KR102301570B1 - 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물 및 이를 이용한 알츠하이머 질환의 예방 및 치료방법 - Google Patents

알츠하이머 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물 및 이를 이용한 알츠하이머 질환의 예방 및 치료방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, 본 발명은 환자의 장내 미생물 환경을 변화하여 아밀로이드 베타의 생성을 억제할 수 있으므로 알츠하이머 질병의 발병 전에 미리 예방이 가능하며, 부작용이 없고, 치료의 접근성이 우수하다.

Description

알츠하이머 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물 및 이를 이용한 알츠하이머 질환의 예방 및 치료방법 {Compositions for the prevention or treatment of Alzheimer's disease and methods of preventing and treating Alzheimer's disease using the same}
본 발명은 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 부티르산을 포함하는 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물; 부티르산을 포함하는 알츠하이머 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물; 및 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
장-뇌축(gut-brain axis)이란 뇌와 장이 서로 생화학적, 신경학적으로 연결되어 상호간에 영향을 미친다는 이론으로, 최근 알츠하이머 병과 같은 신경퇴행성 질환의 치료전략과 관련하여 연구되고 있다. 노인 인구의 증가로 인해 발병률이 증가하고 있는 알츠하이머의 유발 원인은 매우 다양하게 알려지고 있으나, 장-뇌축의 관점에서는 주요 유발 원인으로서 비만을 들 수 있다. 비만 환자의 장에서는 장내 미생물총 조성의 불균형이 발생하며, 유용한 물질을 생성하는 미생물의 분포가 크게 감소되기 때문에, 이러한 관점에서 알츠하이머병의 치료 물질을 스크리닝하기 위한 많은 연구가 진행되고 있다.
장-뇌축의 관점에서 접근한 종래 기술로서, 한국등록특허 제10-1476236호에서는 노화 및 치매의 예방 및/또는 치료 활성을 갖는 유산균이 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-1799829호에서는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 장내 미생물인 아커만시아 뮤시니필라 균주에 대해 다루고 있으나, 알츠하이머 치료에 특이적인 장내 환경에 관한 치료 물질에 대한 연구가 더욱 필요한 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 비만으로 인한 장내 미생물 환경 변화로 야기되는 알츠하이머 질환에 대한 치료 물질을 스크리닝하고 이의 구체적인 작용 기전을 규명하기 위해 예의 노력한 결과, 부티르산이 고농도의 콜레스테롤 환경에 의해 발생되는 NOX2를 감소시키고 Nrf2를 안정화시키며, 아밀로이드 베타의 과도한 생성을 억제하여 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료 용도가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은, 부티르산을 포함하는 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은, 부티르산을 포함하는 알츠하이머 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은, (a) 분리된 세포에 부티르산을 처리한 대조군과, 분리된 세포에 후보물질을 처리한 실험군을 각각 수득하는 단계; (b) 상기 대조군과 실험군에서 BACE1, 아밀로이드 베타, NOX2, 또는 활성산소종의 발현량을 각각 측정하는 단계; 및 (c) 상기 실험군이 대조군에 비해 측정된 BACE1, 아밀로이드 베타, 또는 NOX2의 발현량에서 동등하거나 낮은 수준을 나타내는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는, 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
알츠하이머 질병의 대표적 마커로 알려진 아밀로이드 베타(Aβ)는 과생성된 활성산소종에 의해 증가되는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 알츠하이머 질병의 치료 물질 후보로서 부티르산을 선정하고, 부티르산이 고콜레스테롤 환경으로 인해 증가된 NOX2의 발현감소와 Nrf2의 안정화를 통해 항산화효소 발현을 증가시키며, 이를 통하여 과생성된 활성산소종을 제거하여 Aβ축적을 저해하는 작용을 확인하였다. 고콜레스테롤 환경에 노출된 신경세포에서 NOX2 발현량이 증가되어 활성산소종이 과하게 생성되는 것을 확인했으며, 이를 부티르산이 NF-κB의 핵내 이동을 감소시켜 NOX2의 발현량을 감소시킴을 확인하였다. 또한 부티르산이 고콜레스테롤 환경에 노출된 신경세포의 p21 발현량을 증가시켜 p21/Nrf2 co-localization을 유도함으로써 Nrf2의 핵내 이동이 증가되는 것을 확인하였고, p21의 발현량 증가는 부티르산의 HDAC inhibitor 기능에 의해서 sp1의 아세틸화 조절을 통한 sp1의 핵내 이동 증가로 인한 것임을 확인하였다.
