JP7828888B2

JP7828888B2 - タンパク質抽出の新しい工程

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Publication number: JP7828888B2
Application number: JP2022525395A
Authority: JP
Inventors: ドゥノースフィン; レーイセーテルベリンダ; モクストマス
Original assignee: アフィボディアクティエボラーグ
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2020-11-09
Publication date: 2026-03-12
Anticipated expiration: 2040-11-09
Also published as: BR112022008618A2; IL292533A; KR20220122982A; EP4055027A1; US20220411743A1; JP2023500856A; MX2022005589A; AU2020380524A1; WO2021089862A1; CA3160027A1; CN114616237A

Description

本出願は細胞質又はペリプラズムタンパク質の抽出法に関し、前記方法は細胞懸濁液をある温度で加熱するステップを含み、前記温度において、抽出対象の細胞質又はペリプラズムタンパク質を含む細胞の熱誘導溶解が起こり、及び抽出対象の細胞質又はペリプラズムタンパク質の不可逆的な変性が起こらない。本出願はまた、細胞質又はペリプラズムタンパク質を抽出するためのシステムに関する。

医療及び生物工学的用途のための組換えタンパク質の大規模生産には、高品質の最終製品を生み出す、コスト効率の良く再現性のある生産工程の要求を満たすための、工程の開発及び最適化が必要である。小規模生産でうまく機能する工程は、技術的又は経済的な理由のために、大規模生産では実現可能でない場合がある。工業生産をターゲットとする場合、潜在的な大規模工程を模倣した条件での工程開発、それに続く開発生産工程のスケールアップが不可欠である。

細胞によって発現される組換えタンパク質の製造において、効率的な細胞溶解、及び所望の産物の回収は極めて重要である。細胞を溶解するためのいくつかの方法が開発され、記載されている。これらには、機械的均質化、超音波均質化、圧力均質化、熱処理、凍結/融解サイクル、並びに浸透圧溶解及び化学的溶解が含まれる。選定方法は、細胞から抽出される目的タンパク質の特性、前記タンパク質の細胞内局在、関連する体積、及び必要なスループットなどの様々な要因に依存する。

耐熱性タンパク質の抽出のためには、熱処理による溶解は、望ましくない宿主細胞由来タンパク質の沈殿、及び／又は不溶性凝集体の除去をもたらし得、それゆえ以後の精製を助ける可能性があるため、有利であり得る。さらには、スクリーニング段階で使用する場合、熱処理による溶解は、正しく折り畳まれたタンパク質のより大きな収量をもたらす可能性の高い耐熱性変異体に有利に働きかける。

しかしながら、大規模生産のために、細胞懸濁液を加熱及び冷却するために必要な時間は、目的のタンパク質が沈殿又は分解し始める可能性があるために、全体の収量に影響を及ぼし得る。細胞懸濁液を加熱及び冷却するために必要な時間は、生産物に関連する不純物の生成に伴う問題をさらに引き起こす可能性がある。したがって、熱処理による溶解は、より大きなバイオリアクター又は容器での加熱及び冷却が長時間かかり、それにより、抽出工程の結果が制御されにくいため、細胞発現によるタンパク質の大規模生産には最適ではない。したがって、大規模な細胞発現工程におけるプロセス効率及びタンパク質の収率を改善するための、改良された抽出手順が必要である。

本発明の目的は、目的の細胞質またはペリプラズムタンパク質の効率的な抽出を提供すること、すなわち、高収率及び／又は高品質の前記タンパク質を、特に大規模生産において、提供することである。本発明の別の目的は、抽出される目的タンパク質の沈殿または分解を回避または軽減しながら、目的の細胞質又はペリプラズムタンパク質の抽出を提供することである。本発明のさらなる目的は、生成物に関連する不純物の生成を回避または軽減しながら、目的の細胞質又はペリプラズムタンパク質の抽出を提供することである。

これらの目的ならびに本発明のその他の目的は、以下の説明を検討した後に当業者に明らかであるはずであるが、本発明の一態様における、細胞質又はペリプラズムタンパク質を抽出する方法によって達成され、前記方法は、
―細胞を含む第1細胞懸濁液を提供するステップであり、前記細胞が抽出対象の細胞質またはペリプラズムタンパク質を含み、前記第1細胞懸濁液が第1温度を有している前記ステップ、及び、
―前記第1細胞懸濁液を動作温度で加熱するステップであり、前記動作温度において、前記細胞の少なくとも一分画が熱誘導溶解の対象になり、及び抽出対象の細胞質またはペリプラズムタンパク質の少なくとも一分画が不可逆的変性の対象にならない前記ステップ：
を含み、前記第1細胞懸濁液の加熱が、
―水溶液を提供するステップであり、前記水溶液が、前記第1温度よりも高い第2温度を有する前記ステップ、及び、
―第1細胞懸濁液と水溶液とを混合して、それにより第2細胞懸濁液を得るステップであり、前記第2細胞懸濁液が第1温度よりも高い第3温度を有する前記ステップ：
を含む。

したがって、細胞質又はペリプラズムタンパク質を抽出する方法は、言い換えると、
―細胞を含む第1細胞懸濁液を提供するステップであり、前記細胞が抽出対象の細胞質またはペリプラズムタンパク質を含み、前記第1細胞懸濁液が第1温度を有している前記ステップ、及び、
―前記第1細胞懸濁液を動作温度で加熱するステップであり、前記動作温度において、細胞の熱誘導溶解が起こり、及び抽出対象の細胞質またはペリプラズムタンパク質の不可逆的変性が起こらない前記ステップ：
を含み得、前記第1細胞懸濁液の加熱が、
―水溶液を提供するステップであり、前記水溶液が、前記第1温度よりも高い第2温度を有する前記ステップ、及び、
―第1細胞懸濁液と水溶液とを混合して、それにより第2細胞懸濁液を得るステップであり、前記第2細胞懸濁液が第1温度よりも高い第3温度を有する前記ステップ：
を含む。

