JP7828586B2 - 核酸抽出容器および核酸抽出方法 - Google Patents

核酸抽出容器および核酸抽出方法

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Description

本発明は、核酸抽出容器および核酸抽出方法に関する。
遺伝子検査は、各種医学分野における検査、農作物や病原性微生物の同定、食品の安全性評価、さらには病原性ウイルスや各種感染症の検査にも広く活用されている。遺伝子である微小量の核酸を高感度に検出するために、核酸の一部を増幅して得られたものを分析する方法が知られている。中でも、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Polmerase Chain Reaction）は、生体等から採取されたごく微量の核酸のある部分を選択的に増幅する注目の技術である。このＰＣＲを行うためには、生体試料から核酸を抽出する必要がある。
このような遺伝子検査の一例として、水中、土壌中、空気中などの環境中に特定の生物が生息できるかどうかを調べるために、特定の生物由来のＤＮＡ（環境ＤＮＡと称される)の存在の有無をＰＣＲによって分析する技術が知られている（例えば非特許文献１～３参照）。分析にあたって環境ＤＮＡ学会では「環境ＤＮＡ調査実験マニュアル」を作成し、標準法としてこの方法（以下、学会標準法と称する）で定性・定量測定をすることを推奨している（非特許文献４参照）。学会標準法では、河川や海の水をビーカー等で汲み取ってフィルタリングした後、ＤＮＡを抽出している。
Hideyuki Doi et.al, Freshwater Biology (2017) 62, 30-39 PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0149786 March 2, 2016 PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0142008 November 4, 2015 "環境ＤＮＡ調査・実験マニュアル(ver2.1)"、一般社団法人環境ＤＮＡ学会、インターネット＜URL: http://ednasociety.org/eDNA_manual_ver2_1_3.pdf>
学会標準法は、比較的確実に測定結果を得ることができ、効率（環境からＰＣＲ等の増幅にかける事のできる状態までＤＮＡを取り出す割合）の高い方法と考えられる。しかしながら、この方法では、試料からＤＮＡの抽出までの手順が多く時間がかかること、抽出にスキルが必要であり、作業者による測定結果のバラツキが大きいこと、抽出に必要な部材や機材、試薬が多く高価であること等の問題がある。これらの問題は、環境ＤＮＡに限らず、微生物やウイルスの同定のための核酸の抽出においても見られる。
本発明はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的の一つは、試料からの核酸の抽出を簡単、短時間かつ低コストで行うことができる技術の提供にある。
本発明のある態様は核酸抽出容器である。この核酸抽出容器は、試料から核酸を含む生物由来物質を捕集する親水性のフィルタと、フィルタ上に生物由来物質を捕集する生物由来物質捕集領域と、フィルタを透過した試料が通過する試料透過領域とを備えるフィルタ部と、
生物由来物質捕集領域と連通する試料注入口と、
生物由来物質捕集領域と連通する空気連通口と、
試料透過領域と連通する試料排出口と、
を備え、
空気連通口は外部に対して開閉可能なように構成されている。
本発明の他の態様は、核酸抽出方法である。この核酸抽出方法は、
親水性のフィルタを備えるフィルタ部に試料を通過させ、フィルタ上に核酸を含む生物由来物質を捕集する工程と、
フィルタ部に核酸抽出液を入れ、核酸をフィルタ上で抽出する工程と、
フィルタ上の抽出した核酸を含む溶液をフィルタ部から回収する工程と、
を含む。
本発明のさらに他の態様も、核酸抽出方法である。この核酸抽出方法は、
親水性のフィルタを備えるフィルタ部に試料を通過させ、フィルタ上に核酸を含む生物由来物質を捕集する工程と、
フィルタ部に核酸抽出液を入れ、核酸をフィルタ上で抽出する工程と、
フィルタ上の抽出した核酸を含む溶液を、フィルタ部と連通する流路内へ移動させる工程と、
流路に空気を注入することによって、核酸を含む溶液を分注する工程と、
を含む。
本発明によれば、試料からの核酸の抽出を簡単、短時間かつ低コストで行うことができる。
図１（ａ）および図１（ｂ）は、本発明の第１実施形態にかかる核酸抽出容器を説明するための図である。 図１（ａ）に示す核酸抽出容器のＡ－Ａ断面図である。 図１（ａ）に示す核酸抽出容器のＢ－Ｂ断面図である。 図１（ａ）に示す核酸抽出容器が備える基板の平面図である。 核酸抽出容器の変形例１を説明するための図である。 核酸抽出容器の変形例２を説明するための図である。 フィルタ部を透過する試料の流れを説明するための図である。 核酸抽出液によるフィルタ上での核酸抽出を説明するための図である。 図９（ａ）および図９（ｂ）は、本発明の第２実施形態にかかる核酸抽出容器を説明するための図である。 図９（ａ）に示す核酸抽出容器のＡ－Ａ断面図である。 図９（ａ）に示す核酸抽出容器のＢ－Ｂ断面図である。 図９（ａ）に示す核酸抽出容器のＣ－Ｃ断面図である。 図９（ａ）に示す核酸抽出容器のＤ－Ｄ断面図である。 図９（ａ）に示す核酸抽出容器が備える基板の平面図である。 図１５（ａ）および図１５（ｂ）は、本発明の第３実施形態にかかる核酸抽出容器を説明するための図である。 図１５（ａ）に示す核酸抽出容器のＡ－Ａ断面図である。 図１５（ａ）に示す核酸抽出容器のＥ－Ｅ断面図である。 図１５（ａ）に示す核酸抽出容器が備える基板の平面図である。 第３流路の領域Ｃに核酸を含む溶液がある様子を模式的に示す図である。 図２０（ａ）および図２０（ｂ）は、本発明の第４実施形態にかかる核酸抽出容器を説明するための図である。 図２０（ａ）に示す核酸抽出容器のＡ－Ａ断面図である。 図２０（ａ）に示す核酸抽出容器のＢ－Ｂ断面図である。 図２０（ａ）に示す核酸抽出容器のＣ－Ｃ断面図である。 図２０（ａ）に示す核酸抽出容器のＤ－Ｄ断面図である。 図２０（ａ）に示す核酸抽出容器が備える基板の平面図である。 図２６（ａ）および図２６（ｂ）は、本発明の第５実施形態にかかる核酸抽出容器を説明するための図である。 図２６（ａ）に示す核酸抽出容器のＡ－Ａ断面図である。 図２６（ａ）に示す核酸抽出容器のＢ－Ｂ断面図である。 図２６（ａ）に示す核酸抽出容器のＣ－Ｃ断面図である。 図２６（ａ）に示す核酸抽出容器のＤ－Ｄ断面図である。 図２６（ａ）に示す核酸抽出容器のＥ－Ｅ断面図である。 図２６（ａ）に示す核酸抽出容器のＦ－Ｆ断面図である。 図２６（ａ）に示す核酸抽出容器が備える基板の平面図である。 図３４（ａ）および図３４（ｂ）は、本発明の第５実施形態にかかる核酸抽出容器が備える押え板を説明するための図である。 図３４（ａ）に示す押え板のＪ－Ｊ断面図である。 図３４（ａ）に示す押え板のＨ－Ｈ断面図である。 図３４（ａ）に示す押え板のＧ－Ｇ断面およびＩ－Ｉ断面の図である。 生物由来物質捕集領域の体積が２０μＬのときの抽出液量とＤＮＡ濃度との関係を示すグラフである。
以下、本発明を添付の図面および好適な実施の形態をもとに説明する。実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。
［第１実施形態］
図１（ａ）および図１（ｂ）は、本発明の第１実施形態にかかる核酸抽出容器１０を説明するための図である。図１（ａ）は、核酸抽出容器１０の平面図であり、図１（ｂ）は、核酸抽出容器１０の正面図である。図２は、図１（ａ）に示す核酸抽出容器のＡ－Ａ断面図である。図３は、図１（ａ）に示す核酸抽出容器のＢ－Ｂ断面図である。図４は、図１（ａ）に示す核酸抽出容器が備える基板の平面図である。
核酸抽出容器１０は、下面１２ａおよび上面１２ｂに溝状の第１の流路１４、第２の流路１６、第３の流路１８、および親水性のフィルタ２２を備えるフィルタ部２０が形成された樹脂製の基板１２と、基板１２の下面１２ａ上に貼られた、第１の流路１４の一部および第２の流路１６を封止するための第１封止フィルム２４と、基板１２の上面１２ｂに貼られた２枚の封止フィルム（第２封止フィルム２６および第３封止フィルム２８）とからなる。
基板１２は、温度変化に対して安定で、使用される試料溶液に対して侵されにくい材質から形成されることが好ましい。さらに、基板１２は、成形性がよく、透明性やバリア性が良好で、且つ、低い自家蛍光性を有する材質から形成されることが好ましい。このような材質としては、ガラス等の無機材料をはじめ、ポリプロピレン、アクリル、ポリエステル、シリコーンなどの樹脂、中でもシクロオレフィンポリマー樹脂（ＣＯＰ）が好適である。基板１２の寸法の一例は、長辺７２ｍｍ、短辺２６ｍｍ、厚み４ｍｍである。作業しやすい基板１２のサイズとして、特に長辺は５０～２００ｍｍが好適である。成型性の観点から、厚みは１～４ｍｍが好適である。短辺は成型コストの観点から１０～５０ｍｍが好適である。このような基板は射出成型や注型成型、ＮＣ加工機などによる切削加工によって作製することができる。
