JP7843342B2

JP7843342B2 - ｅＮＡＭＰＴ増加剤、サーチュイン活性化又は発現増強剤、ＮＡＤ＋増加剤、及び老化細胞抑制剤

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Description

本発明は、ｅＮＡＭＰＴ増加、サーチュインの活性化又は発現増強、ＮＡＤ^＋増加、及び老化細胞の抑制に用いられる剤に関する。

線虫、ハエ、哺乳動物などで高発現することにより寿命が延長され、欠損により寿命が短くなる分子として、サーチュイン（Ｓｉｒｔｕｉｎ）が知られている。サーチュインは、ＮＡＤ^＋依存性脱アセチル化酵素であり、その遺伝子は細菌から真核生物まで広く保存されている。酵母や線虫のサーチュインホモログであるＳｉｒ２を欠損させると寿命が短縮し、過剰発現させると寿命が延長することから、サーチュインは動物における長寿遺伝子の候補として注目されている。哺乳類には、７つのサーチュイン（ＳＩＲＴ１～７）が存在し、中でも構造や機能が酵母Ｓｉｒ２と最も類似しているＳＩＲＴ１は、老化に伴う遺伝子の発現、細胞内代謝、エネルギー消費、炎症及びストレス応答経路等の幅広い細胞機能の制御に関与する可能性が明らかにされている（非特許文献１）。
また、近年、サーチュインは特定の疾患との関係の可能性も明らかにされている。例えば、非特許文献２にはＳＩＲＴ１のノックアウトマウスでは即時記憶、古典的条件付け及び空間学習を含む認知機能が低下した。逆に、ＳＩＲＴ１の過剰発現は規則正しいシナプス可塑性と記憶を示すことが認められた。このことから、ＳＩＲＴ１が正常な学習、記憶、シナプス可塑性に作用することが明らかにされている。また、ＳＩＲＴ１との間で、非特許文献３には肝脂肪症、非特許文献４には心機能、との関係性が、それぞれ記載されている。

ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）は、生体内において、脱水素酵素の補酵素やサーチュインの基質として機能している。またＮＡＤ^＋量の増加は、サーチュインの活性を増大することが知られている。ＮＡＤの合成はニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＮＡＭＰＴ）によって制御されている。ＮＡＭＰＴの働きは年齢とともに低下するため、ＮＡＤ^＋量が減少し、サーチュインの活性は低下することが知られている。非特許文献５には、ＮＡＤ^＋の前駆体であるニコチンアミドリボシドの投与が脳内の細胞老化を抑制することが開示されている。また、ＮＡＤ^＋について、非特許文献６には非アルコール性脂肪性肝疾患、非特許文献７には腎障害、との関係性が、それぞれ記載されている。

細胞老化は、細胞分裂に伴うＤＮＡ複製エラーの蓄積、酸化ストレス、放射線、がん遺伝子の活性化等を介して過度なＤＮＡ損傷が生じることにより、ｐ１６／ＲＢ経路やｐ５３／ｐ２１経路が活性化され、サイクリン阻害キナーゼの阻害因子が誘導されることにより不可逆的な細胞周期の停止が起こる現象である。細胞老化を起こした細胞（老化細胞）は、加齢に伴うミトコンドリア及び免疫機能の低下による細胞老化の促進や除去能力の低下により組織内に蓄積する。組織内に蓄積した老化細胞は細胞老化関連分泌因子と呼ばれる炎症性サイトカインやプロテアーゼ等を分泌することで、周囲の組織を傷害し、組織や生体の老化を促進する。一方、老化細胞の除去は組織の機能障害を防止あるいは遅延させ、老化を抑制することが示唆されている（非特許文献８）。また、老化細胞の増加が腎障害（非特許文献９）、脂肪肝（非特許文献１０）に関与することが明らかになっている。

一方、Ｓ－１－プロペニルシステインは、下記式（１）で示されるシステイン誘導体であり、ニンニク等のアリウム属植物に含まれ得る含硫成分の一つである。

Ｓ－１－プロペニルシステインは、免疫調節作用（特許文献１）、血圧降下作用（特許文献２）、抗酸化作用（特許文献３）、血流改善作用（特許文献４）、オートファジー活性化作用（特許文献５）、歯周病予防、治療又は改善作用（特許文献６）等の薬理作用を有することが報告されている。しかしながら、Ｓ－１－プロペニルシステインの、ｅＮＡＭＰＴ増加、サーチュインの活性化や老化細胞抑制、ＮＡＤ^＋増加については全く知られていない。

国際公開第２０１６／０８８８９２号国際公開第２０１６／１９９８８５号特開２０２０－０２９５２９号公報国際公開第２０１９／０３１４４２号国際公開第２０１９／２３５５９７号国際公開第２０２０／２３０８１３号

Trends Cell Biol. 2014;24(8):464-71. J Neurosci 2010;30(29):9695-9707. Molecular Medicine Reports 2018;18:1609-1615 Aging 2021;13(10):14482-14498 Cell Metab. 2018 Mar 6;27(3):513-528. British Journal of Pharmacology 2016;173:2352-2368 Nature 2016;531(7595):528-532 Nature. 2011 Nov 2;479(7372):232-6. Front Pharmacol. 2019;10:770. Nature Communications 2017;8:15691