따라서, 부티르산이 NOX2 발현감소를 통한 활성산소종 생성 억제와 p21/Nrf2 co-localization 유도로 Nrf2 안정화를 통한 항산화 효소 발현 증가를 통해 활성산소종을 제거함으로써, 결과적으로 신경세포 내 Aβ축적을 억제함을 확인하였으며, 결과적으로 알츠하이머 병의 예방 및 치료 효과가 있음을 규명하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 부티르산을 포함하는, 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
상기 부티르산(butyric acid)은 포화카복실산의 하나로서 천연의 지방을 구성하는 산 중에서 탄소수가 가장 적은 유기산으로, 화학식 C4H8O2, 분자량 88.11g/mol을 갖는 화합물이다. 본 발명에서 부티르산은 아이소부티르산과 노말부티르산 두 구조이성질체를 모두 포함한다.
본 발명에서, 상기 알츠하이머 질환은 치매를 유발하는 퇴행성 뇌질환으로, 특히 비만, 고콜레스테롤, 고지혈증, 또는 지질대사 이상으로 인한 알츠하이머 질환인 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 약학 조성물은 신경세포의 BACE1, 아밀로이드 베타(Aβ), 또는 NOX2의 발현을 감소시키는 것일 수 있으며, 또한 활성산소종의 발생을 억제하는 것일 수 있다. 본 발명에서는 알츠하이머 질병의 치료 물질 후보로서 부티르산을 선정하고, 부티르산이 고콜레스테롤 환경으로 인해 증가된 NOX2의 발현감소와 Nrf2의 안정화를 통해 항산화효소 발현을 증가시키며, 이를 통하여 과생성된 활성산소종을 제거하여 Aβ축적을 저해하는 작용을 확인하였다.
본 발명에서, 상기 약학 조성물은 루미노코카세애(Ruminococcaceae)와 래크노스피래세애(Lachnospiraceae) 미생물의 장내 분포를 증가시키는 것일 수 있다. 본 발명에서는 부티르산 생성 미생물이 다수 포함된 루미노코카세애(Ruminococcaceae)와 래크노스피래세애(Lachnospiraceae)는 일반 쥐에 비해 비만 쥐에서 크게 감소되었으며 (도 8), 비만 쥐의 혈장 내 부티르산 농도가 감소되었음을 확인하였다 (도 9). 따라서 부티르산이 포함된 약학 조성물의 처리 또는 투여를 통해 상기 미생물의 장내 분포를 변화시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 '예방'은, 본 발명의 조성물의 투여로 알츠하이머 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 '치료'는, 상기 조성물의 투여로 알츠하이머 유발 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 '개체' 알츠하이머 질환이 이미 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 조성물을 개체에게 투여함으로써, 상기 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용된 용어 '약학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 바이러스 감염 질환의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 일반적으로 1일에 50 ㎎/kg, 바람직하게는 20~100 ㎎/kg의 양이 투여되도록 하며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 수회, 바람직하게 1회 내지는 4회 분할 투여할 수 있으며, 이는 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 부티르산을 포함하는, 알츠하이머 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 부티르산, 알츠하이머 질환, 예방에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
부티르산 또는 이의 생리학적으로 허용가능한 염을 알츠하이머의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품 조성물에 첨가될 수 있다. 상기 성분을 건강기능식품 첨가물로 사용할 경우, 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
본 발명의 조성물을 건강기능식품에 포함하여 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료 조성물 중 1 ~ 10 중량%, 구체적으로 5 ~ 10 중량%의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 부티르산을 포함하는, 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 부티르산, 알츠하이머, 예방, 치료에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
알츠하이머 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법은 다음의 단계를 포함하는 것일 수 있다:
(a) 분리된 세포에 부티르산을 처리한 대조군과, 분리된 세포에 후보물질을 처리한 실험군을 각각 수득하는 단계;
(b) 상기 대조군과 실험군에서 BACE1, 아밀로이드 베타, NOX2, 또는 활성산소종의 발현량을 각각 측정하는 단계; 및
(c) 상기 실험군이 대조군에 비해 측정된 BACE1, 아밀로이드 베타, NOX2, 또는 활성산소종의 발현량에서 동등하거나 낮은 수준을 나타내는 후보물질을 선별하는 단계.
