JP7833596B2 - ３’－ヒドロキシブロッキング基を有するヌクレオシドおよびヌクレオチド、ならびにそれらのポリヌクレオチドシーケンシング方法における使用 - Google Patents

３’－ヒドロキシブロッキング基を有するヌクレオシドおよびヌクレオチド、ならびにそれらのポリヌクレオチドシーケンシング方法における使用

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Description

（背景）
（分野）
本開示は、一般に、３’－ヒドロキシ保護基を含むヌクレオチド、ヌクレオシド、また
はオリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドシーケンシング方法におけるそれらの使
用に関する。３’－ヒドロキシ保護ヌクレオチド、ヌクレオシド、またはオリゴヌクレオ
チドを調製する方法もまた、開示される。
（関連技術の説明）
分子の研究の進歩は、部分的には、分子またはその生物学的反応を特徴づけるために使
用される技術の改善によって導かれてきた。特に、核酸ＤＮＡおよびＲＮＡの研究は、配
列分析およびハイブリダイゼーションイベントの研究に使用される技術の開発から恩恵を
受けている。
核酸の研究を改善した技術の例は、固定化された核酸の作製されたアレイの開発である
。これらのアレイは、通常、固体支持材料上に固定化されたポリヌクレオチドの高密度マ
トリックスからなる。例えば、Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ． １２： １９－２６， １９９４を参照されたい。これは、マスクによって保護
されているが、適切に修飾されたヌクレオチドホスホルアミダイトの付着を可能にするた
めに定義された領域で露出されている化学的に増感されたガラス表面を使用して核酸を組
み立てる方法を記載している。製造されたアレイはまた、既知のポリヌクレオチドを所定
の位置で固体支持体上に「スポット」する技術によって製造することができる（例えば、
Ｓｔｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
９２： ６３７９－６３８３， １９９５）。
アレイに結合した核酸のヌクレオチド配列を決定する１つの方法は、「合成によるシー
ケンシング」または「ＳＢＳ」と呼ばれる。ＤＮＡの配列を決定するためのこの技術は、
理想的には、シーケンスされている核酸の反対側の正しい相補的ヌクレオチドの制御され
た（すなわち、一度に１つずつ）取り込みを必要とする。これにより、各ヌクレオチド残
基が一度に１つずつシーケンスされるため、複数のサイクルでヌクレオチドを追加するこ
とで正確なシーケンスが可能になり、制御されていない一連の取り込みが発生するのを防
ぐ。取り込まれたヌクレオチドは、標識部分の除去およびその後の次のシーケンシングの
前に、それに付着した適切な標識を使用して読み取られる。
単一の取り込みのみが発生することを保証するために、構造修飾（「保護基」または「
ブロッキング基」）が、成長鎖に追加される各標識ヌクレオチドに含まれ、１つのヌクレ
オチドのみが組み込まれることを保証する。保護基を有するヌクレオチドが添加された後
、次に、シーケンスされているＤＮＡの完全性を妨げない反応条件下で、保護基が除去さ
れる。その後、シーケンシングサイクルは、次の保護された標識ヌクレオチドの取り込み
を継続できる。
ＤＮＡシーケンシングに役立つために、通常ヌクレオチド三リン酸であるヌクレオチド
は、ヌクレオチドの塩基が追加されると、それをポリヌクレオチド鎖に組み込むために使
用されるポリメラーゼが複製し続けるのを防ぐために、一般に３’－ヒドロキシ保護基を
必要とする。ヌクレオチドに追加でき、それでも適切なグループのタイプには多くの制限
がある。保護基は、ポリヌクレオチド鎖に損傷を与えることなく糖部分から容易に除去可
能であると同時に、追加のヌクレオチド分子がポリヌクレオチド鎖に付加されるのを防ぐ
べきである。さらに、修飾ヌクレオチドは、それをポリヌクレオチド鎖に組み込むために
使用されるポリメラーゼまたは別の適切な酵素と適合性である必要がある。したがって、
理想的な保護基は、長期安定性を示し、ポリメラーゼ酵素によって効率的に取り込まれ、
二次またはさらなるヌクレオチド取り込みの遮断を引き起こし、ポリヌクレオチド構造に
損傷を与えない穏やかな条件下で、好ましくは水性条件下で除去される能力を有さなけれ
ばならない。
可逆的保護基は以前に記載されている。たとえば、Ｍｅｔｚｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２２ （２０）： ４２５９－４
２６７， １９９４）は、８つの３’修飾２－デオキシリボヌクレオシド５’－三リン酸
（３’修飾ｄＮＴＰ）の合成と使用、および取り込み活性のための２つのＤＮＡテンプレ
ートアッセイ。ＷＯ２００２／０２９００３は、ポリメラーゼ反応において成長中のＤＮ
Ａ鎖上の３’－ＯＨ基をキャップするためのアリル保護基の使用を含み得るシーケンシン
グ方法を記載している。
さらに、いくつかの可逆的保護基の開発およびＤＮＡ適合性条件下でそれらを脱保護す
る方法は、国際出願公開番号ＷＯ２００４／０１４８９７およびＷＯ２０１４／１３９５
９６で以前に報告されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書中に
組み込まれる。
（概要）
本開示のいくつかの実施形態は、３’-炭素原子に共有結合した構造
を形成する除去可能な３’－ＯＨ保護または遮断基を有するリボースまたはデオキシリボ
ースを含むヌクレオチドまたはヌクレオシドであって、式中：
各Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキ
ル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルコキシ、シアノ、ハロゲン、置換されて
いてもよいフェニル、または置換されていてもよいアラルキルである。
各Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、独立してＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、
シアノ、またはハロゲンであり；
あるいは、Ｒ１ａおよびＲ２ａは、それらが結合している原子とともに、必要に応じて
置換された５～８員のヘテロシクリル基を形成し；
Ｒ３は、Ｈ、置換されていてもよいＣ２～Ｃ６アルケニル、置換されていてもよいＣ３
～Ｃ７シクロアルケニル、置換されていてもよいＣ２～Ｃ６アルキニル、または置換され
ていてもよい（Ｃ１～Ｃ６アルキレン）Ｓｉ（Ｒ４）３であり；かつ
各Ｒ４は、独立してＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、または任意に置換されたＣ６～Ｃ１０ア
リールである、ヌクレオチドまたはヌクレオシドに関する。いくつかの実施形態では、各
Ｒ１ａおよびＲ１ｂがＨまたはＣ１～Ｃ６アルキルであり、Ｒ２ａおよびＲ２ｂの両方が
Ｈである場合、Ｒ３は、置換Ｃ２～Ｃ６アルケニル、置換されていてもよいＣ３～Ｃ７シ
クロアルケニル、置換されていてもよいＣ２～Ｃ６アルキニル、または置換されていても
よい（Ｃ１～Ｃ６アルキレン）Ｓｉ（Ｒ４）３である。いくつかの実施形態では、各Ｒ１
ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａおよびＲ２ｂがＨである場合、Ｒ３はＨではない。
本開示のいくつかの実施形態は、３’－炭素原子に共有結合した構造
を形成する除去可能な３’－ＯＨブロッキング基を有するリボースまたはデオキシリボー
スを含むヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、式中：
Ｒ５およびＲ６のそれぞれは、独立してＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニ
ル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２～Ｃ８アルコキシアルキル、
置換されていてもよい－（ＣＨ２）ｍ－フェニル、置換されていてもよい－（ＣＨ２）ｎ
－（５または６員ヘテロアリール）、置換されていてもよい－（ＣＨ２）ｋ－Ｃ３～Ｃ７
カルボシクリル、または置換されていてもよい－（ＣＨ２）ｐ－（３～７員ヘテロシクリ
ル）であり；
－（ＣＨ２）ｍ－、－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｋ－、および－（ＣＨ２）ｐ－の
それぞれは置換されていてもよく；かつ
ｍ、ｎ、ｋ、およびｐのそれぞれは、独立して０、１、２、３、または４である、
ヌクレオシドまたはヌクレオチドに関する。
本開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の３’－ＯＨブロック化ヌクレオチド
分子を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに関する。
本開示のいくつかの実施形態は、シーケンシング反応において標的一本鎖ポリヌクレオ
チドに相補的な成長ポリヌクレオチドを調製する方法に関連し、ヌクレオチドの取り込み
が導入を妨げる、本明細書に記載のヌクレオチド分子を成長する相補的ポリヌクレオチド
に取り込むことを含む。成長する相補的ポリヌクレオチドへの後続のヌクレオチドの。い
くつかの実施形態において、ヌクレオチドの取り込みは、ポリメラーゼ、末端デオキシヌ
クレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、または逆転写酵素によって達成される。一
実施形態では、組み込みは、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によって達成
される。
本開示のいくつかのさらなる実施形態は、以下を含む、標的一本鎖ポリヌクレオチドの
配列を決定するための方法に関する：
（ａ）３’－ＯＨブロッキング基および本明細書に記載の検出可能な標識を含むヌクレオ
チドを、標的ポリヌクレオチド鎖の少なくとも一部に相補的なコピーポリヌクレオチド鎖
に組み込むこと；
（ｂ）コピーポリヌクレオチド鎖に組み込まれたヌクレオチドの同一性を検出すること；
および
（ｃ）コピーポリヌクレオチド鎖に組み込まれたヌクレオチドから標識および３’－ＯＨ
ブロッキング基を化学的に除去すること。
いくつかの実施形態において、シーケンシング方法は、（ｄ）化学的に除去された標識
および３’ブロッキング基をコピーポリヌクレオチド鎖から洗い流すことをさらに含む。
いくつかの実施形態において、そのような洗浄工程はまた、組み込まれていないヌクレオ
チドを除去する。いくつかのそのような実施形態において、組み込まれたヌクレオチドの
３’ブロッキング基および検出可能な標識は、次の相補的ヌクレオチドを導入する前に除
去される。いくつかのさらなる実施形態において、３’ブロッキング基および検出可能な
標識は、化学反応の単一のステップで除去される。いくつかの実施形態では、本明細書に
記載の連続的な組み込みは、少なくとも５０回、少なくとも１００回、少なくとも１５０
回、少なくとも２００回、または少なくとも２５０回実行される。
本開示のいくつかのさらなる実施形態は、本明細書に記載の複数のヌクレオチドまたは
ヌクレオシド分子を含むキット、およびそのための包装材料に関する。本明細書に記載の
ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、またはキットを使用して、生物学的
システム（例えば、そのプロセスまたは構成要素を含む）を検出、測定、または同定する
ことができる。ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはキットを使用できる例示的な
技術には、シーケンシング、発現分析、ハイブリダイゼーション分析、遺伝子分析、ＲＮ
Ａ分析、細胞アッセイ（例えば、細胞結合または細胞機能分析）、またはタンパク質アッ
セイ（例えば、タンパク質結合アッセイまたはタンパク質活性アッセイ）。自動シーケン
シング機器等、特定の技術を実行するための自動機器で使用することができる。シーケン
シング機器には、異なる検出可能なラベルを区別するために、異なる波長で動作する２つ
以上のレーザーが含まれている場合がある。
図１は、６５℃の緩衝液中での時間の関数としての種々の３’ブロック化ヌクレオチドの安定性を示す折れ線グラフである。 図２Ａは、３’－ＡＯＭブロッキング基を持つヌクレオチドと溶液中の３’－Ｏ－アジドメチル（－ＣＨ２Ｎ３）ブロッキング基を持つヌクレオチドの脱ブロック化率を時間の関数として比較した残りのヌクレオチド（出発物質）のパーセンテージ（％）を例示する折れ線グラフである。図２Ｂは、３’ブロックヌクレオチドのブロック解除率を溶液中の種々のアセタールブロッキング基と比較した時間の関数としての３’ブロック解除ヌクレオチドのパーセンテージ（％）を例示する折れ線グラフである。 図３Ａおよび３Ｂは、取り込みミックスに３’－ＡＯＭブロッキング基を含む完全に機能化されたヌクレオチド（ｆｆＮ）を使用したイルミナＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）機器でのシーケンス結果を例示する。図３Ｃは、３’－Ｏ－アジドメチルブロッキング基を含む標準のｆｆＮと比較した、取り込みミックスに３’－ＡＯＭブロッキング基を含む完全に機能化されたヌクレオチド（ｆｆＮ）を使用したシーケンスエラー率を例示する。 図４Ａおよび４Ｂはそれぞれ、２つの異なるＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ８１２およびＰｏｌ１９０１）を使用した３’－ＡＯＭおよび３’－Ｏ－アジドメチルブロッキング基を含む完全に機能化されたヌクレオチドを使用したフェージング、プレフェージング、およびエラー率を含む主要なシーケンスメトリックの比較をそれぞれ例示する。 図５は、４５℃の緩衝液中での時間の関数としての３’－ＡＯＭまたは３’－Ｏ－アジドメチルブロッキング基を持つ完全に機能化されたヌクレオチドのシーケンス安定性を例示する折れ線グラフである。 図６は、６５℃の緩衝液中での時間の関数としての種々の３’ブロッキング基を持つヌクレオシドの安定性を例示する折れ線グラフである。 図７は、２つの異なる条件下（Ｏｘｏｎｅ（登録商標）またはＮａＩＯ４）でのチオカルバメート３’ブロッキング基ジメチルチオカルバメート（ＤＭＴＣ）の切断（ブロック解除）率を３’－Ｏ－アジドメチル（３’－Ｏ－ＣＨ２Ｎ３）ブロッキング基のそれと比較した、残りの３’ブロックヌクレオチドのパーセンテージ（％）を時間の関数として例示する折れ線グラフである。
（詳細な説明）
本開示の実施形態は、シーケンシング用途、例えば、合成によるシーケンシング（ＳＢ
Ｓ）のための３’－ＯＨアセタールまたはチオカルバメートブロッキング基を有するヌク
レオシドおよびヌクレオチドに関する。これらのブロッキング基は、当技術分野で知られ
ているものと比較して、溶液中でより優れた安定性を提供する。特に、３’－ＯＨブロッ
キング基は、完全に機能化されたヌクレオチド（ｆｆＮ）の合成中の安定性が向上し、シ
ーケンス機器での処方、保存、操作中の溶液中での安定性も向上している。さらに、本明
細書に記載の３’－ＯＨブロッキング基はまた、データ品質を改善するために、低いプレ
フェージング、低い信号減衰を達成し得、これにより、シーケンシングアプリケーション
からのより長い読み取りが可能になる。
（定義）
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、当
業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。用語「含んでいる（ｉｎｃ
ｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」
、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」といった他の形式の使用は、限定的ではない。用語「
有している（ｈａｖｉｎｇ）」ならびに「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」
、「有した（ｈａｄ）」といった他の形式の使用は、限定的ではない。本明細書で使用さ
れているように、クレームの移行句（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｐｈｒａｓｅ）中であ
っても本体部（ｂｏｄｙ）中であっても、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」およ
び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、オープンエンド化された意味を有すると
解釈されるべきである。即ち、上記の用語は、句「少なくとも有している（ｈａｖｉｎｇ
ａｔ ｌｅａｓｔ）」または「少なくとも含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｔ ｌ
ｅａｓｔ）」と同義的に解釈されるべきである。例えば、プロセスの文脈で使用される場
合、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、プロセスが少なくとも記載された
ステップを含むが、追加のステップを含んでもよいことを意味する。化合物、組成物、ま
たはデバイスの文脈で使用される場合、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は
、化合物、組成物、またはデバイスが少なくとも記載された特徴または成分を含むが、追
加の特徴または成分もまた含んでもよいことを意味する。
本明細書で使用される一般的な有機略語は、次のように定義される。
℃ 摂氏温度
ｄＡＴＰ デオキシアデノシン三リン酸
ｄＣＴＰ デオキシシチジン三リン酸
ｄＧＴＰ デオキシグアノシン三リン酸
ｄＴＴＰ デオキシチミジン三リン酸
ｄｄＮＴＰ ジデオキシヌクレオチド三リン酸
ｆｆＮ 完全に機能化されたヌクレオチド
ＲＴ 室温
ＳＢＳ 合成によるシーケンシング
ＳＭ 出発材料
本明細書で使用される「アレイ」という用語は、異なるプローブ分子が相対位置に従っ
て互いに区別できるように、１以上の基板に付着した異なるプローブ分子の集団を指す。
アレイは、基板上の異なるアドレス指定可能な位置にそれぞれ配置された異なるプローブ
分子を含むことができる。代替的または追加的に、アレイは、それぞれが異なるプローブ
分子を有する別個の基板を含むことができ、異なるプローブ分子は、基板が付着する表面
上の基板の位置に従って、または基板の位置に従って識別され得る液体で。別個の基板が
表面上に位置する典型的なアレイには、例えば、米国特許第６，３５５，４３１Ｂ１号、
米国特許第２００２／０１０２５７８号およびＰＣＴ公開第ＷＯ００／６３４３７号に記
載されているウェル内にビーズを含むアレイが含まれるが、これらに限定されない。例え
ば、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）等のマイクロ流体デバイスを使用して、液体ア
レイ内のビーズを区別するために本発明で使用できる例示的なフォーマットは、例えば、
米国特許第６，５２４，７９３号に記載されている。本発明で使用できるアレイのさらな
る例には、米国特許第５，４２９，８０７；５，４３６，３２７；５，５６１，０７１；
５，５８３，２１１；５，６５８，７３４；５，８３７，８５８；５，８７４，２１９；
５，９１９，５２３；６，１３６，２６９；６，２８７，７６８；６，２８７，７７６；
６，２８８，２２０；６，２９７，００６；６，２９１，１９３；６，３４６，４１３；
６，４１６，９４９；６，４８２，５９１；６，５１４，７５１と６，６１０，４８２号
；およびＷＯ９３／１７１２６；ＷＯ９５／１１９９５；ＷＯ９５／３５５０５；ＥＰ７
４２２８７；およびＥＰ７９９８９７に記載されているものが含まれるが、これらに限定
されない。
本明細書で使用される場合、用語「共有結合した（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ａｔｔａｃ
ｈｅｄ）」または「共有結合した（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｂｏｎｄｅｄ）」は、原子間
での電子対の共有を特徴とする化学結合の形成を指す。例えば、共有結合されたポリマー
コーティングは、他の手段、例えば、接着または静電相互作用を介した表面への結合と比
較して、基板の官能化された表面と化学結合を形成するポリマーコーティングを指す。表
面に共有結合しているポリマーは、共有結合に加えて手段を介して結合することもできる
ことが理解されよう。
本明細書で使用される「Ｒ」基は、示された原子に結合することができる置換基を表す
。Ｒ基は、置換されていても置換されていなくてもよい。２つの「Ｒ」基が「それらが結
合している原子とともに」環または環系を形成すると記載されている場合、原子、介在結
合、および２つのＲ基の集合単位が列挙された環であることを意味する。例えば、以下の
サブ構造が存在し：
かつＲ１およびＲ２が水素およびアルキルからなる群から選択されるものとして定義され
るか、またはＲ１およびＲ２がそれらが結合している原子とともにアリールまたはカルボ
シクリルを形成するものとして定義される場合、Ｒ１およびＲ２は、水素またはアルキル
から選択され得るか、あるいは、当該サブ構造は、以下の構造を有し：
式中、Ａは、描かれた二重結合を含むアリール環またはカルボシクリルである。
特定のラジカル命名規則は、文脈に応じて、モノラジカルまたはジラジカルのいずれか
を含むことができることを理解されたい。例えば、置換基が分子の残りの部分への２つの
結合点を必要とする場合、置換基はジラジカルであることが理解される。例えば、２つの
結合点を必要とするアルキルとして識別される置換基には、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２
－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－等のジラジカルが含まれる。他のラジカル命名規則
は、ラジカルが「アルキレン」や「アルケニレン」等のジラジカルであることを明確に示
す。
本明細書で使用される用語「ハロゲン」または「ハロ」は、元素の周期表の列７の放射
線安定性原子のいずれか１つ、例えば、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を意味し、フ
ッ素および塩素が好ましい。
本明細書で使用される場合、「ａ」および「ｂ」が整数である「Ｃａ～Ｃｂ」は、アル
キル、アルケニルまたはアルキニル基の炭素原子の数、またはシクロアルキルまたはアリ
ール基の環原子の数を指す。すなわち、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアル
キルの環、およびアリールの環は、「ａ」から「ｂ」までの炭素原子を含むことができる
。例えば、「Ｃ１～Ｃ４アルキル」基は、１から４個の炭素を有するすべてのアルキル基
、すなわち、ＣＨ３－、ＣＨ３ＣＨ２－、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２－、（ＣＨ３）２ＣＨ－、
ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－および（ＣＨ３）３Ｃ－；
Ｃ３～Ｃ４のシクロアルキル基とは、３から４個の炭素原子を有するすべてのシクロプロ
ピル基、すなわち、シクロプロピルおよびシクロブチルを指す。同様に、「４～６員ヘテ
ロシクリル」基は、合計４から６個の環原子を有するすべてのヘテロシクリル基、例えば
、アゼチジン、オキセタン、オキサゾリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モル
ホリン等を指す。アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、またはアリール
基に関して「ａ」および「ｂ」が指定されていない場合、これらの定義に記載されている
最も広い範囲が想定される。本明細書で使用される場合、「Ｃ１～Ｃ６」という用語は、
Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６、ならびに２つの数値のいずれかによって定義
される範囲を含む。例えば、Ｃ１～Ｃ６アルキルは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およ
びＣ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ３アルキル等を含む。同様に、Ｃ２～Ｃ
６アルケニルは、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ５アルケニル
、Ｃ３～Ｃ４アルケニル等を含む。Ｃ２～Ｃ６アルキニルは、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５お
よびＣ６アルキニル、Ｃ２～Ｃ５アルキニル、Ｃ３～Ｃ４アルキニル等を含む。Ｃ３～Ｃ
８シクロアルキルはそれぞれ、３、４、５、６、７および８炭素原子、またはＣ３～Ｃ７
シクロアルキルまたはＣ５～Ｃ６シクロアルキル等の２つの数値のいずれかによって定義
される範囲を含む炭化水素環を含む。
本明細書で使用される場合、「アルキル」は、完全に飽和した（すなわち、二重結合ま
たは三重結合を含まない）直鎖または分岐炭化水素鎖を指す。アルキル基は、１～２０個
の炭素原子を有してもよい（本明細書中に現れる場合は常に、「１～２０」といった数値
範囲は、指定された範囲内の各整数を指す；例えば、「１～２０個の炭素原子」は、アル
キル基が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子等で、２０個までの炭素原子
からなってもよいが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「アルキル」の出現も
カバーする）。アルキル基はまた、１～９個の炭素原子を有する中型アルキルであっても
よい。アルキル基はまた、１～６個の炭素原子を有するより低級のアルキルであり得た。
アルキル基は、「Ｃ１～Ｃ４アルキル」または同様の呼称として指定してもよい。ほんの
一例として、「Ｃ１～Ｃ６アルキル」は、アルキル鎖に１～６個の炭素原子が存在するこ
と、すなわち、アルキル鎖がメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イ
ソブチル、ｓｅｃ－ブチル、およびｔ－ブチルからなる群から選択されることを示す。典
型的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブ
チル、ターシャリーブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられるが、これらに限定されな
い。
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」は、Ｒが上記で定義されるアルキルである
式－ＯＲを指し、例えば「Ｃ１～Ｃ９アルコキシ」であり、メトキシ、エトキシ、ｎ－プ
ロポキシ、１－メチルエトキシ（イソプロポキシ）、ｎ－ブトキシ、ｉｓｏ－ブトキシ、
ｓｅｃ－ブトキシ、およびｔｅｒｔ－ブトキシ等が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、１以上の二重結合を含む直鎖または分
岐炭化水素鎖を指す。アルケニル基は、２～２０個の炭素原子を有し得るが、本定義は、
数値範囲が指定されていない用語「アルケニル」の出現もカバーする。アルケニル基はま
た、２から９個の炭素原子を有する中型アルケニルであってもよい。アルケニル基はまた
、２～６個の炭素原子を有するより低級のアルケニルであってもよい。アルケニル基は、
「Ｃ２～Ｃ６アルケニル」または同様の呼称として指定してもよい。ほんの一例として、
「Ｃ２～Ｃ６アルケニル」は、アルケニル鎖に２～６個の炭素原子が存在すること、すな
わち、アルケニル鎖がエテニル、プロペン－１－イル、プロペン－２－イル、プロペン－
３－イル、ブテン－１－イル、ブテン－２－イル、ブテン－３－イル、ブテン－４－イル
、１－メチル－プロペン－１－イル、２－メチル－プロペン－１－イル、１－エチル－エ
テン－１－イル、２－メチル－プロペン－３－イル、ブタ－１，３－ジエニル、ブタ－１
，２，－ジエニル、およびブタ－１，２－ジエン－４－イルからなる群から選択されるこ
とを示す。典型的なアルケニル基としては、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニ
ル、およびヘキセニル等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、１以上の三重結合を含む直鎖または分
岐炭化水素鎖を指す。アルキニル基は、２～２０個の炭素原子を有し得るが、本定義は、
数値範囲が指定されていない用語「アルキニル」の出現もカバーする。アルキニル基はま
た、２～９個の炭素原子を有する中型アルキニルであってもよい。アルキニル基はまた、
２～６個の炭素原子を有するより低級のアルキニルであり得た。アルキニル基は、「Ｃ２
～Ｃ６アルキニル」または同様の呼称として指定してもよい。ほんの一例として、「Ｃ２
～Ｃ６アルキニル」は、アルキニル鎖に２～６個の炭素原子が存在すること、すなわち、
アルキニル鎖がエチニル、プロピン－１－イル、プロピン－２－イル、ブチン－１－イル
、ブチン－３－イル、ブチン－４－イル、および２－ブチニルからなる群から選択される
ことを示す。典型的なアルキニル基としては、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチ
ニル、およびヘキシニル等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」は、１つ以上のヘテロ原子、すなわち
、鎖骨格に窒素、酸素および硫黄を含むがこれらに限定されない炭素以外の元素を含む直
