65 70 75 80 Trp Glu Glu Ile Tyr Val Cys Ala Ile Glu Met Val Lys Val Ile Leu 85 90 95 Glu Phe Phe Phe Glu Phe Lys Asn Pro Ser Met Leu Tyr Leu Ala Thr 100 105 110 Gly His Arg Val Gln Trp Leu Arg Tyr Ala Glu Trp Leu Leu Thr Cys 115 120 125 Pro Val Ile Leu Ile His Leu Ser Asn Leu Thr Gly Leu Ser Asn Asp 130 135 140 Tyr Ser Arg Arg Thr Met Gly Leu Leu Val Ser Asp Ile Gly Thr Ile 145 150 155 160 Val Trp Gly Ala Thr Ser Ala Met Ala Thr Gly Tyr Val Lys Val Ile 165 170 175 Phe Phe Cys Leu Gly Leu Cys Tyr Gly Ala Asn Thr Phe Phe His Ala 180 185 190 Ala Lys Ala Tyr Ile Glu Gly Tyr His Thr Val Pro Lys Gly Arg Cys 195 200 205 Arg Met Val Val Lys Leu Met Ala Tyr Ala Tyr Phe Ala Ser Trp Gly 210 215 220 Ser Tyr Pro Ile Leu Trp Ala Val Gly Pro Glu Gly Phe Gly Val Leu 225 230 235 240 Ser Val Tyr Gly Ser Thr Val Gly His Thr Ile Ile Asp Leu Met Ser 245 250 255 Lys Asn Cys Trp Gly Leu Leu Gly His Tyr Leu Arg Val Leu Ile His 260 265 270 Glu His Ile Leu Ile His Gly Asp Ile Arg Lys Thr Thr Lys Leu Asn 275 280 285 Ile Gly Gly Thr Glu Ile Glu Val Glu Thr Leu Val Glu Asp Glu Ala 290 295 300 Glu Ala Gly Ala Val Asn Lys Gly Thr Gly Lys 305 310 315 <210> 9 <211> 300 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VChR1 helix 6 swap mutant <400> 9 Met Asp Tyr Pro Val Ala Arg Ser Leu Ile Val Arg Tyr Pro Thr Asp 1 5 10 15 Leu Gly Asn Gly Thr Val Cys Met Pro Arg Gly Gln Cys Tyr Cys Glu 20 25 30 Gly Trp Leu Arg Ser Arg Gly Thr Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ala Ile 35 40 45 Thr Leu Gln Trp Val Val Phe Ala Leu Ser Val Ala Cys Leu Gly Trp 50 55 60 Tyr Ala Tyr Gln Ala Trp Arg Ala Thr Cys Gly Trp Glu Glu Val Tyr 65 70 75 80 Val Ala Leu Ile Glu Met Met Lys Ser Ile Ile Glu Ala Phe His Glu 85 90 95 Phe Asp Ser Pro Ala Thr Leu Trp Leu Ser Ser Gly Asn Gly Val Val 100 105 110 Trp Met Arg Tyr Gly Glu Trp Leu Leu Thr Cys Pro Val Leu Leu Ile 115 120 125 His Leu Ser Asn Leu Thr Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser Lys Arg Thr 130 135 140 Met Gly Leu Leu Val Ser Asp Val Gly Cys Ile Val Trp Gly Ala Thr 145 150 155 160 Ser Ala Met Cys Thr Gly Trp Thr Lys Ile Leu Phe Phe Leu Ile Ser 165 170 175 Leu Ser Tyr Gly Met Tyr Thr Tyr Phe His Ala Ala Lys Val Tyr Ile 180 185 190 Glu Ala Phe His Thr Val Pro Lys Gly Ile Cys Arg Met Val Val Lys 195 200 205 Leu Met Ala Tyr Ala Tyr Phe Ala Ser Trp Gly Ser Tyr Pro Ile Leu 210 215 220 Trp Ala Val Gly Thr Glu Gly Phe Gly His Ile Ser Pro Tyr Gly Ser 225 230 235 240 Ala Ile Gly His Ser Ile Leu Asp Leu Ile Ala Lys Asn Met Trp Gly 245 250 255 Val Leu Gly Asn Tyr Leu Arg Val Lys Ile His Glu His Ile Leu Leu 260 265 270 Tyr Gly Asp Ile Arg