상기 분리된 세포는 부티르산 또는 후보물질에 의하여 BACE1, 아밀로이드 베타, NOX2, 또는 활성산소종의 발현량이 저해되는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 례로서 신경세포가 될 수 있다.
알츠하이머 병의 치료에 대한 효율성이 낮고, 부작용 발생 가능성이 높았던 종래 기술과 달리, 본 발명은 환자의 장내 미생물 환경을 변화하여 아밀로이드 베타의 생성을 억제할 수 있으므로 알츠하이머 질병의 발병 전에 미리 예방이 가능하며, 부작용이 없고, 치료의 접근성이 우수하다는 효과가 있다.
도 1은 고농도 콜레스테롤 환경에 노출된 신경세포에서 부티르산의 NOX2 억제와 Nrf2 안정화를 통한 BACE1 의존적 아밀로이드 생성 억제 기전에 관한 모식도이다.
도 2 내지 도 9는 비만 모델 쥐의 뇌에서 BACE1 발현과 Aβ 축적, 그리고 비만모델 쥐의 장내 미생물 총 조성 변화에 관한 것이다.
도 10 내지 도 15는 고콜레스테롤에 의해 유도되는 BACE1 발현과 Aβ축적에 부티르산이 미치는 영향에 관한 것이다.
도 16 내지 도 23은 고콜레스테롤에 의해 유도되는 NOX2 발현에 부티르산이 미치는 영향에 관한 것이다.
도 24 내지 도 31은 고콜레스테롤에 의해 유도되는 p21 발현 감소와 p21/Nrf2 co-localization 감소에 부티르산이 미치는 영향에 관한 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 실험 재료 및 방법
1-1. SK-N-MC cells의 배양
인간 신경모세포종 세포주(Human Neuroblastoma Cell Line)인 SK-N-MC 세포를 5% 농도의 CO2, 37 ℃에서 10% FBS 및 1% 항생제 용액이 보충된 DMEM 배지에서 피더 층 없이 배양하였다. 세포를 5% CO2로 37 ℃에서 유지되는 인큐베이터에서 60, 100mm 직경의 배양 접시 또는 12well, 96well 플레이트에서 성장시켰다. 세포가 배양 접시에 대략 60% 정도 도달했을 때, 실험 전에 배지를 1% 항생제 용액 및 2%의 SR 24시간이 보충된 DMEM으로 대체하였다. 이후, 1% 항생제 및 콜레스테롤, 부티르산 및 이부프로펜과 같은 시약을 함유하는 DMEM에서 세포를 2% SR로 유지시켰다.
1-2. 고지방 식이 유도 비만 쥐 모델의 뇌 조직 준비
식이 요법을 통해 비만을 유도하기 위해, 6주령의 수컷 ICR 마우스에 규칙적인 일반 식이(chow 식이) 또는 고지방 식이 (60kcal % 지방 및 90g 첨가된 NaCl / 4057kcal, Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, 미국)를 14주 동안 급여하였고, 실험 전에 3일 동안 새로운 환경에서 마우스를 안정화 시켰다. 생쥐는 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있게 하였으며, 방은 표준 환경 조건 (24 ± 2 ℃, 07:00에 불이 켜지는 12/12 시간 명/암주기)에서 유지되었다.