鎖または分岐炭化水素鎖を指す。ヘテロアルキル基は、１から２０個の炭素原子を有し得
るが、本定義は、数値範囲が指定されていない「ヘテロアルキル」という用語の出現もカ
バーする。ヘテロアルキル基はまた、１から９個の炭素原子を有する中型のヘテロアルキ
ルであり得る。ヘテロアルキル基はまた、１から６個の炭素原子を有するより低いヘテロ
アルキルであり得る。ヘテロアルキル基は、「Ｃ１～Ｃ６ヘテロアルキル」または同様の
呼称として指定され得る。ヘテロアルキル基は、１つまたは複数のヘテロ原子を含み得る
。例としてのみ、「Ｃ４～Ｃ６ヘテロアルキル」は、ヘテロアルキル鎖に４～６個の炭素
原子があり、さらに鎖の骨格に１つまたは複数のヘテロ原子があることを示す。
「芳香族」という用語は、共役パイ電子系を有する環または環系を指し、炭素環式芳香
族（例えば、フェニル）および複素環式芳香族基（例えば、ピリジン）の両方を含む。こ
の用語は、環系全体が芳香族であるという条件で、単環式または縮合環多環式（すなわち
、隣接する原子の対を共有する環）基を含む。
本明細書で使用される場合、「アリール」は、環骨格に炭素のみを含む芳香族環または
環系（すなわち、２つの隣接する炭素原子を共有する２つ以上の縮合環）を指す。アリー
ルが環系の場合、系内のすべての環は芳香族である。アリール基は、６～１８個の炭素原
子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない「アリール」という用語の出現
もカバーする。いくつかの実施形態では、アリール基は、６～１０個の炭素原子を有する
。アリール基は、「Ｃ６～Ｃ１０アリール」、「Ｃ６またはＣ１０アリール」、または同
様の呼称として指定され得る。アリール基の例としては、これらに限定されないが、フェ
ニル、ナフチル、アズレニル、およびアントラセニルが挙げられる。
「アラルキル」または「アリールアルキル」は、「Ｃ７－１４アラルキル」といった、
置換基としてアルキレン基を介して結合されたアリール基であり、ベンジル、２－フェニ
ルエチル、３－フェニルプロピル、およびナフチルアルキルが挙げられるがこれらに限定
されない。いくつかの場合では、アルキレン基は、より低級のアルキレン基（すなわち、
Ｃ１～Ｃ６アルキレン基）である。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」は、１以上のヘテロ原子、すなわち、
環骨格中の窒素、酸素および硫黄が挙げられるがこれらに限定されない、炭素以外の元素
を含む芳香族環または環系（すなわち、２つの隣接する原子を共有する２以上の縮合環）
を指す。ヘテロアリールが環系である場合、系内の各環は、芳香族である。ヘテロアリー
ル基は、５～１８個の環員数（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含めた、環骨格を
構成する原子の数）を有してもよいが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「ヘ
テロアリール」の出現もカバーする。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール基は、５
～１０の環員数または５～７個の環員数を有する。ヘテロアリール基は、「５～７員のヘ
テロアリール」、「５～１０員のヘテロアリール」、または同様の呼称として指定しても
よい。ヘテロアリール環の例としては、フリル、チエニル、フタラジニル、ピロリル、オ
キサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル
、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニ
ル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イソイ
ンドリル、およびベンゾチエニルが挙げられるが、これらに限定されない。
「ヘテロアラルキル」または「ヘテロアリールアルキル」は、置換基として、アルキレ
ン基を介して結合されたヘテロアリール基である。例としては、２－チエニルメチル、３
－チエニルメチル、フリルメチル、チエニルエチル、ピロリルアルキル、ピリジルアルキ
ル、イソキサゾリルアルキル、およびイミダゾリルアルキルが挙げられるが、これらに限
定されない。いくつかの場合では、アルキレン基は、より低級のアルキレン基（すなわち
、Ｃ１～Ｃ６アルキレン基）である。
本明細書で使用される場合、「カルボシクリル」は、環系骨格に炭素原子のみを含む非
芳香族環状環または環系を意味する。カルボシクリルが環系である場合、２つ以上の環は
、融合、架橋、またはスピロ接続された様式で一緒に結合されてもよい。環系の少なくと
も１つの環が芳香族でない限り、カルボシクリルは、任意の程度の飽和度を有してもよい
。したがって、カルボシクリルとしては、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびシ
クロアルキニルが挙げられる。カルボシクリル基は、３～２０個の炭素原子を有してもよ
いが、本定義は、数値範囲が指定されていない「カルボシクリル」という用語の出現もカ
バーする。カルボシクリル基はまた、３～１０個の炭素原子を有する中型カルボシクリル
であってもよい。カルボシクリル基はまた、３～６個の炭素原子を有するカルボシクリル
であってもよい。カルボシクリル基は、「Ｃ３～Ｃ６カルボシクリル」または同様の呼称
として指定してもよい。カルボシクリル環の例としては、シクロプロピル、シクロブチル
、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、２，３－ジヒドロ－インデン、
ビシクル［２．２．２］オクタニル、アダマンチル、およびスピロ［４．４］ノナニルが
挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」は、完全に飽和したカルボシクリル環
または環系を意味する。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、
およびシクロヘキシルが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ヘテロシクリル」は、環骨格に少なくとも１つのヘテロ
原子を含む非芳香族環状環または環系を意味する。ヘテロシクリルは、融合、架橋、また
はスピロ結合の方法で一緒に結合してもよい。ヘテロシクリルは、環系の少なくとも１つ
の環が芳香族でない限り、任意の程度の飽和度を有してもよい。ヘテロ原子は、環系の非
芳香族環または芳香族環のいずれかに存在してもよい。ヘテロシクリル基は、３～２０の
環員数（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含めた、環骨格を構成する原子の数）を
有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロシクリル」の出現もカ
バーする。ヘテロシクリル基はまた、３～１０の環員数を有する中型ヘテロシクリルであ
ってもよい。ヘテロシクリル基はまた、３～６の環員数を有するヘテロシクリルであって
もよい。ヘテロシクリル基は、「３－６員ヘテロシクリル」または同様の呼称として指定
してもよい。好ましい６員単環式ヘテロシクリルでは、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳ
の１つから３つまで選択され、好ましい５員単環式ヘテロシクリルでは、ヘテロ原子は、
Ｏ、Ｎ、またはＳの１つまたは２つのヘテロ原子から選択される。ヘテロシクリル環の例
としては、アゼピニル、アクリジニル、カルバゾリル、シノリニル、ジオキソラニル、イ
ミダゾリニル、イミダゾリジニル、モルホリニル、オキシラニル、オキセパニル、チエパ
ニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ジオキソピペラジニル、ピロリジニル、４－ピペリ
ドニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、１，３－ジオキシニル、１，３－ジオキサニル
、１，４－ジオキシニル、１，４－ジオキサニル、１，３－オキサチアニル、１，４－オ
キサチイニル、１，４－オキサチアニル、２Ｈ－１，２－オキサジニル、トリオキサニル
、ヘキサヒドロ－１，３，５－トリアジニル、１，３－ジオキソリル、１，３－ジオキソ
ラニル、１，３－ジチオリル、１，３－ジチオラニル、イソキサゾリニル、イソキサゾリ
ジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、オキサゾリジノニル、チアゾリニル、チア
ゾリジニル、１，３－オキサチオラニル、インドリニル、イソインドリニル、テトラヒド
ロフラン、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロイオフェニル、テトラヒドロチオピラニ
ル、テトラヒドロ－１，４－チアジニル、チアモルホリニル、ジヒドロベンゾフラニル、
ベンズイミダゾリジニル、およびテトラヒドロキノリンが挙げられるが、これらに限定さ
れない。
「Ｏ－カルボキシ」基とは、Ｒが、水素、本明細書で定義される、Ｃ１～Ｃ６アルキル
、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、Ｃ６～Ｃ
１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および３～１０員ヘテロシクリルから選択さ
れる、「－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ」基を指す。
「Ｃ－カルボキシ」基とは、Ｒが、水素、本明細書で定義される、Ｃ１～Ｃ６アルキル
、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、Ｃ６～Ｃ
１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および３～１０員ヘテロシクリルからなる群
から選択される「Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ」基を指す。非限定的な例には、カルボキシル（すなわ
ち、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）が含まれる。
「スルホニル」基とは、Ｒが、水素、本明細書で定義される、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ
２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル、Ｃ６～Ｃ１０
アリール、５～１０員ヘテロアリール、および３～１０員ヘテロシクリルから選択される
「－ＳＯ２Ｒ」基を指す。
「スルフィノ」基は、「－Ｓ（＝Ｏ）ＯＨ」基を指す。
「Ｓ－スルホンアミド」基とは、ＲＡおよびＲＢが、各々独立して水素、本明細書で定
義される、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～
Ｃ７カルボシクリル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および３～１
０員ヘテロシクリルから選択される、「－ＳＯ２ＮＲＡＲＢ」基を指す。
「Ｎ－スルホンアミド」基とは、ＲＡおよびＲｂが、各々独立して水素、本明細書で定
義される、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～
Ｃ７カルボシクリル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および３～１
０員ヘテロシクリルから選択される、「－Ｎ（ＲＡ）ＳＯ２ＲＢ」基を指す。
「Ｃ－アミド」基とは、ＲＡおよびＲＢが、各々独立して水素、本明細書で定義される
、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ７カル
ボシクリル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および３～１０員ヘテ
ロシクリルから選択される、「－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＡＲＢ」基を指す。
「Ｎ－アミド」基とは、ＲＡおよびＲＢが、各々独立して水素、本明細書で定義される
、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ７カル
ボシクリル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および３～１０員ヘテ
ロシクリルから選択される、「－Ｎ（ＲＡ）Ｃ（＝Ｏ）ＲＢ」基を指す。
「アミノ」基とは、ＲＡおよびＲＢが、各々独立して水素、本明細書で定義される、Ｃ
１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ３～Ｃ７カルボシ
クリル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、５～１０員ヘテロアリール、および３～１０員ヘテロシ
クリルから選択される、「－ＮＲＡＲＢ」基を指す。非限定的な例には、遊離アミノ（す
なわち、－ＮＨ２）が含まれる。
「アミノアルキル」基とは、アルキレン基を介して接続されたアミノ基を指す。
「アルコキシアルキル」基とは、「Ｃ２～Ｃ８アルコキシアルキル」等といった、アル
キレン基を介して結合したアルコキシ基を指す。
本明細書で使用される場合、置換基は、１以上の水素原子が別の原子または基と交換さ
れた非置換の親基に由来する。特に明記しない限り、基が「置換された」と見なされる場
合、その基は、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルケニル、Ｃ１－Ｃ６アルキニル、Ｃ
１－Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３－Ｃ７カルボシクリル（任意でハロ、Ｃ１－Ｃ６アルキル
、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１－Ｃ６ハロアルコキシで
置換）、Ｃ３－Ｃ７－カルボシクリル－Ｃ１－Ｃ６－アルキル（任意でハロ、Ｃ１－Ｃ６
アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１－Ｃ６ハロアル
コキシで置換）、３－１０員ヘテロシクリル－Ｃ１－Ｃ６－アルキル（任意でハロ、Ｃ１
－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１－Ｃ６ハ
ロアルコキシで置換）、アリール（任意でハロ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコ
キシ、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１－Ｃ６ハロアルコキシで置換）、アリール（
Ｃ１－Ｃ６）アルキル（任意でハロで置換、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ
、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１－Ｃ６ハロアルコキシ）、５－１０員ヘテロアリ
ール（任意でハロ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキ
ル、およびＣ１－Ｃ６ハロアルコキシで置換）、５－１０員ヘテロアリール（Ｃ１－Ｃ６
）アルキル（任意でハロ、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６ハロ
アルキル、およびＣ１－Ｃ６ハロアルコキシで置換）、ハロ、－ＣＮ、ヒドロキシ、Ｃ１
－Ｃ６アルコキシ、Ｃ１－Ｃ６アルコキシ（Ｃ１－Ｃ６）アルキル（すなわち、エーテル
）、アリールオキシ、スルフヒドリル（メルカプト）、ハロ（Ｃ１－Ｃ６）アルキル（例
、－ＣＦ３）、ハロ（Ｃ１－Ｃ６）アルコキシ（例、－ＯＣＦ３）、Ｃ１－Ｃ６アルキル
チオ、アリールチオ、アミノ、アミノ（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、ニトロ、Ｏ－カルバミル
、Ｎ－カルバミル、Ｏ－チオカルバミル、Ｎ－チオカルバミル、Ｃ－アミド、Ｎ－アミド
、Ｓ－スルホンアミド、Ｎ－スルホンアミド、Ｃ－カルボキシ、Ｏ－カルボキシ、アシル
、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、スルフィニル、スルホニ
ル、－ＳＯ３Ｈスルフィノ、－ＯＳＯ２Ｃ１－４アルキル、およびオキソ（＝Ｏ）から独
立して選択される１以上の置換基で置換されていることを意味する。基が「任意で置換さ
れた」と記載されている場合はいつでも、その基を、上記の置換基で置換することができ
る。
本明細書で使用される「ヒドロキシ」という用語は、－ＯＨ基を指す。
本明細書で使用される「シアノ」基という用語は、「ＣＮ」基を指す。
本明細書で使用される「アジド」という用語は、－Ｎ３基を指す。
本明細書で使用される「ヌクレオチド」には、窒素含有複素環式塩基、糖、および１以
上のリン酸基が含まれる。それらは、核酸配列の単量体単位である。ＲＮＡでは糖はリボ
ースであり、ＤＮＡではデオキシリボース、つまりリボースに存在する水酸基を持たない
糖である。窒素含有複素環塩基は、プリンまたはピリミジン塩基であり得る。プリン塩基
には、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびそれらの修飾誘導体または類似体が
含まれる。ピリミジン塩基には、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）
、およびそれらの修飾誘導体または類似体が含まれる。デオキシリボースのＣ－１原子は
、ピリミジンのＮ－１またはプリンのＮ－９に結合する。
本明細書で使用される「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドに構造的に類似しているが、
リン酸部分が欠けている。ヌクレオシド類似体の例は、標識が塩基に結合し、リン酸基が
糖分子に結合していないものである。本明細書では、「ヌクレオシド」という用語は、当
業者に理解される通常の意味で使用される。例には、リボース部分を含むリボヌクレオシ
ドおよびデオキシリボース部分を含むデオキシリボヌクレオシドが含まれるが、これらに
限定されない。修飾ペントース部分は、酸素原子が炭素で置き換えられているおよび／ま
たは炭素が硫黄または酸素原子で置き換えられているペントース部分である。「ヌクレオ
シド」は、置換された塩基および／または糖部分を有することができるモノマーである。
さらに、ヌクレオシドをより大きなＤＮＡおよび／またはＲＮＡポリマーおよびオリゴマ
ーに組み込むことができる。
本明細書では、「プリン塩基」という用語は、当業者に理解される通常の意味で使用さ
れ、その互変異性体を含む。同様に、「ピリミジン塩基」という用語は、当業者に理解さ
れる通常の意味で本明細書で使用され、その互変異性体を含む。置換されていてもよいプ
リン塩基の非限定的なリストには、プリン、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、キサ
ンチン、アロキサンチン、７－アルキルグアニン（例えば、７－メチルグアニン）、テオ
ブロミン、カフェイン、尿酸およびイソグアニンが含まれる。ピリミジン塩基の例には、
シトシン、チミン、ウラシル、５，６－ジヒドロウラシルおよび５－アルキルシトシン（
例えば、５－メチルシトシン）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、本明細書
に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチドを「含む」と記載される場合、本明細書に記載
のヌクレオシドまたはヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと共
有結合を形成することを意味する。同様に、ヌクレオシドまたはヌクレオチドが、オリゴ
ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに「取り込まれる」等、オリゴヌクレオチドまたは
ポリヌクレオチドの一部として記載される場合、本明細書に記載のヌクレオシドまたはヌ
クレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと共有結合を形成することを
意味する。いくつかのそのような実施形態において、共有結合は、オリゴヌクレオチドま
たはポリヌクレオチドの３’ヒドロキシ基と、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチ
ドの３’炭素原子とヌクレオチドの５’炭素原子との間のホスホジエステル結合として本
明細書に記載されるヌクレオチドの５’リン酸基との間に形成される。
本明細書で使用される「誘導体」または「類似体」は、修飾された塩基部分および／ま
たは修飾された糖部分を有する合成ヌクレオチドまたはヌクレオシド誘導体を意味する。
そのような誘導体および類似体は、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ， Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａ
ｎａｌｏｇｓ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ， １９８０） および Ｕｈｌｍ
ａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３－５８４，
１９９０ で議論されている。ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、ホスホル
アニリデートおよびホスホルアミデート結合。本明細書で使用される「誘導体」、「類似
体」および「修飾された」は交換可能に使用され、本明細書で定義される「ヌクレオチド
」および「ヌクレオシド」という用語に包含される。
本明細書で使用される「リン酸塩」という用語は、当業者に理解される通常の意味で使
用され、そのプロトン化された形を含む（例えば、
）。本明細書で使用される「一リン酸」、「二リン酸」、および「三リン酸」という用語
は、当業者に理解される通常の意味で使用され、プロトン化された形態を含む。
本明細書で使用される「保護基」および「保護基」という用語は、分子内の既存の基が
望ましくない化学反応を起こすのを防ぐために分子に付加される任意の原子または原子団
を指す。「保護基」と「保護基」は同じ意味で使用される場合がある。
本明細書で使用される接頭辞「ｐｈｏｔｏ」または「ｐｈｏｔｏ－」は、光または電磁
放射に関することを意味する。この用語は、電波、マイクロ波、赤外線、可視、紫外線、
Ｘ線、またはスペクトルのガンマ線部分として一般的に知られている１つまたは複数の範
囲を含むがこれらに限定されない電磁スペクトルのすべてまたは一部を含むことができる
。スペクトルの一部は、本明細書に記載の金属等、表面の金属領域によってブロックされ
るものであり得る。代替的または追加的に、スペクトルの一部は、ガラス、プラスチック
、シリカ、または本明細書に記載の他の材料でできた領域等、表面の隙間領域を通過する
ものであり得る。特定の実施形態では、金属を通過できる放射線を使用することができる
。代替的または追加的に、ガラス、プラスチック、シリカ、または本明細書に記載の他の
材料によってマスクされた放射線を使用することができる。
本明細書で使用される場合、「フェージング」という用語は、３’ターミネーターおよ
びフルオロフォアの不完全な除去、および所与のシーケンシングサイクルでのポリメラー
ゼによるクラスター内のＤＮＡ鎖の一部の取り込みの完了の失敗によって引き起こされる
ＳＢＳの現象を指す。プレフェージングは、効果的な３’ターミネーターのないヌクレオ
チドの取り込みによって引き起こされる。取り込みイベントは、終了の失敗により１サイ
クル先に進む。フェージングとプレフェージングにより、特定のサイクルで測定された信
号強度は、現在のサイクルからの信号と、前後のサイクルからのノイズで構成される。サ
イクル数が増えると、フェージングとプレフェージングの影響を受けるクラスターあたり
の配列の割合が増え、正しい塩基の特定が妨げられる。プレフェージングは、合成による
シーケンシング（ＳＢＳ）中に、保護されていない、またはブロックされていない３’－
ＯＨヌクレオチドが微量存在することによって引き起こされる可能性がある。保護されて
いない３’－ＯＨヌクレオチドは、製造プロセス中、または場合によっては保管および試
薬処理プロセス中に生成される可能性がある。したがって、プレフェージングの発生率を
低下させるヌクレオチド類似体の発見は驚くべきことであり、既存のヌクレオチド類似体
よりもＳＢＳ用途において大きな利点を提供する。たとえば、提供されるヌクレオチド類
似体は、より速いＳＢＳサイクル時間、より低いフェージングおよびプレフェージング値
、およびより長いシーケンス読み取り長をもたらす可能性がある。
（３’－ヒドロキシアセタールブロッキング基）
本開示のいくつかの実施形態は、３’－炭素原子に共有結合した構造
を形成する除去可能な３’－ＯＨ保護または遮断基を有するリボースまたはデオキシリボ
ースを含むヌクレオチドまたはヌクレオシド分子であって、式中：
各Ｒ１ａおよびＲ１ｂは、独立して、Ｈ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキ
ル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ、Ｃ１～Ｃ６ハロアルコキシ、シアノ、ハロゲン、任意で置換
されたフェニル、または任意で置換されたアラルキルであり；
各Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、独立してＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル
、シアノ、またはハロゲンであり；
あるいは、Ｒ１ａおよびＲ２ａは、それらが結合している原子とともに、必要に応じて
置換された５～８員のヘテロシクリル基を形成し；
Ｒ３は、Ｈ、任意で置換されたＣ２～Ｃ６アルケニル、任意で置換されたＣ３～Ｃ７シ
クロアルケニル、任意で置換されたＣ２～Ｃ６アルキニル、または任意で置換された（Ｃ
１～Ｃ６アルキレン）Ｓｉ（Ｒ４）３であり；かつ
各Ｒ４は、独立してＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、または任意に置換されたＣ６～Ｃ１０ア
リールであり；ただし、各Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａ、およびＲ２ｂがＨの場合、Ｒ３はＨ
ではない、
ヌクレオチドまたはヌクレオシド分子に関する。
本開示のいくつかのさらなる実施形態は、式（Ｉ）の構造：
を有する化合物であって、式中、Ｒ’はＨ、一リン酸、二リン酸、三リン酸、チオリン酸
、リン酸エステル類似体、反応性リン含有基に結合した－Ｏ－、または保護基によって保
護された－Ｏ－であり；Ｒ’’はＨまたはＯＨであり；Ｂは核酸塩基であり；Ｒ１ａ、Ｒ
１ｂ、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、およびＲ３の各々は、上記で定義されている、化合物に関する。
いくつかのさらなる実施形態では、Ｂは、
である。いくつかのさらなる実施形態において、核酸塩基は、場合によりリンカーを介し
て、検出可能な標識（例えば、蛍光色素）に共有結合し、例えば、Ｂが、
である。いくつかのそのような実施形態において、Ｒ’は、三リン酸である。いくつかの
そのような実施形態では、Ｒ’’は、Ｈである。
本明細書に記載のアセタールブロッキング基のいくつかの実施形態では、Ｒ１ａおよび
Ｒ１ｂの少なくとも１つはＨである。いくつかのそのような実施形態では、各Ｒ１ａおよ
びＲ１ｂはＨである。他のいくつかの実施形態では、Ｒ１ａおよびＲ１ｂの少なくとも１
つはＣ１～Ｃ６アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピルまたはｔ－ブチルであ
る。いくつかの実施形態では、Ｒ２ａおよびＲ２ｂのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲ
ン、またはＣ１～Ｃ６アルキルである。いくつかのそのような実施形態において、Ｒ２ａ
およびＲ２ｂのうちの少なくとも１つは、ＨまたはＣ１～Ｃ６アルキルである。いくつか
のそのような実施形態では、各Ｒ２ａおよびＲ２ｂはＨである。いくつかのそのような実
施形態では、各Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、Ｃ１～Ｃ６アルキル、例えば、メチル、エチル、
イソプロピルまたはｔ-ブチルである。一実施形態では、各Ｒ２ａおよびＲ２ｂはメチル
である。いくつかのそのような実施形態において、各Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、独立して、
Ｃ１～Ｃ６アルキルまたはハロゲンである。いくつかのそのような実施形態において、Ｒ
２ａはＨであり、Ｒ２ｂはハロゲンまたはＣ１～Ｃ６アルキルである。
本明細書に記載のアセタールブロッキング基のいくつかの実施形態において、Ｒ３は、
必要に応じて置換されたＣ２～Ｃ６アルケニルである。いくつかのそのような実施形態に
おいて、Ｒ３は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、およびそれ
らの組み合わせからなる群から独立して選択される１つ以上の置換基で任意で置換された
Ｃ２～Ｃ６アルケニル（例えば、ビニル、プロペニル）である。いくつかのさらなる実施
形態では、Ｒ３は
である。いくつかの他の実施形態において、Ｒ３は、必要に応じて置換されたＣ２～Ｃ６