第１封止フィルム２４および第２封止フィルム２６は、一方の主面が粘着性を備えていてもよいし、押圧や紫外線などのエネルギー照射、加熱等により粘着性や接着性を発揮する機能層が一方の主面に形成されていてもよく、容易に基板１２の下面１２ａおよび上面１２ｂそれぞれと密着して一体化できる機能を備える。第１封止フィルム２４および第２封止フィルム２６は、粘着剤も含めて低い自家蛍光性を有する材質から形成されることが望ましい。この点でシクロオレフィンポリマー、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレンまたはアクリルなどの樹脂からなる透明フィルムが適しているが、これらに限定されない。また、第１封止フィルム２４および第２封止フィルム２６は、板状のガラスや樹脂から形成されてもよい。この場合はリジッド性が期待できることから、核酸抽出容器１０の反りや変形防止に役立つ。第１封止フィルム２４および第２封止フィルム２６の流路に接する部分はタンパク質の吸着が少ないものであることが好ましい。
基板１２の下面１２ａおよび上面１２ｂには溝状の第１の流路１４、第２の流路１６および第３の流路１８が形成されている。本実施形態に係る核酸抽出容器１０において、第１の流路１４、第２の流路１６および第３の流路１８の大部分は基板１２の下面１２ａおよび上面１２ｂに露出した溝状に形成されている。金型等を用いた射出成形により安価かつ容易に成形できるようにするためである。この溝を封止して流路として活用するために、基板１２の下面１２ａ上に第１封止フィルム２４が、上面１２ｂ上に第２封止フィルム２６が貼られる。第１の流路１４および第２の流路１６の寸法の一例は、幅１．０ｍｍ、深さ１．０ｍｍである。第３の流路１８の寸法の一例は幅０．６ｍｍ、深さ０．６ｍｍである。第３の流路の全体積減らす観点から、第３の流路１８の平均断面積は第１の流路１４の平均断面積より小さいことが好ましい。これによって、フィルタリング時に第１の流路１４に圧力が掛かり、試料が第３の流路１８に入り込むのを減らことができ、抽出液の回収時に第３の流路１８に抽出液が残るのを防ぐことができる。
第１の流路１４は試料注入口３０とフィルタ部２０の生物由来物質捕集領域２０ａとを連通している。試料注入口３０は、基板１２の上面１２ｂに露出するように形成されている。試料注入口３０はシリンジとの勘合を良くするように形成されていてもよい。例えば円柱状の筒を基板１２から延ばすことができる。また、試料を入れたシリンジを安定して固定できるように、試料注入口３０をルアーロック式でシリンジと連結できるように形成してもよい。
試料は、試料注入口３０から第１の流路１４に導入される。第１の流路１４中にフィルタ２２よりも孔径の大きい異物除去用のプレフィルタを設けてもよい。
円形のフィルタ部２０が、基板１２の上面１２ｂ上に露出するように形成されている。フィルタ部２０は、第２封止フィルム２６によって封止されている。フィルタ部２０には、円形の親水性のフィルタ２２が設置されている。核酸抽出の際に、フィルタ２２上の試料の有無が外部から視認できるようにするフィルタ部を形成するのが好ましく、例えば、第２封止フィルム２６として透明なフィルムを採用することができる。図２に示すように、フィルタ部２０は、フィルタ２２上に核酸を含む生物由来物質を捕集する生物由来物質捕集領域２０ａと、フィルタ２２を透過した試料が通過する試料透過領域２０ｂとを備える。ここで、試料透過領域２０ｂにおいてフィルタ２２が親水性の物質に近接していると、生物由来物質をフィルタ２２で捕集後空気を注入して試料を流路から排出する際にフィルタ２２とこの物質の間に水が残りやすく、水が残ると核酸抽出の際に核酸抽出液がフィルタ２２を透過しやすくなる。したがって、試料透過領域２０ｂにおいてフィルタ２２は親水性の物質に近接していないことが望ましい。
フィルタ２２は親水性である。そのようなフィルタの材料としては、例えばポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、グラスファイバー、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエステル、セルロース等が挙げられ、中でもタンパク質が吸着しにくいＰＶＤＦやＰＥＳが好適である。フィルタ２２の孔径は、捕集する生物由来物質に応じて適宜選択することができる。例えばフィルタ２２の孔径１μｍ以下である。
ここで、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの誘導体を含むものとする。また、生物由来物質は、生物の生体を構成する物質の他、細菌等の微生物およびウイルスを含むものとする。
生物由来物質捕集領域２０ａにおいて、フィルタ２２はＯリング３２によって固定されている。フィルタの寸法の一例は直径４ｍｍであり、Ｏリング３２の寸法の一例は外径４ｍｍ、内径２ｍｍである。図２に示すように、第１の流路１４から試料をフィルタ２２上に送り、第３の流路１８から核酸抽出液をフィルタ２２上に送るために、Ｏリング３２には切り欠き３２ａおよび３２ｂが形成されている。第１の流路側の切り欠き３２ａはＯリング３２の上側に形成されているが、Ｏリング３２の下側に切り欠き３２ａが形成されていてもよい。第３の流路側の切り欠き３２ｂはＯリング３２の下側に形成されている。これは、フィルタ２２上の核酸抽出液をすべて回収できるようにするためである。
フィルタ２２を通過した液体が試料透過領域２０ｂを通過し、第２の流路を通って試料排出口３４から排出されるように、第２の流路１６は、試料排出口３４と試料透過領域２０ｂとを連通している。図２に示すように、本実施形態では、試料排出口３４は基板１２の上面１２ｂ上に露出するように形成されているが、下面１２ａ上に露出するように形成されていてもよい。
第３の流路１８は、空気連通口３６とフィルタ部２０の生物由来物質捕集領域２０ａとを連通している。空気連通口３６は、基板１２の上面１２ｂに露出するように形成されている。図１（ａ）に示すように、空気連通口３６には、第３封止フィルム２８が貼られている。第３封止フィルム２８は、空気連通口３６を封止可能なサイズのものが用いられる。試料を試料注入口３０から第１の流路を介してフィルタ２２に透過させる際には、第３封止フィルム２８によって空気連通口３６は閉じられており、試料が第３の流路に入らないようにする。フィルタ２２上に捕集された生物由来物質を核酸抽出液によって抽出する際には、第３封止フィルム２８を剥がし、空気連通口３６を開ける。このように空気連通口を外部に対して開閉可能なように構成することによって、フィルタ２２上で核酸の抽出が可能となる。本実施形態では、空気連通口３６の開閉は第３封止フィルムによって行われるが、その他にも、樹脂や金属の栓を差し込む方法等によって開閉を行うことができる。
核酸抽出液は、試料注入口３０および空気連通口３６のいずれか一方からフィルタ部２０の生物由来物質捕集領域２０ａに、例えばピペッターを用いて導入することができる。核酸抽出液の量は、フィルタ２２の表面すべてと接触できる量であればよいし、一部に接して抽出液を動かすことで表面すべてと接触できる量であればよい。フィルタ２２の表面と接触させた抽出液は、例えばピペッターを用いて空気連通口３６および試料注入口３０のいずれか一方から回収することができる。空気連通口３６は、ピペッターの先端と嵌合するように構成されていてもよい。
図１（ａ）に示すように、第１の流路１４および第３の流路１８は、生物由来物質捕集領域２０ａを挟んで互いに反対側に延びていることが好ましく、フィルタ部２０と連通する第１の流路１４と第３の流路１８が直線上にあることがより好ましい。これによって、試料をフィルタ２２に通過させた後、試料が第１の流路１４およびフィルタ部２０に残らないようにすることができる。
核酸抽出容器１０においては、すべての流路が直線状に形成されているが、流路の形態はこれに限定されない。例えば、流路は、曲線部と直線部とを組み合わせたいわゆる連続的に折り返す蛇行状に形成されてもよいし、途中で幅が広がってもよい。フィルタ部２０を直列に複数個並べてもよい。これによって、基板１２上でフィルタ部２０が占める面積を増やすことができ、より多くの生物由来物質を捕集することができる。
（変形例１）
次に、第１実施形態にかかる核酸抽出容器の変形例について説明する。図５は核酸抽出容器の変形例１を説明するための図である。図５に示す核酸抽出容器５０は、基板１２の上面１２ｂ上に核酸抽出液注入口５２がさらに設けられており、核酸抽出液注入口５２と連通する第１の分岐流路５４が第３の流路１８に接続されている点が、図１（ａ）に示す核酸抽出容器１０と異なる。なお、第１の分岐流路５４は第１の流路１４に接続されていてもよい。