第1細胞懸濁液を動作温度で加熱するステップは、したがって目的の細胞質またはペリプラズムタンパク質の遊離をもたらし、それにより、遊離した目的の細胞質またはペリプラズムタンパク質を提供する。溶解した細胞を含む第１細胞懸濁液と暖かい溶液とを混合するステップは、溶解温度への細胞懸濁液の素早い加熱を可能にし、抽出対象のタンパク質の回収率の増加を可能にする。第１細胞懸濁液は、バッチ式で又は連続式で、好ましくは連続式で水溶液と混合し得る。第１細胞懸濁液及び水溶液の間の混合比は、１：０．１～１：１４の範囲で、好ましくは１：１～１：１４の範囲で、より好ましくは１：２～１：１２の範囲で、より好ましくは１：３～１：１０の範囲であり得る。第1の細胞懸濁液を水溶液と混合することにより達成される希釈は、粘度及び抽出される目的のタンパク質が他のタンパク質と付着、及び／又は共沈するリスクを低下させることが企図される。

本発明に従った方法を用いると、細胞を１０分以下、例えば０．１秒～１０分の範囲で、好ましくは５分以下、例えば０．１秒～５分の範囲で、より好ましくは１分以下、例えば０．１秒～１分の範囲で、より好ましくは１０秒以下、例えば０．１秒～１０秒の範囲で、最も好ましくは１秒以下、例えば０．１秒～１秒の範囲で、加熱することで、第３温度に到達し得る。

本明細書において、目的の細胞質またはペリプラズムタンパク質の抽出とは、目的のタンパク質が発現した細胞の細胞質又はペリプラズムからの、前記タンパク質の遊離を指す。本明細書において、細胞の熱誘導溶解が起こり、及び抽出対象の細胞質又はペリプラズムタンパク質の不可逆的変性が起こらない動作温度とは、細胞の少なくとも少数分画、好ましくは主要分画又は本質的に全てが溶解の対象となり、抽出対象の細胞質またはペリプラズムタンパク質のタンパク質分子の少なくとも少数分画、好ましくは主要分画又は本質的に全てが、不可逆的変性の対象にならない温度を指す。本明細書において、変性とは、タンパク質が、それらの天然状態で存在する四次、三次及び／又は二次構造を部分的に又は完全に失う工程を指す。

水溶液は、典型的には、細胞及びタンパク質の処理において一般的に利用されるように、緩衝溶液である。言い換えると、水溶液は本方法における使用に適した組成を有する。したがって、当業者は、抽出対象のタンパク質の回収を最適化するために水溶液の組成を適合させることができる。水溶液の組成の適合は、典型的には、適切な緩衝成分、適切な塩濃度、導電率および/またはpH、および/または任意の添加剤の選択を含む。前記添加剤は、修飾又は分解から目的のタンパク質を保護するもの、又は望ましくない細胞成分の沈殿を増強するものを含み得る。

したがって、水溶液は、目的のタンパク質の抽出を増強するpH及び／又は伝導率を有し得、及び／又は添加剤を含み得る。さらに水溶液は、修飾、分解、ミスフォールディング又は沈殿に対する目的のタンパク質の保護を強化するpH及び／又は伝導率を有し得、及び／又は添加剤を含み得る。さらに水溶液は、望ましくない細胞成分、例えば宿主細胞由来タンパク質、DNA、RNA、エンドトキシン、又はその他の細胞成分の変性、又は沈殿を増強するpH及び／又は伝導率を有し得、及び／又は添加剤を含み得る。さらに水溶液は、細胞の溶解が起こる温度に影響を及ぼす、好ましくは低下させるpH及び／又は伝導率を有し得、及び／又は添加剤を含み得る。

第１細胞懸濁液は、典型的には細胞培養液を遠心分離又は濾過に供することにより提供される。また、凍結細胞ペレット、好ましくは遠心分離または濾過により細胞培養物から得られたものと、温かい緩衝液との混合によって第1細胞懸濁液を提供することも可能である。

第１温度、すなわち抽出される目的のタンパク質を含む細胞を含む提供される細胞懸濁液を提供する温度は、０°Ｃ～３７°Ｃの範囲で、好ましくは２°Ｃ～３７°Ｃの範囲で、より好ましくは８°Ｃ～３０°Ｃの範囲で、より好ましくは１８°Ｃ～２５°Ｃの範囲であってもよい。第1温度は、代わりに０°Ｃ未満であってもよく、その時細胞懸濁液はグリセロールなどの不凍液製剤を含む。

動作温度、すなわち細胞の溶解が起こる温度は９０°Ｃ以下、例えば２０°Ｃ～９０°Ｃの範囲で、好ましくは４０°Ｃ～９０°Ｃの範囲で、より好ましくは５０°Ｃ～９０°Ｃの範囲で、より好ましくは６０°C～９０°Ｃの範囲で、より好ましくは７０°C～９０°Ｃの範囲で、より好ましくは７０°C～８５°Ｃの範囲で、最も好ましくは７５°C～８５°Ｃの範囲で、あってもよい。

第２温度、すなわち提供される水溶液の温度は１１０°C以下、例えば４０～１１０°Cの範囲で、好ましくは５０°C～１１０°Cの範囲で、より好ましくは６０°C～９９°Cの範囲で、より好ましくは、７０～９９°Cの範囲で、より好ましくは、８０～９９°Cの範囲で、より好ましくは、９０～９９°Cの範囲で、最も好ましくは、９０～９５°Cの範囲であってもよい。

第３温度、すなわち第１細胞懸濁液及び水溶液を混合することで得られる第２細胞懸濁液の温度は、９０°Ｃ以下、例えば４０～９０°Ｃの範囲で、好ましくは５０～９０°Ｃの範囲で、より好ましくは、６０～８５°Ｃの範囲で、より好ましくは、６５～８５°Ｃの範囲で、より好ましくは、６５～８０°Ｃの範囲で、より好ましくは、６５～７８°Ｃの範囲で、最も好ましくは、６８～７８°Ｃの範囲であってもよい。第３温度は、代わりに７０～８０°Ｃの範囲であってもよい。第３温度において、抽出対象の細胞質又はペリプラズムタンパク質の少なくとも一分画が、好ましくは不可逆的変性の対象とならない。

