JP7828100B2 - ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ポリヌクレオチド及びその使用 - Google Patents

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ポリヌクレオチド及びその使用

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Description

本発明は、Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）－２由来ポリヌクレオチド及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの模倣物質、ポリヌクレオチドに対する阻害剤、コロナウイルスの複製促進剤、コロナウイルスの複製促進用組成物、コロナウイルスの複製抑制剤、コロナウイルスの複製抑制用組成物、動物細胞、コロナウイルスの複製抑制方法、コロナウイルスの複製促進方法、コロナウイルスの製造方法に関する。本願は、２０２２年１月２８日に、日本に出願された特願２０２２－０１１９１１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現の転写後調節を担う２２塩基程度の短いノンコーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、哺乳類や植物等の真核生物において普遍的に見られる分子であり、ウイルスの中にも、ｓｍａｌｌ ｖｉｒａｌ ＲＮＡ（ｓｖＲＮＡ）と呼ばれるＲＮＡをゲノムにコードし、ｍｉＲＮＡと同様の機構で宿主やウイルス自身の遺伝子発現を制御するものが存在する。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のゲノムからもｓｖＲＮＡが複数見つかっており、その中の一つは肺の炎症との関連が示唆されている（非特許文献１を参照。）。
Morales et al., SARS-CoV-Encoded Small RNAs Contribute to Infection-Associated Lung Pathology, Cell Host & Microbe, 21, 344-355, 2017.
ウイルスがどのように自身の遺伝子発現や複製を制御しているか、また、感染後どのようにして発病に至るのかについて、分子機構を解明することは、効果的な治療方法を開発する上で重要である。
しかしながら、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が産生するｓｖＲＮＡの存在はこれまでに報告されていない。本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が産生するｓｖＲＮＡを明らかにし、コロナウイルスの生活環を制御する技術を提供することを目的とする。
本発明は以下の態様を含む。
［１］（ｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列、（ｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して６０％以上の配列同一性を有する塩基配列、を含み、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有する、ポリヌクレオチド。
［２］（ｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列、（ｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して６０％以上の配列同一性を有する塩基配列、からなり、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有する、［１］に記載のポリヌクレオチド。
［３］［１］又は［２］に記載のポリヌクレオチドの模倣物質。
［４］［１］又は［２］に記載のポリヌクレオチドに対する阻害剤。
［５］［１］若しくは［２］に記載のポリヌクレオチド又は請求項［３］に記載の模倣物質を有効成分とする、コロナウイルスの複製促進剤。
［６］［１］又は［２］に記載のポリヌクレオチドの２種以上の組み合わせ、［３］に記載の模倣物質の２種以上の組み合わせ、又は、それらの組み合わせを有効成分として含む、コロナウイルスの複製促進用組成物。
［７］［４］に記載の阻害剤を有効成分とする、コロナウイルスの複製抑制剤。
［８］［４］に記載の阻害剤の２種以上の組み合わせを有効成分として含む、コロナウイルスの複製抑制用組成物。
［９］［７］に記載の複製抑制剤又は［８］に記載の複製抑制用組成物を含む、コロナウイルス感染症の予防及び／又は治療のための医薬組成物。
［１０］［１］若しくは［２］に記載のポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせを含む、動物細胞。
［１１］［１］若しくは［２］に記載のポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせを発現するように改変されている、［１０］に記載の動物細胞。
［１２］動物細胞を、［７］に記載の複製抑制剤又は［８］に記載の複製抑制用組成物と接触させる工程を含む、前記動物細胞におけるコロナウイルスの複製抑制方法。
［１３］動物細胞を、［５］に記載の複製促進剤又は［６］に記載の複製促進用組成物と接触させる工程と、前記工程の前又は後に前記動物細胞にコロナウイルスを感染させる工程と、を含む、前記動物細胞におけるコロナウイルスの複製促進方法。
［１４］［１０］又は［１１］に記載の動物細胞にコロナウイルスを感染させる工程と、コロナウイルスを感染させた前記動物細胞を培養する工程と、を含む、コロナウイルスの製造方法。
［１５］［１３］に記載の方法によりコロナウイルスを複製させる工程と、複製したコロナウイルスを前記動物細胞から分離する工程と、を含む、コロナウイルスの製造方法。
本発明によれば、コロナウイルスの生活環を制御する技術を提供することができる。また、本発明によれば、コロナウイルス感染症の予防及び／又は治療薬、又はワクチンを提供することができる。