本発明は、Ｓ－１－プロペニルシステイン、その塩、又はこれらを含有する組成物の新規用途を提供することに関する。

本発明は、以下の１）～１１）に係るものである。
１）Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を有効成分とするｅＮＡＭＰＴ増加剤。
２）Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を含有し、動物に投与される、ｅＮＡＭＰＴ増加剤。
３）血液中ｅＮＡＭＰＴの増加に用いられる２）記載の剤。
４）Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を含有し、動物に投与されて、１以上の器官における、サーチュインの活性化又は発現増強、又は老化細胞抑制に用いられる剤。
５）Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を含有し、動物に投与されて、１以上の器官におけるＮＡＤ^＋増加に用いられる剤。
６）前記器官は、脳、腎臓、骨格筋、肝臓、及び心臓からなる群より選ばれる１以上を含む４）又は５）記載の剤。
７）前記器官は、骨格筋、肝臓、及び心臓からなる群より選ばれる１以上を含む６）記載の剤。
８）前記器官は、さらに、脳及び腎臓からなる群より選ばれる１以上を含む７）記載の剤。
９）２以上の器官に作用させるための４）～８）のいずれか１項記載の剤。
１０）３以上の器官に作用させるための９）記載の剤。
１１）食品添加剤又は食品の形態である、１）～１０）のいずれか１項記載の剤。

本発明によれば、Ｓ－１－プロペニルシステイン、その塩、又はこれらを含有する組成物の新規用途を提供することができる。

Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による大脳皮質のサーチュイン活性化作用を示す。Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による海馬のＳＩＲＴ１タンパク質量の変化を示す。Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による海馬のＮＡＤ^＋量の変化を示す。Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による海馬における老化細胞マーカーであるｐ５３タンパク質の変化を示す。Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による腎臓のＳＩＲＴ１の発現量の変化を示す。Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による腎臓における老化細胞マーカーであるｐ１６及びｐ２１遺伝子の発現量の変化を示す。Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による腎臓における腎障害のマーカーであるＫＩＭ－１及びＮＧＡＬ遺伝子タンパク質量の変化を示す。Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による認知・記憶の維持を示す。Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による腎臓、骨格筋、肝臓のＮＡＤ^＋量の変化を示す。Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による大脳皮質、海馬、心臓、肺、肝臓、腎臓、骨格筋のＳＩＲＴ１タンパク質量の変化を示す。Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による視床下部のＳＩＲＴ１タンパク質量の変化を示す。Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による血液中ｅＮＡＭＰＴ量の変化を示す。Ｓ－１－プロペニルシステインの投与による肝臓、心臓のＳＩＲＴ１タンパク質量の変化を示す。

＜剤＞
「Ｓ－１－プロペニルシステイン」は、下記式（１）の波線で示されるように、シス又はトランスの立体配置が存在する。本発明において、Ｓ－１－プロペニルシステインはトランス体の割合が多いものが好ましく、トランス体の割合がトランス体とシス体の合計を１００％とした場合に、５０～１００％であるのがより好ましく、７５～１００％であるのがより好ましく、８０～１００％であるのがより好ましく、９０～１００％であるのがさらに好ましい。
また、システイン構造中に不斉炭素が存在することから光学異性体が存在するが、Ｄ体、Ｌ体あるいはラセミ体のいずれであってもよい。

Ｓ－１－プロペニルシステインの塩は、生理学的に許容される塩であり、また、酸付加塩又は塩基付加塩の何れでもよい。酸付加塩としては、たとえば、（イ）塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの鉱酸との塩、（ロ）ギ酸、酢酸、クエン酸、フマル酸、グルコン酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸との塩、（ハ）メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などのスルホン酸類との塩を、また、塩基付加塩としては、たとえば、（イ）ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属との塩、（ロ）カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩、（ハ）アンモニウム塩、（ニ）トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ－ベンジル－β－フェネチルアミン、１－エフェナミン、Ｎ，Ｎ′－ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩を挙げることができる。

更に、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩は、未溶媒和型のみならず、水和物や溶媒和物としても存在することができ、斯かる水和物又は溶媒和物は製造条件により任意の結晶形として存在することができる。従って、本発明におけるＳ－１－プロペニルシステイン又はその塩は、全ての立体異性体、水和物、溶媒和物、及び全ての多形結晶形態もしくは非晶形を包含するものである。

Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩は、有機合成手法により取得することができる（〔１〕Tetrahedron Letter, 1975, 37, 3201-3202；〔２〕Synthesis, 2006, 20, 3367-3369；〔３〕Bull. Korean Chem. Soc. 2011, 32(1), 319-320）。
また、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩は、アリウム属植物を種々の方法で加工することにより得ることができる。例えば、加熱処理したアリウム属植物に、Bacillus subtilis由来のプロテアーゼ又はラクターゼを含む酵素を作用させＳ－１－プロペニルシステインを得る方法（特許第６１０５８７１号公報）、アリウム属の植物の搾汁又は抽出物にガンマグルタミルトランスペプチダーゼ又はグルタミナーゼ活性を有する酵素を共存させＳ－１－プロペニルシステインを得る方法（特開２０１５－１４４５７１号公報）、ニンニクに酵母を接種し発酵させＳ－１－プロペニルシステインを得る方法（韓国特許第２０１０－０７２８７４－５号）、アリウム属植物をエタノール水溶液中で１ヵ月以上熟成し、Ｓ－１－プロペニルシステインを得る方法（国際公開第２０１６／０８８８９２号、Molecules. 2017;22:570.）等が挙げられる。