第１細胞懸濁液の加熱はさらに、第３温度から動作温度への第２細胞懸濁液の加熱を含み得る。したがって、より暖かい溶液と混合することによる第１細胞懸濁液の加熱に続けて、溶解温度に向かってさらなる加熱を続けてもよい。前記のさらなる加熱は、単に第１細胞懸濁液と、より暖かい溶液とを混合することにより動作温度に到達できない場合に適切であり、これは混合する流体の混合比や温度に制限が適用される場合であってもよい。さらに、前記のさらなる加熱は、第２細胞懸濁液の温度の正確な制御を可能にする。第３温度から動作温度への第２細胞懸濁液の加熱は、好ましくは間接的な熱交換、例えばチューブ式熱交換器、又はプレート式熱交換器によって行われる。

第３温度は動作温度より１０°Ｃ以下、好ましくは５°Ｃ以下であることが好ましい。第１細胞懸濁液は、主により暖かい溶液と混合することにより、溶解温度に向かって大規模に加熱することが望ましい。したがって、第３温度が動作温度に近い場合に有利である。５又は１０°Ｃの残りの温度差は、さらなる加熱による温度の微調整を可能にするであろう。

あるいは、第１細胞懸濁液の加熱は、第３温度から動作温度への第２細胞懸濁液の冷却をさらに含み得る。したがって、より暖かい溶液と混合することによる第１細胞懸濁液の加熱に続けて、冷却を続けてもよい。前記冷却は、第１細胞懸濁液とより暖かい水溶液との混合により、望ましい動作温度より高温の温度に達する場合に適切である。さらに前記冷却は、第２細胞懸濁液の温度の正確な制御を可能にする。第３温度から動作温度への第２細胞懸濁液の冷却は、好ましくは間接的な熱交換、例えばチューブ式熱交換器、又はプレート式熱交換器によって行われる。第３温度は動作温度より１０°Ｃ以上、好ましくは５°Ｃ以上であることが好ましい。上述のように、５又は１０°Ｃの残りの温度差は、冷却による温度の微調整を可能にするであろう。

あるいは、第３温度は動作温度であってもよい。適切な精度で、第1の細胞懸濁液をより暖かい溶液と混合することにより動作温度に直接到達され得る場合には、溶解温度に向かうさらなる加熱が省略されてもよい。

前記方法は、第２細胞懸濁液を動作温度で維持するステップをさらに含み得る。細胞懸濁液を懸濁液の加熱及びその後の冷却の間など、長期間にわたって高温に保つことは、抽出対象のタンパク質の回収に悪影響を及ぼす可能性がある一方で、単に溶解温度に達するだけでは最適な抽出には十分ではない可能性がある。したがって、抽出法において第２細胞懸濁液を動作温度で、一定期間維持するステップを含むことは有利である。本明細書において、動作温度での維持は、実質的な動作温度での維持、すなわち第２細胞懸濁液からの任意の望ましくない熱損失の結果としてあり得るそのようなより低い温度での維持を指す。第２細胞懸濁液は、１秒～２０分の範囲、又は１０秒～２０分の範囲、好ましくは１秒～１０分の範囲、又は１０秒～１０分の範囲、より好ましくは１秒～５分の範囲、又は１０秒～５分の範囲、最も好ましくは１０秒～４分の範囲、例えば、１０秒～３０秒の範囲、又は１分～４分の範囲の期間にわたって、動作温度で維持される。

前記方法は、第２細胞懸濁液を動作温度から第４温度に冷却するステップをさらに含み得、第４温度は、好ましくは、抽出対象とする可逆的に変性した細胞質又はペリプラズムタンパク質の少なくとも一分画が、再生の対象になる温度である。したがって、前記方法は言い換えると、第２細胞懸濁液を動作温度から第４温度に冷却するステップをさらに含み得、第４温度は、好ましくは、抽出対象とする可逆的に変性した細胞質又はペリプラズムタンパク質の再生が起こる温度である。細胞懸濁液を高温で長期間維持するステップは、すでに述べたように、抽出対象のタンパク質の回収に悪影響を及ぼす。したがって、前記抽出法において第２細胞懸濁液の動作温度から第４温度への冷却を含むことは有利である。同じ理由のために、抽出対象のタンパク質を、細胞片及び／又は天然宿主細胞由来タンパク質から分離するための任意のその後の手順の前に、第２細胞懸濁液を冷却することは有利である。抽出対象のタンパク質を最終的にその天然型から回収するために、第４温度は、抽出対象とする可逆的に変性した細胞質又はペリプラズムタンパク質の再生が起こる温度であることが有利である。本明細書において、この温度は、抽出対象とする可逆的に変性した細胞質又はペリプラズムタンパク質の再生が起こる温度であり、抽出対象のタンパク質の、任意の可逆的に変性したタンパク質分子の少なくとも少数分画、好ましくは主要分画又は本質的に全てが、それらの天然状態への再生を受ける温度に関する。第４温度は、２～３７°Ｃの範囲、好ましくは８～３０°Ｃの範囲、又は２５～３７°Ｃの範囲、より好ましくは１８～２５°Ｃの範囲であってもよい。

第１温度及び第４温度の両方よりも高い温度での滞留時間は２０分以下、例えば、１秒～２０分の範囲、又は１０秒～２０分の範囲、好ましくは１０分以下、例えば、１秒～１０分の範囲、又は１０秒～１０分の範囲、より好ましくは５分以下、例えば、１秒～５分の範囲、又は１０秒～５分の範囲であることが好ましい。

目的の細胞質又はペリプラズムタンパク質の抽出、及び可能であれば細胞懸濁液の冷却後、前記方法は、細胞片及び／又は天然宿主細胞由来タンパク質からの、目的の細胞質又はペリプラズムタンパク質の分離をさらに含み得る。前記分離方法は、当業者によく知られており、及び典型的には沈殿、濾過、遠心分離、及び／又は１つ以上の形態のクロマトグラフィーを含む。