Lys Lys Gln Lys Ile Thr Ile Ala Gly Gln Glu 275 280 285 Met Glu Val Glu Thr Leu Val Ala Glu Glu Glu Asp 290 295 300 <210> 10 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> ReaChR helix 6 swap mutant <400> 10 Met Val Ser Arg Arg Pro Trp Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Val Ala 1 5 10 15 Leu Ala Ala Gly Ser Ala Gly Ala Ser Thr Gly Ser Asp Ala Thr Val 20 25 30 Pro Val Ala Thr Gln Asp Gly Pro Asp Tyr Val Phe His Arg Ala His 35 40 45 Glu Arg Met Leu Phe Gln Thr Ser Tyr Thr Leu Glu Asn Asn Gly Ser 50 55 60 Val Ile Cys Ile Pro Asn Asn Gly Gln Cys Phe Cys Leu Ala Trp Leu 65 70 75 80 Lys Ser Asn Gly Thr Asn Ala Glu Lys Leu Ala Ala Asn Ile Leu Gln 85 90 95 Trp Val Val Phe Ala Leu Ser Val Ala Cys Leu Gly Trp Tyr Ala Tyr 100 105 110 Gln Ala Trp Arg Ala Thr Cys Gly Trp Glu Glu Val Tyr Val Ala Leu 115 120 125 Ile Glu Met Met Lys Ser Ile Ile Glu Ala Phe His Glu Phe Asp Ser 130 135 140 Pro Ala Thr Leu Trp Leu Ser Ser Gly Asn Gly Val Val Trp Met Arg 145 150 155 160 Tyr Gly Glu Trp Leu Leu Thr Cys Pro Val Ile Leu Ile His Leu Ser 165 170 175 Asn Leu Thr Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser Lys Arg Thr Met Gly Leu 180 185 190 Leu Val Ser Asp Val Gly Cys Ile Val Trp Gly Ala Thr Ser Ala Met 195 200 205 Cys Thr Gly Trp Thr Lys Ile Leu Phe Phe Leu Ile Ser Leu Ser Tyr 210 215 220 Gly Met Tyr Thr Tyr Phe His Ala Ala Lys Val Tyr Ile Glu Ala Phe 225 230 235 240 His Thr Val Pro Lys Gly Leu Cys Arg Met Val Val Lys Leu Met Ala 245 250 255 Tyr Ala Tyr Phe Ala Ser Trp Gly Ser Tyr Pro Ile Leu Trp Ala Val 260 265 270 Gly Pro Glu Gly Phe Gly His Ile Ser Pro Tyr Gly Ser Ala Ile Gly 275 280 285 His Ser Ile Leu Asp Leu Ile Ala Lys Asn Met Trp Gly Val Leu Gly 290 295 300 Asn Tyr Leu Arg Val Lys Ile His Glu His Ile Leu Leu Tyr Gly Asp 305 310 315 320 Ile Arg Lys Lys Gln Lys Ile Thr Ile Ala Gly Gln Glu Met Glu Val 325 330 335 Glu Thr Leu Val Ala Glu Glu Glu Asp Lys Tyr Glu Ser Ser Leu Glu 340 345 350

Claims (21)

  1. 서열 번호 1(크림슨)의 전장 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고,
    그의 친(parent) 광-유도성 이온 채널과는 다음 아미노산 치환 (i) 내지 (iii) 중 하나 이상만이 상이하며:
    (i) 서열 번호 1의 Y261에 상응하는 아미노산 위치에 Phe,
    (ii) 서열 번호 1의 Y268에 상응하는 아미노산 위치에 Phe,
    (iii) 서열 번호 1의 S267에 상응하는 아미노산 위치에 Met;
    상기 치환(들)은, -60 mV의 클램프 전위(clamp potential), 140mM NaCl, 2mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10mM HEPES, pH 7.4의 배쓰 용액, 및 110mM NaCl, 2mM MgCl2, 10mM EGTA, 10mM HEPES, pH 7.4의 피펫 용액에서 전세포 구성에서의 패치-클램프 측정에 의해 비교될 때, 친 채널에 비해 돌연변이 채널의 오프-키네틱스(off-kinetics)를 가속화시키는,
    돌연변이 광-유도성 이온 채널.
  2. 제1항에 있어서, 서열 번호 1(크림슨)의 전장과 적어도 96% 동일성을 가지는, 돌연변이 광-유도성 이온 채널.