図１は、実験例１で実施したＳｍａｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑの結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム上にマップされたリードの割合を示すグラフである。 図２は、実験例１で実施したＳｍａｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑの結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム上にマップされたリードを示す図である。 図３は、図２における顕著なピークに着目して、その周辺領域を拡大表示した図である。 図４は、図２における顕著なピークに着目して、その周辺領域を拡大表示した図である。 図５Ａは、実験例２における定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。 図５Ｂは、実験例２における定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。 図５Ｃは、実験例２における定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。 図５Ｄは、実験例２における定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。 図６は、実験例３において、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ１ａｂ、その１００ｎｔ上流及び１００ｎｔ下流の領域の２次構造を予測した結果を示す図である。 図７は、実験例３において、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２、それらの１００ｎｔ上流及び１００ｎｔ下流の領域の２次構造を予測した結果を示す図である。 図８は、実験例４で作製したｓｖＲＮＡ阻害剤の構造を示す模式図である。 図９左は、実験例４で作製したｓｖＲＮＡ模倣物質の構造を示す模式図である。図９右は、ｓｖＲＮＡ模倣物質がＲＩＳＣ複合体に取り込まれた状態を示す模式図である。 図１０は、実験例５の実験スケジュールを説明する図である。 図１１は、実験例５において、ｓｖＲＮＡ阻害剤を単独で又は組み合わせて導入した場合に、細胞培養上清中に含まれるウイルスゲノムのコピー数を定量した結果を示すグラフである。 図１２は、実験例５において、ｓｖＲＮＡ模倣物質を単独で又は組み合わせて導入した場合に、細胞培養上清中に含まれるウイルスゲノムのコピー数を定量した結果を示すグラフである。 図１３は、実験例６の実験スケジュールを説明する図である。 図１４は、実験例６において、ｓｖＲＮＡ阻害剤を単独で又は組み合わせて導入した場合に、細胞培養上清中に含まれるウイルスゲノムのコピー数を定量した結果を示すグラフである。 図１５Ａは、実験例７における定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。 図１５Ｂは、実験例７における定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。 図１５Ｃは、実験例７における定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。 図１６Ａは、実験例８における定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。 図１６Ｂは、実験例８における定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。 図１６Ｃは、実験例８における定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。
本明細書において、「有効成分とする」とは、活性成分（後述する、ポリヌクレオチド、模倣物質又は阻害剤）を、これらの物質の効能又は活性を達成するのに十分な量を含むことを意味する。あるいは、後述する、ポリヌクレオチド、模倣物質又は阻害剤を、主要な活性成分として含むことを意味する。
［ポリヌクレオチド］
一実施形態において、本発明は、（ｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列、（ｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して６０％以上の配列同一性を有する塩基配列、を含み、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有する、ポリヌクレオチドを提供する。
実施例において後述するように、発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のｓｖＲＮＡとして、配列番号１～３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを同定した。発明者らは更に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞中に、これらのポリヌクレオチドを存在させると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製が促進することを明らかにした。また、配列番号１～３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２以外のコロナウイルスにおいても塩基配列が保存されている。
したがって、本実施形態のポリヌクレオチドを用いてコロナウイルスの生活環を制御することができる。具体的には、例えば、細胞中に、コロナウイルス及び本実施形態のポリヌクレオチドを共存させることにより、コロナウイルスの複製を促進することができる。すなわち、本実施形態のポリヌクレオチドを、コロナウイルスに対する弱毒化ワクチン又は不活化ワクチンの原料として、コロナウイルスを大量培養する用途等に利用することができる。
本明細書において、コロナウイルスとしては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１等が挙げられるがこれらに限定されない。
本実施形態のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）複合体に取り込まれ、ＲＮＡｉ経路又はｍｉＲＮＡ経路により、標的ｍＲＮＡの分解又は発現抑制を行うと考えられる。