アルキニルである。いくつかのそのような実施形態において、Ｒ３は、ハロゲン、Ｃ１～
Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、およびそれらの組み合わせからなる群から独立
して選択される１つ以上の置換基で任意で置換されたＣ２～Ｃ６アルキニル（例えば、エ
チニル、プロピニル）である。一実施形態では、Ｒ３は、必要に応じて置換されたエチニ
ル（
）である。他のいくつかの実施形態では、Ｒ３は、任意で置換されている（Ｃ１～Ｃ６ア
ルキレン）Ｓｉ（Ｒ４）３である。いくつかのそのような実施形態において、Ｒ４の少な
くとも１つはＣ１－４アルキルである。いくつかのさらなる実施形態において、Ｒ４のそ
れぞれは、Ｃ１～Ｃ４アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピルまたはｔ-ブチ
ルである。一実施形態では、Ｒ３は、－（ＣＨ２）－ＳｉＭｅ３である。いくつかの代替
の実施形態では、Ｒ３は、Ｃ１～Ｃ６アルキルである。
いくつかの代替の実施形態において、Ｒ１ａおよびＲ２ａは、それらが結合している原
子と共に、５から７員のヘテロシクリルを形成する。いくつかのそのような実施形態にお
いて、Ｒ１ａおよびＲ２ａは、それらが結合している原子と共に、６員のヘテロシクリル
を形成する。いくつかのそのような実施形態において、６員のヘテロシクリル基は、構造
を有する。いくつかのさらなる実施形態では、各Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂおよびＲ３の少なくとも
１つはＨである。他のいくつかの実施形態では、各Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂおよびＲ３の少なくと
も１つはＣ１～Ｃ６アルキルである。一実施形態では、各Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂおよびＲ３はＨ
である。
いくつかのさらなる実施形態において、式（Ｉ）の化合物はまた、式（Ｉａ）によって
表される：
式中、各Ｒ２ｃおよびＲ２ｄは、独立して、Ｈ、ハロゲン（例えば、フルオロ、クロロ）
、Ｃ１～Ｃ６アルキル（例えば、メチル、エチル、またはイソプロピル）、またはＣ１～
Ｃ６ハロアルキル（例えば、－ＣＨＦ２、－ＣＨ２Ｆ、または－ＣＦ３）である。いくつ
かのそのような実施形態では、Ｒ１ａおよびＲ１ｂの１つはＨである。いくつかのそのよ
うな実施形態では、各Ｒ１ａおよびＲ１ｂはＨである。他のいくつかの実施形態では、Ｒ
１ａおよびＲ１ｂの少なくとも１つはＣ１～Ｃ６アルキル、例えばメチル、エチル、イソ
プロピルまたはｔ－ブチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２ａおよびＲ２ｂのそれ
ぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲン、またはＣ１～Ｃ６アルキルである。いくつかのそのよ
うな実施形態では、各Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、Ｈである。いくつかのそのような実施形態
では、Ｒ２ｃおよびＲ２ｄのそれぞれは、独立して、Ｈ、ハロゲンまたはＣ１～Ｃ６アル
キルである。いくつかのそのような実施形態において、各Ｒ２ｃおよびＲ２ｄは、Ｃ１～
Ｃ６アルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピルまたはｔ-ブチルである。一実施
形態では、各Ｒ２ｃおよびＲ２ｄはメチルである。いくつかのそのような実施形態では、
各Ｒ２ｃおよびＲ２ｄは独立してハロゲンである。いくつかのそのような実施形態では、
Ｒ２ｃはＨであり、Ｒ２ｄはＨ、ハロゲン（フルオロ、クロロ）またはＣ１～Ｃ６アルキ
ル（例えば、メチル、エチル、イソプロピルまたはｔ-ブチル）である。さらなる実施形
態において、各Ｒ１ａおよびＲ１ｂはＨであり；Ｒ２ａはＨであり；Ｒ２ｂはＨ、ハロゲ
ンまたはメチルであり；Ｒ２ｃはＨであり；Ｒ２ｄは、Ｈ、ハロゲン、メチル、エチル、
イソプロピル、またはｔ－ブチルである。
本明細書に記載のブロッキング基の非限定的な実施形態が、以下からなる群から選択さ
れる構造を有するものを含んでいる：
、リボースまたはデオキシリボースの３’炭素に共有結合されている。
（３’－ヒドロキシチオカルバメートブロッキング基）
本開示のいくつかの追加の実施形態は、３’-炭素原子に共有結合した構造
を形成する除去可能な３’－ＯＨ遮断基を有するリボースまたはデオキシリボースを含む
ヌクレオシドまたはヌクレオチドであって、式中：
Ｒ５およびＲ６のそれぞれは、独立してＨ、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ２～Ｃ６アルケニ
ル、Ｃ２～Ｃ６アルキニル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ２～Ｃ８アルコキシアルキル、
任意に置換－（ＣＨ２）ｍ－フェニル、置換されていてもよい－（ＣＨ２）ｎ－（５また
は６員ヘテロアリール）、置換されていてもよい－（ＣＨ２）ｋ－Ｃ３－Ｃ７カルボシク
リル、または置換されていてもよい－（ＣＨ２）ｐ－（３～７員ヘテロシクリル）であり
；
あるいは、Ｒ５およびＲ６は、それらが結合している原子とともに、置換されていても
よい５～７員のヘテロシクリルを形成し；
－（ＣＨ２）ｍ－、－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｋ－、および－（ＣＨ２）ｐ－の
それぞれは置換されていてもよく；かつ
ｍ、ｎ、ｋ、およびｐのそれぞれは、独立して０、１、２、３、または４である、
ヌクレオシドまたはヌクレオチドに関する。
いくつかの追加の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物に関する：
式中、Ｒ’はＨ、一リン酸、二リン酸、三リン酸、チオリン酸、リン酸エステル類似体、
反応性リン含有基に結合した－Ｏ－、または保護基によって保護された－Ｏ－であり；Ｒ
’’はＨまたはＯＨであり；Ｂは核酸塩基であり；Ｒ５とＲ６のそれぞれは上で定義され
ている。いくつかのさらなる実施形態では、Ｂは、
である。いくつかのさらなる実施形態において、核酸塩基は、場合によりリンカーを介し
て、検出可能な標識（例えば、蛍光色素）に共有結合し、例えば、Ｂが、
である。いくつかのそのような実施形態において、Ｒ’は、三リン酸である。いくつかの
そのような実施形態では、Ｒ’’は、Ｈである。
本明細書に記載のチオカルバメートブロッキング基のいくつかの実施形態では、Ｒ５お
よびＲ６の少なくとも１つはＨである。いくつかのそのような実施形態では、各Ｒ５およ
びＲ６はＨである。いくつかのそのような実施形態では、Ｒ５はＨであり、Ｒ６はＣ１～
Ｃ６アルキル、たとえば、メチル、エチル、イソプロピル、またはｔ－ブチルである。い
くつかのそのような実施形態において、Ｒ５はＨであり、Ｒ６はＣ２～Ｃ６アルケニル（
例えば、ビニルまたはアリル）またはＣ２～Ｃ６アルキニル（例えば、エチニルまたはプ
ロピニル）である。いくつかのそのような実施形態において、Ｒ５はＨであり、Ｒ２は、
任意で置換された－（ＣＨ２）ｍ－フェニル、任意で置換された－（ＣＨ２）ｎ－（５ま
たは６員ヘテロアリール）、任意で置換された－（ＣＨ２）ｋ－Ｃ３～Ｃ７カルボシクリ
ル、または必要に応じて置換－（ＣＨ２）ｐ－（３～７員のヘテロシクリル）。いくつか
のさらなる実施形態において、Ｃ３～Ｃ７カルボシクリル基は、Ｃ３～Ｃ７シクロアルキ
ルまたはＣ３～Ｃ７シクロアルケニルであり得る。３から７員のヘテロシクリル基は、環
構造にゼロまたは１つの二重結合を含み得る。さらなる実施形態において、Ｒ５はＨであ
り、Ｒ６は、任意で置換された－（ＣＨ２）ｍ－フェニル、任意で置換された－（ＣＨ２
）ｎ－６員ヘテロアリール、任意で置換された－（ＣＨ２）ｋ－Ｃ５またはＣ６カルボシ
クリル、または任意で置換された－（ＣＨ２）ｐ－（５または６員のヘテロシクリル）。
いくつかの実施形態では、ｍ、ｎ、ｋ、またはｐは０である。他の実施形態では、ｍ、ｎ
、ｋまたはｐは１または２である。他のいくつかの実施形態では、Ｒ５およびＲ６の少な
くとも１つは、Ｃ１～Ｃ６アルキルである。例えば、メチル、エチル、イソプロピルまた
はｔ－ブチル。いくつかのさらなる実施形態において、Ｒ５およびＲ６の両方は、Ｃ１～
Ｃ６アルキルである。一実施形態では、Ｒ５およびＲ６の両方がメチルである。
いくつかの代替の実施形態において、Ｒ５およびＲ６は、それらが結合している原子と
共に、任意で置換された５から７員のヘテロシクリルを形成する。いくつかのそのような
実施形態において、Ｒ５およびＲ６は、それらが結合している原子と共に、必要に応じて
置換されたピペリジニルを形成する。
本明細書に記載の３’－Ｏ－チオカルバメートブロッキング基の非限定的な実施形態は
、以下からなる群から選択される構造を有するものを含む：
リボースまたはデオキシリボースの３’炭素に共有結合されている。
本開示の追加の実施形態は、本明細書に記載のヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに関する。
本明細書に記載のブロッキング基の実施形態のいずれかにおいて、基が「任意で置換さ
れた」と記載される場合、それは、非置換または置換のいずれかであり得る。
本明細書に記載の３’ヒドロキシブロッキング基を有するヌクレオチドまたはヌクレオ
シドの任意の実施形態において、ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、場合によりリンカ
ーを介して、検出可能な標識（例えば、フルオロフォア）に共有結合し得る。リンカーは
、切断可能または切断不可能であり得る。いくつかのそのような実施形態において、検出
可能な標識（例えば、フルオロフォア）は、切断可能なリンカーを介してヌクレオシドま
たはヌクレオチドの核酸塩基に共有結合している。いくつかの他の実施形態では、検出可
能な標識（例えば、フルオロフォア）は、切断可能なリンカーを介してヌクレオシドまた
はヌクレオチドの３’酸素に共有結合している。いくつかのさらなる実施形態において、
そのような切断可能なリンカーは、アジド部分またはジスルフィド部分、アセタール部分
、またはチオカルバメート部分を含み得る。いくつかの実施形態において、３’ヒドロキ
シブロッキング基および切断可能なリンカー（および付着した標識）は、同じまたは実質
的に同じ化学反応条件下で除去され得、例えば、ブロッキング基および検出可能な標識は
、単一の化学反応において除去され得る。他の実施形態では、ブロッキング基および検出
可能な標識は、２つの別個のステップで除去される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるヌクレオチドまたはヌクレオシド
は、２’デオキシリボースを含む。いくつかのさらなる局面において、２’デオキシリボ
ースは、糖環の５’位置に１つ、２つ、または３つのリン酸基を含む。いくつかのさらな
る態様において、本明細書に記載されるヌクレオチドは、ヌクレオチド三リン酸である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の３’ブロックヌクレオチドまたはヌク
レオシドは、先行技術に開示された標準の３’－ＯＨブロッキング基で保護された同じヌ
クレオチドまたはヌクレオシドと比較して、保存中の溶液またはシーケンシングアプリケ
ーション中の試薬取り扱いにおいて優れた安定性を提供する。例えば、３’－Ｏ－アジド
メチル保護基。例えば、本明細書に開示されるアセタールまたはチオカルバメートブロッ
キング基は、同時に同じ期間のコンディションでアジドメチルで保護された３’－ＯＨと
比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％
、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７
００％、８００％、９００％、１０００％、１５００％、２０００％、２５００％、また
は３０００％向上した安定性を付与し得、それにより、プレフェーズ値が減少し、シーケ
ンスの読み取り長が長くなる。いくつかの実施形態では、安定性は、周囲温度または周囲
温度より低い温度（例えば、４～１０℃）で測定される。他の実施形態では、安定性は、
４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃または６５℃等の高温で測定される。いくつか
のそのような実施形態では、安定性は、塩基性ｐＨ環境、例えば、ｐＨ９．０、９．２、
９．４、９．６、９．８または１０．０の溶液中で測定される。いくつかのそのような実
施形態において、安定性は、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）、末端デオキ
シヌクレオチジルトランスフェラーゼ、または逆転写酵素等の酵素の存在の有無にかかわ
らず測定される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の３’ブロックヌクレオチドまたはヌク
レオシドは、先行技術に開示された標準３’－ＯＨブロッキング基で保護された同じヌク
レオチドまたはヌクレオシドと比較して、シーケンシングアプリケーションの化学的切断
ステップ中に溶液中で優れた脱ブロッキング速度を提供する。例えば、３’－Ｏ－アジド
メチル保護基。例えば、本明細書に開示されるアセタールまたはチオカルバメートブロッ
キング基は、標準の脱ブロック試薬（トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン等）を使
用したアジドメチル保護３’－ＯＨと比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０
％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％
、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００
％、１５００％、または２０００％向上した脱ブロック化率を付与し得、それによってシ
ーケンスサイクルの全体的な時間を短縮する。いくつかの実施形態では、脱ブロック化率
は、周囲温度または周囲温度より低い温度（例えば、４～１０℃）で測定される。他の実
施形態では、脱ブロック化率は、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、または６５
℃等の高温で測定される。いくつかのそのような実施形態では、脱ブロック化速度は、塩
基性ｐＨ環境、例えば、ｐＨ９．０、９．２、９．４、９．６、９．８または１０．０の
溶液中で測定される。いくつかのそのような実施形態では、脱ブロック試薬と基質（すな
わち、３’ブロックヌクレオシドまたはヌクレオチド）のモル比は、約１０：１、約５：
１、約２：１、または約１：１である。
いくつかの実施形態では、パラジウム脱ブロック試薬（例えば、Ｐｄ（０）を使用して
、３’アセタールブロッキング基（例えば、ＡＯＭブロッキング基）を除去する。Ｐｄは
、ＡＯＭ基の２つの酸素原子ともキレート錯体を形成し得る。アリル基の二重結合として
、官能基のすぐ近くにある脱ブロック試薬を除去できるようにし、脱ブロック化速度を加
速させることができる。
（３’－ＯＨブロッキング基の脱保護）
本明細書に記載の３’－アセタールブロッキング基は、様々な化学的条件下で除去また
は切断することができる。ビニルまたはアルケニル部分を含むアセタールブロッキング基
の場合、非限定的な切断条件には、ホスフィン配位子、例えばトリス（ヒドロキシメチル
）の存在下でのＰｄ（ＯＡｃ）２またはアリルＰｄ（ＩＩ）クロリドダイマー等のＰｄ（
ＩＩ）錯体が含まれる。ホスフィン（ＴＨＭＰ）、またはトリス（ヒドロキシルプロピル
）ホスフィン（ＴＨＰまたはＴＨＰＰ）。アルキニル基（例えば、エチニル）を含むそれ
らのブロッキング基については、それらはまた、ホスフィンリガンド（例えば、ＴＨＰま
たはＴＨＭＰ）の存在下で、Ｐｄ（ＩＩ）錯体（例えば、Ｐｄ（ＯＡｃ）２またはアリル
Ｐｄ（ＩＩ）クロリドダイマー）によって除去され得る。
（パラジウム切断試薬）
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるアセタール遮断基は、パラジウム
触媒によって切断され得る。いくつかのそのような実施形態において、Ｐｄ触媒は水溶性
である。いくつかのそのような実施形態では、Ｐｄ（０）錯体（例えば、トリス（３，３
’、３’’－ホスフィンジネトリス（ベンゼンスルホナト）パラジウム（０）非ナトリウ
ム塩非水和物）である。場合によっては、Ｐｄ（０）錯体は、アルケン、アルコール、ア
ミン、ホスフィン、金属水素化物等の試薬によるＰｄ（ＩＩ）錯体の還元からその場で生
成される。適切なパラジウム源には、Ｎａ２ＰｄＣｌ４、Ｐｄ（ＣＨ３ＣＮ）２Ｃｌ２、
（ＰｄＣｌ（Ｃ３Ｈ５））２、［Ｐｄ（Ｃ３Ｈ５）（ＴＨＰ）］Ｃｌ、［Ｐｄ（Ｃ３Ｈ５
）（ＴＨＰ）２］Ｃｌ、Ｐｄ（ＯＡｃ）２、Ｐｄ（Ｐｈ３）４、Ｐｄ（ｄｂａ）２、Ｐｄ
（Ａｃａｃ）２、ＰｄＣｌ２（ＣＯＤ）、そのような一実施形態では、Ｐｄ（０）錯体は
、Ｎａ２ＰｄＣｌ４からその場で生成される。別の実施形態では、パラジウム源は、アリ
ルパラジウム（ＩＩ）クロリドダイマー［（ＰｄＣｌ（Ｃ３Ｈ５））２］である。いくつ
かの実施形態では、Ｐｄ（０）錯体は、Ｐｄ（ＩＩ）錯体をホスフィンと混合することに
よって水溶液中で生成される。適切なホスフィンには、トリス（ヒドロキシプロピル）ホ
スフィン（ＴＨＰ）、トリス（ヒドロキシメチル）、ホスフィン（ＴＨＭＰ）、１，３，
５－トリアザ－７－ホスファアダマンタン（ＰＴＡ）、ビス（ｐ－スルホナトフェニル）
フェニルホスフィン二水和物カリウム塩、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣ
ＥＰ）、およびトリフェニルホスフィン－３，３’、３’－トリスルホン酸三ナトリウム
塩等の水溶性ホスフィンが含まれる。
いくつかの実施形態では、Ｐｄ（０）は、Ｐｄ（ＩＩ）錯体［（ＰｄＣｌ（Ｃ３Ｈ５）
）２］をその場でＴＨＰと混合することによって調製される。Ｐｄ（ＩＩ）錯体とＴＨＰ
のモル比は、約１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、ま
たは１：１０である可能性がある。いくつかのさらなる実施形態において、アスコルビン
酸またはその塩（例えば、アスコルビン酸ナトリウム）等の１つ以上の還元剤を添加する
ことができる。いくつかの実施形態において、開裂混合物は、第一級アミン、第二級アミ
ン、第三級アミン、炭酸塩、リン酸塩、またはホウ酸塩、またはそれらの組み合わせ等の
追加の緩衝試薬を含み得る。いくつかのさらなる実施形態において、緩衝試薬は、エタノ
ールアミン（ＥＡ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、グリシン、
炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、２－ジメチルアミノメタノール
（ＤＭＥＡ）、２－ジエチルアミノメタノール（ＤＥＥＡ）、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テト
ラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、またはＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テトラエチルエ
チレンジアミン（ＴＥＥＤＡ）、またはそれらの組合せを含む。一実施形態では、緩衝試
薬はＤＥＥＡである。別の実施形態では、緩衝試薬は、炭酸塩、リン酸塩、またはホウ酸
塩、あるいはそれらの組合せ等の１つまたは複数の無機塩を含む。一実施形態では、無機
塩は、ナトリウム塩である。
あるいは、ブロッキング基を含むアルキニル部分は、（ＮＨ４）２ＭｏＳ４の存在下で
も切断され得る。アルキニル部分の他の非限定的な切断条件には、ＴＨＰＴＡ配位子（ト
リス（３－ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン）とのＣｕ（ＩＩ）錯体、お
よびアスコルビン酸塩が含まれる。６員複素環（例えば、テトラヒドロピラン）を含むブ
ロッキング基の非限定的な切断条件には、シクロデキストリンまたはＬｎ（ＯＴｆ）３（
ランタニドトリフラート）が含まれる。アルキルシラン基を含むブロッキング基（例えば
、－ＣＨ２ＳｉＭｅ３）の非限定的な切断条件には、ＬｉＢＦ４（四フッ化ホウ酸リチウ
ム）が含まれる。－Ｏ（ＣＨ２）Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル等の他のアセタールブロッキン
グ基は、ＬｉＢＦ４またはＢｉ（ＯＴｆ）３（ビスマストリフラート）によって除去でき
る。記載された様々なブロッキング基を切断するための非限定的な例示的な条件は、以下
のスキーム１に示されている。
スキーム１．３’－脱ブロック化条件の例示
本明細書に記載の３’－Ｏ－チオカルバメートブロッキング基は、様々な化学的条件下
で除去または切断することができる。本明細書に記載のチオカルバメートブロッキング基
を切断するための非限定的な例示的な条件には、ＮａＩＯ４およびＯｘｏｎｅ（登録商標
）（ペルオキシ一硫酸カリウム）が含まれる。
さらに、－ＣＨ２Ｎ３のアジド基はホスフィンによってアミノ基に変換できる。あるい
は、－ＣＨ２Ｎ３のアジド基は、そのような分子をチオール、特にジチオスレイトール（
ＤＴＴ）等の水溶性チオールと接触させることによってアミノ基に変換することができる
。一実施形態では、ホスフィンはＴＨＰである。
（線形化との互換性）
核酸シーケンシング反応のスループットを最大化するために、複数のテンプレート分子
を並行してシーケンシングできることが有利である。複数のテンプレートの並列処理は、
核酸アレイ技術を使用して実現できる。これらのアレイは、通常、固体支持材料上に固定
化されたポリヌクレオチドの高密度マトリックスからなる。
ＷＯ９８／４４１５１およびＷＯ００／１８９５７は両方とも、複数の同一の固定化ポ
リヌクレオチド鎖および複数の同一の固定化ポリヌクレオチド鎖から形成されるクラスタ
ーまたは「コロニー」からなるアレイを形成するために、増幅産物を固体支持体に固定化
することを可能にする核酸増幅の方法を記載している。複数の同一の固定化された相補鎖
。このタイプのアレイは、本明細書では「クラスター化アレイ」と呼ばれる。これらの方
法に従って調製されたクラスター化アレイ上のＤＮＡコロニーに存在する核酸分子は、例
えば、ＷＯ９８／４４１５２に記載されているように、シーケンシング反応のためのテン
プレートを提供することができる。ＷＯ９８／４４１５１およびＷＯ００／１８９５７に
記載されるような固相増幅反応の生成物は、固定化ポリヌクレオチド鎖および固定化相補
鎖の対のアニーリングによって形成されるいわゆる「架橋」構造であり、両方の鎖が５’
端のしっかりしたサポート。核酸シーケンシングのためのより適切なテンプレートを提供
するために、少なくとも部分的に一本鎖であるテンプレートを生成するために、「架橋」
構造における固定化鎖の１つの実質的にすべてまたは少なくとも一部を除去することが好
ましい。したがって、一本鎖であるテンプレートの部分は、シーケンシングプライマーへ
のハイブリダイゼーションに利用可能である。「架橋」二本鎖核酸構造内の１つの固定化
鎖の全部または一部を除去するプロセスは、「線形化」と呼ばれる。線形化には、酵素的
切断、光化学的切断、または化学的切断を含むがこれらに限定されない種々の方法がある
。線形化方法の非限定的な例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／０１０２５１、米国特許
公開番号２００９／００８８３２７、米国特許公開番号２００９／０１１８１２８、およ
び米国特許出願第６２／６７１，８１６号に開示され、これらは参照により全体に組み込
まれる。
いくつかの実施形態において、３’－ＯＨブロッキング基の脱保護または除去のための
条件はまた、線形化プロセスと適合性がある。いくつかのさらなる実施形態において、脱
保護条件は、Ｐｄ錯体およびホスフィン、例えば、Ｐｄ（ＯＡｃ）２およびＴＨＰの使用
を含む化学的線形化プロセスと適合性がある。いくつかの実施形態では、Ｐｄ複合体は、
ホスフィンの存在下でインサイチュでＰｄ（０）を生成するＰｄ（ＩＩ）複合体である。
特に明記しない限り、ヌクレオチドへの言及は、ヌクレオシドにも適用可能であること
を意図している。
（標識ヌクレオチド）
本開示の一態様によれば、記載された３’－ＯＨブロック化ヌクレオチドはまた、検出
可能な標識も含み、そのようなヌクレオチドは標識ヌクレオチドと呼ばれる。標識（例え
ば、蛍光色素）は、疎水性引力、イオン引力、および共有結合を含む種々の手段によって
、オプションのリンカーを介して結合することができる。いくつかの局面において、染料
は、共有結合によって基質にコンジュゲートされる。より具体的には、共有結合はリンカ
ー基による。場合によっては、そのような標識ヌクレオチドは「修飾ヌクレオチド」とも
呼ばれる。
標識ヌクレオチドは、非限定的な例として、ＰＣＲ増幅、等温増幅、固相増幅、ポリヌ
クレオチドシーケンシング（例えば、固相シーケンシング）、ニックトランスレーション
反応等において、酵素合成によって形成されたポリヌクレオチドを標識するために有用で
ある。
いくつかの実施形態において、色素は、ヌクレオチド塩基を介してオリゴヌクレオチド
またはヌクレオチドに共有結合され得る。例えば、標識ヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチドは、リンカー部分を介して、ピリミジン塩基のＣ５位置または７－デアザプリン塩
基のＣ７位置に付着した標識を有することができる。
特に明記しない限り、ヌクレオチドへの言及はヌクレオシドにも適用できるものとする
。本出願はまた、ＤＮＡを参照してさらに説明されるが、特に明記しない限り、説明はＲ
ＮＡ、ＰＮＡ、および他の核酸にも適用可能である。
（リンカー）
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のヌクレオチドまたはヌク
レオシド分子のプリンまたはピリミジン塩基は、上記の検出可能な標識に結合することが
できる。そのようないくつかの実施形態では、使用されるリンカーは切断可能である。切
断可能なリンカーを使用すると、必要に応じて検出後に標識を確実に除去でき、その後に
組み込まれる標識ヌクレオチドまたはヌクレオシドとの干渉信号を回避できる。いくつか
の実施形態において、切断可能なリンカーは、アジド部分、－Ｏ－Ｃ２～Ｃ６アルケニル
部分（例えば、－Ｏ－アリル）、ジスルフィド部分、アセタール部分（本明細書に記載の
３’アセタールブロッキング基と同じまたは類似）を含む。）、またはチオカルバメート
部分（本明細書に記載の３’アセタールブロッキング基と同じまたは類似）。
いくつかの他の実施形態では、使用されるリンカーは切断不可能である。本発明の標識
ヌクレオチドが組み込まれる各場合において、その後にヌクレオチドを組み込む必要がな
く、したがって、ヌクレオチドから標識を除去する必要がない。
切断可能なリンカーは当技術分野で知られており、従来の化学を適用して、リンカーを
ヌクレオチド塩基および標識に結合させることができる。リンカーは、酸、塩基、求核剤
、求電子剤、ラジカル、金属、還元剤または酸化剤、光、温度、酵素等への暴露を含む、
任意の適切な方法によって切断することができる。３’－Ｏ－ブロッキング基結合を切断
するために使用される。適切なリンカーは、Ｇｒｅｅｎｅ ＆ Ｗｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅ
ｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ に開示されている標準的な化学保護基から適合させることが
できる。固相合成で使用されるさらに適切な切断可能なリンカーは、Ｇｕｉｌｌｉｅｒ
ｅｔ ａｌ． （Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． １００：２０９２－２１５７， ２０００）に
開示される。
検出可能な標識が塩基に付着している場合、ワトソン・クリック塩基対形成が依然とし
て実行できる限り、リンカーはヌクレオチド塩基上の任意の位置に付着することができる
。プリン塩基の文脈では、リンカーがプリンまたは好ましいデアザプリン類似体の７位を
介して、８修飾プリンを介して、Ｎ－６修飾アデノシンまたはＮ－２修飾グアニンを介し
て結合している場合が好ましい。ピリミジンの場合、結合はシトシン、チミジンまたはウ
ラシルの５位およびシトシンのＮ－４位を介することが好ましい。
いくつかの実施形態では、リンカーはスペーサーユニットを含むことができる。ヌクレ
オチドと酵素、例えばポリメラーゼとの間の相互作用を妨害しないように、標識がヌクレ
オチドから十分な距離を保っている限り、リンカーの長さは重要ではない。
いくつかの実施形態において、リンカーは、３’－ＯＨ保護基と同様の官能基からなり
得る。これにより、ラベルと保護基の両方を１回の処理で除去するだけで済むため、脱保
護と脱保護のプロセスがより効率的になる。
用語「切断可能なリンカー」の使用は、リンカー全体が除去される必要があることを意
味するものではない。切断部位は、リンカーの一部が切断後に色素および／または基質部
分に結合したままであることを保証するリンカー上の位置に配置することができる。切断
可能なリンカーは、非限定的な例として、求電子的に切断可能なリンカー、求核的に切断
可能なリンカー、光切断可能なリンカー、還元的条件下（例えば、ジスルフィドまたはア
ジド含有リンカー）、酸化的条件下で切断可能であり、安全キャッチリンカーの使用を介
して切断可能であり、排除メカニズムによって切断可能であるものであってもよい。切断
可能なリンカーを使用して色素化合物を基質部分に結合させることにより、必要に応じて
、検出後に標識を除去することができるようになり、下流ステップでの干渉シグナルを回
避することができる。