（変形例２）
図６は核酸抽出容器の変形例２を説明するための図である。図６に示す核酸抽出容器６０は、基板１２の上面１２ｂ上に核酸抽出液取出口６２がさらに設けられており、核酸抽出液取出口６２と連通する第２の分岐流路６４が第３の流路１８に接続されている点が、図１（ａ）に示す核酸抽出容器１０と異なる。なお、第２の分岐流路６４は第１の流路１４に接続されていてもよい。
（変形例３）
実施の形態では、上述の変形例１および変形例２を組み合わせて、基板１２に、核酸抽出液注入口、核酸抽出液取出口、第１の分岐流路、および第２の分岐流路を設けてもよい。
（変形例４）
実施の形態では、第３の流路および第１の流路のいずれか一方に核酸抽出液を予め封入し、核酸抽出液がある領域からフィルタ部までの間に空気が封入されていてもよい。これによって、核酸抽出の工程をより簡略化することができる。
（変形例５）
実施の形態では、フィルタ部の試料透過領域において、捕集対象物が大きい場合孔径の大きいフィルタを使用してもよい。この場合、核酸抽出液がフィルタを透過するが、試料排出口側から弱い圧力をかけることによって、核酸抽出液がフィルタを透過しないようにすることができる。この時の圧力は湿った親水性フィルタを空気が通らない圧力であればよい。例えば村田製作所製のマイクロブロアポンプ（ＭＺＢ１００１Ｔ０２）を使用し、１ｋＰ程度の圧力を試料排出口からかけることができる。また、試料が基板の下面からフィルタを介して上面へ透過するようにし、フィルタの下側に核酸抽出液を通すように基板に流路およびフィルタ部を形成してもよい。
（変形例６）
実施の形態では、第１の流路、フィルタ部、第２の流路、第３の流路を含む１つのチャネルが１つの基板に形成されている。チャネル当たりのコストを考えると複数のチャネルを１つの基板に作ることが好適である。
次に、以上のように構成された核酸抽出容器１０の使用方法について説明する。まず、試料注入口３０から試料を第１の流路１４へ導入し、フィルタ部２０に試料を透過させる。試料の導入の方法はこれらに限られないが、例えばピペットやスポイト、シリンジ等で該注入口から適量の試料を直接導入してもよい。さらにピペットやスポイト、シリンジ等による試料の吐出、導入後、さらに加圧して押すもしくは試料排出口３４から吸引することによって、フィルタ部まで試料を移動させてもよい。
図７は、フィルタ部を透過する試料の流れを説明するための図である。図８において矢印Ａで示すように、試料は、第１の流路１４からフィルタ部２０へ移動し、フィルタ２２を透過する。この際、フィルタ部２０の生物由来物質捕集領域２０ａにおいて、フィルタ２２上に、核酸を含む生物由来物質が捕集される。フィルタ２２を透過した試料は、第２の流路１６へ移動する。次に、試料注入口３０から空気を注入し、第１の流路１４、フィルタ部２０、第２の流路１６から試料を排出する。これらの工程において、空気連通口３６は第３封止フィルム２８によって封止されたままである。
次に、第３封止フィルム２８を剥がし、空気連通口３６から核酸抽出液を第３の流路へ注入する。図８は、核酸抽出液によるフィルタ上での核酸抽出を説明するための図である。図８において矢印Ｂ１で示すように、核酸抽出液は、第３の流路からフィルタ部２０へ移動し、フィルタ２２の表面に接触する。なお、核酸抽出液を試料注入口３０から第１の流路１４へ注入し、フィルタ部２０へ移動させてもよい。
フィルタ２２の孔径は上述したように例えば１μｍ以下であるため、核酸抽出液はフィルタ２２を透過せずにフィルタ２２上に留まる。核酸抽出液の量は、フィルタ２２の表面全体に接触できる量であってもよいし、全体に接触できない量であってもよい。核酸抽出液の量がフィルタ２２の表面全体に接触できるものである場合、フィルタ２２上に核酸抽出液を例えば１分間静置させることによって、フィルタ２２上の生物由来物質から核酸を抽出することができる。核酸抽出液の量がフィルタ２２の表面全体に接触できないものである場合、例えばピペッターを空気連通口３６または試料注入口３０に差し込み、ピペッターによる空気の押し出しまたは吸い込みによって、図８の矢印Ｂ２で示すように、核酸抽出液をフィルタ２２上で往復させる。この核酸抽出液の往復運動によって、フィルタ２２上に捕集された生物由来物質から核酸を抽出できる。なお、ピペッターで行った核酸抽出液の往復運動はマイクロブロアポンプ等を用いて往復させることも可能である。この往復運動は、例えば特開２０１９－１８０４１８に記載の方法で動作させることができる。
例えば試料が、壊れた細胞を多く含み、ミトコンドリアや核酸が細胞から放出されている場合、フィルタ２２上に捕集された核酸は常温で核酸抽出液に接触させると抽出される。一方、試料が細菌等の場合は常温では核酸が抽出されない場合がある。その場合、９５℃程度の温度を掛けることにより核酸を抽出することができる。例えば、基板１２を高温の金属板に載せ、生物由来物質捕集領域２０ａの温度を９５℃付近に上げることによって、細菌等の試料から核酸を抽出することができる。
フィルタ２２上の抽出した核酸を含む溶液は、ピペッターを空気連通口３６または試料注入口３０に差し込み、該溶液を吸い出すことによって、フィルタ部２０から回収する。以上で試料中の核酸の抽出は完了である。
［第２実施形態］
本発明の第２実施形態に係る核酸抽出容器も、基板と、該基板に貼り付けられた封止フィルムと、フィルタと、からなる。第１実施形態に係る核酸抽出容器１０と共通する構成については同一の符号を使用し、重複する説明を適宜省略する。
図９（ａ）および図９（ｂ）は、本発明の第２実施形態にかかる核酸抽出容器を説明するための図である。図１０は、図９（ａ）に示す核酸抽出容器のＡ－Ａ断面図である。図１１は、図９（ａ）に示す核酸抽出容器のＢ－Ｂ断面図である。図１２は、図９（ａ）に示す核酸抽出容器のＣ－Ｃ断面図である。図１３は、図９（ａ）に示す核酸抽出容器のＤ－Ｄ断面図である。図１４は、図９（ａ）に示す核酸抽出容器が備える基板の平面図である。第２実施形態にかかる核酸抽出容器８０は、フィルタ部および第２の流路に関して第１実施形態にかかる核酸抽出容器１０と異なる構成を有する。
図９（ａ）に示すように、第２実施形態にかかる核酸抽出容器８０においては、溝状のフィルタ部８２が、基板１２の上面１２ｂ上に露出するように形成されている。フィルタ部８２には、長方形の親水性のフィルタ８４が設置されている。フィルタ部８２は、フィルタ８４の上に生物由来物質捕集領域８２ａと、フィルタ８４の下に試料透過領域８２ｂとを備える。図９（ａ）に示すように、生物由来物質捕集領域８２ａにおいて、フィルタ８４は、その長辺の両側にシリコーンゴム８６、８８を設置することによって固定されている。フィルタ８４の寸法の一例は長辺２１ｍｍ、短辺４．０ｍｍであり、シリコーンゴム８６、８８の寸法の一例は長辺２１ｍｍ、短辺１．５ｍｍ、厚み０．５ｍｍである。したがって、生物由来物質捕集領域８２ａは幅１．０ｍｍ、深さ０．５ｍｍの流路になっている。第２実施形態にかかる核酸抽出容器８０のフィルタ部８２は、第１実施形態にかかる核酸抽出容器１０のフィルタ部２０よりも試料の透過面積が広い。そのため、第２実施形態では、核酸の抽出の効率をさらに上げることができる。
図９（ａ）に示すように、フィルタ８４が露出している部分（シリコーンゴム８６、８８に挟まれている部分）は、第１の流路１４および第３の流路１８と同じ直線上にある。これによって、試料を透過させた後の流路の空気への置換を容易にし、抽出液の移動と回収を容易にする。
図１０に示すように、試料透過領域８２ｂは、第２の流路９０の第１の支流路９０ａ、第２の支流路９０ｂ、第３の支流路９０ｃ、第４の支流路９０ｄと連通している。支流路の数は、フィルタ８４の形状に応じて適宜変更できる。
以上のように構成された第２実施形態にかかる核酸抽出容器８０を、上述した第１実施形態にかかる核酸抽出容器１０の使用方法と同様に使用することによって、試料中の核酸を抽出することができる。
上記の変形例１～６は、第２実施形態にかかる核酸抽出容器８０にも適用できる。
［第３実施形態］
本発明の第３実施形態に係る核酸抽出容器も、第２実施形態にかかる核酸抽出容器と同様に、基板と、該基板に貼り付けられた封止フィルムと、フィルタと、からなる。第２実施形態に係る核酸抽出容器８０と共通する構成については同一の符号を使用し、重複する説明を適宜省略する。
図１５（ａ）および図１５（ｂ）は、本発明の第３実施形態にかかる核酸抽出容器を説明するための図である。図１６は、図１５（ａ）に示す核酸抽出容器のＡ－Ａ断面図である。図１７は、図１５（ａ）に示す核酸抽出容器のＥ－Ｅ断面図である。図１８は、図１５（ａ）に示す核酸抽出容器が備える基板の平面図である。第３実施形態にかかる核酸抽出容器１００は、基板１２の上面１２ｂ上に核酸抽出液取出口１０２と、核酸抽出液取出口１０２と連通し、第３の流路１８に接続されている第２の分岐流路１０４と、基板１２の上面１２ｂ上に空気注入口１０６と、空気注入口１０６と連通し、第３の流路１８に接続されている第３の分岐流路１０８が設けられており、核酸抽出液取出口１０２および空気注入口１０６が第４封止フィルム１１０によって封止されている点で、第２実施形態にかかる核酸抽出容器８０と異なる構成を有する。第３実施形態では、第２の分岐流路１０４との第３の流路１８の接続位置と第３の分岐流路１０８との第３の流路１８の接続位置との間の第３の流路１８の領域Ｃを用いることによって、所定量の核酸抽出液を分注し、核酸抽出液取出口１０２に送ることができる。