前記細胞は原核細胞、例えば、大腸菌（E.coli）細胞、又は真核細胞であり得る。

抽出対象の細胞質又はペリプラズムタンパク質は、細菌性受容体タンパク質の３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン、又はそれらの変異体を含み得る。特定の実施形態において、前記３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインは、細菌性受容体タンパク質のドメインから選択される。そのようなドメインの非限定的な例は、i）黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡの５つの異なる３ヘリカルドメイン、例えばドメインＢ、及びそれらの誘導体である。いくつかの実施形態において、３ヘリックスバンドルタンパク質ドメインは、ブドウ球菌プロテインＡのドメインＢに由来する、プロテインＺの変異体（Wahlberg E et al, 2003, PNAS 100(6):3185-3190）、及び、ii）連鎖球菌プロテインＧのアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）（Kraulis et al, FEBS Lett 378:190, 1996）、又はその誘導体である。

第１細胞懸濁液と水溶液とを混合するステップは、スタティックミキサー又は攪拌容器中で、好ましくはスタティックミキサー中で実行され得る。当該技術分野において慣用的であるように、スタティックミキサーは、一連の固定ブレード、典型的にはヘリカルブレード、又はバー、典型的には噛み合い及び／又は連結バーの格子を備えるパイプであり得る。前記混合は、スタティックミキサーにおいて連続モードで実行されることが好ましい。第１細胞懸濁液の流れがスタティックミキサーにおける水溶液の流れと交わるとき、提供された第１細胞懸濁液よりも高い温度を有する第２細胞懸濁液が、実質的に瞬時に得られる。

上述の目的は、別の態様において、目的の細胞質又はペリプラズムタンパク質を抽出するシステムによって達成され、前記システムは、
―流入口及び流出口を有する細胞懸濁液供給導管であり、流入口が細胞懸濁液容器に接続可能である、前記細胞懸濁液供給導管；
―流入口及び流出口を有する水溶液供給導管であり、流入口が水溶液容器に接続可能である、前記水溶液供給導管；
―少なくとも一つの流入口及び流出口を有するスタティックミキサーであり、少なくとも一つの流入口が、前記細胞懸濁液供給導管の流出口、及び前記水溶液供給導管の流出口と液体連通している、前記スタティックミキサー；
―加熱される細胞懸濁液の流入口及び加熱された細胞懸濁液の流出口を有する第１熱交換器であって、流入口が、前記スタティックミキサーの流出口と液体連通している、前記第１熱交換器；
―冷却される細胞懸濁液の流入口及び冷却された細胞懸濁液の流出口を有する第２熱交換器であって、流入口が、前記第１熱交換器の流出口と液体連通している、前記第２熱交換器；
―入口と出口とを有する排出導管であって、流入口が、前記第2熱交換器の流出口と液体連通しており、流出口がタンパク質懸濁容器、又はタンパク質懸濁処理システムに接続可能である、前記排出導管：
を備える。

前記システムは、上記に開示された方法を実行するのに適している。スタティックミキサーは、溶解温度への細胞懸濁液の素早い加熱を提供し、抽出対象のタンパク質の回収率の増加を可能にする。当該技術分野において慣用的であるように、スタティックミキサーは、一連の固定ブレード、典型的にはヘリカルブレード、又はバー、典型的には噛み合い及び／又は連結バーの格子を備えるパイプであり得る。スタティックミキサーは、一つの流入口を有し得、前記流入口が細胞懸濁液供給導管の流出口、及び水溶液供給導管の流出口の両方と液体連通する、又は、二つの流入口を有し得、前記流入口のうち一つが、細胞懸濁液供給導管の流出口と液体連通して、その他が水溶液供給導管の流出口と液体連通している。

第１熱交換器及び第２熱交換器は、独立して、チューブ式熱交換器、プレート式熱交換器、又は被覆物もしくは容器に囲まれている導管であってもよい。

前記システムは、第１熱交換器の流出口及び第２熱交換器の流入口の間の液体連通を提供する保持導管をさらに含み得、前記保持導管は、好ましくは被覆物又は容器によって、又は
断熱材によって、又は電気加熱ブランケットなどの加熱ブランケットによって囲まれている。保持ユニットは、一定時間細胞懸濁液の温度を第１熱交換器によって達成される温度として、実質的に維持する機会を提供する。保持ユニットでの滞留時間は、１秒～２０分の範囲、又は１０秒～２０分の範囲、好ましくは、１秒～１０分の範囲、又は１０秒～１０分の範囲、より好ましくは、１秒～５分の範囲、又は１０秒～５分の範囲であり得る。一般的な慣行として、所望の滞留時間は、細胞懸濁液の流速に関連する保持ユニットに適した体積の選択、もしくはその逆によって得ることができる。

細胞懸濁液供給導管は、細胞懸濁液を細胞懸濁液供給導管の流出口に向かって送るポンプを含み得る。水溶液供給導管は、水溶液を水溶液供給導管の流出口に向かって送るポンプを含み得る。これらのポンプの一方または両方は、蠕動ポンプなどの容積型ポンプであってもよい。

前記システムは、熱媒体を第１熱交換器、及び／又は保持ユニットの被覆物もしくは容器に提供する、少なくとも一つの加熱ユニットをさらに含み得る。

前記システムは、本明細書の他の箇所に開示されている温度、及び／又は流れで動作するように適合され得る。スタティックミキサー、第１熱交換器、保持ユニット及び第２熱交換器、並びにそれらを接続する導管を通る流れは、パイプ及び装置内での、例えば細胞片又はタンパク質の停滞を低減させるように、乱流であることが好ましい。

図１は、本発明に記載されるシステムの略図である。

図２は、実施例３のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

図３は、実施例４のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

図1は、細胞質又はペリプラズムタンパク質を抽出するシステム100を示す。システム100は、細胞懸濁液供給導管102および水溶液供給導管104を備え、これらは両方ともスタティックミキサー106に接続されている。システム100は第１熱交換器108、保持ユニット110及び第２熱交換器112をさらに含み、それらが直列に接続されている。スタティックミキサー106は第１熱交換器108と接続されている。前記システムは、排出導管114をさらに含む。第２熱交換器112は排出導管114と接続されている。

細胞懸濁液供給導管102は細胞懸濁容器120と接続され、蠕動ポンプ122を備える。水溶液供給導管104は水溶液容器124と接続され、蠕動ポンプ126を備える。排出導管114はタンパク質懸濁容器128と接続される。保持ユニット110は、被覆物130を備えている。