ここでアリウム属植物としては、ニンニク（Allium sativum L.）、タマネギ（Allium cepa L.）、エレファントガーリック（Allium ampeloprasum L.）、ニラ（Allium tuberosum）及びネギ（Allium fistulosum L.）等が挙げられる。これらの植物は、単独あるいは組み合わせて用いてもよい。また、上記アリウム属植物は生のものをそのまま、あるいは必要に応じて外皮を取り除き、切断又は細断したもの、あるいはこれらを粉末化したもの、また、医薬や食品の製造に可能な溶媒を用いて抽出したものを用いることができる。溶媒としては、水やアルコールなどや、酸あるいは塩基性物質を溶媒に添加したものなどが挙げられる。

本発明のＳ－１－プロペニルシステイン又はその塩は、単離・精製されたもののみならず、粗生成物、上記植物又はその加工物、上記植物からの抽出操作によりＳ－１－プロペニルシステイン又はその塩の含有量が高められた画分を用いることができる。

本発明において、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩は、乾燥物換算で１ｐｐｍ以上、好ましくは１０ｐｐｍ以上、１００ｐｐｍ以上、５００ｐｐｍ以上、又は１０００ｐｐｍ以上の量で含まれてよい。当該含有量の上限は、特に限定されないが、１０００００ｐｐｍ以下、５００００ｐｐｍ以下、又は１００００ｐｐｍ以下であってよい。

例えば、以下に示すように、１）アリウム属植物を１０～５０％のエタノール水溶液中、０～８０℃で、１ヶ月以上抽出し（工程１）、２）得られた抽出物を固液分離後、エタノール溶出画分を回収する（工程２）、ことにより取得することができる。

工程１）で使用するエタノール水溶液は、１０～５０％のエタノール水溶液を使用することができるが、好ましくは２０～４０％のエタノール濃度に調製されたものである。また、処理温度は０～８０℃の範囲に設定することができるが、好ましくは１０～６０℃、更に好ましくは２０～４０℃である。処理期間は上記条件下で少なくとも１ヶ月以上抽出に付すことができるが、好ましくは１～２０ヶ月、更に好ましくは１～１０ヶ月である。また、本工程は衛生面やエタノールの揮発等を考慮し、気密、密封あるいは密閉容器内で行うことができるが、密閉容器を使用するのが好ましい。

工程２）では、工程１）で得られた抽出物を固液分離後、エタノール溶出画分が回収される。回収物を適宜濃縮することにより、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を含む抽出画分を得ることができる。当該抽出画分は、そのまま使用することができるが、適宜、スプレードライなどにより乾燥させて使用することもできる。

更に、上記Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を含む抽出画分からのＳ－１－プロペニルシステイン又はその塩の単離は、必要に応じて分子排除サイズ３０００～４０００の透析膜を用いて透析に付し、次いで陽イオン交換樹脂を用いた吸着・分離、順相クロマトグラフィー又は逆相クロマトグラフィーによる分離精製手段を適宜組み合わせることにより行うことができる。
ここで、陽イオン交換樹脂を用いた吸着・分離は、陽イオン交換樹脂（例えば、アンバーライト（ダウ・ケミカル社）、ＤＯＷＥＸ（ダウ・ケミカル社製）、ＤＩＡＩＯＮ（三菱化学製）等）に吸着させ、０．１～３Ｎのアンモニア水で溶出させる方法が挙げられる。
順相クロマトグラフィーとしては、例えばシリカゲルカラムを用いて、クロロフォルム／メタノール／水混合物等で溶出させる方法が挙げられる。
逆相クロマトグラフィーとしては、例えばオクタデシルシリルカラムを用いて、０．０１～３％ギ酸水溶液等で溶出させる方法が挙げられる。

好ましくは、上記エタノール抽出画分を透析（透析膜：分子排除サイズ３０００～４０００）し、次いで陽イオン交換樹脂に吸着させた後、０．５～２Ｎのアンモニア水で溶出し、溶出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：クロロフォルム／メタノール／水混合物）に付して目的物を含む画分を回収し、さらに分取用逆相カラムクロマトグラフィー（溶媒：０．１～０．５％ギ酸水溶液）に付して目的物を回収する方法が挙げられる。
上記工程１）及び２）によって得られるＳ－１－プロペニルシステインは、トランス体の割合が、トランス体とシス体の合計を１００％とした場合に、大凡７０～９０％である。

本発明におけるＳ－１－プロペニルシステイン又はその塩は、例えば原料の一つであるニンニクの希エタノール抽出液（エキス分１４．５％，アルコール数１．１８）のＬＤ_５０値が、経口、腹腔及び皮下のいずれの投与経路においても、５０ｍｌ／ｋｇ以上であること（The Journal of Toxicological Sciences. 1984;9:57.）及びニンニクやタマネギ等のアリウム属植物が食品として常用されていること、等により一般に低毒性である。

後記試験例に示すように、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩は、血液中ｅＮＡＭＰＴを増加させた。よって、Ｓ－１－プロペニルシステイン、その塩又はこれらを含有する組成物は、ｅＮＡＭＰＴ増加剤となり得る。
脂肪組織等から分泌されたｅＮＡＭＰＴ、細胞外型ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼは、血液等の体液中を循環して全身の１以上の臓器の細胞へと送出され、ＮＡＤ^＋合成を促進する。実際、動物の脳、腎臓、骨格筋及び肝臓でＮＡＤ^＋（サーチュインの機能を向上する機能が知られている。）を増加させた。
そして、老化促進マウスの大脳皮質においてＳＩＲＴ１活性を増加させ、海馬、腎臓、視床下部、心臓、肺、肝臓、及び骨格筋においてＳＩＲＴ１の発現を増加させた。
また、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩は、老化細胞のマーカーであるｐ１６及びｐ２１を腎臓で、ｐ５３を海馬で発現した細胞を抑制した。