図１７に示すように、核酸抽出液取出口１０２は、核酸抽出液を溜めることができる形状としてもよい。核酸抽出液を溜めた核酸抽出液取出口１０２に、ＰＣＲ増幅のための試薬を直接混合することができる。
次に、以上のように構成された核酸抽出容器１００の使用方法について説明する。まず、上述した第１実施形態にかかる核酸抽出容器１０の使用方法と同様にして、フィルタ部８２に試料を通過させ、フィルタ８４上に核酸を含む生物由来物質を捕集し、フィルタ部８２に核酸抽出液を入れ、核酸をフィルタ８４上で抽出する。
次に、フィルタ８４上の抽出した核酸を含む溶液は、ピペッターを空気連通口３６に差し込み、ピペッターを動作させることによって、第３の流路１８の領域Ｃを含む位置へ移動させる。核酸抽出の際に、第３封止フィルム２８は剥がされており、空気連通口３６は開いている。図１９は、第３の流路１８の領域Ｃに核酸を含む溶液がある様子を模式的に示す。次に、第３封止フィルム２８を貼り戻して空気連通口３６を閉じ、試料注入口３０を新たな封止フィルム（図示せず）によって閉じる。その後、第４封止フィルム１１０を剥がし、核酸抽出液取出口１０２および空気注入口１０６を開ける。ピペッターを空気注入口１０６に差し込み、空気を押し込むことによって、領域Ｃにある核酸を含む溶液のみを核酸抽出液取出口１０２へ送る。これによって、核酸を含む溶液を分注する。核酸抽出液取出口１０２の形状は、上述したように溶液を溜めることができるものである。さらに、領域Ｃの容積を、ＰＣＲ増幅試薬と直接混合できる容積とすることによって、核酸抽出液取出口１０２にその容積の溶液を溜めることができる。この場合、核酸抽出液取出口１０２に溜まった溶液にＰＣＲ増幅のための試薬を直接添加することができる。
上記の変形例１、４～６は、第３実施形態にかかる核酸抽出容器１００にも適用できる。
［第４実施形態］
図２０（ａ）および図２０（ｂ）は、本発明の第４実施形態にかかる核酸抽出容器を説明するための図である。図２１は、図２０（ａ）に示す核酸抽出容器のＡ－Ａ断面図である。図２２は、図２０（ａ）に示す核酸抽出容器のＢ－Ｂ断面図である。図２３は、図２０（ａ）に示す核酸抽出容器のＣ－Ｃ断面図である。図２４は、図２０（ａ）に示す核酸抽出容器のＤ－Ｄ断面図である。図２５は、図２０（ａ）に示す核酸抽出容器が備える基板の平面図である。
核酸抽出容器１２０は、下面１２２ａおよび上面１２２ｂに溝状の第１の流路１２４、第２の流路１２６、第３の流路１２８、および親水性のフィルタ１３２を備えるフィルタ部１３０が形成された樹脂製の基板１２２と、基板１２２の下面１２２ａ上に貼られた、第２の流路１２６およびフィルタ部１３０を封止するための第１封止フィルム１３４と、基板１２２の上面１２２ｂに貼られた２枚の封止フィルム（第２封止フィルム１３６および第３封止フィルム１３８）とからなる。
基板１２２の材質および寸法は、第１実施形態における基板１２と同様である。また、基板１２２は、第１実施形態の基板１２と同様に、射出成型や注型成型、ＮＣ加工機などによる切削加工によって作製することができる。
第１封止フィルム１３４および第２封止フィルム１３６の構成および材質は、第１実施形態における第１封止フィルム２４および第２封止フィルム２６と同様である。第１封止フィルム１３４および第２封止フィルム１３６の流路に接する部分はタンパク質の吸着が少ないものであることが好ましい。
基板１２２の下面１２２ａおよび上面１２２ｂには溝状の第１の流路１２４、第２の流路１２６および第３の流路１２８が形成されている。第１実施形態と同様に、第４実施形態に係る核酸抽出容器１２０においても第１の流路１２４、第２の流路１２６および第３の流路１２８の大部分は基板１２２の下面１２２ａおよび上面１２２ｂに露出した溝状に形成されている。金型等を用いた射出成形により安価かつ容易に成形できるようにするためである。この溝を封止して流路として活用するために、基板１２２の下面１２２ａ上に第１封止フィルム１３４が、上面１２ｂ上に第２封止フィルム１３６が貼られる。第１の流路１２４、第２の流路１２６および第３の流路１２８の寸法は、第１実施形態における第１の流路１４、第２の流路１６、第３の流路１８と同様である。
第１の流路１２４は試料注入口１４０とフィルタ部１３０の生物由来物質捕集領域１３０ａとを連通している。試料注入口１４０は、基板１２２の上面１２２ｂ上に突出するように形成されている。試料注入口１４０の形状は、図示のものに限られず、第１実施形態における試料注入口３０と同様に、試料注入口１４０をシリンジとの勘合を良くするように形成されていてもよいし、ルアーロック式でシリンジと連結できるように形成してもよい。
試料は、試料注入口１４０から第１の流路１２４に導入される。第１の流路１２４中にフィルタ１３２よりも孔径の大きい異物除去用のプレフィルタを設けてもよい。
溝状のフィルタ部１３０が、基板１２２の下面１２２ａ上に露出するように形成されている。フィルタ部１３０は、第１封止フィルム１３４によって封止されている。フィルタ部１３０には、親水性のフィルタ１３２が設置されている。図２１に示すように、フィルタ部１３０は、フィルタ１３２上に核酸を含む生物由来物質を捕集する生物由来物質捕集領域１３０ａと、フィルタ１３２を透過した試料が通過する試料透過領域１３０ｂとを備える。第１実施形態において説明したように、核酸抽出の際に核酸抽出液がフィルタ１３２を透過しないようにするためには、試料透過領域１３０ｂにおいてフィルタ１３２は親水性の物質に近接していないことが望ましい。
試料透過領域１３０ｂにおいて、フィルタ１３２は、その長辺の両側にシリコーンゴム１４２、１４４を設置することによって固定されているが、フィルタを基板１２２の下面１２２ａの溝面に接着もしくは融着してもよい。フィルタ１３２の寸法の一例は長辺４０ｍｍ、短辺４．０ｍｍであり、シリコーンゴム１４２、１４４の寸法の一例は長辺４０ｍｍ、短辺１．５ｍｍ、厚み０．５ｍｍである。したがって、試料透過領域１３０ｂは幅１．０ｍｍ、深さ０．５ｍｍの流路になっている。生物由来物質捕集領域１３０ａは、基板１２２の下面１２２ａ上に溝状に形成されており、試料透過領域１３０ｂにフィルタ１３２を設置することによって流路になっている。生物由来物質捕集領域１３０ａの寸法の一例は、幅１．０ｍｍ、深さ０．５ｍｍである。このようにフィルタ部１３０を基板１２２の下面１２２ａ上に形成し、フィルタ１３２を試料透過領域１３０ｂ側から固定することによって、本実施形態におけるシリコーンゴムのようなフィルタの固定具に異物が付いていたり、核酸抽出容器の組み立て時に異物が入ったりしても、核酸抽出液にこれらの異物が混入しないようにすることができる。また、試料をフィルタに透過させる際に基板において生物由来物質捕集領域に圧力がかかるため、圧力の大きさによってはフィルタ部を封止するフィルムが剥がれるリスクがあるが、本実施形態におけるフィルタ部１３０の構成によれば、生物由来物質捕集領域１３０ａを密封する面積が小さくなり、フィルタ部を封止するフィルムが剥がれるリスクが小さくなる。
フィルタ１３２の材料および孔径は、第１実施形態におけるフィルタ２２と同様である。
フィルタ１３２を通過した液体が試料透過領域１３０ｂを通過し、第２の流路１２６を通って試料排出口１４６から排出されるように、第２の流路１２６は、試料排出口１４６と試料透過領域１３０ｂとを連通している。本実施形態では、試料排出口１４６は基板１２２の上面１２２ｂ上から突出するように形成されているが、下面１２２ａ上に形成されていてもよい。
第３の流路１２８は、空気連通口１４８とフィルタ部１３０の生物由来物質捕集領域１３０ａとを連通している。空気連通口１４８は、基板１２２の上面１２２ｂに突出するように形成されている。図２０（ａ）に示すように、空気連通口１４８には、第３封止フィルム１３８が貼られている。空気連通口１４８および第３封止フィルム１３８の構成は、第１実施形態における空気連通口３６および第３封止フィルム２８と同様である。
核酸抽出液は、第１実施形態と同様に、試料注入口１４０および空気連通口１４８のいずれか一方からフィルタ部１３０の生物由来物質捕集領域１３０ａに導入することができる。核酸抽出液の量は、フィルタ１３２の表面すべてと接触できる量であればよいし、一部に接して抽出液を動かすことで表面すべてと接触できる量であればよい。フィルタ１３２の表面と接触させた抽出液は、第１実施形態と同様に、空気連通口１４８および試料注入口１４０のいずれか一方から回収することができるが、生物由来物質捕集領域１３０ａに圧力をかけて抽出液をフィルタ１３２に透過させ、試料排出口１４６から回収してもよい。空気連通口１４８は、ピペッターの先端と嵌合するように構成されていてもよい。