システムの動作中、細胞懸濁液容器120は室温で第1細胞懸濁液を提供し、一方、水溶液容器124は９５°Cで緩衝溶液を提供する。ポンプ122、126は第１細胞懸濁液及び緩衝溶液を容器120、124からスタティックミキサー106に送り、細胞懸濁液及び水溶液は１／５の比で混合され、結果として約７０°Cの第２細胞懸濁液になる。第２細胞懸濁液は、第１熱交換器108に渡され、第２細胞懸濁液の温度は７５°Cに上げられる。第２細胞懸濁液は、第１熱交換器108から、保持ユニット110を経由して第２熱交換器112に渡され、第２細胞懸濁液の温度は２５°Cに下げられる。第２細胞懸濁液は保持ユニット110中で５分の滞留時間を有する。第２細胞懸濁液は、第２熱交換器112から、排出導管114を経てタンパク質懸濁容器128に渡され、さらなる処理を施すためにそこから収集してもよい。

システム100は、加熱ユニット140をさらに含む。加熱ユニットには、導管142を経由して水道水が提供される。加熱ユニット140は、水道水を加熱して、第１熱交換器108及び被覆物130に、それぞれ導管144及び146を経由して熱媒体を提供する。熱媒体は、それぞれ導管148及び150を経由して加熱ユニット140に戻される。導管142内の水道水はまた、第2熱交換器112に冷媒体を提供する。冷媒体は、導管152を経由して排出される。

実施例１、ＢＰＥＰ０１の熱誘導抽出
本実施例における記載は、Ｚ変異体（Ｚ０１）の２つのコピー及び連鎖球菌プロテインＧのＧＡ３由来のアルブミン結合ドメインを含む、ＢＰＥＰ０１と呼ばれる約１９ｋＤａポリペプチドの2つの反復生産バッチの培養、スタティックミキサーの使用を含む熱誘導抽出、及びその後の分析を指す。発酵槽を用いた加熱処理との比較が含まれる。

材料と方法

培養：培養の規模は、６Ｌ又は２０Ｌのいずれかであった。E.coli T7E3細胞（GeneBridge）を、産物の遺伝子断片を含むプラスミドで形質転換した。リサーチセルバンク（ＲＣＢ）は、５０ｍｇ/ｌカナマイシンを含むベジトンＬＢ培地(Sigma-Aldrich)を用いて作製した。培養物がＯＤ６００＝０．９４に達した時点で、グリセロールを終濃度１５％となるように添加し、培養物をバイアル(１ｍｌ／バイアル)に小分けし、-80°Ｃで凍結した。

振盪フラスコ培地(6.7ｇ／ｌ酵母ニトロゲンベース（Becton Dickinson）、5.5ｇ／ｌグルコース一水和物、７ｇ／ｌリン酸一水素二カリウム、１ｇ／lクエン酸三ナトリウム二水和物、50mg/mlカナマイシン)に、解凍したＲＣＢバイアル200μｌ／ｌを接種した。ＯＤ６００＞４に３０°Ｃで培養後、培地を含む発酵槽(硫酸アンモニウム3.75ｇ／ｌ、リン酸一水素二カリウム3.3ｇ／ｌ、リン酸二水素一カリウム4.95ｇ／ｌ、クエン酸三ナトリウム二水和物1.88ｇ／ｌ、消泡剤204(Sigma-Aldrich)１ｍｌ／ｌ、硫酸マグネシウム6.1ｍｏｌ／ｌ、カナマイシン50ｍｇ／ｌ、グルコース1.2ｇ／ｌ、塩化鉄(III)六水和物74ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛24ｍｇ／ｌ七水和物、硫酸銅(II)五水和物４ｍｇ／ｌ硫酸マンガン(II)一水和物16ｍｇ／ｌ、塩化カルシウム二水和物10ｍｇ／ｌ)を０．０５-０．１のＯＤ６００で振盪フラスコ培地に接種した。培養は一般的に３７°Ｃで攪拌及び過圧下(０．５バール以下)で実施し、溶存酸素レベルを３０％以上に制御した。ｐＨは、ｐＨ＝７に制御し、そして接種後3時間後にグルコース供給を開始した。１７．５時間後に３３°Ｃまで降温し、そしてタンパク質発現誘導を行うために、１８時間後に０．６ｍＭのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えた。培養は２７～３０時間後に停止した。

細胞濃縮：培養物を遠心分離又は接線流濾過のいずれかによって採取した。９，８００×ｇで２３°Ｃで１５分間遠心分離を行い、上清を捨てた。大規模な分離装置を反映するために、細胞ペレットを再懸濁し、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を使用して約７００ｇ／ｋｇの細胞スラリーを得た。再生セルロース（P2C01MV05, Merck-Millipore）の２×０．５ｍ² １０００ｋＤａフィルターで接線流濾過を行い、そこで培養物を3分の1まで濃縮し、続いて3つのダイアフィルトレーション容積の50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０によるダイアフィルトレーションを行った。

スタティックミキサーシステムを使用した熱誘導抽出：１０ｍＭリン酸ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７（熱処理中にｐＨ６．５になると予想される）、[放熱バッファー１]、をマルチ発酵システムの培地調製タンク（System Greta, Belach Bioteknik）で９１～９５°Cに加熱した。２つの別々の熱処理ランにおいて、ペリスタルティックポンプを使用して、23°Ｃの細胞濃縮物(それぞれ、～1.6L及び～4.3L)及び加熱された放熱バッファー１を、それぞれ30ｍｌ／分及び137ｍｌ／分の流量でスタティックミキサー（PMS3、ESSKA.se Industriteknik）に導き、それぞれ結果として細胞濃縮物を5.6倍に希釈した。混合後、細胞懸濁液を、７６～７８°Ｃに設定した水浴に入れた保持ユニット(Pumpsil（登録商標） 6.4 × 1.6 mm tubing with a volume of 56 cm³, Watson Marlow)に導いた。結果として生じる装置は、細胞懸濁液の約76°C(動作温度)での加熱を20秒の保持時間と共にもたらした。加熱及び保持後、細胞懸濁液を、氷水の入ったバケツに入れた冷却コイル(S30、Bryggbolaget)に導いた。氷を、熱処理された細胞懸濁液中の温度を～25°Cに保つために水に繰り返し加えた。