血液中ｅＮＡＭＰＴの動態及び作用と、血液中ｅＮＡＭＰＴ増加、各種臓器におけるＮＡＤ^＋増加、サーチュインの活性化又は発現増強、及び老化細胞抑制という現象とを総合的に考慮すると、Ｓ－１－プロペニルシステイン、その塩又はこれらを含有する組成物は、動物に投与されて、１以上（好ましくは、各用途について独立に、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、又は７以上）の器官における、サーチュインの活性化又は発現増強、ＮＡＤ^＋増加、老化細胞抑制に用いることができる。

器官は、特に限定されず、例えば脳、腎臓、骨格筋、肝臓、及び心臓の１以上が挙げられる。中でも、器官は、骨格筋、肝臓、及び心臓の１以上が挙げられ、これに加えて脳及び腎臓の１以上を含んでもよい。

ただし、本発明は、脳のみに作用する態様を含まなくてもよい。また、本発明は、サーチュインの活性化又は発現増強、老化細胞抑制に関して、腎臓のみに作用する態様を含まなくてもよい。また、本発明は、サーチュインの活性化又は発現増強に関して、脳及び腎臓のみに作用する態様を含まなくてもよい。

本発明のサーチュインの活性化又は発現増強剤及び老化細胞抑制剤は、サーチュインの低活性又は低発現に起因する症状、又は老化細胞の増加に起因する症状の予防、治療又は改善のために用いられてよい。
ＳＩＲＴ１の機能低下や細胞老化の亢進は、既に述べたように、腎障害、認知／記憶障害（短期及び長期を含む。）、肝脂肪症、心機能不全、脂肪肝等の症状や疾患に関わっているとされている（非特許文献２～４、９～１０）。腎障害としては、ＫＩＭ－１及びＮＧＡＬが高発現する疾患、急性腎障害、糖尿病性腎症、ネフローゼ症候群等が挙げられる。認知／記憶障害としては、大脳皮質又は海馬の神経障害、学習障害、記憶障害（短期及び長期を含む。）等が挙げられる。

本発明において、「サーチュイン」とは、サーチュインタンパク質及びそのホモログを意味する。ヒトのサーチュインには、１～７（ＳＩＲＴ１～７）が知られているが、本発明においてはＳＩＲＴ１が好ましい。

「サーチュイン発現増強」とは、サーチュイン遺伝子の転写産物及び／又はサーチュインタンパク質が増加することであって、例えば、遺伝子の転写及び／又は翻訳の活性化、転写産物及び／又はタンパク質の安定性の向上、転写産物及び／又はタンパク質分解の阻害等、が包含される。

本発明において、「細胞老化」とは、細胞に不可逆的な細胞周期の停止が起こる現象を指す。細胞老化は、例えば、脳細胞（例えば、海馬細胞、大脳皮質細胞）、腎細胞、肝臓、骨格筋で認められている。「老化細胞抑制」とは、老化細胞の除去、細胞老化現象の予防又は遅延、の一方又は双方を指す。

ｐ１６、ｐ２１及びｐ５３遺伝子は、細胞老化を引き起こすＤＮＡ損傷の分子マーカーとして知られているが、本発明の老化細胞抑制剤は、細胞老化を促進するミトコンドリアの機能不全やＤＮＡ損傷を抑制するものがより好ましい。また、免疫機能を高めることにより老化細胞をより効果的に抑制することができる。

本発明のＮＡＤ^＋増加剤は、ＮＡＤ^＋の低存在に起因する症状の予防、治療又は改善のために用いられてよい。
ＮＡＤ^＋の低存在は、既に述べたように、非アルコール性脂肪性肝疾患、腎障害等の症状や疾患に関わっているとされている（非特許文献２～５、１０～１２）。腎障害としては、ＫＩＭ－１及びＮＧＡＬが高発現する疾患、急性腎障害、糖尿病性腎症、ネフローゼ症候群等が挙げられる。

本発明のｅＮＡＭＰＴ及び／又はＮＡＤ^＋増加剤、サーチュイン活性化／発現増強剤及び老化細胞抑制剤は、医薬又は食品の形態であってもよく、あるいはこれらに添加される素材又は製剤の形態であってもよい。

また、当該食品には、ｅＮＡＭＰＴ及び／又はＮＡＤ^＋増加、サーチュイン活性化／発現増強又は老化細胞抑制をコンセプトとし、必要に応じてその機能に基づく作用を説明表示した食品、機能性食品、機能性表示食品、病者用食品、特定保健用食品、栄養補助食品（サプリメント）が包含される。

当該医薬の剤形は、経口に適した剤形であることが好ましい。経口投与製剤の具体的な剤形として、例えば、固形剤としては錠剤、カプセル剤、細粒剤、丸剤、顆粒剤、液剤としては乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤等の形態が挙げられる。斯かる医薬製剤は、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩に、必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色料、矯味矯臭剤、ｐＨ調整剤等を適宜配合し、常法に従って調製することができる。
ただし、当該医薬の剤形は、特に限定されず、非経口に適した剤形、例えば、静脈内（注射、カテーテル）、経粘膜（液剤又は軟膏）、頭蓋内投与（カテーテル）に適した剤形であってもよい。