図２０（ａ）に示すように、第１の流路１２４および第３の流路１２８は、生物由来物質捕集領域１３０ａを挟んで互いに反対側に延びていることが好ましく、フィルタ部１３０と連通する第１の流路１２４と第３の流路１２８が直線上にあることがより好ましい。これによって、試料をフィルタ１３２に通過させた後、試料が第１の流路１２４およびフィルタ部１３０に残らないようにすることができる。
核酸抽出容器１２０においては、すべての流路が直線状に形成されているが、流路の形態はこれに限定されない。例えば、流路は、曲線部と直線部とを組み合わせたいわゆる連続的に折り返す蛇行状に形成されてもよいし、途中で幅が広がってもよい。フィルタ部１３０を直列に複数個並べてもよい。これによって、基板１２２上でフィルタ部１３０が占める面積を増やすことができ、より多くの生物由来物質を捕集することができる。
以上のように構成された第４実施形態にかかる核酸抽出容器１２０を、上述した第１実施形態にかかる核酸抽出容器１０の使用方法と同様に使用することによって、試料中の核酸を抽出することができる。
上記の変形例１～６は、第４実施形態にかかる核酸抽出容器１２０にも適用できる。
［第５実施形態］
図２６（ａ）および図２６（ｂ）は、本発明の第５実施形態にかかる核酸抽出容器を説明するための図である。図２７は、図２６（ａ）に示す核酸抽出容器のＡ－Ａ断面図である。図２８は、図２６（ａ）に示す核酸抽出容器のＢ－Ｂ断面図である。図２９は、図２６（ａ）に示す核酸抽出容器のＣ－Ｃ断面図である。図３０は、図２６（ａ）に示す核酸抽出容器のＤ－Ｄ断面図である。図３１は、図２６（ａ）に示す核酸抽出容器のＥ－Ｅ断面図である。図３２は、図２６（ａ）に示す核酸抽出容器のＦ－Ｆ断面図である。図３３は、図２６（ａ）に示す核酸抽出容器が備える基板の平面図である。図３４（ａ）および図３４（ｂ）は、本発明の第５実施形態にかかる核酸抽出容器が備える押え板を説明するための図である。図３５は、図３４（ａ）に示す押え板のＪ－Ｊ断面図である。図３６は、図３４（ａ）に示す押え板のＨ－Ｈ断面図である。図３７は、図３４（ａ）に示す押え板のＧ－Ｇ断面およびＩ－Ｉ断面の図である。
核酸抽出容器１６０は、下面１６２ａおよび上面１６２ｂに溝状の流路１６４、および親水性のフィルタ１６８を備えるフィルタ部１６６が形成された樹脂製の基板１６２と、基板１６２の下面１６２ａ上に貼られた、流路１６４およびフィルタ部１６６を封止するための第１封止フィルム１７０と、フィルタ１６８をフィルタ部１６６に固定する押え板１８０とからなる。
基板１６２の材質および寸法は、第１実施形態における基板１２と同様である。また、基板１６２は、第１実施形態の基板１２と同様に、射出成型や注型成型、ＮＣ加工機などによる切削加工によって作製することができる。
第１封止フィルム１７０の構成および材質は、第１実施形態における第１封止フィルム２４および第２封止フィルム２６と同様である。第１封止フィルム１７０の流路に接する部分はタンパク質の吸着が少ないものであることが好ましい。
基板１６２の下面１６２ａには溝状の流路１６４が形成されている。第５実施形態に係る核酸抽出容器１６０において、流路１６４は基板１６２の下面１６２ａに露出した溝状に形成されている。金型等を用いた射出成形により安価かつ容易に成形できるようにするためである。この溝を封止して流路として活用するために、基板１６２の下面１６２ａ上に第１封止フィルム１７０が貼られる。流路１６４の寸法は、第１実施形態における第２の流路１６と同様である。
試料注入口１７４はフィルタ部１６６の生物由来物質捕集領域１３０ａと連通している。試料注入口１７４は、基板１６２の上面１６２ｂ上に突出するように形成されている。試料注入口１７４の形状は、図示のものに限られず、第１実施形態における試料注入口３０と同様に、試料注入口１７４をシリンジとの勘合を良くするように形成されていてもよいし、ルアーロック式でシリンジと連結できるように形成してもよい。
試料は、試料注入口１７４からフィルタ部１６６の生物由来物質捕集領域１６６ａに導入される。試料注入口１７４中にフィルタ１６８よりも孔径の大きい異物除去用のプレフィルタを設けてもよい。
溝状のフィルタ部１６６が、基板１６２の下面１６２ａ上に露出するように形成されている。フィルタ部１６６には、親水性のフィルタ１６８が設置されている。図２７に示すように、フィルタ部１６６は、フィルタ１６８上に核酸を含む生物由来物質を捕集する生物由来物質捕集領域１６６ａと、フィルタ１６８を透過した試料が通過する試料透過領域１６６ｂとを備える。試料透過領域１６６ｂにおいて、フィルタ１６８は、押え板１８０を設置することによって固定されているが、フィルタ１６８を基板１６２の下面１６２ａの溝面に接着もしくは融着してもよい。フィルタ部１６６は、第１封止フィルム１７０によって封止されている。第１実施形態において説明したように、核酸抽出の際に核酸抽出液がフィルタ１６８を透過しないようにするためには、試料透過領域１６６ｂにおいてフィルタ１６８は親水性の物質に近接していないことが望ましい。
フィルタ１６８の寸法の一例は長辺４６ｍｍ、短辺６ｍｍであり、押え板１８０の寸法の一例は長辺４６ｍｍ、短辺６ｍｍ、厚み１ｍｍである。試料透過領域１６６ｂは幅１ｍｍ、深さ１ｍｍの流路になっている。生物由来物質捕集領域１６６ａは、基板１６２の下面１６２ａ上に溝状に形成されており、試料透過領域１６６ｂにフィルタ１６８を設置することによって流路になっている。生物由来物質捕集領域１６６ａの寸法の一例は、幅１ｍｍ、深さ０．５ｍｍである。このようにフィルタ部１６６を基板１６２の下面１６２ａ上に形成し、フィルタ１６８を試料透過領域１６６ｂ側から押え板１８０によって固定することによって、本実施形態における押え板に異物が付いていたり、核酸抽出容器の組み立て時に異物が入ったりしても、核酸抽出液にこれらの異物が混入しないようにすることができる。また、試料をフィルタに透過させる際に基板において生物由来物質捕集領域に圧力がかかるため、圧力の大きさによってはフィルタ部を封止するフィルムが剥がれるリスクがあるが、本実施形態におけるフィルタ部１６６の構成によれば、生物由来物質捕集領域１６６ａを密封する面積が小さくなり、フィルタ部を封止するフィルムが剥がれるリスクが小さくなる。
フィルタ１６８の材料および孔径は、第１実施形態におけるフィルタ２２と同様である。
押え板１８０は、図３４（ａ）、図３４（ｂ）、図３５～図３７に示すように、樹脂製の基板１８２からなり、基板１８２には、試料透過領域１６６ｂを構成する切り抜き１８２ａが形成されている。基板１８２の材質は第１実施形態における基板１２と同様である。基板１８２のサイズおよび形状は、所望のフィルタ部１６６のサイズおよび形状に応じて適宜調整できる。切り抜き１８２ａのサイズおよび形状は、所望の試料透過領域１６６ｂのサイズおよび形状に応じて適宜調整できる。また、基板１８２は、第１実施形態の基板１２と同様に、射出成型や注型成型、ＮＣ加工機などによる切削加工によって作製することができる。
フィルタ１６８を通過した液体が試料透過領域１６６ｂを通過し、流路１６４を通って試料排出口１７６から排出されるように、流路１６４は、試料排出口１７６と試料透過領域１６６ｂとを連通している。本実施形態では、試料排出口１７６は基板１６２の上面１６２ｂ上から突出するように形成されているが、下面１６２ａ上に形成されていてもよい。
空気連通口１７８は、フィルタ部１６６の生物由来物質捕集領域１６６ａと連通している。空気連通口１７８は、基板１６２の上面１６２ｂに突出するように形成されている。図２６（ａ）に示すように、空気連通口１７８には、第２封止フィルム１７２が貼られている。空気連通口１７８および第２封止フィルム１７２の構成は、第１実施形態における空気連通口３６および第３封止フィルム２８と同様である。
核酸抽出液は、第１実施形態と同様に、試料注入口１７４および空気連通口１７８のいずれか一方からフィルタ部１６６の生物由来物質捕集領域１６６ａに導入することができる。核酸抽出液の量は、フィルタ１６８の表面すべてと接触できる量であればよいし、一部に接して抽出液を動かすことで表面すべてと接触できる量であればよい。フィルタ１６８の表面と接触させた抽出液は、第１実施形態と同様に、空気連通口１７８および試料注入口１７４のいずれか一方から回収することができるが、生物由来物質捕集領域１６６ａに圧力をかけて抽出液をフィルタ１６８に透過させ、試料排出口１７６から回収してもよい。空気連通口１７８は、ピペッターの先端と嵌合するように構成されていてもよい。
図２６（ａ）および図２７に示すように、試料注入口１７４および空気連通口１７８は、生物由来物質捕集領域１６６ａと直接連通している。さらに、第１～第４実施形態よりも封止フィルムの数が少ない。それ故に、第１～第４実施形態よりも低いコストで第５実施形態に係る核酸抽出容器を製造できる。