생쥐는 무작위로 배정되었으며, "의학 실험 가이드" (한국 의료 과학원 편집)에 따라 수행되었고 서울대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받아 실험을 진행하였다(SNU-180802-2). 마우스의 뇌를 제거하고 12 시간 동안 0.1M PBS에서 4% 파라포름알데히드에 의해 고정시켰다. 뇌 조직을 90% 수크로오스와 함께 밤새 주입하여 동결 보호하였고, 30μm 두께의 관상 섹션을 저온 조절기 (Leica, Deerfield, Germany)를 사용하여 연속적으로 절단하였다. 추가 처리를 위해 PBS를 함유한 6well 플레이트로 섹션을 옮겼다.
1-3. Metagenomic 16S rRNA 시퀀싱 및 데이터 분석
마우스 배설물 샘플은 -80℃의 RNA laterTM 용액에 처리 전까지 저장하였다. 16S rRNA 분석을 위한 DNA 추출은 제조사의 권고에 따라 토양용 FastDNA® SPIN 키트 (MP Biomedicals, Solon, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 박테리아 16S rRNA V3-V4 영역은 어댑터 오버행 서열이 추가된 하기 프라이머를 사용하여 Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library 준비 가이드 (Illumina, CA, USA)에 따라 증폭하였다.
정방향 프라이머:
5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG -3 '
역방향 프라이머:
5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC -3 '
또한 2 x 300 bp 페어 드 엔드 시퀀싱 기능이 있는 MiSeq 플랫폼 (Illumina, CA, USA)을 표준 Illumina 시퀀싱 프로토콜을 통한 앰플리콘 시퀀싱에 사용하였다. FastQC을 사용하여 각 샘플의 미가공 서열에 대한 품질 관리를 조사하였다. 그런 다음, 16S rRNA 시퀀싱 데이터를 위한 표준화된 파이프라인인 QIIME2 (v.2019.4)을 처리하였다. q2-cutadapt 플러그인은 프라이머 서열을 제거하는데 사용되었고, QIIME2에 싸여진 DADA2 소프트웨어 패키지는 품질 필터링, 노이즈 제거를 비롯한 품질 관리에 사용되었으며, 앰플리콘 서열 변이체 (ASV)를 포함하는 테이블 구조를 특징짓는 데 사용되었다. 그 후, q2-phylogeny 플러그인을 계통 발생 트리 생성에 사용하였다. 또한, QIIME2 다양성 플러그인에서 핵심 메트릭-계통 발생으로 알파 다양성 (α- 다양성) 및 베타 다양성 (β- 다양성)을 수행하여, 이러한 두 가지 유형의 다양성 분석을 제공하였다. 분류학적 주석의 경우, GreenGene 데이터베이스에 사전 훈련된 Na
Figure 112020000199218-pat00001
ve Bayes 분류기가 있는 QIIME2 기능 분류기 플러그인 (classify-sklearn) (99% 유사성 분류 단위(OTU)로 v.13_8)을 수행하였다. 마지막으로, 통계학적 프로파일 분석 통계 (STAMP) software를 사용하여 그룹 간의 분류학적 프로파일링 분석을 비교하였다.
1-4. 혈장 샘플 준비
샘플 준비에 대한 모든 절차는 종래 참고문헌에 따라 수행하였다. 구체적으로, 100μl의 내부 표준 용액 (150μM 아크릴산, 1500μM m-인산)을 200μl 플라즈마에 첨가하였다. 샘플을 5분 동안 vortexing한 다음 원심 분리 (30 분, 20817g)시키고, 침전물을 4 ℃에서 30분 동안 고형화 시켰다. 100μl의 맑은 상층액을 새로운 튜브로 옮기고 100μl의 세척된 프로필 포르메이트를 첨가하였다. 이러한 샘플을 5분 동안 vortexing한 후, 원심 분리 (10 분, 20817g)에 이어서 유기층 50μl를 GC-MS vial (Waters, Milford, Massachusetts, 미국)에 옮기고 분석하였다.