食品の形態は、特に限定されるものではなく、例えば、固形食品、半流動食品、ゲル状食品、錠剤、キャプレット、カプセル剤等、種々の形態をとることができ、更に具体的には、菓子、飲料、調味料、水産加工食品、食肉加工食品、パン、健康食品等の種々の食品の形態であり得る。
斯かる食品は、これらの食品を通常製造する場合に用いられる食品素材と、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を適宜配合し、常法により製造することができる。

上記医薬又は食品には、ｅＮＡＭＰＴ及び／又はＮＡＤ^＋増加、サーチュインの活性化、発現増強や老化細胞抑制に関与する他の物質、例えば、レスベラトロールやニコチンアミドモノヌクレオチドを含有することができる。また、炎症を和らげるようなビタミン類、脂質類、ミネラル類、例えば、ビタミンＣ、ビタミンＥ，ビタミンＢ２，ビタミンＢ６，ナイアシン、ヘスペリジン、α－リポ酸、グルタチオン、コエンザイムＱ１０、亜鉛、マグネシウム、オメガ３脂肪酸などを含有することができる。

上記医薬又は食品の、一日当たりの好ましい摂取量は、摂取する対象、摂取の形態、同時に摂取する素材や添加剤等の種類、摂取の間隔等の要因に依存して変動するものであるが、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩として、一日当たり０．００１～１０ｍｇ／ｋｇ摂取することが好ましく、０．１～１ｍｇ／ｋｇ摂取することがより好ましい。また、所望により、この一日量を２～４回に分割して摂取することもできる。

投与又は摂取対象としては、サーチュインの活性低下又は発現低下、老化細胞が増加している、あるいはＮＡＤ^＋及び／又はｅＮＡＭＰＴの量が低下している生物が挙げられるが、これら又は特定疾患（例えば糖尿病、腎障害）のない健常生物であってもよい。当該生物は、これまでに説明してきた動物に限らず、線虫、細胞（前記の動物又は植物に由来してよい。）も含むが、動物が好ましい。当該動物としては、脊椎動物（好ましくはげっ歯類及び霊長類）、魚類、鳥類、昆虫類及び爬虫類が挙げられ、特にげっ歯類（特にラット及びマウス）及び霊長類（特にヒト及びサル）が好ましい。

アリウム属植物の加工物やアリウム属植物に含まれる含硫成分が動物に投与されて、動物体内でｅＮＡＭＰＴ増加、サーチュイン活性化又は発現増強、ＮＡＤ^＋増加を実証された事実、及び、動物体内の非がん細胞の老化抑制を実証された事実は、本発明者らが知る限り存在しない。これらは、本発明者らの鋭意検討の結果、予想外に発見されたものである。

腎障害、認知／記憶障害（短期及び長期を含む。）、肝脂肪症、心機能不全、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝疾患等に罹患したヒト、あるいは当該疾患の予防を望む動物（例えばヒト）等が挙げられるが、健常生物も好ましい。

＜別の態様＞
別の態様において、本発明は、上述した各種用途に使用するためのＳ－１－プロペニルシステイン又はその塩、又は、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を含有する組成物に関してもよい。
別の態様において、本発明は、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩、又は、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を含有する組成物を投与して、上述した各種用途に使用する方法に関してもよい。
別の態様において、本発明は、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩の、又は、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を含有する組成物の、上述した各種用途としての使用に関してもよい。
別の態様において、本発明は、上述した各種用途に使用される剤の製造における、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩、又は、Ｓ－１－プロペニルシステイン又はその塩を含有する組成物の使用に関してもよい。
これらの態様の詳細は、上述した剤の詳細と同様である。

製造例１ニンニクのエタノール抽出画分
外皮を取り除いたニンニク鱗茎約１ｋｇと約１０００ｍＬの３０％エタノールを容器に入れ密閉した。この容器を室温で１～１０ヶ月放置し、適宜攪拌した。この混合物から固体と液体を分離し、液体をスプレードライによって乾燥させ、黄褐色の粉末を得た。

製造例２ニンニクのエタノール抽出画分からのＳ－１－プロペニルシステインの単離
（１）製造例１で得られたニンニクのエタノール抽出画分をポアサイズ３５００の透析チューブに入れ、精製水に対して透析を行った。透析外液を陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０Ｗｘ８（Ｈ＋）に通じ、精製水で樹脂を良く洗浄した。樹脂に吸着したアミノ酸類を２Ｎのアンモニアで溶出させ、減圧濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムに付し、クロロフォルム／メタノール／水混合物を溶媒としてカラムクロマトグラフィーを行った。目的物（Ｓ－１－プロペニルシステイン）を含む画分を回収し、濃縮した。濃縮物を水に溶解し、分取用逆相カラム（オクタデシルシリルカラム）を用いて、０．１％ギ酸を溶媒としてクロマトグラフィーを行い、目的物を回収し溶媒を凍結乾燥によって取り除いた。得られた凍結乾燥物は、ＮＭＲ（溶媒：重水）及び質量分析装置にて、構造を以下に示す標準物質から得られたスペクトルと比較し、トランス－Ｓ－１－プロペニルシステインとシス－Ｓ－１－プロペニルシステイン（トランス体：シス体＝８：２）の混合物であることを確認した。