図２６（ａ）および図２７に示すように、試料注入口１７４および空気連通口１７８は、生物由来物質捕集領域１６６ａを挟んで互いに反対側に配置されていることが好ましい。これによって、試料をフィルタ１６８に通過させた後、試料がフィルタ部１６６に残らないようにすることができる。
核酸抽出容器１６０においては、流路が直線状に形成されているが、流路の形態はこれに限定されない。例えば、流路は、曲線部と直線部とを組み合わせたいわゆる連続的に折り返す蛇行状に形成されてもよいし、途中で幅が広がってもよい。フィルタ部１６６を直列に複数個並べてもよい。これによって、基板１６２上でフィルタ部１６６が占める面積を増やすことができ、より多くの生物由来物質を捕集することができる。
以上のように構成された第５実施形態にかかる核酸抽出容器１６０を、上述した第１実施形態にかかる核酸抽出容器１０の使用方法と同様に使用することによって、試料中の核酸を抽出することができる。
上記の変形例５、６は、第５実施形態にかかる核酸抽出容器１６０にも適用できる。
以下、本発明の実施例を説明するが、これら実施例は、本発明を好適に説明するための例示に過ぎず、なんら本発明を限定するものではない。
本実施例では、環境ＤＮＡの分析について、実施の形態にかかる核酸抽出溶液を用いた方法と、従来の学会標準法とを比較した。ここで、環境ＤＮＡ(environmental DNA, eDNA)とは、環境中に放出された、そこに生息する生物由来のＤＮＡを指す。より具体的には、環境中に生息する様々な生物は、そのＤＮＡを周囲に常に放出している。例えば、動物の場合、そのＤＮＡは、皮膚、体毛、排泄物、死体などを通じて放出される。環境中に含まれる環境ＤＮＡを検出または定量することによって、その環境に生息する生物種を特定したり、その環境の生物多様性を把握したりすることができる。なお、分析するＤＮＡの種類は、安定性の観点から、ミトコンドリアＤＮＡであることが多い。学会標準法では数百ｍＬ～１Ｌの試料水をフィルタリングし、そこで捕集した環境ＤＮＡを含む粒子からＤＮＡを抽出し、最終的に２００μＬの液に抽出した状態にする。その後、この液の一部（２μＬ程度）を使用しＰＣＲにて検出し、被測定生物がいるかどうか、もしくはどの程度いるかを見る。
本実施例におけるＰＣＲで使用した試薬を下記表１に示す。
ＰＣＲで使用したフォワードプライマー（プライマーＦ）、リバースプライマー（プライマーＲ）、プローブの配列は下記の通りである。
ニジマスプライマーＦ： 5'-AGTCTCTCCCTGTATATCGTC-3'（配列番号１）
ニジマスプライマーＲ： 5'-GATTTAGTTCATGAAGTTGCGAGAGTA-3'（配列番号２）
ニジマスプローブ： 5'-CCAACAACTCTTTAACCATC-3'（配列番号３）
プローブの５’側はＦＡＭ、３’側は［ＮＦＱ］－［ＭＧＢ］で標識した。
（参考文献： Wilcox, T.M, Carim, K.J., McKelvey, K.S., Young, M.K., & Schwartz, M.K. 2015(4 Nov.). The dual challenges of generality and specificity when developing environmental DNA markers for species and subspecies of Oncorhynchus. PLoS ONE, 10(11) e0142008. doi:10.1371/journal.pone.0142008.）
コイプライマーＦ： 5'-GGTGGGTTCTCAGTAGACAATGC-3'（配列番号４）
コイプライマーＲ： 5'-GGCGGCAATAACAAATGGTAGT-3'（配列番号５）
コイプローブ： 5'- CACTAACACG ATTCTTCGCA TTCCACTTCC-3''（配列番号６）
プローブの５’側はＦＡＭ、３’側はＴＡＭＲＡで標識した。
（参考文献： Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H. & Kawabata, Z. 2012. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE , 7: e35868.）
カツオプライマーＦ： 5'-TACCCCTGACGTAGAATCAGCC-3'（配列番号７）
カツオプライマーＲ： 5'-GGCCAATATGGGAGTAAATGCAG-3'（配列番号８）
カツオプローブ; 5'- TGCCGAGACGTAAACTTCGG -3'（配列番号９）
プローブの５’側はＣｙ５、３’側はＢＨＱ３で標識した。
（参考文献： Lin, W.-F. & Hwang, D.-F. 2008. Application of species-specific PCR for the identification of dried bonito product (Katsuobushi). Food Chemistry 106: 390-396.）
ＰＣＲの増幅反応の条件は以下の通りである。
９５℃で１５秒間、その後、６０℃で１０秒間と９５℃で３．５秒間との繰り返し。
（実施例１）
図１（ａ）および図１（ｂ）に示す核酸抽出容器１０を作製した。核酸抽出容器１０は２６＊７５＊４ｍｍの板状であり、材質はシクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）である。流路、フィルタ部、空気連通口は３Ｍ社のポリオレフィンマイクロシーリングテープ（９７９５）を貼り付けることによって封止した。第１の流路１４および第２の流路１６のサイズは幅１．０ｍｍ、深さ１．０ｍｍであり、第３の流路１８のサイズは幅０．６ｍｍ、深さ０．６ｍｍである。親水性フィルタのサイズはφ４ｍｍである。フィルタ２２はφ４＊φ２のＯリング３２によって固定されている。フィルタ２２の素材はポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）であり、孔径は０．４５μｍである。フィルタ２２の有効面はφ３ｍｍである。
この核酸抽出容器を用いて以下の手順でＤＮＡが抽出された抽出液を得た。
（１）試料注入口３０に１０ｍＬシリンジを差し込み、ここから試料２ｍＬを流し込んだ。この時、試料排出口３４にチューブを差し込み、排出された溶液は廃棄した。
（２）先のシリンジを一旦抜き取り、空気を１０ｍＬ吸い込んだ後、再度試料注入口３０に差し込み、空気１０ｍＬを流路に流し込むことによって第１の流路１４および第２の流路１６内の試料を排出した。
（３）空気連通口３６のシールフィルムを剥がし、ここから５μＬのＤＮＡ抽出液をピペッターで注入し、目視で位置を確認しながらＤＮＡ抽出液をフィルタ部２０まで押し込み、１分間放置した。
（４）空気連通口３６にピペッターを差し込み、先の抽出液を吸い取った。
試料はカツオの生肉を純水中に懸濁した懸濁液の希釈水である。ＤＮＡ抽出液として２００ｍＭのＮａ２ＣＯ３水溶液を使用した。
核酸抽出容器１０を用いて得られた抽出液から１．６μＬをＰＣＲ増幅試薬１４．４μＬと混ぜ、日本板硝子社製ＰＣＲ１１００で増幅し、サイクル閾値（Ｃｔ値）３８．９を得た。フィルタリングおよび抽出に要した時間は約３分であった。本実施例では抽出液をそのままＰＣＲ増幅試薬と混ぜたが、抽出液を中和液等と混合した後、ＰＣＲ試薬と混ぜてもよい。
（比較例１）
”環境ＤＮＡ調査・実験マニュアル(ver2.1)”（一般社団法人環境ＤＮＡ学会、インターネット＜URL: http://ednasociety.org/eDNA_manual_ver2_1_3.pdf>）に従って、実施例１と同じ試料５０ｍＬをカートリッジ式フィルタ（ステリベクス０．４５μｍ；メルク社製）で濾過後、キアゲン社のDneasy Blood and Tissue kitを用いてＤＮＡを抽出した。得られた抽出液１．６μＬをＰＣＲ増幅試薬１４．４μＬと混ぜ、実施例１と同じモバイルＰＣＲ装置（製品名PicoGene PCR1100）で増幅し、Ｃｔ値４０．１を得た。フィルタリングおよび抽出に要した時間は約２時間であった。
実施例１および比較例１の結果を下記表２に示す。
実施例１での試料の量は比較例１のものより１／１０以下と少ない。また、実施例１では、フィルタリングから抽出までの工程が比較例１のものより簡単であり、かつ工程にかかる時間が比較例１の２時間に対して３分程度である。さらに、表２に示すように、実施例１で得られたＣｔ値は比較例１で得られたものとほぼ同等であり、これは、実施例１は試料の量が１／１０でありながら比較例１と同等の検出感度を得ることができることを示す。実施例１で使用する消耗品は少なく、抽出に使用した核酸抽出容器１０の構造は簡単であり、低コストで製造できる。一般に、核酸測定ではキャリーオーバーというコンタミを避けるため多くのものを使い捨てにするため、消耗品のコストを下げることは重要である。さらに、実施例１では、試料の量が少ないことから、検査会社に試料となる水を送るのが簡単になる。また、実施例１では、特別な機器が不要で作業手順が少なく簡単なため誰にでも簡単に抽出でき、現場でもできる。加えて、実施例１ではフィルタリングと抽出を閉空間でできるのでコンタミネーションのリスクが減る。