  3. 제1항에 있어서,
    서열 번호 1의 Y261에 상응하는 아미노산 위치에 Phe; 또는
    서열 번호 1의 Y268에 상응하는 아미노산 위치에 Phe; 또는
    서열 번호 1의 S267에 상응하는 아미노산 위치에 Met; 또는
    서열 번호 1의 Y261에 상응하는 아미노산 위치에 Phe, 및 서열 번호 1의 S267에 상응하는 아미노산 위치에 Met; 또는
    서열 번호 1의 Y268에 상응하는 아미노산 위치에 Phe, 및 서열 번호 1의 S267에 상응하는 아미노산 위치에 Met; 또는
    서열 번호 1의 Y261에 상응하는 아미노산 위치에 Phe, 서열 번호 1의 Y268에 상응하는 아미노산 위치에 Phe, 및 서열 번호 1의 S267에 상응하는 아미노산 위치에 Met;
    을 포함하는, 돌연변이 광-유도성 이온 채널.
  4. 제1항에 있어서, 서열 번호 1의 위치 176에 상응하는 아미노산 위치에 Arg를 추가로 포함하는, 돌연변이 광-유도성 이온 채널.
  5. 제1항에 있어서, 하기 서열 번호 3의 모티프를 포함하는, 돌연변이 광-유도성 이온 채널:
    Cys - Arg - Met - Val - Val - Lys - Leu - Met - Ala - Tyr - Ala - Xaa12 - Phe - Ala - Ser - Trp - Gly - Xaa18 - Xaa19 - Pro - Ile - Leu - Trp - Ala - Val,
    상기에서,
    Xaa12는 Phe 또는 Tyr이고;
    Xaa18은 Met 또는 Ser이고;
    Xaa19는 Phe 또는 Tyr이다.
  6. 제1항에 있어서,
    (a) 서열 번호 1의 Y261, Y268, 및 S267에 상응하는 아미노산 위치들 중 하나 이상에서의 상기 아미노산 치환(들); 또는
    (b) 서열 번호 1의 Y261, Y268, 및 S267에 상응하는 아미노산 위치들 중 하나 이상에서의 상기 아미노산 치환(들) 및 서열 번호 1의 위치 176에 상응하는 아미노산 위치에서의 Arg;
    를 제외한 서열 번호 1(크림슨)의 아미노산 서열을 포함하는, 돌연변이 광-유도성 이온 채널.
  7. 제1항에 있어서, 적색 광 흡수 채널로돕신인, 돌연변이 광-유도성 이온 채널.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 광-유도성 이온 채널을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구조물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 광-유도성 이온 채널을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  10. 제8항에 따른 핵산 구조물을 포함하는 발현 벡터.
  11. 제8항에 따른 핵산 구조물을 포함하는 단리된 세포.
  12. 제11항에 있어서, 세포가 포유동물 세포인, 단리된 세포.
  13. 제12항에 있어서, 세포가
    (a) 해마 세포, 광수용체 세포, 망막간상 세포, 망막추체 세포, 망막 신경절 세포, 양극성 뉴런, 신경절 세포, 가성 단극 뉴런, 다극 뉴런, 피라미드 뉴런, 푸르키네 세포, 또는 과립 세포; 또는
    (b) 신경모세포종 세포; HEK293 세포; COS 세포; BHK 세포; CHO 세포; 골수종 세포; 또는 MDCK 세포인,
    단리된 세포.
  14. 고속 대량 처리 스크리닝에 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 광-유도성 이온 채널을 사용하는 방법.
  15. 고속 대량 처리 스크리닝에 제11항에 따른 단리된 세포를 사용하는 방법.
  16. 뉴런 세포의 광-자극을 위해 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 광-유도성 이온 채널을 비치료적으로 사용하는 방법.
  17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 것인, 돌연변이 광-유도성 이온 채널.
  18. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이 광-유도성 이온 채널을 포함하는 비-인간(non-human) 동물.
  19. 제8항에 따른 핵산 구조물을 포함하는 비-인간(non-human) 동물.
  20. 제9항에 따른 발현 벡터를 포함하는 비-인간(non-human) 동물.
  21. 세포를 포함하는 비-인간(non-human) 동물로서, 상기 세포가 제8항에 따른 핵산 구조물을 포함하는 것인, 비-인간 동물.
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