ｔｒａｎｓ－Ｓ－１－プロペニルシステイン
¹H-NMR (500 MHz, in D₂O-NaOD, δ): 1.76 (d, 3H, J = 7.0 Hz), 2.98 (dd, 1H, J = 7.5, 14.5 Hz), 3.14 (dd, 1H, J = 4.5, 14.5 Hz) 3.69 (dd, 1H, J = 4.5, 7.5Hz), 5.10-5.14 (m, 1H), 6.02(d, 1H, J = 15.5 Hz);
¹³C-NMR (125 MHz, in D₂O-NaOD, δ): 17.61, 33.53, 53.70, 119.92, 132.12, 172.73,
HRMS: observed [M+H]⁺ = 162.0583, calculated [M+H]⁺ = 162.0581

ｃｉｓ－Ｓ－１－プロペニルシステイン
¹H-NMR (500 MHz, in D₂O, δ): 1.74 (d, 3H, J = 7.0 Hz), 3.21 (dd, 1H, J = 7.5, 15.0 Hz), 3.31 (dd, 1H, J = 4.5, 15.0 Hz), 3.95 (dd, 1H, J = 4.5, 7.5 Hz), 5.82-5.86 (m, 1H), 6.01(d, 1H, J = 9.5 Hz);
¹³C-NMR (125 MHz, in D₂O-NaOD, δ): 13.89, 33.88, 54.16, 122.58, 127.78, 172.63.
HRMS: observed [M+H]⁺ = 162.0580, calculated [M+H]⁺ = 162.0581

（２）ニンニクのエタノール抽出画分中のＳ－１－プロペニルシステインの測定
製造例１（１）で得られたニンニクのエタノール抽出画分を５００ｍｇから１ｇ容器に取り、内部標準としてＳ－ｎ－３－ブテニルシステインの２０ｍＭ塩酸溶液を加え、２０ｍＭ塩酸にて２０ｍＬとした。良く攪拌した後、一部を取り１７５０Ｇにて遠心分離を約１０分間行った。得られた上清を一部取り、遠心式ろ過ユニット（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ、ｃｕｔｏｆｆ：３０００）を用いて遠心ろ過を行った（１５０００ｒｐｍ、１０分）。得られたろ過物２０μＬを取り、ＡｃｃＱ・ＴａｇＤｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて誘導体化をおこなった。別途、標準化合物を２０ｍＭ塩酸に溶解し、試料と同様の操作を行い、検量線用標準液を調製した。試料溶液及び標準液をＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）にてクロマトグラフィーを行い、含量を求めた。その結果、Ｓ－１－プロペニルシステインは、３．７±０．３ｍｇ／ｇ乾燥物であった。

試験例
サーチュイン活性化作用
（１）試料の調製
生物活性を評価するための被検液の調製を以下の通り行った。生物活性評価に際し、被検液はいずれも用時調製を行った。
（ａ）製造例２で製造したＳ－１－プロペニルシステイン（シス／トランス混合物）を約５ｍｇ精密に量り取り、精製水１０ｍＬに溶解し、投与液とした。
（ｂ）製造例２で製造したＳ－１－プロペニルシステイン（シス／トランス混合物）を約６ｍｇ精密に量り取り、培養液１ｍＬに溶解した。この液を原液とし、適宜希釈してｉｎｖｉｔｒｏ試験に供した。

（２）評価試験用動物
生物活性を評価するための動物を以下のように飼育した。試験用老化促進マウスＳＡＭＰ８（雄性）を日本エスエルシーより購入した。購入後、１週間の順化を行い、評価試験用動物とした。

（３）評価試験用ヒト神経芽細胞の調製
ヒト神経芽細胞株ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を１０％ウシ胎児血清、抗生物質ペニシリン、ストレプトマイシン溶液を添加したダルベッコ改変イーグル培地で培養し、評価試験用細胞とした。

（４）サーチュイン活性化試験
サーチュインの活性を測定するためにプロメガ社製のＳＩＲＴ１＿ＧＬＯキットを購入した。大脳皮質の溶解液を９６穴プレートに入れ、各種反応試薬を添加したのちにプレートリーダーによりルシフェラーゼの発光強度を測定した。

（ａ）ＳＩＲＴ１活性化作用（ｉｎｖｉｖｏ）：
上記（２）の評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を単回経口投与した後、１５、３０、６０、１８０分後に大脳皮質を摘出した。大脳皮質は組織自動破砕機を用いて破砕後に細胞溶解液を加え可溶化した。遠心分離を行い、その上清中のサーチュインの活性を測定した。結果を図１に示す。
Ｓ－１－プロペニルシステインを投与１８０分後にサーチュイン活性が増加した。（図１）。

（ｂ）ＳＩＲＴ１タンパク質増加作用（ｉｎｖｉｖｏ）：
上記（２）の評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を２週間反復経口投与した後、海馬を摘出した。海馬は組織自動破砕機を用いて破砕後にサーモフィッシャーサイエンティフィック社製のプロテアーゼ／ホスファターゼ混合型阻害剤を添加した精製水で１０倍に希釈したミリポア社製のＲＩＰＡ細胞溶解用緩衝液により細胞を溶解した後、遠心（１００００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、上清を細胞抽出液とした。この細胞抽出液を用いて定法に従いウエスタンブロッティング法により解析した。抗体は、抗ＳＩＲＴ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、及び抗β－アクチン抗体（富士フィルム和光純薬社製）を用いた。結果を図２に示す。Ｓ－１－プロペニルシステインは、ＳＩＲＴ１タンパク質量を増加させた。