発酵槽を使用した熱誘導抽出：細胞濃縮物を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０と混合し、続いて終濃度２ｍＭとなるようにＥＤＴＡを添加し、０．５Ｍリン酸水素二ナトリウムを用いてｐＨ６．５にｐＨ調整し、結果として細胞濃縮物を3.8倍希釈した。細胞懸濁液の加熱は、被覆物付き発酵槽ＢＲ２０の加熱システム（Belach Bioteknik）を使用して、７６°Ｃ、３分で行った。加熱、保持、及び２５°Ｃまで冷却する時間の合計は約１時間で、２００Ｌ発酵槽での大規模熱処理をシミュレートした。

タンパク質分析：定量は、少量分画の小規模アフィニティークロマトグラフィー精製、続いて精製溶出液のＡｂｓ２８０測定によってなされた。

結果

スタティックミキサーシステムを用いた熱処理細胞懸濁液における生成物の定量は、２つの代表的なランにおいて平均１００％の回収率を示した。比較として、発酵槽熱処理手順の使用は、８７％の回収率をもたらした。スタティックミキサーを用いて結果として得られた工程改善効果は、生成物の回収率の点で、１５％であった。

実施例２、ＢＰＥＰ０２の熱誘導抽出
本実施例における記載は、２つの異なるＺ変異体（Ｚ０２ａ及びＺ０２ｂ）及び連鎖球菌プロテインＧのＧＡ３由来のアルブミン結合ドメインを含む、ＢＰＥＰ０２と呼ばれる約１９ｋＤａポリペプチドの培養、スタティックミキサーの使用を含む熱誘導抽出、及びその後の分析を指す。発酵槽を用いた加熱処理との比較が含まれる。

材料と方法

培養：培養の規模は、２Ｌ又は２０Ｌのいずれかであった。培養は、ＲＣＢ調製時の最終的なＯＤ６００を０．８０とし、培養の１７．５時間後に温度を３１°Ｃまで下げた以外は、基本的に実施例１に記載の通りに行った。

細胞濃縮：培養物を遠心分離又は接線流ろ過により回収した。１５，９００×ｇで４°Ｃで２５分間遠心分離を行い、上清を捨てた。再生セルロース（P2C01MV05、Merck-Millipore）の２×０．５ｍ² １０００ｋＤａフィルターで接線流ろ過を行い、そこで培養物を３分の１まで濃縮し、続いて３つのダイアフィルトレーション容積の１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８によるダイアフィルトレーションを行った。

スタティックミキサーシステムを使用した熱誘導抽出：細胞を熱処理する前に、凍結した。２５ｍＭリン酸ナトリウム、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８（熱処理中にｐＨ７．３になると予想される）、[放熱バッファー２]、をマルチ発酵システムの培地調製タンク（System Greta, Belach Bioteknik）で９１～９５°Cに加熱した。２つのペリスタルティックポンプを使用して、23°Ｃの細胞濃縮物(～６Ｌ)及び加熱された放熱バッファー２を、それぞれ２５ｍｌ／分及び１４２ｍｌ／分の流量でスタティックミキサー（PMS3、ESSKA.se Industriteknik）に導き、それぞれ結果として細胞濃縮物を６．７倍に希釈した。混合後、細胞懸濁液を、７６°Ｃに設定した水浴に入れた保持ユニット(S30, Bryggbolaget, 推定体積500 cm³)に導いた。結果として生じる装置は、細胞懸濁液の約76°C(動作温度)での３分間の加熱をもたらした。加熱後、細胞懸濁液を、氷水の入ったバケツに入れた冷却コイル(S30、Bryggbolaget)に導いた。氷を、熱処理された細胞懸濁液中の温度を～25°Cに保つために水に繰り返し加えた。

発酵槽を使用した熱誘導抽出：細胞を熱処理する前に、凍結した。細胞濃縮物を１７９ｍＭリン酸、１１ｍＭクエン酸緩衝液と混合し、続いて終濃度２ｍＭとなるようにＥＤＴＡを添加し、結果として細胞濃縮物を５倍希釈した。結果として得られた細胞懸濁液のｐＨは、７．３であった。細胞懸濁液の加熱は、発酵槽ＢＲ２０の加熱システム（Belach Bioteknik）を使用して、７６°Ｃ、３分で行った。加熱、保持、及び２５°Ｃまで冷却する時間の合計は７５分であった。

結果

スタティックミキサーシステムを用いた熱処理細胞懸濁液における生成物の定量は、６９％の回収率を示した。比較として、発酵槽熱処理手順を用いると、回収率は４６％であった。スタティックミキサーを用いて結果として得られた工程改善効果は、生成物の回収率の点で、５０％であった。

実施例３、ＢＰＥＰ０３の熱誘導抽出
本実施例における記載は、Ｚ変異体（Ｚ０３）の２つのコピー及び連鎖球菌プロテインＧのＧＡ３由来のアルブミン結合ドメインを含む、ＢＰＥＰ０３と呼ばれる約１９ｋＤａポリペプチドの培養、スタティックミキサーの使用を含む熱誘導抽出、及びその後の分析を指す。発酵槽を用いた加熱処理との比較が含まれる。

材料と方法

培養：培養の規模は、１Ｌであった。培養の１７．５時間後に温度を３１°Ｃまで下げた以外は、基本的に実施例１に記載の通りに培養を行った。

細胞濃縮：培養物を遠心分離により回収した。９，８００×ｇで２３°Ｃで１５分間遠心分離を行い、上清を捨てた。大規模な分離装置を反映するために、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中で細胞ペレットを再懸濁し、～７００ｇ／ｋｇの細胞スラリーを得た