（実施例２）
図９（ａ）および図９（ｂ）に示す核酸抽出容器８０を作製した。核酸抽出容器８０は２６＊７５＊４ｍｍの板状であり、材質はシクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）である。流路、フィルタ部、空気連通口は３Ｍ社のポリオレフィンマイクロシーリングテープ（９７９５）を貼り付けることによって封止した。第１の流路１４および第２の流路１６のサイズは幅１．０ｍｍ、深さ１．０ｍｍであり、第３の流路１８のサイズは幅０．６ｍｍ、深さ０．６ｍｍである。フィルタ８４のサイズは長さ２１ｍｍ、幅４ｍｍである。幅１．５ｍｍ、厚み０．５ｍｍのシリコーンゴム８６、８８でフィルタ８４の両サイドを上から押さえることによって、フィルタ８４を固定した。フィルタ８４の素材はポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）であり、孔径は０．４５μｍである。フィルタ８４の有効面積は２０ｍｍ２である。
この核酸抽出容器８０を用いて、以下の手順でＤＮＡが抽出された抽出液を得た。
（１）試料注入口３０に１０ｍＬシリンジを差し込み、ここから試料１０ｍＬもしくは５ｍＬを流し込んだ。この時、試料排出口３４にチューブを差し込み、排出された溶液は廃棄した。
（２）先のシリンジを一旦抜き取り、空気を１０ｍＬ吸い込んだ後、再度試料注入口３０に差し込み、空気１０ｍＬを第１の流路および第２の流路に流し込んだ。
（３）空気連通口３６の第３封止フィルム２８を剥がし、ここから５μＬのＤＮＡ抽出液をピペッターで注入し、抽出液をフィルタ部８２まで押し込んだ。その後、目視で位置を確認しながら、フィルタ８４の有効面全域をＤＮＡ抽出液が触れるように、ピペッターを用いてＤＮＡ抽出液を１分間往復させた。
（４）空気連通口３６にピペッターを差し込み、先の抽出液を吸い取った。
試料はニジマスの水槽水を純水で１００倍希釈したもの１０ｍＬ（実施例２－１）、つくば市のコイの生息する池の水５ｍＬ（実施例２－２）である。ＤＮＡ抽出液として２００ｍＭのＮａ２ＣＯ３水溶液（実施例２－１）、カネカ社の簡易抽出キットＶｅｒｓｉｏｎ２（実施例２－２）を使用した。
得られたＤＮＡ抽出液から１．６μＬを取り、そのままＰＣＲ増幅試薬１４．４μＬと混ぜ、実施例１と同じモバイルＰＣＲ装置で増幅し、下記表３に示す結果を得た。今回抽出液をそのままＰＣＲ増幅試薬と混ぜたが、抽出液を中和液等と混合した後ＰＣＲ試薬と混ぜてもよい。フィルタリングおよび抽出に要した時間は約３分であった。
本実施例におけるＤＮＡ抽出においては、ＤＮＡ抽出液はフィルタの約半分にしか接していないが、それを往復することによってフィルタの全面積にトラップされたＤＮＡを抽出できることがわかった。このことからフィルタ部の長さを長くし、試料の透過量を上げることによって更に感度を上げることができる。
通常、核酸の抽出は被抽出物（ネズミの尾や植物など）を抽出液に漬けて溶解し、核酸を抽出する。本実施例では、抽出液に漬けなくても、生物由来物質が捕集されたフィルタ上を抽出液が流れるだけで抽出できることが分かった。流れるだけで抽出できると言うことは全体を漬ける場合に比べて抽出液が少なくてもよく、これは抽出液中の核酸濃度が上がることにつながる。
（比較例２）
比較例１と同様にして、実施例２－１と同じ試料１００ｍＬ（比較例２－１）、実施例２－２と同じ試料５０ｍＬ（比較例２－２）からＤＮＡを抽出した。得られた抽出液１．６μＬをＰＣＲ増幅試薬１４．４μＬと混ぜ、実施例１と同じモバイルＰＣＲ装置で増幅し、表４に示す結果を得た。フィルタリングおよび抽出に要した時間は約２時間であった。
実施例２では比較例２と同じ試料を使っていても１／１０の試料量でほば同じＣｔ値が得られており、同じＤＮＡ量を検出できている。すなわち、実施例２での検出感度は比較例２と同等であり、実施例２は実施例１と同様に、検査会社へ試料を送るのが容易であり、抽出手順が簡単であり、コンタミネーションが少ないという利点を有する
（実施例３）
図１５（ａ）および図１５（ｂ）に示す核酸抽出容器１００を作製した。核酸抽出容器１００は２６＊７５＊４ｍｍの板状であり、材質はシクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）である。流路、フィルタ部、注入口は３Ｍ社のポリオレフィンマイクロシーリングテープ（９７９５）を貼り付けることによって封止した。第１の流路１４および第２の流路１６のサイズは幅１．０ｍｍ、深さ１．０ｍｍである。第３の流路１８のサイズは幅０．６ｍｍ、深さ０．６ｍｍである。第２の分岐流路１０４および第３の分岐流路１０８のサイズは第３の流路１８と同じである。フィルタ８４のサイズは長さ２１ｍｍ、幅４ｍｍである。幅１．５ｍｍ、厚み０．５ｍｍのシリコーンゴム８６、８８でフィルタ８４の両サイドを上から押さえることによって、フィルタ８４を固定した。フィルタ８４の素材はポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）であり、孔径は０．４５μｍである。フィルタ８４の有効面積は２０ｍｍ２である。
この核酸抽出容器１００を用いて、以下の手順でＤＮＡが抽出された抽出液を得た。試料は実施例２－１の水１０ｍＬである。
（１）試料注入口３０に１０ｍＬシリンジを差し込み、ここから試料１０ｍＬを流し込んだ。この時排出口にチューブを差し込み排出された溶液は廃棄した。
（２）先のシリンジを一旦抜き取り、空気を１０ｍＬ吸い込んだ後、再度試料注入口３０に差し込み空気１０ｍＬを流路に流し込んだ。
（３）第３封止フィルム２８を剥がし、空気連通口３６から５μＬの抽出液をピペッターで注入し、抽出液をフィルタ８４まで押し込んだ後、目視で位置を確認しながらフィルタ８４の有効面全域を抽出液が触れるようにピペッターを用いて１分間往復させ、最後に抽出液を第３の流路１８の領域Ｃを含む部分で停止させた。
（４）第３封止フィルムを、空気連通口３６を封止するように貼り戻し、試料注入口３０を新たな封止フィルムによって塞いだ後、第４封止フィルム１１０を剥がし、ピペッターを空気注入口１０６に差し込み、ピペッターで空気を押し込むことで核酸抽出液取出口１０２の液溜りに先の抽出液溜めた。
液溜りにたまった抽出液は１．６μＬに分注されている。これにＰＣＲ増幅試薬１４．４μＬを投入し、混合した。この混合液中のＤＮＡを実施例１と同じモバイルＰＣＲ装置で増幅し、Ｃｔ値３０．２を得た。フィルタリングおよび抽出に要した時間は約３分であった。本実施例では抽出液をそのままＰＣＲ増幅試薬と混ぜたが、抽出液を中和液等と混合した後ＰＣＲ試薬と混ぜてもよい。実施例２と比較して、１．６μＬの分注が不要となるとともに、ＰＣＲ増幅試薬と混合するチューブも不要となるためより簡単に抽出からＰＣＲ増幅に移ることができる。
（実施例４）
図２６（ａ）および図２６（ｂ）に示す核酸抽出容器１６０を作製した。核酸抽出容器１６０は２６＊７５＊４ｍｍの板状であり、材質はシクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）である。流路、フィルタ部、注入口は３Ｍ社のポリオレフィンマイクロシーリングテープ（９７９５）を貼り付けることによって封止した。流路１６４のサイズは幅１．０ｍｍ、深さ１．０ｍｍである。試料透過領域１６６ｂは、幅１ｍｍ、深さ１ｍｍの流路である。生物由来物質捕集領域１６６ａは、幅１ｍｍ、深さ０．５ｍｍの流路である。フィルタ１６８のサイズは長さ４６ｍｍ、幅６ｍｍである。核酸抽出容器１６０に図３４に示す押え板１８０を入れることによって、フィルタ１６８を固定した。押え板１８０は、６＊４６＊１ｍｍの板状である。フィルタ１６８の素材はポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）であり、孔径は０．６５μｍである。フィルタ１６８の有効面積は４０ｍｍ２である。生物由来物質捕集領域１６６ａの体積は２０μＬである。
この核酸抽出容器１６０を用いて、以下の手順でＤＮＡが抽出された抽出液を得た。
（１）試料注入口１７４に１０ｍＬシリンジを差し込み、ここから試料１０ｍＬを流し込んだ。この時排出口にチューブを差し込み排出された溶液は廃棄した。
（２）先のシリンジを一旦抜き取り、空気を１０ｍＬ吸い込んだ後、再度試料注入口１７４に差し込み空気１０ｍＬを流路に流し込んだ。
（３）第２封止フィルム１７２を剥がし、空気連通口１７８から所定量の抽出液をピペッターで注入し、抽出液をフィルタ１６８まで押し込んだ後、目視で位置を確認しながらフィルタ１６８の有効面全域を抽出液が触れるようにピペッターを用いて２分間往復させた。
（４）同じピペッターを用いて空気連通口１７８から抽出液を回収した。