（Ｃ）ＮＡＤ^＋量増加作用（ｉｎｖｉｖｏ）：
上記（２）の評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を単回経口投与した１８０分後に大脳皮質を摘出した。また、上記（２）の評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を餌に混ぜ、１カ月間摂餌した後、大脳皮質を摘出した。大脳皮質中のＮＡＤ^＋量は同仁化学研究所製ＮＡＤ^＋／ＮＡＤＨＡｓｓａｙＫｉｔを用いて測定した。結果を図３に示す。Ｓ－１－プロペニルシステインは、ＮＡＤ^＋量を増加させた。

（５）海馬における細胞老化マーカーｐ５３タンパク質発現抑制作用（ｉｎｖｉｖｏ）：
上記（２）の評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を６週間反復経口投与した後、海馬を摘出した。海馬は組織自動破砕機を用いて破砕後にロシュ社製のプロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤を添加した精製水で１０倍に希釈したミリポア社製のＲＩＰＡ細胞溶解用緩衝液により細胞を溶解した後、遠心（１００００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、上清を細胞抽出液とした。この細胞抽出液を用いて定法に従いウエスタンブロッティング法により解析した。抗体は、抗ｐ５３抗体（プロテインテック社製）、及び抗β－アクチン抗体（医学生物学研究所製）を用いた。結果を図４に示す。Ｓ－１－プロペニルシステインは、ｐ５３タンパク質量を減少させた。

（６）腎臓におけるＳＩＲＴ１遺伝子発現増強作用（ｉｎｖｉｖｏ）：
上記（２）の評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を２週間反復経口投与した後、腎臓を摘出した。腎臓は組織自動破砕機を用いて破砕後にサーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＴＲＩｚｏｌ溶液を用いてＲＮＡを抽出した。ＴＡＫＡＲＡ社製のＰＲＩＭＥＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔｗｉｔｈｇＥｒａｓｅｒを用いて、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを日本ジェネティクス社製のＫＡＰＡＳＹＢＲＦａｓｔｑＰＣＲキットを用いてＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲを行った。結果を図５に示す。Ｓ－１－プロペニルシステインは、マウス腎臓においてＳＩＲＴ１の発現を増加させた。

（７）腎臓における老化細胞マーカーｐ１６及びｐ２１遺伝子発現抑制作用（ｉｎｖｉｖｏ）：
上記（２）の評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を２週間反復経口投与した後、腎臓を摘出した。腎臓は組織自動破砕機を用いて破砕後にサーモフィッシャーサイエンティフィック社製のＴＲＩｚｏｌ溶液を用いてＲＮＡを抽出した。
ＴＡＫＡＲＡ社製のＰＲＩＭＥＳｃｒｉｐｔＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔｗｉｔｈｇＥｒａｓｅｒを用いて、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを日本ジェネティクス社製のＫＡＰＡＳＹＢＲＦａｓｔｑＰＣＲキットを用いてＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲを行った。結果を図６に示す。Ｓ－１－プロペニルシステインは、老化促進マウスの腎臓においてｐ１６及びｐ２１遺伝子発現した細胞を減少させた。

（８）腎障害抑制作用（ｉｎｖｉｖｏ）：
上記（２）の評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を２週間反復経口投与した後、腎臓を摘出した。腎臓は組織自動破砕機を用いて破砕後にロシュ社製のプロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤を添加した精製水で１０倍に希釈したミリポア社製のＲＩＰＡ細胞溶解用緩衝液により細胞を溶解した後、遠心（１００００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、上清を細胞抽出液とした。この細胞抽出液を用いて定法に従いウエスタンブロッティング法により解析した。抗体は、腎障害のマーカーである腎臓障害分子（ＫＩＭ－１）抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ社製）及びリポカリンー２（ＮＧＡＬ）抗体（プロテインテック社製）、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（富士フィルム和光純薬社製）を用いた。結果を図７に示す。Ｓ－１－プロペニルシステインは、ＫＩＭ－１及びＮＧＡＬを低下させた。

（９）認知・記憶維持作用（ｉｎｖｉｖｏ）：
上記（２）の評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を餌に混ぜ、４カ月間摂餌した後、受動回避試験を行った。受動回避試験はマウスが暗い場所を好む習性を利用した試験で、初日に、明室に入れたマウスが暗室に移動すると電気刺激を受ける（５０Ｖ・１秒間）暗室に移動するまでの時間を獲得試行の反応潜時とした。２か月後、再びマウスを明室に入れ、暗室への移動時間（保持試行の反応潜時）を記憶の指標とする評価方法である。結果を図８に示す。Ｓ－１－プロペニルシステインは加齢による認知・記憶機能低下を改善した。

（１０）腎臓、骨格筋及び肝臓におけるＮＡＤ^＋量増加作用（ｉｎｖｉｖｏ）：
上記（２）の評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を単回経口投与した後、６０分後に大脳皮質、肝臓、腎臓、骨格筋を摘出した。大脳皮質、肝臓、腎臓、骨格筋中のＮＡＤ^＋量は同仁化学研究所製ＮＡＤ^＋／ＮＡＤＨＡｓｓａｙＫｉｔを用いて測定した。結果を図９に示す。Ｓ－１－プロペニルシステインは、ＮＡＤ^＋量を増加させた。