1-5. GC-MS (Gas chromatography-mass spectrometry) 분석
1μl 샘플을 200 ℃에서 유지된 직선형 유리 라이너에 주입하였다. TR-FAME (25m x 0.32mm x 0.25μm)에서 캐리어 가스로서 헬륨 (1ml/분)을 사용하였다. 60 ℃의 초기 오븐 온도를 4 분 동안 유지한 다음, 50 ℃/분으로 130 ℃로 상승시키고, 3.7 분 동안 유지하고 최종적으로 30 ℃/분으로 240 ℃로 상승시키고 10 분 동안 유지시켰다. 이송 라인 및 이온 소스 온도는 250 ℃였다. 모든 샘플, 표준 및 블랭크는 GC-MS 시스템에서 무작위로 분석하였다. TSQ 시리즈 질량 분석기 (미국 매사추세츠 주 서모 피셔)와 함께 트레이스 1300 시리즈 가스 크로마토그래피를 사용하였다. Triplus RSH 오토샘플러 (미국 매사추세츠 주 써모 피셔)와의 통합을 자동으로 수행하였다.
1-6. Western blot 분석
SK-N-MC 세포를 스크레이퍼로 60 또는 100mm 직경의 배양 접시로부터 분리하고 원심 분리 (13,200 rpm, 4 ℃, 5분)로 수집하였다. 수확된 세포 및 뇌 조직을 RIPA 용해 완충액 (ATTO Corporation, 일본 도쿄 소재)으로 용해시키고 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션 하였다. 이어서, 용해물을 원심 분리 (13,200 rpm, 4 ℃, 30 분)로 제거하였다. 단백질 농도는 비친 코닌산 (BCA) 분석 키트 (Bio-Rad, 미국 캘리포니아 주 허큘리스 소재)로 측정하였다. 10μg의 단백질을 함유하는 샘플을 8-15 % 나트륨 도데실 설페이트 폴리 아크릴아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)을 위해 제조한 다음 폴리비닐 리덴플루오라이드 (PVDF) 막으로 옮긴 후 TBST에 용해된 5% skim milk (Gibco)로 40분 동안 차단시켰다. 차단된 막을 TBST로 세척하고 1차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 이어서 막을 세척하고 2시간 동안 실온에서 HRP-접합된 이차 항체와 함께 인큐베이션 하였다. 웨스턴 블로팅 밴드는 화학 발광 (Bio-Rad, 미국 캘리포니아 주 허큘리스)으로 가시화하였다. ChemiDoc ?? XRS + 시스템 (미국 캘리포니아 주 허큘리스 소재의 Bio-Rad)을 사용하여 특정 밴드를 검출하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
1-7. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 과 real-time PCR
RNA는 MiniBEST 범용 RNA 추출 키트 (TaKaRa, Shintsu, Japan)를 사용하여 추출하였다. Maxime RT-PCR PreMix Kit (Intron Biotechnology, Seongnam, Korea)와 함께 1μg의 RNA를 사용하여 역전사를 수행하여 cDNA를 수득하였다. 이어서, 2μL의 cDNA를 Quanti NOVA SYBR Green PCR 키트 (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 증폭시켰다. RNA 표적의 실시간 정량화는 Rotor-Gene 6000 실시간 열 사이클링 시스템 (Corbett Research, NSW, Australia)으로 수행하였다. 반응 혼합물 (20 μL)은 200 ng의 총 RNA, 관심 유전자에 대한 각 프라이머 0.5mM, 및 제조자가 권장하는 적절한 양의 효소 및 형광 염료를 함유하도록 하였다.
real-time PCR은 다음과 같이 수행하였다: DNA 폴리머라아제 활성화를 위해 95 ℃에서 15 분; 변성에 대해 95 ℃에서 15 초; 94 ℃에서 15 초, 54 ℃에서 30 초, 및 72 ℃에서 30 초의 50 사이클. 확장 단계 동안 데이터를 수집하고, 제공된 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행하였다. PCR 산물의 특이성 및 동일성을 확인하기 위해 용융 곡선 분석을 진행하였고, 대조군으로서 ACTB 유전자를 사용하여 유전자 발현 수준의 정규화를 수행하였다.