有用なリンカー基は、ＰＣＴ公開番号国際公開第２００４／０１８４９３号（参照によ
り本明細書に組み込まれる）に見出され得、その例としては、遷移金属および少なくとも
部分的に水溶性の配位子から形成された水溶性ホスフィンまたは水溶性遷移金属触媒を使
用して切断され得るリンカーが挙げられる。水溶液中で、後者は少なくとも部分的に水溶
性の遷移金属錯体、例えば、Ｐｄ（ＩＩ）錯体およびＴＨＰを形成する。そのような切断
可能なリンカーを使用して、ヌクレオチドの塩基を、本明細書に記載の色素といった標識
に接続することができる。
特別なリンカーとしては、以下の式の部分を含むものといった、ＰＣＴ公開番号国際公
開２００４／０１８４９３号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものが
含まれる：
（式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮＱを含む基から選択され、Ｑは、Ｃ１－１０置換ま
たは非置換アルキル基であり、Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮ（アリル）を含む群から選択
され、Ｔは、水素またはＣ１－Ｃ１０置換または非置換アルキル基であり、かつ＊は、部
分がヌクレオチドまたはヌクレオシドの残りの部分に接続されている場所を示す）。いく
つかの態様では、リンカーは、ヌクレオチドの塩基を、例えば、本明細書に記載の色素化
合物といった、標識に接続する。
リンカーの追加の例としては、以下の式の部分を含むものといった、米国公開番号２０
１６／００４０２２５（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものが含まれ
る：
本明細書に示されるリンカー部分は、ヌクレオチド／ヌクレオシドと標識との間のリンカ
ー構造全体または部分を含んでもよい。
リンカー（「Ｌ」）の追加の例には、式の一部が含まれる：
ここで、Ｂは核酸塩基であり；Ｚは－Ｎ３（アジド）、－Ｏ－Ｃ１～Ｃ６アルキル、－Ｏ
－Ｃ２～Ｃ６アルケニル、または－Ｏ－Ｃ２～Ｃ６アルキニル；Ｆ１は、追加のリンカー
構造を含み得る蛍光標識を含む。当業者は、標識の官能基（例えば、カルボキシル）をリ
ンカーの官能基（例えば、アミノ）と反応させることによって、標識がリンカーに共有結
合していることを理解している。
特別な実施形態では、蛍光色素（フルオロフォア）とグアニン塩基との間のリンカーの
長さは、例えば、ポリエチレングリコールスペーサー基を導入することによって変更する
ことができ、それにより、グアニン塩基と当該分野で公知の他のリンケージを介して結合
した同じフルオロフォアと比較して蛍光強度を増加させる。例示的なリンカーおよびそれ
らの特性は、ＰＣＴ公開番号国際公開第２００７０２０４５７号（参照により本明細書に
組み込まれる）に示される。リンカーの設計、特にそれらの長さの増加により、ＤＮＡ等
のポリヌクレオチドに組み込まれたときにグアノシンヌクレオチドのグアニン塩基に結合
したフルオロフォアの輝度を向上させることができる。したがって、色素がグアニン含有
ヌクレオチドに結合した蛍光色素標識の検出を必要とする分析方法で使用する場合、リン
カーが、国際公開第２００７／０２０４５７号に記載されているように式－（（ＣＨ２）
２Ｏ）ｎ－のスペーサー基であって、式中ｎが２と５０との間の整数であるものを含むと
、有利である。
ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、糖または核酸塩基上の部位で標識され得る。当該
分野で公知のように、「ヌクレオチド」は、窒素塩基、糖、および１以上のリン酸基から
なる。ＲＮＡでは、糖は、リボースであり、ＤＮＡでは、デオキシリボース、すなわちリ
ボースに存在するヒドロキシ基を欠く糖である。窒素塩基は、プリンまたはピリミジンの
誘導体である。プリンは、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）であり、ピリミジンは、
シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）、またはＲＮＡの文脈では、ウラシル（Ｕ）である。
デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１またはプリンのＮ－９に結合する
。ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルでもあり、糖のＣ－３またはＣ－５に
結合したヒドロキシ基でエステル化が起こる。ヌクレオチドは通常、一、二、または三リ
ン酸である。
「ヌクレオシド」は構造的にヌクレオチドに類似しているが、リン酸部分が欠落してい
る。ヌクレオシド類似体の例は、標識が塩基に結合しており、糖分子にリン酸基が結合し
ていないものである。
塩基は通常プリンまたはピリミジンと呼ばれるが、当業者は、ヌクレオチドまたはヌク
レオシドがＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を受ける能力を変化させない誘導体およ
び類似体が利用可能であることを理解するであろう。「誘導体」または「類似体」は、コ
ア構造が親化合物と同じであるか、またはそれに非常に類似しているが、例えば、異なる
または追加の側鎖といった、誘導体ヌクレオチドまたはヌクレオシドを別の分子に結合さ
せることを可能にする、化学的または物理的修飾を有する化合物または分子を意味する。
例えば、塩基は、デアザプリンであってもよい。特別な実施形態では、誘導体は、Ｗａｔ
ｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋペアリングを受けることが可能であるべきである。「誘導体」および
「類似体」はまた、例えば、修飾された塩基部分および／または修飾された糖部分を有す
る合成ヌクレオチドまたはヌクレオシド誘導体を含む。そのような誘導体および類似体は
、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ＆Ｓｏｎ，１９８０）およびＵｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖ
ｉｅｗｓ ９０：５４３－５８４，１９９０で考察されている。ヌクレオチド類似体はま
た、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、ホスホラニリ
デート、ホスホルアミデート結合等を含む修飾ホスホジエステル結合を含み得る。
色素は、例えばリンカーを介して、ヌクレオチド塩基上の任意の位置に結合させること
ができる。特別な実施形態では、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成は、得られた類似
体に対して依然として実施することができる。特定の核酸塩基標識部位としては、ピリミ
ジン塩基のＣ５位置または７－デアザプリン塩基のＣ７位置が挙げられる。上記のように
、リンカー基を使用して、色素をヌクレオシドまたはヌクレオチドに共有結合させ得る。
特別な実施形態では、標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、酵素的に組み込
まれ、酵素的に伸長可能であり得る。したがって、リンカー部分は、化合物が核酸複製酵
素によるヌクレオチドの全体的な結合および認識を著しく妨害しないように、ヌクレオチ
ドを化合物に接続するのに十分な長さであり得る。したがって、リンカーはスペーサーユ
ニットを含むこともできる。スペーサーは、例えば、切断部位または標識からヌクレオチ
ド塩基を離す。
本明細書に記載の色素で標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、以下の式を有
してもよい：
式中、Ｄｙｅは、色素化合物であり；Ｂは、例えば、ウラシル、チミン、シトシン、アデ
ニン、グアニンといった、核酸塩基であり；Ｌは、存在しても存在しなくてもよい任意の
リンカー基であり；Ｒ’は、Ｈ、一リン酸、二リン酸、三リン酸、チオリン酸、リン酸エ
ステル類似体、反応性リン含有基に結合した－Ｏ－、またはブロッキング基によって保護
された－Ｏ－であり得；Ｒ’’’は、Ｈ、ＯＨ、ホスホルアミダイト、または本明細書に
記載の３’－ＯＨブロッキング基であり、Ｒ’’は、ＨまたはＯＨである。Ｒ’’’がホ
スホルアミダイトである場合、Ｒ’は、酸で切断可能なヒドロキシ保護基であり、自動合
成条件下でのその後のモノマーカップリングを可能にする。
特別な実施形態では、リンカー（色素とヌクレオチドの間）およびブロッキング基は両
方とも存在し、かつ別個の部分である。特別な実施形態では、リンカーおよびブロッキン
グ基は両方とも、実質的に同様の条件下で切断可能である。したがって、色素化合物とブ
ロッキング基の両方を除去するために必要な処理は１回だけであるため、脱保護および脱
ブロック化プロセスはより効率的であり得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、
リンカーおよびブロッキング基は、同様の条件下で切断可能である必要はなく、代わりに
、別個の条件下で個別に切断可能である。
本開示はまた、色素化合物を組み込んだポリヌクレオチドを包含する。そのようなポリ
ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で結合されたデオキシリボヌクレオチドまたはリ
ボヌクレオチドから各々構成されるＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。ポリヌクレオチ
ドは、天然に存在するヌクレオチド、本明細書に記載の標識化ヌクレオチド以外の非天然
に存在する（または修飾）ヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせを、本明細書
に記載の少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（例えば、色素化合物で標識）と組み合わせ
て含んでもよい。本開示によるポリヌクレオチドはまた、非天然骨格結合および／または
非ヌクレオチド化学修飾を含んでもよい。リボヌクレオチドおよび少なくとも１つの標識
化ヌクレオチドを含むデオキシリボヌクレオチドの混合物からなるキメラ構造もまた企図
される。
本明細書に記載される非限定的な例示的な標識化ヌクレオチドとしては、以下が挙げら
れる：
式中、Ｌは、リンカーを表し、Ｒは、上記の糖残基、または５’位が１、２、または３つ
のリン酸で置換された糖残基を表す。
いくつかの実施形態では、非限定的な例示的な蛍光色素コンジュゲートは、下記に示さ
れる：
式中、ＰＧは本明細書に記載の３’ヒドロキシブロッキング基を表す。本明細書に記載の
標識ヌクレオチドの任意の実施形態において、ヌクレオチドはヌクレオチド三リン酸であ
る。
（キット）
本開示はまた、１つ以上の３’ブロックヌクレオシドおよび／または本明細書に記載の
ヌクレオチド、例えば、式（Ｉ）、（Ｉａ）、または（ＩＩ）の３'ブロックヌクレオチ
ドを含むキットを提供する。そのようなキットは、概して、少なくとも１つのさらなる成
分と共に、色素で標識された少なくとも１つの３’ブロック化ヌクレオチドまたはヌクレ
オシドを含むであろう。さらなる構成要素は、本明細書に記載の方法または以下の実施例
のセクションに記載の方法で特定される１以上の構成要素であってもよい。本開示のキッ
トに組み合わせることができる構成要素のいくつかの非限定的な例を以下に記載する。
特定の実施形態では、キットは、少なくとも１つの標識３’ブロック化ヌクレオチドま
たはヌクレオシドを、標識または非標識ヌクレオチドまたはヌクレオシドとともに含むこ
とができる。例えば、染料で標識されたヌクレオチドは、非標識または天然ヌクレオチド
、および／または蛍光標識ヌクレオチドまたはそれらの任意の組み合わせと組み合わせて
供給され得る。ヌクレオチドの組み合わせは、別個の個別の成分（例えば、容器またはチ
ューブごとに１つのヌクレオチドタイプ）またはヌクレオチド混合物（例えば、同じ容器
またはチューブ内で混合された２つ以上のヌクレオチド）として提供される。
キットが、色素化合物で標識された複数、特に２つ、または３つ、またはより具体的に
は４つの３’ブロック化ヌクレオチドを含む場合、異なるヌクレオチドは異なる色素化合
物で標識されてもよいし、色素化合物なしで１つが暗色であってもよい。異なるヌクレオ
チドが異なる色素化合物で標識されている場合、その色素化合物がスペクトル的に区別可
能な蛍光色素であることは、キットの特徴である。本明細書で使用される場合、「スペク
トル的に識別可能な蛍光色素」という用語は、２つ以上のそのような色素が存在する場合
に、蛍光検出装置（例えば、市販のキャピラリーベースのＤＮＡシーケンシングプラット
フォーム）によって識別できる波長で蛍光エネルギーを放出する蛍光色素を指す。１つの
サンプルに存在する。蛍光色素化合物で標識された２つのヌクレオチドがキットの形で提
供される場合、スペクトル的に区別可能な蛍光色素が、例えば同じレーザー等によって同
じ波長で励起できることが、いくつかの実施形態の特徴である。蛍光色素化合物で標識さ
れた４つの３’ブロックヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＧ）がキットの形で提供され
る場合、スペクトル的に識別可能な蛍光色素の２つが両方とも１つの波長で励起され、他
の２つのスペクトル的に識別可能な色素は、両方とも別の波長で励起できる。特定の励起
波長は４８８ｎｍと５３２ｎｍである。
一実施形態では、キットは、第１の色素で標識された第１の３’ブロックヌクレオチド
および第２の色素で標識された第２のヌクレオチドを含み、色素は、少なくとも１０ｎｍ
、特に２０ｎｍから５０ｎｍの最大吸光度の差を有する。より具体的には、２つの色素化
合物は、１５～４０ｎｍのストークスシフトを有し、ここで、「ストークスシフト」は、
ピーク吸収波長とピーク発光波長との間の距離である。
代替の実施形態では、本開示のキットは、同じ塩基が２つ以上の異なる色素で標識され
ている３’ブロックヌクレオチドを含み得る。第１のヌクレオチド（例えば、３’ブロッ
クされたＴヌクレオチド三リン酸または３’ブロックされたＧヌクレオチド三リン酸）は
、第１の色素で標識され得る。第２のヌクレオチド（例えば、３’ブロックＣヌクレオチ
ド三リン酸）は、第１の色素とはスペクトル的に異なる第２の色素、例えば、６００ｎｍ
未満で吸収する「緑色」色素、および以下で吸収する「青色」色素で標識され得る。５０
０ｎｍ、たとえば４００ｎｍ～５００、特に４５０ｎｍ～４６０ｎｍ）。第３のヌクレオ
チド（例えば、３’ブロックＡヌクレオチド三リン酸）は、第１および第２の色素の混合
物、または第１、第２および第３の色素と第４のヌクレオチド（例えば、３’ブロックＧ
）の混合物として標識され得る。ヌクレオチド三リン酸または３’ブロックＴヌクレオチ
ド三リン酸）は「暗い」可能性があり、ラベルが含まれていません。一例では、ヌクレオ
チド１～４は、「青」、「緑」、「青／緑」、および暗色とラベル付けされ得る。機器を
さらに簡素化するために、４つのヌクレオチドを単一のレーザーで励起された２つの色素
で標識することができる。したがって、ヌクレオチド１～４の標識は、「青１」、「青２
」、「青１／青２」、および闇。
特定の実施形態では、キットは、４つの標識された３’ブロックヌクレオチド（例えば
、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）を含み得、ここで、各タイプのヌクレオチドは、同じ３’ブロッキン
グ基および蛍光標識を含み、各蛍光標識は、別個のものを有する。最大蛍光および各蛍光
標識は、他の３つの標識と区別できる。キットは、２つ以上の蛍光標識が同様の最大吸光
度を有するが異なるストークスシフトを有するようなものであり得る。他のいくつかの実
施形態では、１つのタイプのヌクレオチドは標識されていない。
本明細書では、異なる色素化合物で標識された異なるヌクレオチドを有する構成に関し
てキットが例示されているが、キットは、同じ色素化合物を有する２、３、４またはそれ
以上の異なるヌクレオチドを含み得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態に
おいて、キットはまた、酵素および酵素の作用に適切な緩衝液を含む。いくつかのそのよ
うな実施形態において、酵素は、ポリメラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼ、または逆転写酵素である。特定の実施形態では、酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ
８１２（Ｐｏｌ ８１２）またはＤＮＡポリメラーゼ１９０１（Ｐｏｌ １９０１）等の
ＤＮＡポリメラーゼである。Ｐｏｌ ８１２およびＰｏｌ １９０１ポリメラーゼのアミ
ノ酸配列は、例えば、２０１９年１０月３１日に出願された米国特許出願第１６／６７０
，８７６号および２０１９年１２月４日に出願された１６／７０３，５６９に記載されて
いる。参照により本明細書に組み込まれる。
そのようなキットに含まれる他の成分には、緩衝液等が含まれる。本開示のヌクレオチ
ド、および異なるヌクレオチドの混合物を含む他の任意のヌクレオチド成分は、使用前に
希釈される濃縮形態でキットに提供され得る。そのような実施形態では、適切な希釈緩衝
液も含まれ得る。ここでも、本明細書に記載の方法で特定される構成要素の１以上を、本
開示のキットに含めることができる。
（シーケンシングの方法）
本開示による標識ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、ヌクレオチドまたはヌクレオシ
ドに付着した蛍光標識の検出を含む方法等の任意の分析方法で使用することができる。こ
の文脈において、「ポリヌクレオチドに組み込まれる」という用語は、５’リン酸がリン
酸ジエステル結合で第２の（修飾または非修飾）ヌクレオチドの３’ヒドロキシ－ＯＨ基
に結合していることを意味し、それ自体が長いポリヌクレオチド鎖の一部を形成している
可能性がある。本明細書に記載のヌクレオチドの３’末端は、さらなる（修飾または非修
飾）ヌクレオチドの５’リン酸にホスホジエステル結合で結合していても結合していなく
てもよい。したがって、１つの非限定的な実施形態において、本開示は、（ａ）本開示の
少なくとも１つのヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込むこと、および（ｂ）組み込
まれたヌクレオチドを検出することを含む、ポリヌクレオチドに組み込まれるヌクレオチ
ドを検出する方法を提供する。前記ヌクレオチドに結合した色素化合物からの蛍光シグナ
ルを検出することにより、ポリヌクレオチドに挿入する。
この方法は、本開示による１以上のヌクレオチドがポリヌクレオチドに組み込まれる合
成ステップ（ａ）、および検出によってポリヌクレオチドに組み込まれた１以上のヌクレ
オチドが検出される検出ステップ（ｂ）を含むことができる。またはそれらの蛍光を定量
的に測定する。
本出願のいくつかの実施形態は、以下を含むシーケンシング方法を対象とする。（ａ）
本明細書に記載の少なくとも１つの標識ヌクレオチドをポリヌクレオチドに組み込むこと
；（ｂ）前記ヌクレオチドに付着した新しい蛍光色素からの蛍光シグナルを検出すること
により、ポリヌクレオチドに組み込まれた標識ヌクレオチドを検出する。
本開示のいくつかの実施形態は、以下を含む、標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決
定するための方法に関する：
（ａ）３’－ＯＨブロッキング基および本明細書に記載の検出可能な標識を含むヌクレオ
チドを、標的ポリヌクレオチド鎖の少なくとも一部に相補的なコピーポリヌクレオチド鎖
に組み込むこと；
（ｂ）コピーポリヌクレオチド鎖に取り込まれたヌクレオチドの同一性を検出すること；
および
（ｃ）コピーポリヌクレオチド鎖に取り込まれたヌクレオチドから標識および３’－ＯＨ
ブロッキング基を化学的に除去すること。
いくつかの実施形態において、シーケンシング方法は、（ｄ）化学的に除去された標識
および３’ブロッキング基をコピーポリヌクレオチド鎖から洗い流すことをさらに含む。
いくつかのそのような実施形態において、３’ブロッキング基および検出可能な標識は、
次の相補的ヌクレオチドを導入する前に除去される。いくつかのさらなる実施形態におい
て、３’ブロッキング基および検出可能な標識は、化学反応の単一のステップで除去され
る。いくつかの実施形態において、洗浄工程（ｄ）はまた、組み込まれていないヌクレオ
チドを除去する。いくつかのさらなる実施形態において、パラジウムスカベンジャーはま
た、標識および３’ブロッキング基の化学的開裂後の洗浄工程において使用される。
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）～（ｄ）は、テンプレートポリヌクレオ
チド鎖の部分の配列が決定されるまで繰り返される。いくつかのそのような実施形態では
、ステップ（ａ）～（ｄ）は、少なくとも５０回、少なくとも７５回、少なくとも１００
回、少なくとも１５０回、少なくとも２００回、少なくとも２５０回、または少なくとも
３００回繰り返される。
いくつかの実施形態では、標識および３’ブロッキング基は、２つの別個の化学反応で
除去される。いくつかのそのような実施形態において、コピーポリヌクレオチド鎖に組み
込まれたヌクレオチドから標識を除去することは、組み込まれたヌクレオチドを含むコピ
ー鎖を第１の切断溶液と接触させることを含む。いくつかのそのような実施形態では、第
１の切断溶液は、トリアルキルホスフィン等のホスフィンを含む。トリアルキルホスフィ
ンの非限定的な例には、トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）、トリス－
（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフ
ィン（ＴＨＭＰ）、またはトリス（ヒドロキシエチル）ホスフィン（ＴＨＥＰ）が含まれ
る。一実施形態では、第１の切断溶液はＴＨＰを含む。いくつかのそのような実施形態に
おいて、コピーポリヌクレオチド鎖に組み込まれたヌクレオチドから３’ブロッキング基
を除去することは、組み込まれたヌクレオチドを含むコピー鎖を第２の切断溶液と接触さ
せることを含む。いくつかのそのような実施形態では、第２の開裂溶液は、パラジウム（
Ｐｄ）触媒を含む。いくつかのさらなる実施形態において、Ｐｄ触媒は、Ｐｄ（０）触媒
である。いくつかのそのような実施形態において、Ｐｄ（０）は、Ｐｄ（ＩＩ）錯体［（
ＰｄＣｌ（Ｃ３Ｈ５））２］をその場でＴＨＰと混合することによって調製される。 Ｐ
ｄ（ＩＩ）錯体とＴＨＰのモル比は、約１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：
７、１：８、１：９、または１：１０である可能性がある。一実施形態では、Ｐｄ：ＴＨ
Ｐのモル比は１：５である。いくつかのさらなる実施形態において、アスコルビン酸また
はその塩（例えば、アスコルビン酸ナトリウム）等の１つ以上の還元剤を添加することが
できる。いくつかの実施形態において、第２の開裂溶液は、第一級アミン、第二級アミン
、第三級アミン、炭酸塩、リン酸塩、またはホウ酸塩、またはそれらの組み合わせ等の１
つ以上の緩衝試薬を含み得る。いくつかのさらなる実施形態において、緩衝試薬は、エタ
ノールアミン（ＥＡ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、グリシン
、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、２－ジメチルアミノメタノー
ル（ＤＭＥＡ）、２－ジエチルアミノメタノール（ＤＥＥＡ）、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テ
トラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、またはＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テトラエチル
エチレンジアミン（ＴＥＥＤＡ）、またはそれらの組合せを含む。一実施形態では、緩衝
試薬はＤＥＥＡである。別の実施形態では、緩衝試薬は、炭酸塩、リン酸塩、またはホウ
酸塩、あるいはそれらの組み合わせ等の１つまたは複数の無機塩を含む。一実施形態では
、無機塩はナトリウム塩である。他のいくつかの実施形態では、第２の切断溶液は、Ｎａ
ＩＯ４またはＯｘｏｎｅ（登録商標）を含む。いくつかのさらなる実施形態において、３
’ブロックヌクレオチドは、ＡＯＭ基を含み、第２の切断溶液は、パラジウム（Ｐｄ）触
媒および本明細書に記載の１つ以上の緩衝試薬（例えば、ＤＥＥＡ等の第三級アミン）を
含み、約９．０～約１０．０（たとえば、９．６または９．８）のｐＨを有する。
いくつかの代替の実施形態では、標識および３’－ＯＨ遮断基は、単一の化学反応で除
去される。いくつかのそのような実施形態において、標識は、３’ブロッキング基と同じ
部分を含む切断リンカーを介してヌクレオチドに結合され、例えば、リンカーおよび３’
ブロッキング基の両方は、本明細書に記載されているような、アセタール部分
またはチオカルバメート部分
を含み得る。いくつかのそのような実施形態において、単一の化学反応は、上記のＰｄ触
媒を含む開裂溶液中で実施される。
いくつかのさらなる実施形態において、組み込みステップ（ａ）で使用されるヌクレオ
チドは、完全に官能化されたＡ、Ｃ、ＴおよびＧヌクレオチド三リン酸であり、それぞれ
、本明細書に記載の３’ブロッキング基を含む。いくつかのそのような実施形態において
、本明細書のヌクレオチドは、標準的な３’－Ｏ－アジドメチルブロッキング基で保護さ
れた同じヌクレオチドと比較して、シーケンシングの実行中に溶液中で優れた安定性を提
供する。例えば、本明細書に開示されるアセタールまたはチオカルバメートブロッキング
基は、同じ条件で同じ期間にアジドメチルで保護された３’－ＯＨと比較して、少なくと
も５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、
１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、
９００％、１０００％、１５００％、２０００％、２５００％、または３０００％の向上
した安定性を付与し得、それにより、プレフェーズ値が減少し、シーケンスの読み取り長
が長くなる。いくつかの実施形態では、安定性は、周囲温度または周囲温度より低い温度
（例えば、４～１０℃）で測定される。他の実施形態では、安定性は、４０℃、４５℃、
５０℃、５５℃、６０℃または６５℃等の高温で測定される。いくつかのそのような実施
形態では、安定性は、塩基性ｐＨ環境、例えば、ｐＨ９．０、９．２、９．４、９．６、
９．８または１０．０の溶液中で測定される。いくつかのさらなる実施形態において、本
明細書に記載の３’ブロックヌクレオチドを用いたプレフェージング値は、ＳＢＳを５０
、１００、または１５０サイクル以上実行した後、約０．２５、０．２４、０．２３、０
．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０
．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０
．０６、または０．０５未満である。いくつかのさらなる実施形態において、３’ブロッ
クヌクレオチドを伴う位相値は、 ＳＢＳを５０、１００、または１５０サイクル以上実
行した後、約０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９
、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１
、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、または０．０５未満である。一
実施形態では、各ｆｆＮは３’－ＡＯＭグループを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の３’ブロックヌクレオチドは、標準的
な３’－Ｏ－アジドメチルブロッキング基で保護された同じヌクレオチドと比較して、シ
ーケンシング実行の化学的切断ステップ中に溶液中で優れた脱ブロック化速度を提供する
。例えば、本明細書に開示されるアセタール（例えば、ＡＯＭ）またはチオカルバメート
ブロッキング基は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％
、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５０
０％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１５００％、または２０
００％は、アジドメチルで保護された３’－ＯＨと比較して脱ブロック化率が向上してい
る。標準の脱ブロック試薬（トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン等）を使用するこ
とにより、シーケンスサイクルの全体的な時間を短縮する。いくつかの実施形態では、各
ヌクレオチドの脱ブロック化時間は、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％
、または６０％短縮される。たとえば、３’－ＡＯＭおよび３’－Ｏ－アジドメチルの脱
ブロック化時間は、特定の化学反応条件下でそれぞれ約４～５秒および約９～１０秒であ
る。いくつかの実施形態において、ＡＯＭ遮断基の半減期（ｔ１／２）は、アジドメチル
遮断基よりも少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍速い。いくつ
かのそのような実施形態では、ＡＯＭのｔ１／２は約１分であり、アジドメチルのｔ１／
２は約１１分である。いくつかの実施形態では、脱ブロック化率は、周囲温度または周囲
温度より低い温度（例えば、４～１０℃）で測定される。他の実施形態では、脱ブロック