（１１）大脳皮質、海馬、心臓、肺、肝臓、腎臓、骨格筋におけるＳＩＲＴ１タンパク質増加作用（ｉｎｖｉｖｏ）：
製造例２で製造したＳ－１－プロペニルシステイン（シス／トランス混合物）を約１０ｍｇ精密に量り取り、精製水１０ｍＬに溶解し、投与液とした。
この調製した試料を、上記（２）の評価試験用動物を用いて２週間反復経口投与した後、大脳皮質、海馬、心臓、肺、肝臓、腎臓、骨格筋を摘出した。大脳皮質、海馬、心臓、肺、肝臓、腎臓、骨格筋は組織自動破砕機を用いて破砕後にサーモフィッシャーサイエンティフィック社製のプロテアーゼ／ホスファターゼ混合型阻害剤を添加した精製水で１０倍に希釈したミリポア社製のＲＩＰＡ細胞溶解用緩衝液により細胞を溶解した後、遠心（１００００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、上清を細胞抽出液とした。この細胞抽出液を用いて定法に従いウエスタンブロッティング法により解析した。抗体は、抗ＳＩＲＴ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、及び抗β－アクチン抗体（富士フィルム和光純薬社製）を用いた。結果を図１０に示す。Ｓ－１－プロペニルシステインは、ＳＩＲＴ１タンパク質量を増加させた。

（１２）視床下部におけるＳＩＲＴ１タンパク質増加作用（ｉｎｖｉｖｏ）：
製造例２で製造したＳ－１－プロペニルシステイン（シス／トランス混合物）を精製水に０．００１％濃度となるように溶解し、投与液とした。
生物活性を評価するための動物を以下のように飼育した。試験用老化促進マウスＳＡＭＲ１（雄性）及びＳＡＭＰ８（雄性）を日本エスエルシーより購入した。購入後、１週間の順化を行い、評価試験用動物とした。
この評価試験用動物を用いて、通常食、又はＳＡＭＰ８には上記調製した試料を餌に混ぜ、１０カ月間摂餌した後、視床下部を摘出した。視床下部は組織自動破砕機を用いて破砕後にサーモフィッシャーサイエンティフィック社製のプロテアーゼ／ホスファターゼ混合型阻害剤を添加した精製水で１０倍に希釈したミリポア社製のＲＩＰＡ細胞溶解用緩衝液により細胞を溶解した後、遠心（１００００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、上清を細胞抽出液とした。この細胞抽出液を用いて定法に従いウエスタンブロッティング法により解析した。抗体は、抗ＳＩＲＴ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、及び抗β－アクチン抗体（富士フィルム和光純薬社製）を用いた。結果を図１１に示す。Ｓ－１－プロペニルシステインは、ＳＩＲＴ１タンパク質量を増加させた。

（１３）血液中ｅＮＡＭＰＴ増加作用（ｉｎｖｉｖｏ）：
（１２）で視床下部を摘出した動物について、血液中ｅＮＡＭＰＴ量をＹＯＳＨＩＤＡＭｅｔａｌ．ＣｅｌｌＭｅｔａｂ．２０１９；３０（２）：３２９―３４２．ｅ５の方法に準じて測定した。結果を図１２に示す。Ｓ－１－プロペニルシステインは、血液中ｅＮＡＭＰＴ量を増加させた。

（１４）肝臓、心臓におけるＳＩＲＴ１タンパク質量増加作用（ｉｎｖｉｖｏ）：
（１２）と同様に用意した評価試験用動物を用いて上記（１）（ａ）で調製した試料を２週間反復経口投与した後、肝臓及び心臓を摘出した。肝臓及び心臓は組織自動破砕機を用いて破砕後にサーモフィッシャーサイエンティフィック社製のプロテアーゼ／ホスファターゼ混合型阻害剤を添加した精製水で１０倍に希釈したミリポア社製のＲＩＰＡ細胞溶解用緩衝液により細胞を溶解した後、遠心（１００００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、上清を細胞抽出液とした。この細胞抽出液を用いて定法に従いウエスタンブロッティング法により解析した。抗体は、抗ＳＩＲＴ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）、及び抗β－アクチン抗体（富士フィルム和光純薬社製）を用いた。結果を図１３に示す。Ｓ－１－プロペニルシステインは、ＳＩＲＴ１タンパク質量を増加させた。

Claims

単離されたＳ－１－プロペニルシステイン又はその塩を有効成分とするｅＮＡＭＰＴ増加剤。
単離されたＳ－１－プロペニルシステイン又はその塩を含有し、動物に投与される、ｅＮＡＭＰＴ増加剤。
血液中ｅＮＡＭＰＴの増加に用いられる請求項２記載の剤。
単離されたＳ－１－プロペニルシステイン又はその塩を含有し、動物に投与されて、１以上の器官における、サーチュインの活性化又は発現増強、又は老化細胞抑制に用いられる剤。
単離されたＳ－１－プロペニルシステイン又はその塩を含有し、動物に投与されて、１以上の器官におけるＮＡＤ^＋増加に用いられる剤。
前記器官は、脳、腎臓、骨格筋、肝臓、及び心臓からなる群より選ばれる１以上を含む請求項４又は５記載の剤。
前記器官は、骨格筋、肝臓、及び心臓からなる群より選ばれる１以上を含む請求項６記載の剤。
前記器官は、さらに、脳及び腎臓からなる群より選ばれる１以上を含む請求項７記載の剤。
２以上の器官に作用させるための請求項４又は５記載の剤。
３以上の器官に作用させるための請求項９記載の剤。
食品添加剤又は食品の形態である、請求項１、４、又は５記載の剤。