試料はニジマスの水槽水を純水で５０倍希釈したもの１０ｍＬである。ＤＮＡ抽出液としてカネカ社の簡易抽出キットＶｅｒｓｉｏｎ２を使用した。
得られたＤＮＡ抽出液から１．５μＬを取り、そのままＰＣＲ増幅試薬１３．５μＬと混ぜ、StepOne Plus Real Time PCR System (Applied Biosystems)で増幅した。抽出液量とＤＮＡ濃度（コピー数／μＬ）との関係を図３８に示す。ここで、ＤＮＡ濃度はＰＣＲ時に検量線を作り出てきたＣｔ値から換算したものである。
図３８から、少ない抽出液量で抽出すると抽出液のＤＮＡ濃度が高くなることが分かる。
以上、本発明を実施の形態をもとに説明した。この実施の形態は例示であり、それらの各構成要素や各処理プロセスの組合せにいろいろな変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
本発明は、核酸抽出容器および核酸抽出方法に利用できる。
１０ 核酸抽出容器、 １４ 第１の流路、 １６ 第２の流路、 １８ 第３の流路、 ２０ フィルタ部、 ２０ａ 生物由来物質捕集領域、 ２０ｂ 試料透過領域、 ２２ フィルタ、 ３０ 試料注入口、 ３４ 試料排出口、 ３６ 空気連通口、 ５０ 核酸抽出容器、 ５２ 核酸抽出液注入口、 ５４ 第１の分岐流路、 ６０ 核酸抽出容器、 ６２ 核酸抽出液取出口、 ６４ 第２の分岐流路、 ８０ 核酸抽出容器、 ８２ フィルタ部、 ８２ａ 生物由来物質捕集領域、 ８２ｂ 試料透過領域、 ８４ フィルタ、 ９０ 第２の流路、 １００ 核酸抽出容器、 １０２ 核酸抽出液取出口、 １０４ 第２の分岐流路、 １０６ 空気注入口、 １０８ 第３の分岐流路、 １２０ 核酸抽出容器、 １２４ 第１の流路、 １２６ 第２の流路、 １２８ 第３の流路、 １３０ フィルタ部、 １３０ａ 生物由来物質捕集領域、 １３０ｂ 試料透過領域、 １３２ フィルタ、 １４０ 試料注入口、 １４６ 試料排出口、 １４８ 空気連通口、 １６０ 核酸抽出容器、 １６４ 流路、 １６６ フィルタ部、 １６６ａ 生物由来物質捕集領域、 １６６ｂ 試料透過領域、 １６８ フィルタ、 １７４ 試料注入口、 １７６ 試料排出口、 １７８ 空気連通口。
配列番号１：ニジマスフォワードＰＣＲプライマー
配列番号２：ニジマスリバースＰＣＲプライマー
配列番号３：ニジマスプローブ
配列番号４：コイフォワードＰＣＲプライマー
配列番号５：コイリバースＰＣＲプライマー
配列番号６：コイプローブ
配列番号７：カツオフォワードＰＣＲプライマー
配列番号８：カツオリバースＰＣＲプライマー
配列番号９：カツオプローブ

Claims (21)

  1. 試料から核酸を含む生物由来物質を捕集する親水性のフィルタと、前記フィルタ上に前記生物由来物質を捕集する生物由来物質捕集領域と、前記フィルタを透過した試料が通過する試料透過領域とを備えるフィルタ部と、
    前記生物由来物質捕集領域と連通する試料注入口と、
    前記生物由来物質捕集領域と連通する空気連通口と、
    前記試料透過領域と連通する試料排出口と、
    を備え、
    前記空気連通口は外部に対して開閉可能なように構成され、
    前記生物由来物質捕集領域は、前記フィルタの前記生物由来物質を捕集する面に沿って流体が流れる方向に細長い形状である流路として構成されることを特徴とする核酸抽出容器。
  2. 前記フィルタが前記生物由来物質捕集領域の流路に沿って伸びていることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出容器。
  3. 前記試料注入口および前記空気連通口は、前記生物由来物質捕集領域を挟んで互いに反対側に配置されていることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸抽出容器。
  4. 前記試料注入口と前記生物由来物質捕集領域とを連通する第１の流路と、
    前記試料排出口と前記試料透過領域とを連通する第２の流路と、
    前記空気連通口と前記生物由来物質捕集領域とを連通する第３の流路と、
    をさらに備えることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸抽出容器。
  5. 前記第１の流路および前記第３の流路は、前記生物由来物質捕集領域を挟んで互いに反対側に延びていることを特徴とする請求項４に記載の核酸抽出容器。
  6. 核酸抽出液注入口と、前記核酸抽出液注入口と連通する第１の分岐流路とをさらに備え、前記第１の分岐流路は前記第３の流路と接続していることを特徴とする請求項４または５に記載の核酸抽出容器。
  7. 前記第１の分岐流路内に核酸抽出液が封入されており、前記核酸抽出液がある領域から前記フィルタ部までの間に空気が封入されていることを特徴とする請求項６に記載の核酸抽出容器。
  8. 核酸抽出液取出口と、前記核酸抽出液取出口と連通する第２の分岐流路とをさらに備え、前記第２の分岐流路は前記第３の流路と接続している請求項４から７のいずれかに記載の核酸抽出容器。
  9. 空気注入口と、前記空気注入口と連通する第３の分岐流路とをさらに備え、前記第３の分岐流路は、前記第３の流路と接続していることを特徴とする請求項８に記載の核酸抽出容器。
  10. 前記第２の分岐流路との前記第３の流路の接続位置と前記第３の分岐流路との前記第３の流路の接続位置との間の前記第３の流路の領域が所定量の抽出液を分注するように構成されていることを特徴とする請求項９に記載の核酸抽出容器。
  11. 前記第３の流路内に核酸抽出液が封入されており、前記核酸抽出液がある領域から前記フィルタ部までの間に空気が封入されていることを特徴とする請求項４から１０のいずれかに記載の核酸抽出容器。
  12. 前記第３の分岐流路内に核酸抽出液が封入されており、前記核酸抽出液がある領域から前記フィルタ部までの間に空気が封入されていることを特徴とする請求項９または１０に記載の核酸抽出容器。
  13. 前記第３の流路の平均断面積が前記第１の流路の平均断面積より小さいことを特徴とする請求項４から１２のいずれかに記載の核酸抽出容器。
  14. 前記空気連通口が核酸抽出液注入口であることを特徴とする請求項１から１３のいずれかに記載の核酸抽出容器。
  15. 前記フィルタ上の試料の有無が外部から視認できるように前記フィルタ部が構成されていることを特徴とする請求項１から１４のいずれかに記載の核酸抽出容器。
  16. 親水性のフィルタと、核酸を含む生物由来物質を前記フィルタ上に捕集する生物由来物質捕集領域とを備え、前記生物由来物質捕集領域は、前記フィルタの前記生物由来物質を捕集する面に沿って流体が流れる方向に細長い形状である流路として構成されるフィルタ部に試料を通過させ、前記フィルタ上に前記生物由来物質を捕集する工程と、
    前記フィルタ部の前記生物由来物質捕集領域に核酸抽出液を入れ、核酸を前記フィルタ上で抽出する工程と、
    前記フィルタ上の抽出した核酸を含む溶液を前記フィルタ部から回収する工程と、
    を含むことを特徴とする核酸抽出方法。
  17. 前記フィルタ上の核酸の抽出を、核酸抽出液を前記フィルタの一部に接触させ、前記フィルタ全体が前記核酸抽出液と接触するように前記核酸抽出液を前記生物由来物質捕集領域の流路において移動させることによって行うことを特徴とする請求項１６に記載の核酸抽出方法。
  18. 前記フィルタ上の核酸の抽出を、前記核酸抽出液を前記フィルタに透過させずに行うことを特徴とする請求項１６または１７に記載の核酸抽出方法。
  19. 親水性のフィルタと、核酸を含む生物由来物質を前記フィルタ上に捕集する生物由来物質捕集領域とを備え、前記生物由来物質捕集領域は、前記フィルタの前記生物由来物質を捕集する面に沿って流体が流れる方向に細長い形状である流路として構成されるフィルタ部に試料を通過させ、前記フィルタ上に前記生物由来物質を捕集する工程と、
    前記フィルタ部の前記生物由来物質捕集領域に核酸抽出液を入れ、核酸を前記フィルタ上で抽出する工程と、
    前記フィルタ上の抽出した核酸を含む溶液を、前記フィルタ部と連通する流路内へ移動させる工程と、
    前記流路に空気を注入することによって、前記核酸を含む溶液を分注する工程と、
    を含むことを特徴とする核酸抽出方法。
  20. 前記フィルタ上の核酸の抽出を、核酸抽出液を前記フィルタの一部に接触させ、前記フィルタ全体が前記核酸抽出液と接触するように前記核酸抽出液を前記生物由来物質捕集領域の流路において移動させることによって行うことを特徴とする請求項１９に記載の核酸抽出方法。
  21. 前記フィルタ上の核酸の抽出を、前記核酸抽出液を前記フィルタに透過させずに行うことを特徴とする請求項１６または１７に記載の核酸抽出方法。
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