スタティックミキサーシステムを使用した熱誘導抽出：２５ｍＭリン酸、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．５、[放熱バッファー３]、をマルチ発酵システムの培地調製タンク（System Greta, Belach Bioteknik）で９１～９５°Cに加熱した。２つのペリスタルティックポンプを使用して、23°Ｃの細胞濃縮物(～０．１５Ｌ)及び加熱された放熱バッファー３を、それぞれ２５ｍｌ／分及び１１４ｍｌ／分の流量で、スタティックミキサー（PMS3、ESSKA.se Industriteknik）に導き、それぞれ結果として細胞濃縮物を５．６倍に希釈した。混合後、細胞懸濁液を、７７．６°Ｃに設定した水浴に入れた保持ユニット(S30、Matrevolution、417mlの保持体積が推定される)に導いた。結果として生じる装置は、細胞懸濁液の7５°C、ｐＨ～７．４での瞬間加熱を、３分間の保持時間と共にもたらした。前記懸濁液の動作温度での加熱及び保持後、細胞懸濁液を、氷水の入ったバケツに入れた冷却コイル(S30、Bryggbolaget)に導いた。氷を、熱処理された細胞懸濁液中の温度を～25°Cに保つために水に繰り返し加えた。

発酵槽を使用した熱誘導抽出：細胞濃縮物を２５ｍＭリン酸、２ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．５と混合し、上記のセクションでスタティックミキサー手順について記載したのと同じ割合の細胞濃縮物および緩衝液を得た。細胞懸濁液の加熱は、発酵槽ＢＲ２０の加熱システム（Belach Bioteknik）を用いた＞２００Ｌの発酵槽における大規模加熱処理をシミュレートして行われた。したがって、発酵槽内に加熱プロファイルを設定し、２５°Ｃ～７５°Ｃまでの加熱を約５０分間行うように設定し、続いて７５°Ｃで３分間保持工程を行い、そして最後に２５°Ｃで３０分間冷却を行った。加熱、保持、及び冷却時間の合計は約８３分であった。

タンパク質分析：定量は、少量分画の小規模アフィニティークロマトグラフィー精製、続いて精製溶出液のＡｂｓ２８０測定によってなされた。さらに、生成物関連の不純物、例えば二量体化及び分解などを評価するために、精製分画のＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を行った。

結果

スタティックミキサーによる熱処理からの熱処理細胞懸濁液中の生成物の定量は７１％の回収率を示し、一方で発酵槽での熱処理は３３％の回収率をもたらした。したがって、スタティックミキサーを用いて結果として得られた工程改善効果は、生成物の回収率の点で、１１５％であった。

比較中、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析で示されたように、スタティックミキサー熱処理サンプルについて発酵槽熱処理と比較して、品質の面でも大きな利点が検出された。図２は、スタティックミキサーによる熱処理(レーン２)および発酵槽での熱処理(レーン３)後のＢＰＥＰ０３を含むアフィニティー精製ライセートのＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示し、それぞれ８μｇでゲル上にロードした。Novex（特定商標）Sharp Protein Standard（Ｍｗ：260、160、110、80、60、50、40、30、20、15、10、3.5ｋＤａ）をレーン1にロードした。発酵槽での熱処理サンプルは、より多くの分解及び二量体化の両方を示した。スタティックミキサーを使用する場合の回収率の向上及び良好なサンプルプロファイルに加えて、熱処理にスタティックミキサーを使用するプロセスは、発酵槽ベースの熱処理では実現不可能な工業生産を可能にする。

実施例４、ＢＰＥＰ０４の熱誘導抽出
本実施例における記載は、連鎖球菌プロテインＧの２つのアルブミン結合ドメイン、ＧＡ２及びＧＡ３、並びにＣ末端システイン残基を含む、ＢＰＥＰ０４と呼ばれる約１４ｋＤａアルブミン結合タンパク質の培養、スタティックミキサーの使用を含む熱誘導抽出、及びその後の分析を指す。発酵槽を用いた加熱処理との比較が含まれる。

材料と方法

培養(１Ｌ規模)、ラボスケールスタティックミキサーシステム、及び発酵槽を用いた熱誘導抽出、並びにタンパク質分析は、基本的に実施例3に記載の通りに実施した。

結果

スタティックミキサーによる熱処理、又は発酵槽での熱処理からの熱処理細胞懸濁液中の生成物の定量は、いずれも１００％の回収率を示した。しかしながら前記比較は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析に示されたように、発酵槽熱処理サンプルと比較して、スタティックミキサー熱処理サンプルの品質の点で、利点を示した。図３は、スタティックミキサーによる熱処理(レーン２)および発酵槽での熱処理(レーン３)後のＢＰＥＰ０４を含むアフィニティー精製ライセートのＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析を示し、それぞれ、８μｇでゲルにロードした。Novex（特定商標）Sharp Protein Standardをレーン1にロードした。発酵槽での熱処理サンプルは、より多くの分解、及び多量体形態(二量体、三量体、及び四量体)のより高い画分の両方を示す。

実施例５、ＢＰＥＰ０５の熱誘導抽出
本実施例における記載は、Ｚ変異体（Ｚ０４）の1つのコピー及びＣ末端システイン残基を含む、ＢＰＥＰ０５と呼ばれる約６．７ｋＤａポリペプチドの培養、スタティックミキサーの使用を含む熱誘導抽出、及びその後の分析を指す。発酵槽を用いた加熱処理との比較が含まれる。

材料と方法

培養（１Ｌスケール）、及びスタティックミキサーシステム並びに発酵槽を用いた熱誘起抽出はそれぞれ、ＲＣＢを設ける代わりに、振とうフラスコスターター培地に、ＴＳＢ＋ＹＥ培地の流れる培地を接種し、３０°Ｃで５時間インキュベートした以外は、基本的に実施例３に記載のとおりに行った。生成物の定量は、超高速液体クロマトグラフィー質量分析（ＵＰＬＣ-ＭＳ）により行った。

結果

スタティックミキサー及び発酵槽による熱処理からの熱処理細胞懸濁液中の生成物のＵＰＬＣ-ＭＳ定量は、それぞれ、発酵槽での熱処理と比較してスタティックミキサーを使用した場合に、４３％良好な回収率を示した。