化率は、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、または６５℃等の高温で測定される
。いくつかのそのような実施形態では、脱ブロック化速度は、塩基性ｐＨ環境、例えば、
ｐＨ９．０、９．２、９．４、９．６、９．８または１０．０の溶液中で測定される。い
くつかのそのような実施形態において、脱ブロック試薬と基質（すなわち、３’ブロック
されたヌクレオシドまたはヌクレオチド）のモル比は、約１０：１、約５：１、約２：１
、約１：１、約１：２、約１：５または約１：１０である。一実施形態では、各ｆｆＮは
３’－ＡＯＭグループを含む。
本明細書に記載の方法の任意の実施形態において、標識されたヌクレオチドは、ヌクレ
オチド三リン酸である。本明細書に記載の方法の任意の実施形態において、標的ポリヌク
レオチド鎖は、フローセル等の固体支持体に付着している。
１つの実施形態において、少なくとも１つのヌクレオチドは、ポリメラーゼ酵素の作用
により合成ステップでポリヌクレオチドに組み込まれる。いくつかのそのような実施形態
において、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＰｏｌ ８１２またはＰｏｌ １９０１
であり得る。しかしながら、ヌクレオチドをポリヌクレオチドに結合する他の方法、例え
ば、化学的オリゴヌクレオチド合成または標識オリゴヌクレオチドの非標識オリゴヌクレ
オチドへのライゲーションを使用することができる。したがって、「組み込む」という用
語は、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドに関して使用される場合、化学的方法および
酵素的方法によるポリヌクレオチド合成を包含することができる。
特定の実施形態では、合成ステップが実施され、本開示の標識化３’ブロック化ヌクレ
オチドを含む反応混合物と共にテンプレートポリヌクレオチド鎖をインキュベートするこ
とを任意に含み得る。テンプレートポリヌクレオチド鎖にアニールされたポリヌクレオチ
ド鎖上の遊離３’－ＯＨ基とヌクレオチド上の５’リン酸基との間のホスホジエステル結
合の形成を可能にする条件下でポリメラーゼを提供することもできる。したがって、合成
ステップは、テンプレート鎖に対するヌクレオチドの相補的塩基対形成によって指示され
るポリヌクレオチド鎖の形成を含むことができる。
本方法のすべての実施形態において、標識ヌクレオチドが組み込まれるポリヌクレオチ
ド鎖がテンプレート鎖にアニールされる間、または２本の鎖が分離される変性工程の後に
、検出工程を実施することができる。合成工程と検出工程との間に、さらなる工程、例え
ば化学または酵素反応工程または精製工程を含めることができる。特に、標識ヌクレオチ
ドを組み込んだ標的鎖を単離または精製し、さらに処理するか、またはその後の分析に使
用することができる。例として、合成ステップにおいて本明細書に記載のヌクレオチドで
標識された標的ポリヌクレオチドは、続いて標識プローブまたはプライマーとして使用さ
れ得る。他の実施形態では、本明細書に記載の合成ステップの生成物は、さらなる反応ス
テップにかけられてもよく、必要に応じて、これらの後続ステップの生成物は精製または
単離されてもよい。
合成ステップに適した条件は、標準的な分子生物学技術に精通している者にはよく知ら
れている。一実施形態では、合成ステップは、本明細書に記載のヌクレオチドを含むヌク
レオチド前駆体を使用する標準的なプライマー伸長反応に類似し、適切なポリメラーゼ酵
素の存在下でテンプレート鎖に相補的な伸長標的鎖を形成することができる。他の実施形
態では、合成工程自体が増幅反応の一部を形成し、標的および鋳型ポリヌクレオチド鎖の
コピーに由来するアニールされた相補鎖からなる標識二本鎖増幅産物を生成する。他の例
示的な合成ステップには、ニックトランスレーション、鎖置換重合、ランダムプライムＤ
ＮＡ標識等が含まれる。合成ステップに特に有用なポリメラーゼ酵素は、本明細書に記載
のヌクレオチドの取り込みを触媒できるものである。種々の天然または修飾ポリメラーゼ
を使用することができる。例として、熱安定性ポリメラーゼは、熱サイクル条件を使用し
て実行される合成反応に使用することができるが、等温プライマー伸長反応には熱安定性
ポリメラーゼは望ましくない場合がある。本開示によるヌクレオチドを組み込むことがで
きる適切な熱安定性ポリメラーゼには、ＷＯ２００５／０２４０１０またはＷＯ０６／１
２０４３３に記載されているものが含まれ、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み
込まれる。３７℃等の低温で行われる合成反応では、ポリメラーゼ酵素は必ずしも熱安定
性ポリメラーゼである必要はない。したがって、ポリメラーゼの選択は、反応温度、ｐＨ
、鎖置換活性、およびお気に入り。
特定の非限定的な実施形態では、本開示は、核酸シーケンシング、再シーケンシング、
全ゲノムシーケンシング、一塩基多型スコアリングの方法、ポリヌクレオチドに組み込ま
れた場合の本明細書に記載の標識ヌクレオチドまたはヌクレオシドの検出を含む他の適用
を包含する。蛍光色素を含むヌクレオチドで標識されたポリヌクレオチドの使用に利益を
もたらす他の様々な用途はいずれも、本明細書に記載の色素で標識ヌクレオチドまたはヌ
クレオシドを使用することができる。
特定の実施形態において、本開示は、本開示による標識ヌクレオチドの合成によるポリ
ヌクレオチドシーケンシング（ＳＢＳ）反応における使用を提供する。合成によるシーケ
ンシングは、通常、ポリメラーゼまたはリガーゼを使用して、成長中のポリヌクレオチド
鎖に１つまたは複数のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを５’から３’方向に順次
追加して、テンプレート核酸に相補的な伸長ポリヌクレオチド鎖を形成する。順序付けら
れた追加されたヌクレオチドの１つまたは複数に存在する塩基の同一性は、検出または「
イメージング」ステップで決定することができる。付加された塩基の同一性は、各ヌクレ
オチド取り込みステップの後に決定することができる。次に、テンプレートのシーケンス
は、従来のワトソン－クリック塩基対形成規則を使用して推測することができる。単一塩
基の同一性を決定するための本明細書に記載の標識ヌクレオチドの使用は、例えば、単一
ヌクレオチド多型のスコアリングにおいて有用である可能性があり、そのような単一塩基
伸長反応は本開示の範囲内である。
本開示の一実施形態において、テンプレートポリヌクレオチドの配列は、組み込まれた
ポリヌクレオチドに付着した蛍光標識の検出を通じて、シーケンシングされるテンプレー
トポリヌクレオチドに相補的な新生鎖への１つ以上の本明細書に記載の３’ブロック化ヌ
クレオチドの組み込みを検出することによって決定される。ヌクレオチド。テンプレート
ポリヌクレオチドのシーケンシングは、適切なプライマー（またはヘアピンの一部として
プライマーを含むヘアピンコンストラクトとして準備）でプライムすることができ、３’
末端へのヌクレオチドの付加によって新生鎖が段階的に伸長される。ポリメラーゼ触媒反
応におけるプライマーの量。
特定の実施形態において、異なるヌクレオチド三リン酸（Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ）のそれ
ぞれは、独特のフルオロフォアで標識され得、制御されない重合を防止するために３’位
にブロッキング基も含む。または、４つのヌクレオチドの１つが非標識（暗色）である可
能性がある。ポリメラーゼ酵素は、テンプレートポリヌクレオチドに相補的な新生鎖にヌ
クレオチドを組み込み、ブロッキング基はヌクレオチドのさらなる組み込みを防ぐ。取り
込まれていないヌクレオチドはすべて洗い流すことができ、取り込まれた各ヌクレオチド
からの蛍光シグナルは、レーザー励起および適切な発光フィルターを使用する電荷結合素
子等の適切な手段によって光学的に「読み取る」ことができる。次に、３’－ブロッキン
グ基と蛍光色素化合物を同時にまたは連続して除去（脱保護）して、さらなるヌクレオチ
ド取り込みのために新生鎖を露出させることができる。通常、組み込まれたヌクレオチド
の同一性は、各組み込みステップの後に決定されるが、これは厳密には必須ではない。同
様に、米国特許Ｎｏ．米国特許第５，３０２，５０９号（参照により本明細書に組み込ま
れる）は、固体支持体に固定化されたポリヌクレオチドを配列する方法を開示している。
この方法は、上に例示したように、蛍光標識された３’－ブロックヌクレオチドＡ、Ｇ
、Ｃ、およびＴを、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、固定化ポリヌクレオチドに相補的な
成長鎖に組み込むことを利用する。ポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドに相補的な塩
基を組み込んでいるが、３’－ブロッキング基によってそれ以上の付加が妨げられている
。次に、取り込まれたヌクレオチドの標識を決定し、化学的切断によって保護基を除去し
て、さらに重合を行うことができる。合成によるシーケンシング反応においてシーケンシ
ングされる核酸テンプレートは、シーケンシングが望まれる任意のポリヌクレオチドであ
り得る。シーケンシング反応のための核酸テンプレートは、典型的には、シーケンシング
反応におけるさらなるヌクレオチドの付加のためのプライマーまたは開始点として機能す
る遊離の３’－ＯＨ基を有する二本鎖領域を含む。シーケンシングされるテンプレートの
領域は、相補鎖上のこの遊離の３’－ＯＨ基をオーバーハングする。シーケンシングされ
るテンプレートのオーバーハング領域は、一本鎖でもよいが、シーケンシングされるテン
プレート鎖に相補的な鎖上に「ニックが存在する」ことにより、開始のための遊離の３’
－ＯＨ基を提供するという条件で、二本鎖でもよい。シーケンス反応。そのような実施形
態では、シーケンシングは鎖置換によって進行し得る。特定の実施形態において、遊離３
’－ＯＨ基を有するプライマーは、シーケンシングされるテンプレートの一本鎖領域にハ
イブリダイズする別個の成分（例えば、短いオリゴヌクレオチド）として加えられ得る。
あるいは、シーケンシングされるプライマーおよびテンプレート鎖は、例えばヘアピンル
ープ構造等の分子内二本鎖を形成することができる部分的に自己相補的な核酸鎖の一部を
それぞれ形成することができる。ヘアピンポリヌクレオチドおよびそれらを固体支持体に
付着させる方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／５７２４８およびＷＯ２００５／０４７３
０１に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ヌクレオチドは、
成長するプライマーに連続して追加され、５’から３’方向のポリヌクレオチド鎖が合成
される。付加された塩基の性質は、特に各ヌクレオチド付加後に決定されるが、必ずしも
そうである必要はないので、核酸テンプレートの配列情報を提供する。したがって、ヌク
レオチドの５’リン酸基とのホスホジエステル結合の形成を介して、ヌクレオチドを核酸
鎖の遊離３’－ＯＨ基に結合することにより、ヌクレオチドが核酸鎖（またはポリヌクレ
オチド）に組み込まれます。
シーケンシングされる核酸テンプレートは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはデオキシヌク
レオチドおよびリボヌクレオチドからなるハイブリッド分子でさえあり得る。核酸テンプ
レートは、シーケンシング反応におけるテンプレートのコピーを妨げない限り、天然およ
び／または非天然ヌクレオチドおよび天然または非天然骨格結合を含んでもよい。
特定の実施形態では、シーケンシングされる核酸テンプレートは、当技術分野で公知の
任意の適切な結合方法、例えば共有結合によって固体支持体に結合され得る。特定の実施
形態において、テンプレートポリヌクレオチドは、固体支持体（例えば、シリカベースの
支持体）に直接付着され得る。しかしながら、本開示の他の実施形態において、固体支持
体の表面は、テンプレートポリヌクレオチドの直接的な共有結合を可能にするか、または
それ自体が非であり得るヒドロゲルまたは高分子電解質多層を通してテンプレートポリヌ
クレオチドを固定化するように、何らかの方法で修飾され得る。－固体支持体に共有結合
している。
（合成によるシーケンシングの実施形態および代替物）
いくつかの実施形態は、パイロシーケンシング技術を含む。パイロシーケンシングは、
特定のヌクレオチドが新生鎖に組み込まれるときに無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検
出する（Ｒｏｎａｇｈｉ、Ｍ．、Ｋａｒａｍｏｈａｍｅｄ、Ｓ．、Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ
、Ｂ．、Ｕｈｌｅｎ、Ｍ。ａｎｄ Ｎｙｒｅｎ、Ｐ。（１９９６） “Ｒｅａｌ－ピロリ
ン酸放出の検出を使用した時間ＤＮＡシーケンシング。”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４２（１）、８４－９； Ｒｏｎａｇｈｉ、Ｍ。（２００１）"
パイロシーケンシングはＤＮＡシーケンシングに光を当てる。 “ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ。
１１（１）、３－１１； Ｒｏｎａｇｈｉ 、Ｍ．、Ｕｈｌｅｎ、Ｍ。およびＮｙｒｅｎ
、Ｐ。（１９９８）「リアルタイムピロリン酸に基づくシーケンシング方法」Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２８１（５３７５）、３６３；米国特許第６，２１０，８９１号；第６，２５８，
５６８号および第６，２７４，３２０号の開示。これらは、参照によりその全体が本明細
書に組み込まれる）。パイロシーケンスでは、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルファラー
ゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に即座に変換されることで検出でき、生成され
たＡＴＰのレベルはルシフェラーゼで生成された光子を介して検出される。シーケンスさ
れる核酸は、アレイ内の特徴に付着させることができ、アレイは、アレイの特徴にヌクレ
オチドが組み込まれるために生成される化学発光シグナルを捕捉するために画像化するこ
とができる。アレイを特定のヌクレオチドタイプ（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ等）で処理した後、画
像を取得できる。各ヌクレオチドタイプの追加後に得られる画像は、アレイ内のどの特徴
が検出されるかに関して異なる。画像のこれらの違いは、アレイ上のフィーチャのシーケ
ンスコンテンツの違いを反映している。ただし、各フィーチャの相対的な位置は画像内で
変更されない。画像は、本明細書に記載の方法を使用して保存、処理、および分析するこ
とができる。例えば、それぞれの異なるヌクレオチドタイプでアレイを処理した後に得ら
れた画像は、可逆的ターミネーターベースのシーケンシング方法のための異なる検出チャ
ネルから得られた画像について本明細書に例示されるのと同じ方法で処理することができ
る。
別の例示的なタイプのＳＢＳでは、サイクルシーケンシングは、例えば、ＷＯ０４／０
１８４９７および米国特許第７，０５７，０２６号に記載されているように、例えば、切
断可能または光退色可能な色素標識を含む可逆的ターミネーターヌクレオチドの段階的添
加によって達成される。その開示は参照により本明細書に組み込まれる。このアプローチ
は、ソレクサ（現在のイルミナ社）によって商品化されており、それぞれが参照により本
明細書に組み込まれるＷＯ９１／０６６７８およびＷＯ０７／１２３，７４４にも記載さ
れている。両方の終端を逆にすることができ、蛍光標識が切断される蛍光標識ターミネー
ターの可用性は、効率的なサイクリックリバーシブルターミネーション（ＣＲＴ）シーケ
ンスを容易にする。ポリメラーゼはまた、これらの修飾ヌクレオチドを効率的に組み込み
、そこから伸長するように共同設計することができる。
好ましくは、可逆的ターミネーターベースのシーケンシングの実施形態において、標識
は、ＳＢＳ反応条件下での伸長を実質的に阻害しない。しかしながら、検出ラベルは、例
えば、切断または分解によって除去することができる。配列された核酸の特徴にラベルを
組み込んだ後、画像をキャプチャすることができる。特定の実施形態では、各サイクルは
、アレイへの４つの異なるヌクレオチドタイプの同時送達を含み、各ヌクレオチドタイプ
は、スペクトル的に異なる標識を有する。次に、４つの異なるラベルの１つに対して選択
的な検出チャネルをそれぞれ使用して４つの画像を取得できる。あるいは、異なるヌクレ
オチドタイプを連続して添加することができ、アレイの画像を各添加ステップの間に取得
することができる。そのような実施形態では、各画像は、特定のタイプのヌクレオチドを
組み込んだ核酸の特徴を示すであろう。各機能のシーケンスコンテンツが異なるため、種
々の画像に種々の機能が存在するか、存在しません。ただし、フィーチャの相対位置は画
像内で変更されない。このような可逆ターミネーター－ＳＢＳ法から得られた画像は、本
明細書に記載されているように保存、処理、および分析することができる。画像キャプチ
ャステップに続いて、ラベルを削除することができ、ヌクレオチドの追加と検出の後続の
サイクルのために可逆的なターミネーター部分を削除することができる。特定のサイクル
で検出された後、次のサイクルの前にラベルを除去すると、バックグラウンド信号とサイ
クル間のクロストークを低減できるという利点がある。有用なラベルと除去方法の例を以
下に示す。
いくつかの実施形態は、４つ未満の異なる標識を使用する４つの異なるヌクレオチドの
検出を利用することができる。例えば、ＳＢＳは、米国公開番号第２０１３／００７９２
３２号。最初の例として、ヌクレオチドタイプのペアは同じ波長で検出できるが、ペアの
一方のメンバーと他方のメンバーの強度の違いに基づいて、またはペアの一方のメンバー
への変化に基づいて区別される（例：化学修飾、光化学修飾、または物理的修飾を介して
）、ペアの他のメンバーで検出された信号と比較して、見かけの信号が表示または非表示
になる。 ２番目の例として、４つの異なるヌクレオチドタイプのうち３つは特定の条件
下で検出できるが、４番目のヌクレオチドタイプはそれらの条件下で検出可能なラベルが
ないか、これらの条件下で最小限に検出される（たとえば、バックグラウンド蛍光による
最小限の検出等）。核酸への最初の３つのヌクレオチドタイプの組み込みは、それらのそ
れぞれのシグナルの存在に基づいて決定することができ、核酸への第４のヌクレオチドタ
イプの組み込みは、任意のシグナルの不在または最小限の検出に基づいて決定することが
できる。第３の例として、１つのヌクレオチドタイプは、２つの異なるチャネルで検出さ
れる標識を含むことができるが、他のヌクレオチドタイプは、１つ以下のチャネルで検出
される。前述の３つの例示的な構成は、相互に排他的であるとは見なされず、様々な組み
合わせで使用することができる。３つすべての例を組み合わせた例示的な実施形態は、第
１のチャネルで検出される第１のヌクレオチドタイプ（例えば、第１の励起波長によって
励起されたときに第１のチャネルで検出される標識を有するｄＡＴＰ）を、第２のチャネ
ルで検出される第２のヌクレオチド型（例えば、第２の励起波長によって励起されたとき
に第２のチャネルで検出される標識を有するｄＣＴＰ）、第１および第２のチャネルの両
方で検出される第３のヌクレオチド型（例えば、第１および／または第２の励起波長によ
って励起されたときに両方のチャネルで検出される少なくとも１つの標識を有するｄＴＴ
Ｐ、およびどちらのチャネルでも検出されないか、または最小限に検出されない標識を欠
く第４のヌクレオチドタイプ（例えば、ラベル）を使用する蛍光ベースのＳＢＳ法である
。
さらに、米国公開番号第２０１３／００７９２３２号の組み込まれた資料に記載されて
いるように、シーケンスデータは単一チャネルを使用して取得できる。このようないわゆ
るワンダイシーケンシングアプローチでは、最初のヌクレオチドタイプはラベル付けされ
るが、ラベルは最初の画像が生成された後に削除され、２番目のヌクレオチドタイプは最
初の画像が生成された後にのみラベル付けされる。３番目のヌクレオチドタイプは１番目
と２番目の画像の両方でそのラベルを保持し、４番目のヌクレオチドタイプは両方の画像
でラベル付けされていないままである。
いくつかの実施形態は、ライゲーション技術によるシーケンシングを利用することがで
きる。そのような技術は、オリゴヌクレオチドを組み込むためにＤＮＡリガーゼを利用し
、そのようなオリゴヌクレオチドの組み込みを識別する。オリゴヌクレオチドは、典型的
には、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列中の特定のヌクレオチドの同一性と
相関する異なる標識を有する。他のＳＢＳ法と同様に、標識されたシーケンシング試薬で
一連の核酸機能を処理した後、画像を取得できる。各画像には、特定のタイプのラベルが
組み込まれた核酸の特徴が表示される。各特徴のシーケンスコンテンツが異なるため、異
なる画像には異なる特徴が存在するか存在しませんが、特徴の相対位置は画像内で変更さ
れない。ライゲーションベースのシーケンシング方法から得られた画像は、本明細書に記
載されているように保存、処理、および分析することができる。本明細書に記載の方法お
よびシステムと共に利用することができる例示的なＳＢＳシステムおよび方法は、米国特
許第６，９６９，４８８、６，１７２，２１８、および６，３０６，５９７号に記載され
ている（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態は、ナノポアシーケンシングを利用することができる（Ｄｅａｍｅ
ｒ、ＤＷ＆Ａｋｅｓｏｎ、Ｍ。「ナノポアおよび核酸：超高速シーケンシングの展望」。
ナノポア分析による核酸の分析」、Ａｃｃ。Ｃｈｅｍ。Ｒｅｓ。３５：８１７－８２５（
２００２）； Ｌｉ、Ｊ．、Ｍ。Ｇｅｒｓｈｏｗ、Ｄ。Ｓｔｅｉｎ、Ｅ。Ｂｒａｎｄｉｎ
、およびＪＡ Ｇｏｌｏｖｃｈｅｎｋｏ、「ＤＮＡ分子および構成固体ナノポア顕微鏡」
Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ。２：６１１－６１５（２００３）、その開示は、参照によりその全
体が本明細書に組み込まれる）。そのような実施形態では、標的核酸はナノポアを通過す
る。ナノポアは、合成ポアまたはα－溶血素等の生体膜タンパク質である可能性がある。
標的核酸がナノポアを通過するとき、ポアの電気コンダクタンスの変動を測定することに
より、各塩基対を特定することができる。 （米国特許第７，００１，７９２号； Ｓｏ
ｎｉ、ＧＶ＆Ｍｅｌｌｅｒ、 “Ａ。固体ナノポアを使用した超高速ＤＮＡシーケンシン
グに向けた進歩。” Ｃｌｉｎ。Ｃｈｅｍ。５３、１９９６－２００１（２００７）；
Ｈｅａｌｙ、Ｋ。 “ナノポアベース。単一分子ＤＮＡ分析。 “Ｎａｎｏｍｅｄ。２、
４５９－４８１（２００７）； Ｃｏｃｋｒｏｆｔ、ＳＬ、Ｃｈｕ、Ｊ．、Ａｍｏｒｉｎ
、Ｍ。＆Ｇｈａｄｉｒｉ、ＭＲ”単一分子ナノポアデバイスは単一ヌクレオチドでＤＮＡ
ポリメラーゼ活性を検出する決議。」Ｊ．Ａｍ。Ｃｈｅｍ。Ｓｏｃ。１３０、８１８－８
２０（２００８）、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ナノ
ポアシーケンシングから得られたデータは、本明細書に記載されているように保存、処理
、および分析することができる。特に、データは、本明細書に記載されている光学画像お
よび他の画像の例示的な処理に従って画像として扱うことができる。
シーケンシング方法の他のいくつかの実施形態は、米国特許第９，２２２，１３２号に
記載されているもの等、ナノボールシーケンシング技術において本明細書に記載されてい
る３’ブロックヌクレオチドの使用を含み、その開示は参照により組み込まれる。ローリ
ングサークル増幅（ＲＣＡ）のプロセスを通じて、多数の個別のＤＮＡナノボールが生成
される可能性がある。次に、ナノボール混合物は、単一のナノボールを各位置に関連付け
ることを可能にする特徴を含むパターン化されたスライド表面に分配される。ＤＮＡナノ
ボールの生成では、ＤＮＡは断片化され、４つのアダプター配列の最初の配列にライゲー
ションされる。テンプレートは、ＩＩ型エンドヌクレアーゼで増幅、環状化、切断される
。アダプターの２番目のセットが追加され、続いて増幅、環状化、および切断が行われま
す。このプロセスは、残りの２つのアダプターに対して繰り返される。最終製品は、それ
ぞれがテンプレートシーケンスで区切られた４つのアダプターを備えた円形テンプレート
である。ライブラリ分子はローリングサークル増幅ステップを経て、ＤＮＡナノボールと
呼ばれる大量のコンカテマーを生成し、フローセルに堆積する。Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ
ａｌ．， “Ｃｏｍｉｎｇ ｏｆ ａｇｅ： ｔｅｎ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｎｅｘｔ－ｇ
ｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，” Ｎａｔ
Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ． ２０１６；１７（６）：３３３－５１。
いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを含む方
法を利用することができる。ヌクレオチドの取り込みは、例えば、米国特許第７，３２９
，４９２号および第７，２１１，４１４号（これらは両方とも参照により本明細書に組み
込まれる）に記載されているように、フルオロフォア含有ポリメラーゼとγ－リン酸標識
ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用を介して検出するこ
とができる。またはヌクレオチド組み込みは、例えば、米国特許第７，３１５，０１９号
（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ゼロモード導波路で検
出することができる。例えば、米国特許第７，４０５，２８１号および米国公開番号第２
００８／０１０８０８２号（これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる）に記
載されているように、蛍光ヌクレオチド類似体および操作されたポリメラーゼを使用する
。照明は、蛍光標識ヌクレオチドの取り込みが低バックグラウンドで観察できるように、
表面につながれたポリメラーゼの周りのゼプトリットルスケールの体積に制限することが
できる（Ｌｅｖｅｎｅ， Ｍ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． ”Ｚｅｒｏ－ｍｏｄｅ ｗａｖｅ
ｇｕｉｄｅｓ ｆｏｒ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｔ ｈ
ｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９， ６８２－６８
６ （２００３）； Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ， Ｐ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． ”Ｐａｒａｌ
ｌｅｌ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌ
ｅｓ ｉｎ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ．” Ｏｐｔ． Ｌｅｔｔ． ３３， １０２６－１０
２８ （２００８）； Ｋｏｒｌａｃｈ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． ”Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ
ａｌｕｍｉｎｕｍ ｐａｓｓｉｖａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｍｍｏｂ
ｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｏｌｅｃ
ｕｌｅｓ ｉｎ ｚｅｒｏ－ｍｏｄｅ ｗａｖｅｇｕｉｄｅ ｎａｎｏ ｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅｓ．” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０５， １１
７６－１１８１ （２００８）、その開示は、参照により全体が本明細書に組み込まれる
。）。そのような方法から得られた画像は、本明細書に記載されるように保存、処理、お
よび分析することができる。
いくつかのＳＢＳの実施形態は、ヌクレオチドが伸長産物に組み込まれると放出される
プロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づくシーケンシングは、
Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓの子会社）から市販されている電気検出器および関連技術、または米国公開番号第２０
０９／００２６０８２；２００９／０１２７５８９；２０１０／０１３７１４３；および
２０１０／０２８２６１７号（これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる）に
記載されているシーケンシング方法およびシステムを使用することができる。速度論的排
除を使用して標的核酸を増幅するための本明細書に記載の方法は、プロトンを検出するた
めに使用される基質に容易に適用することができる。より具体的には、本明細書に記載の
方法を使用して、プロトンを検出するために使用されるアンプリコンのクローン集団を生