ｍｉＲＮＡ経路においては、ＲＩＳＣ複合体に取り込まれ、標的ｍＲＮＡの認識に関わるガイド鎖は、標的ｍＲＮＡに対して塩基のミスマッチを有していてもよいことが知られている。したがって、本実施形態のポリヌクレオチドは、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有する限り、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個、例えば１～２個、例えば１個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。以下、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個程度の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列からなるポリヌクレオチドのことを変異体という場合がある。
同様に、本実施形態のポリヌクレオチドは、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有する限り、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して、６０％以上、例えば７０％以上、例えば８０％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。
ここで、基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の塩基数を算出し、下記式（１）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致した塩基数／対象塩基配列の総塩基数×１００ （１）
以下、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して、６０％以上、例えば７０％以上、例えば８０％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドのことも変異体という場合がある。
変異体は、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有する限り、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかに記載の塩基配列中の連続する部分配列であってもよい。例えば、変異体は、２３塩基からなる配列番号１に記載の塩基配列、２８塩基からなる配列番号２に記載の塩基配列、２４塩基からなる配列番号３に記載の塩基配列のいずれか又はこれらの変異体の塩基配列に含まれる、連続するより短い塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。より短い塩基配列の長さとしては、例えば１０～２０塩基が挙げられる。
本実施形態のポリヌクレオチドは、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有する限り、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよいし、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかに記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド、すなわち、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかに記載の塩基配列の５’側若しくは３’側又はその両方に更に任意の塩基配列からなるポリヌクレオチドが付加されたポリヌクレオチドであってもよい。このように、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかに記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドであっても、プロセッシングされてＲＩＳＣ複合体に取り込まれた後に、コロナウイルスの複製を促進する活性を発揮する。上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかに記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドの長さは特に限定されないが、例えば１０００塩基程度であってもよく、例えば５００塩基程度であってもよく、例えば１００塩基程度であってもよく、例えば５０塩基程度であってもよく、例えば２０塩基程度であってもよい。ヒト成熟ｍｉＲＮＡの長さの最頻値は２２塩基である。また、最も短いものは１６塩基であり、最も長いものは２８塩基とされている。また、ｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）の長さは７０塩基程度である。上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかに記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドの長さは、これらのｍｉＲＮＡと同程度の長さであってもよい。
本実施形態のポリヌクレオチドは、１本鎖ＲＮＡであってもよいし、相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと２本鎖ＲＮＡを形成していてもよい。
［模倣物質］
一実施形態において、本発明は、上述したポリヌクレオチドの模倣物質を提供する。すなわち、本実施形態の模倣物質は、（ｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列、（ｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して６０％以上、例えば７０％以上、例えば８０％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有する塩基配列、を含み、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有するポリヌクレオチドの模倣物質であってもよい。あるいは、本実施形態の模倣物質は上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列からなり、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有するポリヌクレオチドの模倣物質であってもよい。本実施形態において、「コロナウイルス」、「配列同一性」については、上述したものと同様である。