実施例６、ＢＰＥＰ０１の大規模放熱
大規模工程における、本発明に記載の熱処理を用いたＢＰＥＰ０１の製造を実証した。培養および回収は、基本的に実施例１に記載の通りに実施したが、１００Ｌ培養スケールで、細胞濃縮のためにディスクスタック遠心分離機（GEA Westfalia）を用いて実施した。熱処理は、実施例1と同じ割合の細胞懸濁液と[放熱バッファー1]と共にスタティックミキサー中で行い、そして保持部容積１３．６Ｌ、及び総流量６．８Ｌ／分であるＳ１７５と表記した熱処理システムを用いて、動作温度７６±１°Ｃで２分間の保持時間を与えた。大規模ランからの回収率は１００％であり、実施例1に記載の小規模ランで得られた回収率とよく対応した。したがって、本実験の結果により、スケーラビリティと産業上利用可能性を確認した。

実施例７、ＢＰＥＰ０２の大規模放熱
３つのバッチは、そのうちの２つはＧＭＰ（Good Manufacturing Practice）の下で行われ、ＢＰＥＰ０２の製造のための、大規模工程における、本発明に記載の熱処理を用いて正常に実行された。栽培および回収は、基本的に実施例２に記載したように、３００Ｌ栽培スケールで実施した。熱処理は、実施例２と同じ割合の細胞懸濁液と[放熱バッファー２]と共にスタティックミキサー中で行い、そして保持部容積２６Ｌ、及び総流量８．６７Ｌ／分であるＳ１６３と表記した熱処理システムを用いて、動作温度８０～８４°Ｃで３分間の保持時間を与えた。３つの大規模ランからの回収率は７３～８５％であり、実施例２に記載の小規模ランで得られた回収率とよく対応した。したがって、本実験の結果により、スケーラビリティと産業上利用可能性を確認した。

Claims

細胞質又はペリプラズムタンパク質の抽出方法であり、
―細胞を含む第1細胞懸濁液を提供するステップであり、前記細胞が抽出対象の細胞質またはペリプラズムタンパク質を含み、前記第1細胞懸濁液が第1温度を有している前記ステップ、及び、
―前記第1細胞懸濁液を動作温度で加熱するステップであり、前記動作温度において、前記細胞の少なくとも一分画が熱誘導溶解の対象になり、及び抽出対象の細胞質またはペリプラズムタンパク質の少なくとも一分画が不可逆的変性の対象にならない前記ステップ：
を含む方法であり、前記第1細胞懸濁液の加熱が、
―水溶液を提供するステップであり、前記水溶液が、前記第1温度よりも高い第2温度を有する前記ステップ、及び、
―第1細胞懸濁液と水溶液とを混合して、それにより第2細胞懸濁液を得るステップであり、前記第2細胞懸濁液が第1温度よりも高い第3温度を有する前記ステップであって、
―前記第１温度が、０～３７℃の範囲であり；及び／又は、
―前記動作温度が、５０～９０℃の範囲であり；及び／又は、
―前記第２温度が、１１０℃以下であり；及び／又は、
―前記第３温度が、５０～９０℃の範囲である、
前記ステップ：
を含み、前記細胞が大腸菌（E.coli）細胞である、前記方法。
前記第１細胞懸濁液を加熱するステップが、
―前記第２細胞懸濁液を、前記第３温度から前記動作温度まで加熱するステップ：
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記第３温度が前記動作温度よりも１０°Ｃ以下低い、請求項１又は２に記載の方法。
前記第３温度が前記動作温度よりも５°Ｃ以下低い、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
前記第３温度が、前記動作温度である、請求項１に記載の方法。
―第2細胞懸濁液を、前記動作温度で、１秒～２０分の範囲の期間にわたって、維持するステップ：
をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
―第2細胞懸濁液を、前記動作温度から第４温度まで冷却するステップであり、前記第４温度が、抽出対象の、可逆的に変性した細胞質またはペリプラズムタンパク質の少なくとも一分画が、再生の対象になる温度である前記ステップ
をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
―抽出対象の細胞質またはペリプラズムタンパク質を細胞破片、及び／又は天然宿主細胞由来タンパク質から分離するステップ
をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記第４温度が、２～３７°Cの範囲である、請求項７又は８に記載の方法。
前記第1温度、及び前記第４温度の両方よりも高い温度における滞留時間が、２０分以下である、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
前記抽出対象の細胞質またはペリプラズムタンパク質が、細菌性受容体タンパク質の３ヘリックスバンドルタンパク質ドメイン、又はそれらの変異体を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
前記第1細胞懸濁液と前記水溶液との混合が、スタティックミキサー中または撹拌容器中で行われる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法を実施するための細胞質又はペリプラズムタンパク質の抽出システムであり、
―流入口及び流出口を有する細胞懸濁液供給導管であり、前記細胞懸濁液供給導管の流入口が細胞懸濁液容器に接続可能である、前記細胞懸濁液供給導管；
―流入口及び流出口を有する水溶液供給導管であり、前記水溶液供給導管の流入口が水溶液容器に接続可能である、前記水溶液供給導管；
―少なくとも一つの流入口及び流出口を有するスタティックミキサーであり、前記スタティックミキサーの少なくとも一つの流入口が、前記細胞懸濁液供給導管の流出口、及び前記水溶液供給導管の流出口と液体連通している、前記スタティックミキサー；
―加熱される細胞懸濁液の流入口及び加熱された細胞懸濁液の流出口を有する第１熱交換器であって、前記第１熱交換器の流入口が、前記スタティックミキサーの流出口と液体連通している、前記第１熱交換器；
―冷却される細胞懸濁液の流入口及び冷却された細胞懸濁液の流出口を有する第２熱交換器であって、前記第２熱交換器の流入口が、前記第１熱交換器の流出口と液体連通している、前記第２熱交換器；
―入口と出口とを有する排出導管であって、流入口が、前記第2熱交換器の流出口と液体連通しており、流出口がタンパク質懸濁容器、又はタンパク質懸濁処理システムに接続可能である、前記排出導管：
を備えたシステム。
第1熱交換器の流出口と第2熱交換器の流入口との間に液体連通を提供する保持導管をさらに含む、請求項１３に記載のシステム。
前記保持導管が、被覆物若しくは容器によって、又は断熱材によって、又は加熱ブランケットによって囲まれる、請求項１４に記載のシステム。