成することができる。
上記のＳＢＳ方法は、複数の異なる標的核酸が同時に操作されるように、多重フォーマ
ットで有利に実行することができる。特定の実施形態では、異なる標的核酸は、共通の反
応容器内または特定の基質の表面上で処理することができる。これにより、シーケンス試
薬の便利なデリバリー、未反応試薬の除去、および取り込みイベントの検出が多重に可能
になる。表面結合標的核酸を使用する実施形態において、標的核酸は、アレイフォーマッ
トであり得る。アレイフォーマットでは、標的核酸は通常、空間的に区別可能な方法で表
面に結合することができる。標的核酸は、直接共有結合、ビーズまたは他の粒子への付着
、または表面に付着しているポリメラーゼまたは他の分子への結合によって結合すること
ができる。アレイは、各部位に標的核酸の単一のコピー（特徴とも呼ばれる）を含むこと
ができ、または同じ配列を有する複数のコピーが各部位または特徴に存在することができ
る。複数のコピーは、以下でさらに詳細に説明するように、ブリッジ増幅またはエマルジ
ョンＰＣＲ等の増幅方法によって生成することができる。
本明細書に記載の方法は、例えば、少なくとも約１０個の特徴／ｃｍ２、１００個の特
徴／ｃｍ２、５００個の特徴／ｃｍ２、１０００個の特徴／ｃｍ２、５０００個の特徴／
ｃｍ２、１０，０００機能／ｃｍ２、５０，０００機能／ｃｍ２、１００，０００機能／
ｃｍ２、１，０００，０００機能／ｃｍ２、５，０００，０００機能／ｃｍ２以上を含む
、様々な密度のいずれかの特徴を有するアレイを使用することができる。
本明細書に記載の方法の利点は、それらが複数の標的核酸の迅速かつ効率的な検出を並
行して提供することである。したがって、本開示は、上に例示されたもの等の当技術分野
で知られている技術を使用して核酸を調製および検出することができる統合システムを提
供する。したがって、本開示の統合システムは、増幅試薬および／またはシーケンシング
試薬を１つまたは複数の固定化ＤＮＡフラグメントに送達することができる流体構成要素
を含むことができ、システムは、ポンプ、バルブ、リザーバー、流体ライン等の構成要素
を含む。フローセルは、標的核酸を検出するための統合システムで構成および／または使
用することができる。例示的なフローセルは、例えば、米国公開番号第２０１０／０１１
１７６８号及び米国シリアル番号第１３／２７３，６６６号に記載されている。これらの
それぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。フローセルについて例示されるように
、統合システムの１つまたは複数の流体構成要素は、増幅方法および検出方法に使用する
ことができる。核酸シーケンシングの実施形態を例として取り上げると、統合システムの
流体構成要素の１つまたは複数を、本明細書に記載の増幅方法、および上記に例示したよ
うなシーケンシング方法におけるシーケンシング試薬の送達に使用することができる。あ
るいは、統合システムは、増幅方法を実行し、検出方法を実行するための別個の流体シス
テムを含むことができる。増幅された核酸を作成し、また核酸の配列を決定することがで
きる統合シーケンシングシステムの例には、ＭｉＳｅｑ（商標）プラットフォーム（Ｉｌ
ｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）および米国シリアル番号第１
３／２７３，６６６号に記載のデバイスが挙げられ、参照により本明細書に組み込まれる
。
ポリヌクレオチドがシリカベースの支持体に直接付着したアレイは、例えば、ＷＯ００
／０６７７０（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているものであり、ポリ
ヌクレオチドは、ガラス上のペンダントエポキシド基とポリヌクレオチド上の内部アミノ
基。さらに、ポリヌクレオチドは、例えば、ＷＯ２００５／０４７３０１（参照により本
明細書に組み込まれる）に記載されているように、硫黄ベースの求核剤と固体支持体との
反応によって、固体支持体に結合させることができる。固体に支持されたテンプレートポ
リヌクレオチドのさらに別の例は、テンプレートポリヌクレオチドが、例えば、ＷＯ００
／３１１４８、ＷＯ０１／０１１４３、ＷＯ０２／１２５６６、ＷＯ０３／０１４３９２
、米国特許米国特許第６，４６５，１７８号およびＷＯ００／５３８１２を参照されたい
。これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
テンプレートポリヌクレオチドが固定化され得る特定の表面は、ポリアクリルアミドヒ
ドロゲルである。ポリアクリルアミドヒドロゲルは、上で引用した参考文献およびＷＯ２
００５／０６５８１４に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。使用でき
る特定のヒドロゲルには、ＷＯ２００５／０６５８１４およびＵ．Ｓ．Ｐｕｂ．番号２０
１４／００７９９２３。一実施形態では、ヒドロゲルはＰＡＺＡＭ（ポリ（Ｎ－（５－ア
ジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－コ－アクリルアミド））である。
ＤＮＡテンプレート分子は、例えば、米国特許第５，２５３，００３号に記載されてい
るように、ビーズまたは微粒子に付着することができる。米国特許第６，１７２，２１８
号（参照により本明細書に組み込まれる）。ビーズまたは微粒子への付着は、シーケンシ
ングアプリケーションに役立ちます。ビーズライブラリは、各ビーズが異なるＤＮＡ配列
を含むように準備することができる。ライブラリの例とその作成方法は、Ｎａｔｕｒｅ、
４３７、３７６－３８０ （２００５） に記載される。 Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３０９，
５７４１， １７２８－１７３２ （２００５）、これらはそれぞれ参照により本明細
書に組み込まれる。本明細書に記載のヌクレオチドを使用するそのようなビーズのアレイ
のシーケンシングは、本開示の範囲内である。
シーケンシングされるテンプレートは、固体支持体上の「アレイ」の一部を形成するこ
とができ、その場合、アレイは任意の便利な形をとることができる。したがって、本開示
の方法は、単一分子アレイ、クラスター化アレイ、およびビーズアレイを含む、あらゆる
タイプの高密度アレイに適用可能である。本開示の標識ヌクレオチドは、固体支持体上へ
の核酸分子の固定化によって形成されるものを含むがこれらに限定されない、本質的に任
意のタイプのアレイ上でテンプレートをシーケンシングするために使用され得る。
しかし、本開示の標識ヌクレオチドは、クラスター化アレイのシーケンシングの文脈に
おいて特に有利である。クラスター化されたアレイでは、アレイ上の異なる領域（サイト
またはフィーチャと呼ばれることが多い）が、複数のポリヌクレオチドテンプレート分子
を構成する。一般に、複数のポリヌクレオチド分子は光学的手段によって個別に分解する
ことはできず、代わりに集団として検出される。アレイの形成方法に応じて、アレイ上の
各部位は、１つの個別のポリヌクレオチド分子の複数のコピー（例えば、その部位は特定
の一本鎖または二本鎖の核酸種に対して均質である）または少数の複数のコピーを含む場
合がある。異なるポリヌクレオチド分子の（例えば、２つの異なる核酸種の複数のコピー
）。核酸分子のクラスター化されたアレイは、当技術分野で一般的に知られている技術を
使用して生成され得る。例として、ＷＯ９８／４４１５１およびＷＯ００／１８９５７（
それぞれが本明細書に組み込まれている）は、クラスターからなるアレイを形成するため
に、テンプレートと増幅産物の両方が固体支持体に固定されたままである核酸の増幅方法
を記載している。または固定化された核酸分子の「コロニー」。これらの方法に従って調
製されたクラスター化アレイ上に存在する核酸分子は、本開示の色素化合物で標識された
ヌクレオチドを使用してシーケンシングするための適切なテンプレートである。
本開示の標識ヌクレオチドは、単一分子アレイ上のテンプレートのシーケンシングにも
有用である。本明細書で使用される「単一分子アレイ」または「ＳＭＡ」という用語は、
固体支持体上に分散（または配列）したポリヌクレオチド分子の集団を指し、個々のポリ
ヌクレオチドと他のすべての集団との間隔は、個々のポリヌクレオチド分子を個別に分離
することが可能である。したがって、固体支持体の表面に固定化された標的核酸分子は、
いくつかの実施形態において、光学的手段によって分解することができる。これは、それ
ぞれが１つのポリヌクレオチドを表す１つまたは複数の異なる信号が、使用される特定の
イメージングデバイスの分解可能な領域内で発生することを意味する。
アレイ上の隣接するポリヌクレオチド分子間の間隔が少なくとも１００ｎｍ、より詳細
には少なくとも２５０ｎｍ、さらにより詳細には少なくとも３００ｎｍ、さらにより詳細
には少なくとも３５０ｎｍである単一分子検出を達成することができる。このように、各
分子は単一分子の蛍光点として個別に分解および検出可能であり、前記単一分子の蛍光点
からの蛍光も単一段階の光退色を示す。
本明細書では、「個別に分解」および「個別の分解」という用語を使用して、視覚化す
ると、アレイ上の１つの分子をその隣接する分子から区別できることを指定する。アレイ
上の個々の分子間の分離は、部分的に、個々の分子を分解するために使用される特定の技
術によって決定される。単一分子アレイの一般的な特徴は、公開された出願ＷＯ００／０
６７７０およびＷＯ０１／５７２４８を参照することによって理解されるであろう。これ
らはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。本開示のヌクレオチドの一用途は、
合成反応によるシーケンシングであるが、ヌクレオチドの有用性はそのような方法に限定
されない。実際、ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに組み込まれたヌクレオチドに付着
した蛍光標識の検出を必要とする任意のシーケンシング方法で有利に使用することができ
る。
特に、本開示の標識ヌクレオチドは、自動蛍光シーケンシングプロトコル、特にサンガ
ーおよび共同研究者の連鎖停止シーケンシング法に基づく蛍光色素ターミネーターサイク
ルシーケンシングにおいて使用され得る。このような方法は、通常、酵素とサイクルシー
ケンシングを使用して、蛍光標識されたジデオキシヌクレオチドをプライマー伸長シーケ
ンシング反応に組み込む。いわゆるサンガーシーケンシング法、および関連プロトコル（
サンガータイプ）は、標識されたジデオキシヌクレオチドによるランダム化された連鎖停
止を利用する。
したがって、本開示は、３’および２’位の両方にヒドロキシル基を欠くジデオキシヌ
クレオチドである標識ヌクレオチドも包含し、そのようなジデオキシヌクレオチドは、サ
ンガー型シーケンシング法等での使用に適している。
３’－ブロッキング基を組み込んだ本開示の標識ヌクレオチドは、サンガー法および関
連プロトコルにおいても有用であり得る。なぜなら、ジデオキシヌクレオチドを使用する
ことによって達成されるのと同じ効果が、３’－ＯＨブロッキング基を有するヌクレオチ
ドを使用することによって達成され得るからである。：両方が後続のヌクレオチドの取り
込みを防ぐ。本開示によるヌクレオチドがサンガー型シーケンシング法で使用される場合
、ヌクレオチドに結合した色素化合物または検出可能な標識は、切断可能なリンカーを介
して結合する必要がないことが理解されるであろう。本開示の標識ヌクレオチドが組み込
まれる各例。ヌクレオチドを後で組み込む必要がないため、ヌクレオチドからラベルを除
去する必要はない。
本明細書に記載の方法の任意の実施形態において、シーケンシングアプリケーションで
使用されるヌクレオチドは、本明細書に記載の３’ブロックヌクレオチド、例えば、式（
Ｉ）、（Ｉａ）、または（ＩＩ）のヌクレオチドである。任意の実施形態において、３’
ブロックヌクレオチドは、ヌクレオチド三リン酸である。
追加の実施形態は、特許請求の範囲を限定することを決して意図しない以下の実施例に
おいてさらに詳細に開示される。
（例１．３’－アセタールブロックヌクレオシドの調製）
この例では、スキーム２に従って種々の３’－アセタール保護Ｔヌクレオシドを調製し
た。
Ｔ１の調製：オーブンで乾燥させた窒素パージした１００ｍＬフラスコに、５－ヨード
－２’－デオキシウリジン（５．０ｇ、１４．１２ｍｍｏｌ）を加えた。これを３０ｍＬ
のピリジンと３回共蒸発させた後、窒素下に置いた。無水ピリジン（２５ｍＬ）を加え、
均一な溶液が得られるまで（約１５分）、反応物を室温で撹拌した。混合物を氷水浴中で
０℃に冷却し、塩化ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル（４．０４ｍＬ、１５．５ｍｍｏ
ｌ）を激しく攪拌しながら（約１時間）ゆっくりと滴下して加えた。すべてのＳＭがＴＬ
Ｃによって消費されるまで、反応を０℃で８時間維持した。飽和塩化アンモニウム水溶液
（約１５ｍＬ）を加え、反応物を室温まで温めた。混合物を酢酸エチル（１００ｍＬ）で
希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液（２００ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、水層
を酢酸エチル（４ｘ５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、
真空で濃縮して、高真空下で残留溶媒を除去した後、約８ｇの透明な黄色の油を得た。粗
生成物Ｔ１を、シリカ上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、白色の結晶性
固体として精製した。収量は６．９４ｇ（８３％）である。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプ
レーネガティブ）５９１．０８［Ｍ－Ｈ］
Ｔ２の調製：オーブン乾燥した窒素パージした茶色の５００ｍＬ３つ口フラスコに、Ｔ
１（６．２３ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（２００ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ
）およびビス（トリフェニルホスフィン）を加えた。窒素下の二塩化パラジウム（ＩＩ）
（３６９ｍｇ、０．５２６ミリモル）。フラスコを光から保護し、無水の脱気したＤＭＦ
（２００ｍＬ）を加えた。この溶液に、２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－プロプ－２－イ
ニル－アセトアミド（４．７４ｇ、３１．６ｍｍｏｌ）を加え、続いて脱気したトリエチ
ルアミン（２．９２ｍＬ、２１．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を窒素下、室温で６時間
撹拌し、ＴＬＣ分析によってそれ以上の出発物質が観察されなかった。揮発性物質を真空
（～１５分）で除去し、ＤＭＦを高真空（～１時間）下で除去して褐色の残留物にした。
これを酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解し、０．１ＭＥＤＴＡ水溶液（２ｘ２００ｍＬ）
で抽出した。水層を合わせ、さらに酢酸エチル（２００ｍＬ）で抽出した。有機相を合わ
せ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、揮発性物質を真空で除去し（～３０分）、さらに高真空下
で乾燥させ（～１時間）、約８ｇの粗褐色／黄色油を得た。混合物をシリカゲルのフラッ
シュカラムクロマトグラフィーによりオフホワイトの固体として精製した。収量：６．０
ｇ（８５％）。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）６１４．１９［Ｍ－Ｈ］。
Ｔ３の調製：窒素下で開始ヌクレオシドＴ２（２．０ｇ、３．２５ｍｍｏｌ）を含むオ
ーブン乾燥窒素パージ１００ｍＬフラスコに、無水ＤＭＳＯ（６．９ｍｌ、９７．５ｍｍ
ｏｌ）を室温で一度に加え、均一な溶液になるまで撹拌した。形成された。酢酸（１１．
１ｍＬ、１９５ｍｍｏｌ）、続いて無水酢酸（１５．１ｍＬ、１６２．０９ｍｍｏｌ）の
両方を滴下した（それぞれ約５分）。混合物を５０℃に温め、ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／石油
エーテル３：２）によって出発ヌクレオシドが完全に消費されるまで（約５時間）撹拌し
た。次に、反応物を半分の体積に濃縮し、氷浴で約０．５℃に冷却した。冷（～０．５℃
）ＮａＨＣＯ３（ａｑ、ｓａｔ。）（４５ｍＬ）をゆっくりと加え、さらに攪拌して、発
泡が観察されなくなるまで（～１５分）、後処理を開始した。溶液を室温まで温め、次に
水をＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）に抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、
濾過し、揮発性物質を減圧下、さらに高真空で蒸発させた。粗生成物Ｔ３を、オフホワイ
トの固体としてシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収量：１
．７９ｇ（８２％）。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）６７４．２０［Ｍ－
Ｈ］－。
Ｔ４の調製：Ｎ２下の無水ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）中の出発ヌクレオシドＴ３（１．
７９ｇ、２．６４９ｍｍｏｌ）の溶液に、シクロヘキセン（１．３４ｍＬ、１３．２ｍｍ
ｏｌ）を加えた。混合物を氷浴で０℃に冷却し、蒸留塩化スルフリル（３２２μＬ、３．
９７ミリモル）をＮ２下でゆっくりと滴下（約２０分）し、その温度で２０分間撹拌した
後、ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ：石油エーテル）＝３：２ｖ／ｖ）は、開始ヌクレオシドが完全
に消費されたことを示している。次に、スキーム３に示すように、新たに蒸留した対応す
る不飽和アルコール（５当量）を直接滴下して塩化物中間体をクエンチした。得られた溶
液を室温で２時間撹拌し、続いて減圧下で揮発性物質を蒸発させた。油性残留物をＥｔＯ
Ａｃ：ブライン（３：２）（１２５ｍＬ）に分配した。有機層を分離し、水性物をさらに
ＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）に抽出した。合わせた有機抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾
過し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。油性残留物をＥｔＯＡｃ：ブライン（３：２）
（１２５ｍＬ）に分配した。有機層を分離し、水性物をさらにＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ
）に抽出した。合わせた有機抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、揮発性物質を減圧下
で蒸発させた。粗生成物Ｔ４をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製
して、最終生成物を黄色の油として得た。収量：ＡＯＭで１．２０ｇ（６９％）。ＰｒＯ
Ｍの場合は１．２９ｇ（７１％）。ＤＰｒＯＭの場合は１．３４ｇ（７１％）。
３’－ＡＯＭ：黄色のオイル。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）［Ｍ－Ｈ
］６８４．２４。
３’－ＰｒＯＭ：黄色のオイル。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）［Ｍ－
Ｈ］６８２．２２。
３’－ＤＰｒＯＭ：黄色のオイル。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）［Ｍ
－Ｈ］７１０．２５。
スキーム３．
Ｔ５の調製：窒素下の５０ｍＬ丸底フラスコ中の出発物質Ｔ４（１．０４ｇ、１．５１
６ｍｍｏｌ）に、室温で無水ＴＨＦ（９ｍＬ）を加えた。次に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１．
０Ｍ、１．７ｍＬ、１．７０ｍｍｏｌ）を滴下し、すべてのＳＭがＴＬＣによって消費さ
れるまで溶液を撹拌した（約２時間）。反応の過程で溶液はオレンジ色に変わった。揮発
性物質を真空で除去してオレンジ色の残留物を得、これをＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶
解し、ＮａＨＣＯ３（飽和水溶液）（６０ｍＬ）で分離した。２つの層を分離し、水層を
ＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、
蒸発させて、粗生成物を黄色の油として得た。粗生成物をシリカゲルのフラッシュクロマ
トグラフィーにより精製して、透明な黄色の油を得た。収量：ＡＯＭで６３７ｍｇ（９４
％）。ＰｒＯＭの場合は５２６ｍｇ（７８％）。ＤＰｒＯＭの場合は６１７ｍｇ（８６％
）。
３’－ＡＯＭ：透明な黄色のオイル。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）［
Ｍ－Ｈ］４４６．１２。
３’－ＰｒＯＭ：透明な黄色の油（５２６ｍｇ７８％）。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプ
レーネガティブ）：［Ｍ－Ｈ］４４４．１０。
３’－ＤＰｒＯＭ：透明な黄色の油（６１７ｍｇ８６％）。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロス
プレーネガティブ）：［Ｍ－Ｈ］４７２．１３。
さらに、２つの追加の３’ブロックＴヌクレオシド（３’－ｅＡＯＭＴおよび３’－ｉ
ＡＯＭＴ）を、上記と同様の方法で調製した。３’－ｉＡＯＭＴ：ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ）：
（負イオン）ｍ／ｚ３２５．５（Ｍ－Ｈ＋）、（正イオン）３２７．３（Ｍ＋Ｈ＋）。３
’－ｅＡＯＭＴ：ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ）：（陽イオン）ｍ／ｚ３４１．３（Ｍ＋１Ｈ＋）。
（例２．３’－ＯＨブロッキング基の安定性テスト）
この例では、５’－ｍＰ ３’－ＡＯＭ Ｔヌクレオチドの安定性テストを、標準の５
’－ｍＰ３’－Ｏ－アジドメチルＴヌクレオチドを含む取り込み緩衝液中で並べて実行し
た。
（緩衝液の製剤化）
１００ｍＭエタノールアミンバッファー（ｐＨ９．８）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、およ
び２．５ｍＭ ＥＤＴＡの溶液中の０．１ｍＭの各５’－一リン酸３’保護Ｔヌクレオチ
ド１ｍＬを、加熱ブロック内で６５℃で２週間インキュベートした。設定した時点で、４
０μＬのアリコートを採取し、ＨＰＬＣで分析して、ブロックされたヌクレオチドの残り
の割合と、ブロックされていないヌクレオチドの最終的な形成を決定した。
ＡＯＭ、ＰｒＯＭ、ＤＰｒＯＭアセタール保護基および標準アジドメチルブロッキング
基を有する５’－一リン酸３’保護ヌクレオチドに関する安定性試験の結果を図１に示す
。ＡＯＭ、ＰｒＯＭおよびＤＰｒＯＭを含む３’ブロックヌクレオチド一リン酸が観察さ
れた。ブロッキング基は、溶液中の脱ブロッキング率の低下を３０～５０倍以上改善した
。この実験は、対応する完全に機能化されたヌクレオチド（ｆｆＮ）が、シーケンスデバ
イスのカートリッジ上の組み込みミックスに保存されたときにどのように動作するかを模
倣する。これらのアセタール保護基によって提供される安定性の改善はまた、シーケンシ
ング実行におけるより低いプレフェージング速度につながるであろう。最後に、それは取
り込み混合試薬の貯蔵寿命を改善する。
（例３．３’－ＡＯＭ脱ブロック化テスト）
この例では、５’－ｍＰ ３’－ＡＯＭ Ｔおよび標準の５’－ｍＰ３’－Ｏ－アジド
メチルＴヌクレオチドの脱ブロック化テストが、各ブロックグループに固有のソリューシ
ョンで個別に実行された。条件は、イルミナの標準的なブロック解除試薬を可能な限り模
倣し、同じ方法論に従うように策定された。活性脱ブロック試薬、バッファー、ヌクレオ
シドの濃度はすべてのテストで同じに保たれているが、各成分の同一性は独特であった。
このように、個々の脱ブロック化化学物質間で観察された速度の違いは、製剤の濃度の違
いによるものではない。
（標準のアジドメチル脱ブロック条件）
ヌクレオチド：５’－一リン酸３’－Ｏ－アジドメチルＴ．アクティブ脱ブロック試薬
：トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）（１８ｍΩ水中で１Ｍ）。（オプ
ション）添加剤：アスコルビン酸ナトリウム（１８ｍΩ水中０．１ｍＭ）最終濃度＝１ｍ
Ｍ。緩衝液：エタノールアミンｐＨ９．８（１８ｍΩ水中で２Ｍ）。クエンチング試薬：
Ｈ２Ｏ２。
（ＡＯＭ脱ブロック条件）
ヌクレオチド：５’－一リン酸３’－Ｏ－アジドメチルＴ。３’－ＡＯＭＴのストック
溶液を、窒素下のガラスバイアル内で、１００ｍＭエタノールアミンバッファー（ｐＨ９
．８）で０．１ｍＭに希釈した。アスコルビン酸ナトリウム添加剤のストック溶液を最終
濃度が０．１ｍＭになるように添加し、溶液を５分間撹拌した。アッセイを開始するため
に、脱ブロック試薬（Ｐｄ／ＴＨＰ＝１／５；アスコルビン酸ナトリウム；エタノールア
ミン）を、室温で攪拌溶液に最終濃度１ｍＭＴＨＰで添加した。指定された時点で、４０
μＬのアリコートを採取し、ＥＤＴＡ／Ｈ２Ｏ２（０．０２５：０．０７５Ｍ）の１：３
混合物６μＬでクエンチした。ＨＰＬＣ分析は、開始ヌクレオシドピーク、３’－ＯＨピ
ーク、およびＨＰＬＣクロマトグラムに表示されるその他のヌクレオチドピークの面積を
測定することによって実行された。他のヌクレオチドベースの副産物は観察されないであ
った。
比較結果を図２Ａに示す。ＡＯＭは、標準のアジドメチルブロッキング基と比較して、
溶液中の非ブロッキング率に関して１０倍の速度改善を提供することが観察された。この
実験は、対応するｆｆＮが脱ブロック化ステップ中のシーケンスでどのように動作するか
を模倣する目的を果たす。脱ブロッキング速度の大幅な改善により、特定のイルミナシー
ケンスプラットフォームで通常使用される１０～２０秒のインキュベーション時間の代わ
りに、フラッシュスルー脱ブロッキングステップが可能になる。結果として、脱ブロック
化率は、合成によるシーケンス（ＳＢＳ）サイクルタイムに大きな影響を及ぼす。
同様の実験条件を３’－ｅＡＯＭ Ｔおよび３’－ｉＡＯＭ Ｔの脱ブロック化アッセ
イに使用した。単一の変更として、脱ブロック化率の明確な違いを観察するために、Ｐｄ
触媒と基質の比率を５：１に減らした。３’－ＡＯＭ Ｔを参照として使用し、結果を図
２Ｂに示す。これらの結果は、ｅＡＯＭおよびｉＡＯＭの脱ブロック化速度が、この特定
の濃度のＰｄ触媒脱ブロック化試薬でＡＯＭよりも２～３倍遅いことを示している。ＡＯ
Ｍブロッキング基の置換バージョンと非置換バージョンの間の脱ブロック化率の差は、Ｐ
ｄ触媒と基質の比率が高いほど小さくなると予想できる。
（例４．シーケンシングのためのパラジウム開裂混合物の最適化）
実施例２に記載の脱ブロック化反応で使用されるＰｄ／ＴＨＰ触媒は、非常に空気に敏
感である。空気にさらされると、それは実質的な活動の喪失を示した。この例では、酸化
ストレスアッセイを開発して、パラジウム開裂混合物の種々の配合物の空気感受性を評価
した。
０．５ｍＬのＰｄクリーブミックスを５ｍＬのガラスバイアルに分注し、室温で３時間
大気に開放したままにした。酸化された切断混合物の残留活性は、以下のように３’－Ａ
ＯＭ Ｔの切断を測定することによって評価された。３’－ＡＯＭ Ｔのストック溶液を
、１００ｍＭ切断混合バッファーで０．１ｍＭに希釈した。アスコルビン酸ナトリウムの
ストック溶液を最終濃度が１ｍＭになるように添加し、続いて酸化開裂混合物を添加して
最終１／２０希釈した。１時間後、４０μＬの溶液を１０μＬのＥＤＴＡ／Ｈ２Ｏ２（０
．２５：０．２５Ｍ）の１：１混合液で直ちにクエンチし、ＨＰＬＣで分析した。この実
験では、次のような種々のバッファー試薬をスクリーニングした。第一級アミン（エタノ
ールアミン、トリス、グリシン等）。第三級アミン（２－ジメチルアミノメタノール（（
ＤＭＥＡ）、２－ジエチルアミノメタノール（ＤＥＥＡ）、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テトラ
メチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）またはＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テトラエチルエチレ
ンジアミン（ＴＥＥＤＡ）等）；および種々の無機塩（ホウ酸塩、炭酸塩、リン酸塩等）
。無機緩衝剤試薬（ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等）が最高の
空気安定性を提供し、パラジウム錯体が高い％活性を保持したことが観察された。さらに
、第三級アミンは、第一級アミンと比較して、Ｐｄ開裂混合物の安定性も大幅に改善した
。
これらの発見に基づいて、２つのパラジウム開裂混合物を調製した。最初の例では、２
５０ｍＭホウ酸緩衝液のストック溶液を使用する。（ｐＨ９．６、２０ｍＬ）を水（１４
ｍＬ）で希釈した後、ＴＨＰ（１００ｍＭＴｒｉｓ中１Ｍ、ｐＨ９、５ｍＬ、５．０ｍｍ
ｏｌ）および塩化アリルパラジウム（ＩＩ）ダイマー（１８３ｍｇ、０．５ミリモル）。
混合物を室温で数分間激しく撹拌した後、１Ｍアスコルビン酸ナトリウム水溶液を添加し
た。（０．５ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）、５ＭＮａＣｌ ａｑ．（１０ｍＬ）および１０％
ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０（０．５ｍＬ）。２番目の例では、２Ｍ ＤＥＥＡバッファー水溶
液のストック溶液。（ｐＨ９．６、０．６ｍＬ）を水（７．６ｍＬ）で希釈した後、ＴＨ
Ｐ（１００ｍＭＴｒｉｓ中１Ｍ、ｐＨ９、１．２ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）および固体塩化
アリルパラジウム（ＩＩ）ダイマー（ＩＩ）のストック溶液を添加した。４３．９ｍｇ、
０．１２ミリモル）。混合物を室温で数分間激しく撹拌した後、１Ｍアスコルビン酸ナト
リウム水溶液を添加した。（０．１２ｍＬ、０．１２ｍｍｏｌ）、５ＭＮａＣｌ ａｑ．
（２．４ｍＬ）および１０％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０（０．１２ｍＬ）。
（実施例５．完全に機能化されたヌクレオチドの調製およびシーケンシング用途への使用
）
この例では、３’－ＡＯＭブロッキング基を持つ種々の完全に機能化されたヌクレオチ
ド（ｆｆＮ）の調製について詳しく説明する。これらのｆｆＮは、イルミナＭｉｎｉＳｅ
ｑ（登録商標）プラットフォームでの合成アプリケーションによるシーケンスにも使用さ
れた。
スキーム４．３’－ＡＯＭ－ｆｆＣ－ＬＮ３－ＳＯ７１８１の合成
中間体ＡＯＭ Ｃ２の合成：ヌクレオシドＣ１（０．５ｇ、０．６４ｍｍｏｌ）をＮ２
下の無水ＤＣＭ（１２ｍＬ）に溶解し、混合物を０℃に冷却した。シクロヘキセン（０．
３２ｍＬ、３．２１ｍｍｏｌ）を加え、続いてＳＯ２Ｃｌ２（ＤＣＭ中１．０Ｍ、１．２
７ｍＬ、１．２７ｍｍｏｌ）を滴下した。反応物をロータリーエバポレーターに素早く移
して減圧下ですべての揮発性物質を除去する前に、追加のシクロヘキセン（０．３２ｍＬ
、３．２１ミリモル）を加えた。固体残留物をさらに高真空下で１０分間乾燥させた後、
Ｎ２下で無水ＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解した。混合物を０℃に冷却し、氷冷アリルアルコー
ル（５ｍＬ）を滴下した。反応物を０℃で２時間撹拌した後、ｓａｔを添加してクエンチ
した。ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）およびＤＣＭ（３０ｍＬ）。２つの相を分離し、
水層をＥｔＯＡｃ（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥し、
濾過し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、ＥｔＯＡｃ／石油エーテルを使
用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、ＡＯＭ Ｃ２を
白色固体として得た（２６４ｍｇ、５２％収率）。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガ
ティブ）：［Ｍ－Ｈ］７８７、［Ｍ＋Ｃｌ］８２３。
中間体ＡＯＭ Ｃ３の合成：ＡＯＭ Ｃ２（２４６ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）をＮ２下
で無水ＴＨＦ（９．５ｍＬ）に溶解し、混合物を０℃に冷却した。酢酸（０．０５４ｍＬ
、０．９４ｍｍｏｌ）を加え、続いてＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１．０Ｍ、５ｗｔ。％水、０．
９９ｍＬ、０．９４ｍｍｏｌ）を滴下した。反応物を０℃で５時間撹拌した後、ＥｔＯＡ
ｃ（２０ｍＬ）で希釈し、次に０．０５Ｍ ＨＣｌ水溶液に注いだ。（２０ｍＬ）。２つ
の層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×２０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ＭｇＳ
Ｏ４で乾燥し、濾過し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、ＤＣＭ／ＥｔＯ
Ａｃを使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、ＡＯＭ
Ｃ３を黄色がかった固体として得た（１１４ｍｇ、６６％収率）。ＬＣ－ＭＳ（エレク
トロスプレーネガティブ）：［Ｍ－Ｈ］５４９、［Ｍ＋Ｈ２Ｏ－Ｈ］５６７、［Ｍ＋Ｃｌ
］５８５、（エレクトロスプレーポジティブ）：［Ｍ＋Ｈ］５５１、［Ｍ＋Ｈ２Ｏ＋Ｈ］
５６９。
中間体ＡＯＭＣ４の合成：ＡＯＭ Ｃ３（０．１１４ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）、新たに
活性化した４Åモレキュラーシーブ、プロトンスポンジ（０．０６６ｇ、０．３１ｍｍｏ
ｌ）、マグネチックスターラーをＮ２の下に置き、無水リン酸トリメチル（１．０ｍＬ）
を加えた。反応物を－１０℃に冷却し、新たに蒸留したＰＯＣｌ３（２３μＬ、０．２５
ｍｍｏｌ）を滴下した。反応物を－１０℃で１時間撹拌した。ビス－トリ－ｎ－ブチルア
ンモニウム塩としてのピロリン酸の溶液（ＤＭＦ中０．５Ｍ、１．７ｍＬ、０．８５ミリ
モル）および無水トリ－ｎ－ブチルアミン（０．４１ｍＬ、１．７４ミリモル）を予混合
し、氷冷活性化物に加えた。一部のヌクレオシド溶液。混合物を室温で５分間激しく撹拌
した。反応混合物を、２Ｍ ＴＥＡＢ水溶液の激しく攪拌された溶液を含む別のフラスコ
に注いだ。（～１０ｍＬ）。反応フラスコを少量のＨ２Ｏですすぎ、洗浄液を２Ｍ ＴＥ
ＡＢ溶液に加えた。次に、合わせた混合物を室温で４時間撹拌し、その後、溶媒を減圧下
で蒸発させた。残留物をＮＨ３水溶液に溶解した。（３５％、約１０ｍＬ）、室温で一晩
撹拌した。反応物を真空下で濃縮し、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘでのフラッシュクロマ
トグラフィーにより精製した。生成物を分取ＨＰＬＣによりさらに精製して、純粋なＡＯ
Ｍ Ｃ４（６２μｍｏｌ、３０％収率、ＵＶ－Ｖｉｓ分光法により測定、λｍａｘ＝２９
４ｎｍ、ε＝８６００Ｍ－１ ｃｍ－１）を得た。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガ
ティブ）：［Ｍ－Ｈ］５８９。
３’－ＡＯＭ－ｆｆＣ－ＬＮ３－ＳＯ７１８１の合成：ＬＮ３－ＳＯ７１８１（０．０
２０５ｍｍｏｌ）をＮ２下の無水ＤＭＡ（４ｍＬ）に溶解した。Ｎ、Ｎ－ジイソプロピル
エチルアミン（２８．６μＬ、０．１６４ｍｍｏｌ）を加え、続いてＴＳＴＵ（ＤＭＡ中
０．１Ｍ、２３４μＬ、０．０２３４ｍｍｏｌ）を加えた。反応物をＮ２下、室温で１時
間撹拌した。その間に、ＡＯＭ Ｃ４の水溶液（０．０１０１ミリモル）を減圧下で蒸発
乾固させ、０．１Ｍ ＴＥＡＢ水溶液に再懸濁した。（４００μＬ）そしてＬＮ３－ＳＯ
７１８１溶液に加えられる。反応物を室温で１７．５時間撹拌し、次に０．１Ｍ ＴＥＡ
Ｂ水溶液でクエンチした。（４ｍＬ）。粗生成物を、ＤＥＡＥ－セファデックスでのフラ
ッシュクロマトグラフィーによって精製した。生成物を分取ＨＰＬＣによりさらに精製し
て、純粋な３’－ＡＯＭ－ｆｆＣ－ＬＮ３－ＳＯ７１８１（６．８１モル、６７％収率、
ＵＶ－Ｖｉｓ分光法により決定、λｍａｘ＝６４４ｎｍ、ε＝２００００００Ｍ－１ ｃ
ｍ－１）。を得た。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレーネガティブ）：［Ｍ－Ｈ］１５６１
、［Ｍ－２Ｈ］７８１、［Ｍ－３Ｈ］５２０。
スキーム５．３’－ＡＯＭ－ｆｆＡの合成
中間体ＡＯＭ Ａ２の合成：ヌクレオシドＡ１（７１６ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）をＮ
２雰囲気下で１０ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解し、シクロヘキセン（４８１μＬ、４
．７５ｍｍｏｌ）を加え、溶液を約－１５℃に冷却した。塩化スルフリル（蒸留、９２μ
Ｌ、１．１４ｍｍｏｌ）を滴下し、反応物を２０分間撹拌した。すべての出発物質が消費
された後、シクロヘキセンの余分な部分（４８１μＬ、４．７５ｍｍｏｌ）を加え、反応
物を減圧下で蒸発乾固させた。残留物を窒素で素早くパージし、次にアリルアルコール（
５ｍＬ、約１００ミリモル）を０℃で撹拌しながら加えた。反応物を０℃で１時間撹拌し
、次に５０ｍＬのＮａＨＣＯ３飽和水溶液でクエンチした。混合物を２×１００ｍＬの酢
酸エチルで抽出した。プールした有機相を１００ｍＬの水および１００ｍＬのブラインで
洗浄し、次にＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発乾固させた。残留物を、石油エーテル
／ＥｔＯＡｃを使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した
。６０％の収率（４３５ｍｇ、０．５７ミリモル）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣＩ）：（
陽イオン）ｍ／ｚ７６３（Ｍ＋Ｈ＋）；（陰イオン）ｍ／ｚ７６１（Ｍ－Ｈ＋）。
中間体ＡＯＭ Ａ３の合成：ヌクレオシドＡＯＭ Ａ２（４７６ｍｇ、０．６２ｍｍｏ
ｌ）をＮ２雰囲気下で乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解し、次にＴＨＦ（７５０μＬ、０．７
５ｍｍｏｌ）中の１．０Ｍ ＴＢＡＦの溶液を加えた。溶液を室温で１．５時間撹拌した
。溶液を５０ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈し、次に１００ｍＬのＮａＨ２ＰＯ４ ｓａｔで洗
浄した。（ｐＨ＝３）、１００ｍＬのブラインを使用。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾
過し、蒸発乾固させた。残留物を、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨを使用するシリカゲルでのフラ
ッシュクロマトグラフィーによって精製した。９０％の収率（２９２ｍｇ、０．５５ミリ
モル）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣＩ）：（陽イオン）ｍ／ｚ５２５（Ｍ＋Ｈ＋）；（陰
イオン）ｍ／ｚ５２３（Ｍ－Ｈ＋）。
中間体ＡＯＭ Ａ４の合成：ヌクレオシドＡＯＭ Ａ３（２８５ｍｇ、０．５４４ｍｍ
ｏｌ）を、減圧下、Ｐ２Ｏ５上で１８時間乾燥させた。無水リン酸トリエチル（２ｍＬ）
といくつかの新たに活性化された４Åモレキュラーシーブを窒素下でそれに加え、次に反
応フラスコを氷浴中で０℃に冷却した。新たに蒸留したＰＯＣｌ３（６１μＬ、０．６５
ｍｍｏｌ）を滴下し、続いてＰｒｏｔｏｎＳｐｏｎｇｅ（登録商標）（１７５ｍｇ、０．
８１６ｍｍｏｌ）を加えた。添加後、反応物をさらに０℃で１５分間撹拌した。次に、無
水ＤＭＦ中のビス－トリ－ｎ－ブチルアンモニウム塩（５．４ｍＬ、２．７２ｍｍｏｌ）
としてのピロリン酸の０．５Ｍ溶液を素早く加え、続いてすぐにトリ－ｎ－ブチルアミン
（５４０μＬ、２．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を氷水浴中にさらに１０分間保持し、
次にそれを１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＢ、２０ｍＬ）に注ぐこと
によってクエンチし、室温で４時間撹拌した。すべての溶媒を減圧下で蒸発させた。上記
の残留物にアンモニアの３５％水溶液（２０ｍＬ）を加え、混合物を室温で少なくとも５
時間撹拌した。次に、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、最初に、ＤＥＡＥ－セフ
ァデックスＡ２５（１００ｇ）でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。カ
ラムは、水性重炭酸トリエチルアンモニウムの勾配で溶出された。三リン酸を含む画分を
プールし、溶媒を減圧下で蒸発乾固させた。粗物質を、ＹＭＣ－Ｐａｃｋ－Ｐｒｏ Ｃ１
８カラムを使用し、０．１Ｍ ＴＥＡＢおよびアセトニトリルで溶出する分取スケールＨ
ＰＬＣによってさらに精製した。化合物ＡＯＭ Ａ４は、トリエチルアンモニウム塩とし
て得られた。５６％の収率（３０６μｍｏｌ）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣＩ）：（陰イ
オン）ｍ／ｚ６１２（Ｍ－Ｈ＋）；（陽イオン）ｍ／ｚ６１４（Ｍ＋Ｈ＋）、７１５（Ｍ
＋Ｅｔ３ＮＨ＋）。
ｆｆＡ合成の一般的な手順：色素リンカー（０．０２０ｍｍｏｌ）を２ｍＬの無水Ｎ、
Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）に溶解した。Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミ
ン（２８．４μＬ、０．１６３ｍｍｏｌ）を加え、続いてＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’－テトラメ
チル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボレートを０．１Ｍ無水
ＤＭＡ溶液（ＴＳＴＵ、２３２μＬ）として加えた。、０．０２３ミリモル）。反応物を
窒素下、室温で１時間撹拌した。その間に、三リン酸ＡＯＭ Ａ４（０．０１ｍｍｏｌ）
の水溶液を減圧下で蒸発乾固し、２００μＬの０．１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム（
ＴＥＡＢ）水溶液に再懸濁した。活性化された色素リンカー溶液を三リン酸に加え、反応
物を室温で１８時間撹拌した。粗生成物を、最初に、ＤＥＡＥ－セファデックスＡ２５（
２５ｇ）でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。三リン酸を含む画分をプ
ールし、溶媒を減圧下で蒸発乾固させた。粗物質を、ＹＭＣ－Ｐａｃｋ－ＰｒｏＣ１８カ
ラムを使用する分取スケールＲＰ－ＨＰＬＣによってさらに精製した。３’－ＡＯＭ－ｆ
ｆＡ－ＬＮ３－ＮＲ７１８０Ａ：３８％の収率（３．８μｍｏｌ）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ）
：（陰イオン）ｍ／ｚ１４５９（Ｍ－Ｈ＋）、７２９（Ｍ－２Ｈ＋）、４８６（Ｍ－３Ｈ
＋）。３’－ＡＯＭ－ｆｆＡ－ＬＮ３－ＢＬ－ＮＲ５５０Ｓ０：３７％の収率（３．７μ
ｍｏｌ）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ）：（陰イオン）ｍ／ｚ１７７１（Ｍ－Ｈ＋）、８８５（Ｍ
－２Ｈ＋）、５８９（Ｍ－３Ｈ＋）。３’－ＡＯＭｆｆＡ－ＬＮ３－ＢＬ－ＮＲ６５０Ｃ
５：５１％の収率（５１μｍｏｌ）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ）：（陰イオン）ｍ／ｚ１９１７
（Ｍ－Ｈ＋）、９５８（Ｍ－２Ｈ＋）、６４５（Ｍ－３Ｈ＋）。
スキーム６．３’－ＡＯＭ－ｐｐｐＧの合成
中間体ＡＯＭＧ４の合成：既知のヌクレオシドｄＧ３（１００ｍｇ、０．１４３ｍｍｏ
ｌ）をＮ２雰囲気下で１０ｍＬの無水ジクロロメタンに溶解し、シクロヘキセン（７２μ
Ｌ、０．７１４ｍｍｏｌ）を加え、溶液を－１２℃に冷却した。塩化スルフリル（蒸留、
（ＤＣＭ中１Ｍ）、１７１μＬ、０．１７１ｍｍｏｌ）を滴下し、反応物を１０分間撹拌
した。シクロヘキセンの余分な部分（７２μＬ、０．７１４ミリモル）を加え、反応物を
－１２℃で３０分間撹拌した。反応物を減圧下で蒸発乾固し、残留物を窒素でパージし、
氷冷したニートのアリルアルコール（蒸留、０．８ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）を－１２℃で撹
拌しながら加えた。反応物を－１２℃で６０分間撹拌し、次に２ｍＬの飽和水溶液でクエ
ンチした。ＮａＨＣＯ３。混合物を酢酸エチル（２ｍＬ）で分離し、水層を酢酸エチルで
抽出した。合わせた有機相を４ｍＬの水および４ｍＬのブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で
乾燥させ、濾過し、蒸発させて原油にした。残渣をシリカゲルのフラッシュクロマトグラ
フィーで精製して、ＡＯＭＧ４を透明な油状物として得た。３６％の収率（５０．９ｍｇ
、０．０７２ミリモル）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣＩ）：（陽イオン）ｍ／ｚ７１０［
Ｍ＋Ｈ］＋；（陰イオン）ｍ／ｚ７０８［Ｍ－Ｈ］－。
中間体ＡＯＭ Ｇ５の合成：ヌクレオシドＡＯＭ－Ｇ４（１１１ｍｇ、０．１５６ｍｍ
ｏｌ）をＮ２雰囲気下で乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解した。酢酸（２７μＬ、０．４６８
ｍｍｏｌ）を加え、続いて１．０Ｍ ＴＢＡＦのＴＨＦ溶液（２９６μＬ、０．２９６ｍ
ｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で５時間撹拌した。溶液を１０ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈し
、１０ｍＬの０．０５Ｍ水溶液で洗浄した。ＨＣｌと有機物が分離された。水相を酢酸エ
チルで抽出した。合わせた有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発乾固させた。残渣
をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーで精製して、ＡＯＭＧ５を白色固体として
得た。４４％の収率（３２．４ｍｇ、０．０６８ミリモル）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣ
Ｉ）：（陽イオン）ｍ／ｚ４７２［Ｍ＋Ｈ］＋；（陰イオン）ｍ／ｚ４７０［Ｍ－Ｈ］－
。
３’－ＡＯＭ－ｐｐｐＧの合成：新たに活性化された４Åモレキュラーシーブを有する
ヌクレオシドＡＯＭ－Ｇ５（７９ｍｇ、０．１６８ｍｍｏｌ）を、減圧下、Ｐ２Ｏ５上で
１８時間乾燥させた。プロトンスポンジ（登録商標）（１７５ｍｇ、０．８１６ｍｍｏｌ
）および無水リン酸トリエチル（０．８ｍＬ）を窒素下で加え、室温で１時間撹拌した。
反応フラスコを氷浴中で０℃に冷却し、新たに蒸留したＰＯＣｌ３（１９μＬ、０．２０
２ｍｍｏｌ）を滴下し、反応物を０℃で１５分間撹拌した。次に、無水ＤＭＦ中のビス－
トリ－ｎ－ブチルアンモニウム塩（１．６８ｍＬ、０．８４ミリモル）としてのピロリン
酸の０．５Ｍ溶液を素早く加え、すぐにトリ－ｎ－ブチルアミン（１６８μＬ、０．７０
５ミリモル）を加えた。反応物を氷／水浴から取り出し、５分間激しく撹拌し、次にそれ
を１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＢ、６ｍＬ）に注ぐことによりクエ
ンチし、室温で１８時間撹拌した。すべての溶媒を減圧下で蒸発させた。残留物を３５％
アンモニア水溶液（１０ｍＬ）に溶解し、室温で少なくとも５時間撹拌した。次に、溶媒
を減圧下で蒸発させ、さらに水と共蒸発させた。粗生成物を、最初に、ＤＥＡＥ－セファ
デックスＡ２５（５０ｇ）でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。カラム
は、水性トリエチルアンモニウムの直線勾配で溶出された。三リン酸を含む画分を集め、
溶媒を減圧下で蒸発乾固させた。粗物質を、ＹＭＣ－Ｐａｃｋ－ＰｒｏＣ１８カラムを使
用する分取スケールＨＰＬＣによってさらに精製した。３’－ＡＯＭ－ｐｐｐＧはトリエ
チルアンモニウム塩として得られた。２４％の収率（３９．７μｍｏｌ）。ＬＣ－ＭＳ（
ＥＳおよびＣＩ）：（陰イオン）ｍ／ｚ５７６［Ｍ－Ｈ］－；（陽イオン）ｍ／ｚ５７８
［Ｍ＋Ｈ］＋。
３’－ＡＯＭ－ｆｆＴ－ＬＮ３－ＮＲ５５０Ｓ０は、３’－ＡＯＭｆｆＡおよびｆｆＣ
の調製で説明したのと同様の方法で合成された。
スキーム７．３’－ＡＯＭ－ｆｆＴ－ＬＮ３’－ＮＲ５５０Ｓ０の合成
中間体Ｔ１の合成：５－ヨード－２’－デオキシウリジン（３ｇ、８．４ミリモル）お
よび酢酸パラジウム（ＩＩ）（１．６ｇ、７．１４ミリモル）を乾燥脱気ＤＭＦに溶解し
、次にＮ－アリルトリフルオロアセトアミド（６．４ｍＬ、４２ミリモル）に溶解した。
）が追加された。溶液を真空下に置き、次に窒素で３回パージし、次に脱気したトリエチ
ルアミン（２．３ｍＬ、１６．８ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を８０℃に２時間加熱した。
黒色の混合物を室温まで冷却し、次に５０ｍＬのメタノールで希釈した。約０．５ｇの活
性炭を加え、溶液をセライトで濾過し、次に減圧下で蒸発させて、褐色の濃厚な油を得た
。この粗生成物を、ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨを使用するシリカゲルでのクロマトグラフィー
によって精製した。収量：（２．２７ｇ、５．９９ミリモル）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよび
ＣＩ）：（陰イオン）ｍ／ｚ３７８（Ｍ－Ｈ＋）。
中間体Ｔ２の合成：５－［３－（２，２，２－トリフルオロアセトアミド）－アリル］
－２’－デオキシウリジン（Ｔ１）（２．５５ｇ、６．７２ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦに溶
解した。イミダゾール（１．３７ｇ、２０．１ミリモル）を加え、続いて４－（ジメチル
アミノ）ピリジン（４１０ｍｇ、３．３６ミリモル）を加えた。反応物を０℃に冷却し、
次にｔｅｒｔ－ブチル（クロロ）ジフェニルシラン（１．９２ｍＬ、７．３９ｍｍｏｌ）
を３０分間隔で３回に分けてゆっくりと加えた。反応物を０℃で６時間撹拌した。次に、
溶媒を蒸発させ、残留物を２００ｍＬのＥｔＯＡｃに再懸濁し、２×２００ｍＬの水溶液
で洗浄した。飽和ＮａＨＣＯ３と２００ｍＬの水、次に１００ｍＬのブライン。有機相を
ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発乾固させた。粗生成物を、ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃを使用
するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。６８％の収率（２．８
０６ｇ、４．５４ミリモル）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣＩ）：（陽イオン）ｍ／ｚ６１
８（Ｍ＋Ｈ＋）；（陰イオン）ｍ／ｚ６１６（Ｍ－Ｈ＋）。
中間体Ｔ３の合成：５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－５－［３－（
２，２，２－トリフルオロアセトアミド）－アリル］－２’－デオキシウリジン（Ｔ２）
（２．８ｇ、４．５３ミリモル）を溶解した１０ｍＬの無水ＤＭＳＯ（１３６ミリモル）
中、次に氷酢酸（１６ｍＬ、２７２ミリモル）および無水酢酸（１６ｍＬ、１５８ミリモ
ル）を加えた。反応物を５０℃に６時間加熱し、次に２００ｍＬの水溶液でクエンチした
。飽和ＮａＨＣＯ３。溶液の泡立ちが止まった後、２ｘ１５０ｍＬのＥｔＯＡｃで抽出し
た。有機相をプールし、２ｘ２００ｍＬの水溶液で洗浄した。飽和ＮａＨＣＯ３、２００
ｍＬの水および１００ｍＬのブライン。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発乾固
させた。粗生成物を、ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃを使用するシリカでのフラッシュクロマトグラ
フィーによって精製した。７７％の収率（２．３７５ｇ、３．５１ミリモル）。ＬＣ－Ｍ
Ｓ（ＥＳおよびＣＩ）：（陽イオン）ｍ／ｚ６７８（Ｍ＋Ｈ＋）；（陰イオン）ｍ／ｚ６
７６（Ｍ－Ｈ＋）。
中間体Ｔ４の合成：５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－３’－Ｏ－メ
チルチオメチル－５－［３－（２，２，２－トリフルオロアセトアミド）－アリル］－２
’－デオキシウリジン（Ｔ３）（３１０ｍｇ、０．４５ミリモル）をＮ２雰囲気下で５ｍ
Ｌの無水ジクロロメタンに溶解し、シクロヘキセン（２２８μＬ、２．２５ミリモル）を
加え、溶液を約－１５℃に冷却した。塩化スルフリル（蒸留、５５μＬ、０．６７５ｍｍ
ｏｌ）を滴下し、反応物を２０分間撹拌した。すべての出発物質が消費された後、シクロ
ヘキセンの余分な部分（２２８μＬ、２．２５ミリモル）を加え、反応物を減圧下で蒸発
乾固させた。残留物を窒素で素早くパージし、次に氷冷アリルアルコール（２．５ｍＬ）
を０℃で撹拌しながら加えた。反応物を０℃で３５分間撹拌し、次に２５ｍＬの飽和水溶
液でクエンチした。次に、ＮａＨＣＯ３を１００ｍＬの飽和水溶液でさらに希釈する。Ｎ
ａＨＣＯ３。混合物を２×５０ｍＬの酢酸エチルで抽出した。プールした有機相をＭｇＳ
Ｏ４で乾燥し、濾過し、蒸発乾固させた。残留物を、ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃを使用するシリ
カゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。６９％の収率（２１４ｍｇ
、０．３１１ミリモル）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣＩ）：（陽イオン）ｍ／ｚ６８８（
Ｍ＋Ｈ＋）；（陰イオン）ｍ／ｚ６８６（Ｍ－Ｈ＋）。
中間体Ｔ５の合成：５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）－３’－Ｏ－ア
リルオキシメチル－５－［３－（２，２，２－トリフルオロアセトアミド）－アリル］－
２’－デオキシウリジン（Ｔ４）（２１０ｍｇ、０．３０５ｍｍｏｌ）をＮ２雰囲気下で
乾燥ＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解した。ＴＨＦ中の１．０ＭＴＢＡＦの溶液（３６７μＬ、０
．３６７ミリモル）を加えた。溶液を室温で３時間撹拌した。溶液を５０ｍＬのＥｔＯＡ
ｃで希釈し、次に５０ｍＬのＮａＨ２ＰＯ４ ｓａｔで洗浄した。（ｐＨ＝３）、および
５０ｍＬの水を使用する。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発乾固させた。残留
物を、ＤＣＭ／ＥｔＯＡｃを使用するシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによ
って精製した。９５％の収率（１３０ｍｇ、０．２８９ミリモル）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳお
よびＣＩ）：（陰イオン）ｍ／ｚ４４８（Ｍ－Ｈ＋）、４８４（Ｍ＋Ｃｌ－）。
中間体Ｔ６の合成：３’－Ｏ－アリルオキシメチル－５－［３－（２，２，２－トリフ
ルオロアセトアミド）－アリル］－２’－デオキシウリジン（Ｔ５）（１２０ｍｇ、０．
２６７ｍｍｏｌ、）を減圧下で乾燥させた。Ｐ２Ｏ５で１８時間。無水リン酸トリエチル
（１ｍＬ）といくつかの新たに活性化された４Åモレキュラーシーブを窒素下でそれに加
え、次に反応フラスコを０℃に冷却した。新たに蒸留したＰＯＣｌ３（３０μＬ、０．３
２ｍｍｏｌ）を滴下し、続いてＰｒｏｔｏｎＳｐｏｎｇｅ（登録商標）（８５ｍｇ、０．
４０ｍｍｏｌ）を加えた。添加後、反応物をさらに０℃で１５分間撹拌した。次に、無水
ＤＭＦ中のビス－トリ－ｎ－ブチルアンモニウム塩（２．７ｍＬ、１．３３ミリモル）と
してのピロリン酸の０．５Ｍ溶液を素早く加え、続いてすぐにトリ－ｎ－ブチルアミン（
２７０μＬ、１．２ミリモル）を加えた。反応物を氷水浴中にさらに１０分間保持し、次
にそれを１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＢ、１０ｍＬ）に注ぐことに
よってクエンチし、室温で４時間撹拌した。すべての溶媒を減圧下で蒸発させた。上記の
残留物にアンモニアの３５％水溶液（１０ｍＬ）を加え、混合物を室温で１８時間撹拌し
た。次に、溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物を１０ｍＬの０．１ＭＴＥＡＢに再懸濁し、
濾過した。濾液を最初に、ＤＥＡＥ－セファデックスＡ２５（１００ｇ）でのイオン交換
クロマトグラフィーによって精製した。カラムを水性重炭酸トリエチルアンモニウム（Ｔ
ＥＡＢ）で溶出した。三リン酸を含む画分をプールし、溶媒を減圧下で蒸発乾固させた。
粗物質を、ＹＭＣ－Ｐａｃｋ－ＰｒｏＣ１８カラムを使用する分取スケールＨＰＬＣによ
ってさらに精製した。化合物Ｔ６をトリエチルアンモニウム塩として得た。３３％の収率
（８９μｍｏｌ）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳおよびＣＩ）：（陰イオン）ｍ／ｚ５９２（Ｍ－Ｈ
＋）、２９５（Ｍ－２Ｈ＋）。
３’－ＡＯＭ－ｆｆＴ－ＬＮ３’－ＮＲ５５０Ｓ０の合成：乾燥した既知の化合物ＬＮ
３－ＮＲ５５０Ｓ０（０．０１５ｍｍｏｌ）をＮ２下の無水ＤＭＡ（２ｍＬ）に溶解した
。Ｎ、Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１７μＬ、０．１ｍｍｏｌ）を加え、続いてＴ
ＳＴＵ（ＤＭＡ中０．１Ｍ、１８０μＬ、０．０１８ｍｍｏｌ）を加えた。反応物をＮ２
下、室温で１時間撹拌した。その間に、Ｔ６の水溶液（０．０１ミリモル）を減圧下で蒸
発乾固し、０．１Ｍ ＴＥＡＢ水溶液に再懸濁した。（２００μＬ）そしてＬＮ３－ＮＲ
５５０Ｓ０溶液に加えられる。反応物を室温で１８時間撹拌し、次に０．１ＭＴＥＡＢ水
溶液でクエンチした。（４ｍＬ）。粗生成物を、ＤＥＡＥ－セファデックスでのフラッシ