1-8. 유세포 분석
세포를 12well 배양 접시에 seeding 하였고, 세포가 약 60%로 도달하였을 때, 배지를 24시간 동안 1% 항생제를 함유하는 DMEM에서 2% SR로 교체하였다. 세포를 30분 동안 5μM DCF-DA 또는 15분 동안 2μM MitoSoxTM Red로 염색하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 0.05% 트립신 및 0.5mM EDTA 용액으로 3분 동안 처리하여 세포를 배양 접시에서 분리한 후, 세포를 3,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. DCF-DA 또는 MitoSoxTM 레드 염색은 유세포 분석 (CytoFlex; Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)을 통해 결정하였다.
1-9. 면역세포화학 (Immunocytochemistry)
공초점 접시에서 세포를 PBS로 세척하였다. 세포를 10분 동안 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 고정한 다음, 10분 동안 막투과를 위해 0.1% 트리톤 X-100으로 인큐베이션 하였다. 세포를 PBS 중 5% 정상 염소 혈청 (NGS)과 함께 30분 동안 배양하고, 1차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 세포를 PBS로 3회 세척하고 실온에서 2시간 동안 Alexa Fluor TM 488 또는 555- 접합된 이차 항체와 함께 인큐베이션 하였다. 면역 형광 이미지는 SRRF (Super-Resolution Radial Fluctuations) 이미징 시스템 (Andor Technology, Belfast, UK)으로 수득하였다.
1-10. 면역조직화학 (Immunohistochemistry)
xylene 및 100, 95, 70 및 50 % 에탄올로 조직의 파라핀을 제거하였다. 이어서 과산화물 불활성화를 위해, 조직을 메탄올 중 3% H2O2에서 배양하고 PBS로 세척하였다. 투과화를 위해, 조직을 0.5% Triton x100을 함유하는 PBS에서 15분 동안 배양하고, PBS로 세척 후 PBS에서 5% NGS와 함께 30 분 동안 배양하였다. APP, BACE1 및 Aβ 항체를 2시간 동안 1 : 100의 비율로 함유한 PBS 중 5% NGS와 함께 인큐베이션 한 후, 이어서 실온에서 1 시간 동안 2차 항체 및 PI를 인큐베이션 하였다. PBS로 15분 동안 세척한 후, FluoViewTM 300 공초점 현미경 (Olympus)을 사용하여 이미지를 얻었다.
1-11. Aβ ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
배지 샘플에서 Aβ (1-42) 농도 수준은 효소 연결 면역 흡착 분석 (ELISA) 키트로 측정하였다. 배지 샘플을 수집하고 13,200 rpm에서 5분 동안 원심 분리한 후, 상층액 샘플을 ELISA 샘플로서 수집하였다. Aβ ELISA 분석의 모든 절차는 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다.
1-12. 통계분석
정량적 데이터는 평균 ± 평균 평균 오차 (S.E.M)로 표시하였다. GraphPad Prism Version 5.0 (GraphPad Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 사후 Bonferroni-Dunn 테스트를 통해 일원 분산 분석 (ANOVA)을 사용하여 둘 이상의 그룹 간의 통계적 차이를 평가하였다. 처리군의 평균과 대조군의 평균을 비교하기 위해 student's t-test을 실시하였으며, p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 2: 실험 결과 및 분석
2-1. 비만 모델 쥐의 뇌에서 BACE1 발현과 Aβ 축적 그리고 비만모델 쥐의 장내 미생물 총 조성 변화
비만모델 마우스의 뇌조직을 분석한 결과, 비만 쥐에서 Aβ생성 조절 효소인 APP와 BACE1 발현량이 증가하였으며 Aβ 또한 더 많이 축적되어 있었음을 확인하였다 (도 2 및 3). 또한, 비만 모델 쥐의 대변을 분석한 결과, 비만 쥐의 장내 미생물 다양성이 대조군에 비해 현저하게 낮았음을 확인하였다 (도 4 및 5).
부티르산 생성 미생물의 함량을 생물 분류 체계를 기준으로 비만 쥐와 일반 쥐를 비교하였다.
미생물의 문(門) 수준(phylum level)에서, 부티르산을 생성하는 미생물이 포함된 후벽균(Firmicutes)은 비만 쥐와 일반 쥐에서 차이가 나타나지 않았고 (도 6), 목(目) 수준(order level)에서 부티르산을 생성하는 미생물이 포함된 클로스트리디움 목(Clostridiales) 또한 차이가 나타나지 않았다 (도 7).
반면, 과(科) 수준(family level)에서는 부티르산 생성 미생물이 다수 포함된 루미노코카세애(Ruminococcaceae)와 래크노스피래세애(Lachnospiraceae)는 일반 쥐에 비해 비만 쥐에서 크게 감소되었으며 (도 8), 비만 쥐의 혈장 내 부티르산 농도도 감소되었음을 확인하였다 (도 9).
따라서, 비만이 발생함에 따라 과 수준에서 부티르산 생성 미생물이 크게 감소되며, 그에 따라 혈장 내 부티르산 농도가 감소됨을 알 수 있다.
2-2. 부티르산이 고콜레스테롤에 의해 유도되는 BACE1발현과 Aβ축적에 미치는 영향 확인
신경세포에 고콜레스테롤을 시간 별로 처리하여 APP와 BACE1의 발현을 확인하였다.
그 결과, 고콜레스테롤을 24, 48시간 처리한 경우 Aβ생성 조절 효소인 APP와 BACE1의 발현량이 유의적으로 증가하였다 (도 10). 이에, 부티르산이 미치는 영향을 확인해본 결과, 고콜레스테롤에 의해 증가한 Aβ생성 조절 효소 중 BACE1만이 부티르산에 의해 유의적으로 감소되었으며, APP는 부티르산에 영향을 받지 않았고 PSEN1은 고콜레스테롤 처리에도 발현량에 큰 변화가 없었음을 확인하였다 (도 11 및 12). 고콜레스테롤에 의해 증가한 BACE1이 부티르산에 의하여 감소되는 것을 형광현미경을 통해서 다시 확인하였다 (도 13).
다양한 짧은 사슬 지방산 간의 BACE1 발현량 감소에 미치는 영향을 확인한 결과, 짧은 사슬 지방산 중에서 특히 부티르산이 고콜레스테롤 처리로 인해 증가된 BACE1을 감소시키는데 가장 큰 영향을 미치는 것을 확인하였다 (도 14). 또한 부티르산은 고콜레스테롤에 의해 증가한 Aβ의 발현량을 대조군 수준까지 감소시킴을 확인하였다 (도 15).
2-3. 고콜레스테롤에 의해 유도되는 NOX2 발현에 미치는 부티르산의 영향 확인
신경세포가 고콜레스테롤 환경에 노출되었을 때 생성되는 주요 활성산소종을 확인하기 위해, Vas2870 (NOX 억제제)과 mitotempo (미토콘드리아 활성산소종 억제제)를 전처리하였다.
활성 산소종의 농도를 확인한 결과, 고콜레스테롤 조건에 의해 증가한 활성산소종이 NOX 억제제인 Vas2870 전처리 시 감소되었지만, 미토콘드리아 활성산소종 억제제 mitotempo 전처리의 경우는 감소되지 않았다 (도 16).