ュクロマトグラフィーによって精製した。生成物を分取ＨＰＬＣによりさらに精製して、
純粋な３’－ＡＯＭ－ｆｆＴ－ＬＮ３’－ＮＲ５５０Ｓ０を得た。６７％の収率（４１・
ｍｏｌ、ＵＶ－Ｖｉｓ分光法で測定、λｍａｘ＝５５０ｎｍ、ε＝１２５０００Ｍ－１ｃ
ｍ－１）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ）：（陰イオン）ｍ／ｚ１５２１（Ｍ－Ｈ＋）、７６１（Ｍ
－２Ｈ＋）、５０７（Ｍ－３Ｈ＋）。
（合成によるシーケンシング実験）
続いて、イルミナＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）機器を使用したシーケンスでｆｆＮをテ
ストした。これらのｆｆＮを含む新しい組み込みミックスを除いて、すべての標準的な市
販試薬が使用された。標準の２ｘ１５０レシピが使用された。標準的な合成によるシーケ
ンシング（ＳＢＳ）プロトコルに加えて、パラジウム開裂混合物の溶液中での５秒間のイ
ンキュベーション（実施例４に記載のＤＥＥＡでＰｄ：ＴＨＰ＝１／５）を追加して、３
’－ＡＯＭのブロックを解除した。
最初の実験では、次のｆｆＮを組み込みミックスで使用した：３’－ＡＯＭ－ｆｆＴ－
ＬＮ３－ＮＲ５５０Ｓ０、３’－ＡＯＭ－ｆｆＡ－ＬＮ３－ＢＬ－ＮＲ５５０Ｓ０、３’
－ＡＯＭ－ｆｆＡ－ＬＮ３－ＢＬ－ＮＲ６５０Ｃ５、３’－ＡＯＭ－ｆｆＡ－ＬＮ３－Ｎ
Ｒ７１８０Ａ、３’－ＡＯＭ－ｆｆＣ－ＬＮ３－ＳＯ７１８１、および３’－ＡＯＭ－ｐ
ｐｐＧ（ダークＧ）。リード１のシーケンス結果を以下に要約する。
２番目の実験では、上記の３’－ＡＯＭ－ｐｐｐＧの調製と同様に非標識３’－ＡＯＭ
－ｐｐｐＴを合成した（ＬＣ－ＭＳ（ＥＳ）：（負イオン）ｍ／ｚ５５１（Ｍ－Ｈ＋））
。市販のグリーンｆｆＧ－ＬＮ３－ＰＥＧ１２－ＡＴＴＯ５３２（イルミナ４チャンネル
システムで使用）の存在下でシーケンスに使用され、上記の最初の実験で説明したものと
同じｆｆＡおよびｆｆＣが使用された。結果を以下に要約する。フェージング値とプレフ
ェージング値に大幅な改善が見られ、信号の減衰は観察されなかった（図３Ａ）。さらに
、読取り１と読取り２の両方のエラー率も減少した。
別の実験では、３’－ＡＯＭ－ｆｆＴ－ＬＮ３’－ＮＲ５５０Ｓ０、３’－ＡＯＭ－ｆ
ｆＡ－ＬＮ３－ＢＬ－ＮＲ５５０Ｓ０、３’－ＡＯＭ－ｆｆＡ－ＬＮ３－ＢＬ－ＮＲ６５
０Ｃ５、３’－ＡＯＭ－ｆｆＡ－ＬＮ３－を含む組み込みミックスＮＲ７１８０Ａ、３’
－ＡＯＭ－ｆｆＣ－ＬＮ３－ＳＯ７１８１、および３’－ＡＯＭ－ｐｐｐＧ（ダークＧ）
を使用した。以前の実行と同様に、パラジウム触媒（Ｐｄ／ＴＨＰ＝１：１０；例４で説
明した１００ｍＭ ＤＥＥＡ）を含む切断混合物との５秒間のインキュベーションを標準
ＳＢＳサイクルに追加した。標準のＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使
用したが、取り込み時間は２倍であった。シグナル減衰表現型は観察されなかった（図３
Ｂ）。さらに、これらのシーケンス結果は、標準のアジドメチルブロッキング基を持つｆ
ｆＮを使用した市販のＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）ラン（平均３；Ｎ＝３）と比較された
。エラー率はほぼ同じであることが観察された（図３Ｃ）。シーケンシングの結果を以下
に要約する。
さらに、３’－ＡＯＭブロッキング基を持つｆｆＮの主要なシーケンスメトリックを、
ＤＮＡポリメラーゼＰｏｌ ８１２を含む標準のＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）市販キット
によって生成されたものと比較し、比較結果を図４Ａに示す。３’－ＡＯＭ－ｆｆＮの安
定性が向上したため、非常に低いプレフェージングが観察された。ただし、２倍の取り込
み時間を使用した場合でも、位相は依然として上昇していた。
さらに別の実験では、市販のＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）キット（Ｐｏｌ ８１２）の
ＤＮＡポリメラーゼの代わりに、別のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ １９０１）を使用し
た。Ｐｏｌ １９０１は、上記の２倍の取り込み時間の代わりに、シーケンスで標準の１
倍の取り込み時間を可能にした。さらに、Ｐｄ切断混合物でのインキュベーションは、標
準的な実行と比較して半分に減少した。これにより、ＳＢＳケミストリーサイクル全体で
１０％の時間を節約できた。シーケンシングメトリクスは大幅に改善され、３’－Ｏ－ア
ジドメチルブロッキング基を含む標準的な市販キットから得られた値を上回った（図４Ｂ
）。
（シーケンシングにおける３’ブロッキング基安定性テスト）
３’－ＡＯＭによるｆｆＮの安定性の向上を実証するために、３’－Ｏ－アジドメチル
基を持つ標準のＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）ｆｆＮと並べて比較した。２セットのｆｆＮ
は、ＤＮＡポリメラーゼのみを除く標準的な取り込み混合製剤で、４５℃で数日間インキ
ュベートされた。各時点で、ＭｉｎｉＳｅｑ（登録商標）にロードする直前に新しいポリ
メラーゼを添加して取り込みミックスを完了した。前述のシーケンス条件が使用された。
プレフェーズ％は、混合物に存在する３’ＯＨ－ｆｆＮのパーセンテージの直接的な指標
であるため、３’ブロックグループの安定性と直接相関する。ｆｆＮの両方のセットのプ
レフェーズ値が記録され、プロットされた（図５）。４５℃では、ｆｆＮを含む３’－Ａ
ＯＭは、３’－Ｏ－アジドメチル基を含む標準のｆｆＮよりも６倍安定しているように見
えることが観察された。シーケンシングメトリクスは、溶液中での安定性アッセイ中に観
察された傾向も確認した－３’－ＡＯＭブロックは３’－Ｏ－アジドメチル基よりも有意
に安定していた。
（実施例６．３’－Ｏ－チオカルバメートブロックヌクレオシドの調製）
この例では、種々の３’－Ｏ－チオカルバメートで保護されたＴヌクレオシドをスキー
ム８に従って調製した。
スキーム８．３’－Ｏ－ジメチルチオカルバメートＴヌクレオシドの合成
Ｔ－７の調製：オーブンで乾燥させた窒素パージした１００ｍＬフラスコに５’－Ｏ－
（４，４’－ジメトキシトリチル）チミジン（１．０ｇ、１．８３６ｍｍｏｌ）を加えた
。これを無水ＤＭＦ（３ｘ２０ｍＬ）と共蒸発させ、窒素下に置きた。無水ＤＣＭ（９．
２ｍＬ）および４－ジメチルアミノピリジン（２２４ｍｇ、０．１８４ｍｍｏｌ）を加え
、均一な溶液が形成されるまで室温で撹拌した。次に、１，１’－チオカルボニルジイミ
ダゾール（３６０ｍｇ、２．０２ｍｍｏｌ）を窒素流にすばやく加え、反応物を再封し、
すべての出発物質が消費されるまで室温で２時間撹拌した。反応混合物をシリカゲルのパ
ッドを通して濾過し、フィルターケーキをＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で洗浄する。揮発性物
質を真空で除去し、粗残留物をさらに精製することなく使用した。
Ｔ－８の調製：前のステップからの化合物Ｔ－７を、真空中で乾燥させた直後に使用し
た。残留物を２５ｍＬの丸底フラッシュ中で窒素下に置き、ジメチルアミン（ＴＨＦ中２
Ｍ、７．３ｍＬ、１４．６ｍｍｏｌ）を加え、ＴＬＣに従ってすべての出発物質が消費さ
れるまで反応物を２時間撹拌した。すべての揮発性物質を真空で除去して透明な粗残留物
を形成し、これをシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、
Ｔ－８を白色の固体として得た。収量：１．１５ｇ（９９％）。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロ
スプレーネガティブ）６３０．２３［Ｍ－Ｈ］。
Ｔ－９の調製：出発ヌクレオシドＴ－８（３２０ｍｇ、０．５０４ｍｍｏｌ）を、空気
中の５０ｍＬ丸底フラスコ内の最小アセトニトリルに溶解した。ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ ５：
１（１２．５ｍＬ：２．５ｍＬ）の溶液を一度に加え、すべての出発物質が消費されるま
で（２～４時間）、反応物を室温で撹拌した。真空下で、すべての揮発性物質を蒸発させ
、残留物をトルエン（２ｘ６０ｍＬ）で共蒸発させると、粗生成物がオフホワイトの固体
として得られる。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、Ｔ－
９を白色固体として得た。収量：１２３ｍｇ（７４％）。ＬＣ－ＭＳ（エレクトロスプレ
ーネガティブ）［Ｍ－Ｈ］３２８．１０。
対応するＭｅＮＨ２またはＮＨ３を使用した同様の合成手順に従って、他の２つのチオ
カルバメート保護基を持つヌクレオシドも調製した。一般的な反応スキームを以下に示す
。
（３’－Ｏ－チオカルバメートブロッキング基の安定性試験）
５’－ｍＰ ３’－ＤＭＴＣ Ｔヌクレオチドの安定性試験は、標準の５’－ｍＰ３’
－Ｏ－アジドメチルＴヌクレオチドを含む取り込み緩衝液中で並べて実施した。
５’－ｍＰ ３’－ＤＭＴＣ Ｔと５’－ｍＰ ３’－Ｏ－アジドメチルＴの両方で、
最終溶液量は１ｍＬで、対応するヌクレオチドの最終濃度は両方とも０．１ｍＭであった
。緩衝水溶液の他の成分には、エタノールアミン（ＥＡ）、エタノールアミンＨＣｌ、Ｎ
ａＣｌ（１００ｍＭ）、およびＥＤＴＡ（２．５ｍＭ）が含まれる。緩衝液の濃度は次の
とおりである。０．５ＭＥＡ緩衝液、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ。
（安定性試験方法）
２００μＬの１０ｘ緩衝液を１．７ｍＬポリプロピレンスナップロックマイクロチュー
ブに加え、適切な量の１８ｍΩ水で希釈した。次に、対応するヌクレオシドを添加し、バ
イアルを密封し、反転、穏やかに攪拌、またはマイクロピペットでポンピングすることに
より混合した。４０μＬのアリコートを採取し、ＨＰＬＣで分析して、開始値（またはｔ
＝０）として機能させた。次に、バイアルを６５℃に設定された予熱された加熱マントル
に入れ、アルミホイルの厚い層で覆い、１か月間加熱する。４０μＬのアリコートを定期
的に採取し（１週目：１日１回、２～４週目：２日ごとに１回）、ＨＰＬＣで分析して、
サンプル中の出発物質の割合とブロック解除された（３’－ＯＨ）ヌクレオチドの割合を
決定した。ヌクレオチドピークと３’ＯＨピークの面積を測定することにより、ＨＰＬＣ
分析を実施した。これらの値は、グラフで表示され、サンプル間の取り込みバッファーの
安定性を比較するために使用される、ブロック解除されたヌクレオチドのパーセンテージ
を計算するために使用された。図６は、６５℃で３’－Ｏ－アジドメチルブロッキング基
でブロックされたヌクレオチドに対する３つの異なるチオカルバメート３’ブロッキング
ヌクレオチドの安定性の比較結果を示している。３’－ＯＣ（＝Ｓ）ＮＨ２または３’－
ＯＣ（＝Ｓ）ＮＨＣＨ３を含むヌクレオチドは、標準の３’－Ｏ－アジドメチル基で保護
されたヌクレオチドよりも安定性が低いが、３’－ＤＭＴＣを含むヌクレオチドは改善さ
れたことが観察された。９日間のテスト期間中の安定性。そのため、ＤＭＴＣは標準のア
ジドメチルブロッキング基よりも優れた安定性を示した。
（例７．３’－Ｏ－チオカルバメートブロッキング基脱ブロッキングテスト）
この例では、５’－ｍＰ ３’－ＤＭＴＣ Ｔおよび標準の５’－ｍＰ ３’－Ｏ－ア
ジドメチルＴヌクレオチドの脱ブロック化または脱ブロック化テストが、各ブロッキング
基に固有のソリューションで個別に実行された。条件は、イルミナの標準的なブロック解
除試薬を可能な限り模倣し、同じ方法論に従うように策定された。活性脱ブロック試薬、
バッファー、ヌクレオシドの濃度はすべてのテストで同じに保たれているが、各成分の同
一性は独特であった。このように、個々の脱ブロック化化学物質間で観察された速度の違
いは、製剤の濃度の違いによるものではない。
（ブロック解除テストの一般的な方法論）
各反応成分は、１８ｍΩの水中で濃縮ストックとして個別に処方され、適切に保管され
、アリコートは以下に示す特定の順序で組み合わされた。予め処方された脱ブロック試薬
の添加により反応を開始した。最終濃度：ヌクレオシド（０．１ｍＭ）、活性脱ブロック
試薬（１ｍＭ）、添加剤（脱ブロック試薬に固有）、バッファー（１００ｍＭ）。最終容
量：２０００μＬ。
３ｍＬのガラスバイアルに、事前に処方された緩衝液、続いて事前に処方された添加剤
溶液を加えた。これを正しい量の１８ｍΩの水で希釈し、１０分間撹拌した。次に、ヌク
レオチド溶液のアリコートを加え、５分間撹拌した。次に、４０μＬのアリコートを採取
し、クエンチング試薬を添加して、参照（またはｔ＝０分）ピークとしてＨＰＬＣで分析
した。次に、脱ブロック試薬を一度に攪拌溶液に加え、計時を開始した。指定された時点
で、４０μＬのアリコートを採取し、適切なクエンチング試薬で直ちにクエンチし、ＨＰ
ＬＣで分析して、これらの指定された時点で発生したブロック解除されたヌクレオチドの
量を決定した。結果はグラフでプロットされ、ブロック解除の効率と有効性を比較するた
めに使用される。
（ＤＭＴＣ脱ブロッキング）
ヌクレオチド：５’－ｍＰ ３’－ＤＭＴＣ Ｔ．アクティブ脱ブロック試薬：ＮａＩ
Ｏ４（１８ｍΩ水中で０．１Ｍ）またはＯｘｏｎｅ（登録商標）（１８ｍΩ水中で０．１
Ｍ）。添加剤：なし。ＮａＩＯ４用バッファー：ｐＨ６．７５リン酸バッファー（１８ｍ
Ω水中１Ｍ）。Ｏｘｏｎｅ（登録商標）用バッファー：ｐＨ８．６５リン酸バッファー（
１８ｍΩ水中１Ｍ）。急冷試薬：チオ硫酸ナトリウム。３’－Ｏ－アジドメチル脱ブロッ
ク化条件は、例３で説明したものと同じである。
ＨＰＬＣ分析は、ヌクレオシドピーク、３’－ＯＨピーク、およびＨＰＬＣクロマトグ
ラムに表示されるその他のヌクレオチドピークの面積を測定することによって実行された
。これらの値を使用して、開始ヌクレオチドとブロック解除されたヌクレオチドのパーセ
ンテージを計算し、グラフで表示して、サンプル間のブロック解除率、効率、および有効
性を比較した。比較結果を図７に示す。ＮａＩＯ４によるＤＭＴＣの脱ブロック化は効率
的ではないことが観察された。ただし、ＤＭＴＣをＯｘｏｎｅ（登録商標）で切断した場
合、ＤＭＴＣブロッキング基を持つヌクレオチドの残りの出発物質の割合は大幅に少なく
なった。要約すると、ＤＭＴＣは、標準のアジドメチルブロッキング基の脱ブロック化率
よりも優れた脱ブロック化率（Ｏｘｏｎｅ（登録商標）を使用）を示している。

Claims (60)

  1. ３’－炭素原子に共有結合した除去可能な３’－ＯＨブロッキング基
    を有するリボースまたはデオキシリボースを含むヌクレオチドであって、検出可能な標識に共有結合している、ヌクレオチド。
  2. ２’デオキシリボースを含む、請求項１に記載のヌクレオチド。
  3. 前記リボースまたはデオキシリボースの５’位置に三リン酸を含む、請求項１または請求項２に記載のヌクレオチド。
  4. 切断可能なリンカーを介して、検出可能な標識に共有結合している、請求項１～３のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
  5. 前記検出可能な標識が、切断可能なリンカーを介して前記ヌクレオチドの核酸塩基に共有結合している、請求項４に記載のヌクレオチド。
  6. 前記切断可能なリンカーが、アジド部分、－Ｏ－アリル部分、ジスルフィド部分、アセタール部分、またはチオカルバメート部分を含む、請求項５に記載のヌクレオチド。
  7. 前記切断可能なリンカーが、以下からなる群から選択される部分：

    （式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮＱからなる群から選択され、Ｑは、Ｃ １－１０ 置換または非置換アルキル基であり、Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨおよびＮ（アリル）からなる群から選択され、Ｔは、水素またはＣ １ －Ｃ １０ 置換または非置換アルキル基であり、かつ＊は、前記部分がヌクレオチドの残りの部分に接続されている場所を示す。）
    を含む、請求項５に記載のヌクレオチド。
  8. 前記切断可能なリンカーが、以下：

    （式中、Ｂは、核酸塩基であり；Ｚは、－Ｎ ３ （アジド）、－Ｏ－Ｃ １ ～Ｃ ６ アルキル、－Ｏ－Ｃ ２ ～Ｃ ６ アルケニル、または－Ｏ－Ｃ ２ ～Ｃ ６ アルキニルであり；Ｆ１は、追加のリンカー構造を含み得る蛍光標識を含む。）
    からなる群から選択される、請求項５に記載のヌクレオチド。
  9. 前記３’－ＯＨブロッキング基および前記切断可能なリンカーが、同じ化学反応条件下で除去される、請求項５～８のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
  10. 以下：

    からなる群から選択される核酸塩基を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
  11. 以下：

    （式中、Ｌは、リンカーであり、Ｄｙｅは、蛍光色素である。）
    からなる群から選択される核酸塩基を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
  12. 以下：

    （式中、Ｌは、リンカーであり、Ｄｙｅは、蛍光色素であり、Ｒは、３’－炭素原子に共有結合した除去可能な３’－ＯＨブロッキング基

    を有する前記リボースまたはデオキシリボースである。）
    からなる群から選択される構造を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
  13. 前記除去可能な３’－ＯＨブロッキング基が、同時に同じ期間のコンディションでアジドメチルで保護された３’－ＯＨと比較して、少なくとも５％向上した安定性を付与する、請求項１～１２のいずれか一項に記載のヌクレオチド。
  14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のヌクレオチドが組み込まれているオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドの３’－炭素原子と前記ヌクレオチドの５’－炭素原子との間にホスホジエステル結合が形成されている、オリゴヌクレオチド。
  15. アレイの表面上に固定化されている、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
  16. シーケンシング反応において標的一本鎖ポリヌクレオチドに相補的な成長ポリヌクレオチドを調製する方法であって、請求項１～１３のいずれか一項に記載のヌクレオチドを成長相補的ポリヌクレオチドに組み込むことを含み、前記ヌクレオチドの組み込みが、前記相補的な成長ポリヌクレオチドへのあらゆるその後のヌクレオチドの導入を防止する、方法。
  17. 請求項３～１３のいずれか一項に記載のヌクレオチドを、前記相補的な成長ポリヌクレオチドに組み込むことを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. ヌクレオチドの組み込みがポリメラーゼによって達成される、請求項１６または１７に記載の方法。
  19. 以下を含む、標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する方法：
    （ａ）前記標的一本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的なコピーポリヌクレオチド鎖の中に、請求項４～１３のいずれか一項に記載のヌクレオチドを組み込むこと；
    （ｂ）前記コピーポリヌクレオチド鎖の中に組み込まれたヌクレオチドのアイデンティティを検出すること；および
    （ｃ）前記コピーポリヌクレオチド鎖の中に組み込まれたヌクレオチドから請求項４～１３のいずれか一項に記載のヌクレオチドにおける検出可能な標識および除去可能な３’－ＯＨブロッキング基を化学的に除去すること。
  20. 工程（ａ）で組み込まれたヌクレオチドが、ヌクレオチド三リン酸である、請求項１９に記載の方法。
  21. （ｄ）化学的に除去された前記検出可能な標識および前記除去可能な３’－ＯＨブロッキング基を前記コピーポリヌクレオチド鎖から洗い流すことをさらに含む、請求項１９または２０に記載の方法。
  22. パラジウム捕捉剤が、工程（ｄ）において使用される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記鋳型ポリヌクレオチド鎖の前記部分の配列が決定されるまで、工程（ａ）～（ｄ）を繰り返すことをさらに含む、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
  24. 前記工程（ａ）～（ｄ）が、少なくとも５０回繰り返される、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記コピーポリヌクレオチド鎖の中に組み込まれたヌクレオチドに由来する検出可能な標識および除去可能な３’－ＯＨブロッキング基が、単一化学反応において除去される、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 工程（ｃ）が、前記組み込まれたヌクレオチドを、パラジウム触媒を含む切断溶液と接触させることを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記コピーポリヌクレオチド鎖の中に組み込まれたヌクレオチドに由来する検出可能な標識および除去可能な３’－ＯＨブロッキング基が、２つの別個の化学反応において除去される、請求項１９～２４のいずれか一項記載の方法。
  28. 工程（ｃ）が、前記組み込まれたヌクレオチドを、ホスフィンおよびパラジウム触媒を含む切断溶液と接触させることを含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記ホスフィンが、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン、トリス（ヒドロキシエチル）ホスフィンまたはトリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィンである、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記パラジウム触媒を含む前記開裂溶液が、一級アミン、二級アミン、三級アミン、炭酸塩、リン酸塩、およびホウ酸塩、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の緩衝試薬をさらに含む、請求項２６、２８、または２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記緩衝試薬が、エタノールアミン（ＥＡ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、グリシン、炭酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、２－ジメチルアミノエタノール（ＤＭＥＡ）、２－ジエチルアミノエタノール（ＤＥＥＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’、Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、およびＮ，Ｎ，Ｎ’、Ｎ’－テトラエチレンジアミン（ＴＥＥＤＡ）、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記切断溶液が、アスコルビン酸またはその塩をさらに含む、請求項２６または２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記方法が、多重フォーマットで実施される、請求項１９～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記方法が、表面結合標的核酸を使用するアレイフォーマットで実施され、前記標的核酸が、空間的に区別可能な様式で表面に結合される、請求項１９～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記アレイが、各部位置に同じ配列の標的核酸を有する複数のコピーを含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記標的核酸の複数のコピーが、ブリッジ増幅によって形成される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記標的核酸の複数のコピーが、コンカテマー中に存在する、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記アレイが、少なくとも１０特徴／ｃｍ ２ の濃度を有する、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の使用。
  39. 前記方法が、第１のチャネルにおいて検出される第１のヌクレオチド型、第２のチャネルにおいて検出される第２のヌクレオチド型、前記第１および前記第２のチャネルの両方において検出される第３のヌクレオチド型、ならびにいずれかのチャネルにおいて検出されないかまたは最小限に検出される標識を欠く第４のヌクレオチド型を使用する、請求項１９～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記方法が、４つの別個ヌクレオチド型を使用し、各ヌクレオチド型が、スペクトル的に異なる標識を有する、請求項１９～３８のいずれか一項に記載の方法。
  41. プレフェージング値が、５０サイクルを超えた後、０．２５未満である、請求項２４～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. フェージング値が、５０サイクルを超えた後、０．２５未満である、請求項２４～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記ヌクレオチドの組み込みが、ＤＮＡポリメラーゼによって達成される、請求項１９～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 請求項１～１３のいずれか一項に記載のヌクレオチドに該当する１以上のヌクレオチドを含むキット。
  45. 少なくとも１つのヌクレオチドが、２’デオキシリボースの３’－炭素原子に共有結合した以下の構造：
    の３’－ＯＨブロッキング基を有するヌクレオチド５’－三リン酸である、請求項４４に記載のキット。
  46. 酵素および前記酵素の動作に適した緩衝液をさらに含む、請求項４４または４５に記載のキット。
  47. 前記酵素が、ポリメラーゼである、請求項４６に記載のキット。
  48. 前記ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４７に記載のキット。
  49. 請求項４～１３のいずれか一項に記載の検出可能な標識で標識された少なくとも１つのヌクレオチドを含む、請求項４４～４８のいずれか一項に記載のキット。
  50. 請求項４～１３のいずれか一項に記載の検出可能な標識で標識された２、３または４種類のヌクレオチドを含む、請求項４４～４８のいずれか一項に記載のキット。
  51. 検出可能な標識を有さないダークヌクレオチドをさらに含む、請求項５０に記載のキット。
  52. 前記異なるタイプの標識ヌクレオチドが、スペクトル的に区別可能な色素化合物で標識される、請求項５０または５１に記載のキット。
  53. 少なくとも１つのタイプのヌクレオチドが、前記核酸塩基において２つ以上の異なる色素で標識される、請求項５０～５２のいずれか一項に記載のキット。
  54. 第１のタイプのヌクレオチドが第１の色素で標識され、第２のタイプのヌクレオチドが第１の色素とは異なる第２の色素で標識され、第３のタイプのヌクレオチドが前記第１および前記第２の色素の混合物として標識され、または前記第１、前記第２および前記第３の色素の混合物として標識され、第４のヌクレオチドが標識を含まない、請求項５０～５３のいずれか一項に記載のキット。
  55. 検出可能な標識で標識された４種類のヌクレオチドを含み、検出可能な標識で標識されたヌクレオチドがＡ、Ｃ、ＴおよびＧであり、各種類のヌクレオチドが異なる蛍光最大値を有する蛍光標識を有し、蛍光標識のそれぞれが、他の３つの蛍光標識と区別可能である、請求項５０に記載のキット。
  56. トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン類、パラジウム（Ｐｄ）触媒、アスコルビン酸またはそれらの塩、およびエタノールアミン（ＥＡ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、グリシン、炭酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、２－ジメチルアミノエタノール（ＤＭＥＡ）、２－ジエチルアミノエタノール（ＤＥＥＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’、Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、およびＮ，Ｎ，Ｎ’、Ｎ’－テトラエチレンジアミン（ＴＥＥＤＡ）、およびそれらの組合せからなる群から選択される緩衝剤をさらに含む、請求項４４～５５のいずれかに記載のキット。
  57. パラジウム捕捉剤を含む洗浄溶液をさらに含む、請求項４４～５６のいずれか一項に記載のキット。
  58. 合成による多重シーケンシングに使用するための、請求項４４～５７のいずれか一項記載のキット。
  59. 合成による多重シーケンシングにおける、請求項１～１３のいずれか一項に記載のヌクレオチドの使用。
  60. 前記配列決定工程が、少なくとも５０回繰り返される、請求項５９に記載の使用。
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