고콜레스테롤 처리에 의해 증가하는 주요 활성산소종이 미토콘드리아 활성산소종이 아님을 추가적으로 확인하기 위해 MitosoxTM Red(미토콘드리아 활성산소종 인디케이터)로 염색하여 이를 확인하였다. 그 결과, 고콜레스테롤 처리에 의해 미토콘드리아 활성산소종이 유의적으로 증가되지 않았으며 (도 17), NOX2의 대표적인 전사인자인 NF-κB는 고콜레스테롤 조건에서 핵 내 이동이 증가하였으나 부티르산에 의해 감소되는 양상을 나타내었다 (도 18 및 19). 또한, NOX2와 NOX4 중에서 NOX2만이 고콜레스테롤 처리시 mRNA 발현이 증가하여 부티르산에 의해 감소되었고, (도 20 및 21), Bay11-7082 (NF-κB 억제제) 전처리에 의해서 NOX2 발현이 감소됨을 확인하였다 (도 22). 고콜레스테롤 환경에 노출된 신경세포에 NAC (활성산소종 억제제), Vas2870, 또는 mitotempo를 전처리했을 때 NAC과 Vas2870 전처리의 경우에서만 증가된 Aβ가 유의적으로 감소되었음을 확인하였다 (도 23).
이러한 결과를 통해, 고콜레스테롤 처리에 의해 증가하는 주요 활성산소종은 미토콘드리아 활성산소종이 아니며, 부티르산 처리를 통해 이러한 활성 산소종의 발생이 억제될 수 있음을 알 수 있다.
2-4. 고콜레스테롤에 의해 유도되는 p21 발현 감소와 p21/Nrf2 co-localization 감소에 미치는 부티르산의 영향 확인
고콜레스테롤에 따른 p21 발현 감소와 p21/Nrf2 co-localization 감소에 미치는 부티르산의 영향을 확인하였다.
그 결과, 신경세포에서 Nrf2의 핵내 이동이 고콜레스테롤 조건에서 감소되었으나 부티르산 처리에 의해 증가되었으며 (도 24 및 25), sp1의 핵내 이동 또한 고콜레스테롤 조건에서 감소되었으나 부티르산에 의해 증가되었음을 확인하였다 (도 26 및 27).
부티르산이 sp1의 핵내 이동에 영향을 미치는지 확인하기 위해 고콜레스테롤 환경에 부티르산과 이부프로펜(Ibuprofen)을 함께 전처리하고 sp1의 핵내 이동을 관찰하였다. 그 결과, 부티르산과 Ibuprofen을 함께 전처리한 경우 고콜레스테롤 처리로 인해 감소된 sp1의 핵내 이동이 증가되지 않았음을 확인하였다 (도 28).
추가로, 부티르산이 sp1의 아세틸화 조절에 영향을 미쳐 sp1의 핵내 이동이 변하는 것인지 확인하기 위해, 고콜레스테롤 조건에 C646 (p300/CBP 억제제)을 부티르산과 함께 전처리하였다. 그 결과, 감소된 sp1의 핵내 이동이 증가되지 않았음을 확인하였다 (도 29). 또한, 고콜레스테롤에 환경에 노출된 신경세포에서는 p21의 발현이 감소되었지만 부티르산에 의해 증가하였고 (도 30), p21/Nrf2 co-localization 또한 함께 증가됨을 확인하였다 (도 31).
따라서, 이러한 결과를 통해 부티르산이 비만으로 인한 알츠하이머 병의 예방 및 치료 효과에 미치는 영향을 더욱 구체적으로 확인하였음을 알 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

  1. (a) 분리된 세포에 부티르산을 처리한 대조군과, 분리된 세포에 후보물질을 처리한 실험군을 각각 수득하는 단계;
    (b) 상기 대조군과 실험군에서 BACE1, 아밀로이드 베타, NOX2, 또는 활성산소종의 발현량을 각각 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 실험군이 대조군에 비해 측정된 BACE1, 아밀로이드 베타, NOX2, 또는 활성산소종의 발현량에서 동등하거나 낮은 수준을 나타내는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는, 알츠하이머 질환의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 알츠하이머 질환은 비만, 고콜레스테롤, 또는 지질대사 이상으로 인한 알츠하이머 질환인 것인, 스크리닝 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
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