本明細書において、模倣物質とは、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列からなり、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有するポリヌクレオチドと同様の活性を有する物質を意味する。
実施例において後述するように、本実施形態の模倣物質を用いてコロナウイルスの生活環を制御することができる。具体的には、例えば、細胞中に、コロナウイルス及び本実施形態の模倣物質を共存させることにより、コロナウイルスの複製を促進することができる。すなわち、本実施形態の模倣物質を、コロナウイルスに対する弱毒化ワクチン又は不活化ワクチンの原料としてコロナウイルスを大量培養する用途等に利用することができる。
本実施形態の模倣物質は、上記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列からなり、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有するポリヌクレオチドと、その相補鎖のポリヌクレオチドとがハイブリダイズした２本鎖ポリヌクレオチドであってもよい。本実施形態の模倣物質は、１本鎖ポリヌクレオチドであってもよいし、環状型ポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドはＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよいが、ＲＮＡであることが好ましい。また、本実施形態の模倣物質は、天然型のＲＮＡであってもよいし、化学修飾されたＲＮＡであってもよい。
化学修飾されたＲＮＡとしては、糖修飾リボヌクレオチド、骨格修飾リボヌクレオチド、塩基修飾リボヌクレオチド等が挙げられる。化学修飾により、ＲＮＡ機能の向上や、ヌクレアーゼ抵抗性が向上する等の効果が得られる。
糖修飾リボヌクレオチドの例としては、糖の２’位のＯＨ基が、水素原子若しくはハロゲン原子、又は、ＯＲ、Ｒ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＮからなる群より選択される基で置換されたリボヌクレオチドが挙げられる。上記Ｒは、Ｃ１－Ｃ１０、好ましくはＣ１－Ｃ６の、アルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、又はアルキニル基であり、特に好ましくはメチル基、エチル基、メトキシエチル基、アミノ基、アミノプロピル基、又はイソプロピル基である。また、上記ハロゲン原子は、好ましくはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、特に好ましくはＦである。
上記のうち、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾されたリボヌクレオチドを特に好適に用いることができる。中でも、２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡは、ヌクレアーゼ抵抗性が高く、２本鎖の熱的安定性が高く、自然免疫応答を回避できる等の特性を有する。
本実施形態の模倣物質は、Ｓ化ヌクレオチド（ホスホロチオエート）を含むことで、糖－リン酸間がホスホロチオエート結合で結合していてもよい。ＤＮＡ／ＲＮＡのホスホロチオエート化は、当該塩基対形成に影響を与えずに高いヌクレアーゼ耐性を付与することができる。
本実施形態の模倣物質は、非天然由来の塩基を含有するリボヌクレオチド、例えば５位で修飾されたウリジン又はシチジン（例として、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ブロモウリジン）、８位で修飾されたアデノシン又はグアノシン（例として、８－ブロモ－グアノシン）、デアザヌクレオチド（例として、７－デアザアデノシン）、Ｏ－又はＮ－アルキル化ヌクレオチド（例として、Ｎ６－メチルアデノシン等を含んでいてもよい。
さらに、糖の２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレン結合を介して架橋した２’，４’－ＢＮＡ（ｂｒｉｄｇｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）／ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）（Koshkin A. A. et al.,LNA (Locked Nucleic Acid): An RNA Mimic Forming Exceedingly Stable LNA:LNA Duplexes, J. Am. Chem. Soc., 120 (50), 13252-13253, 1998.）、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）（国際公開第２０００／０４７５９９号）、フラノース環の酸素原子を硫黄原子に置換した４’－チオヌクレオチド（Dande P., et al, Improving RNA Interference in Mammalian Cells by 4'-Thio-Modified Small Interfering RNA (siRNA): Effect on siRNA Activity and Nuclease Stability When Used in Combination with 2'-O-Alkyl Modifications, J. Med. Chem., 49 (5), 1624-1634, 2006.、国際公開第２００４／１８４９４号）等のヌクレオチド類似体も好適に用いることができる。
上記修飾ヌクレオチドはいずれも公知技術であり、オリゴ核酸の生体内安定性を向上させる方法として汎用されている。本実施形態の模倣物質においては、その一部又は全部を、上記修飾ヌクレオチドから選ばれる１種又は２種以上の修飾ヌクレオチドに置換してもよい。
また、組織特異的なデリバリーや細胞膜透過性の向上を目的として、ペプチド、アプタマー、疎水性分子等を、本実施形態の模倣物質の末端（５’端及び／又は３’端）ヌクレオチドにコンジュゲートしてもよい。この目的に好適な疎水性分子としては、コレステロール、ビタミンＥ（α－ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）、パルミチン酸等が挙げられる。
上記修飾は組み合わせて用いてもよく、例えば、上記Ｓ化されたＲＮＡに上記ペプチド、アプタマー、疎水性分子等をコンジュゲートさせてもよい。また、末端とそれ以外の部位に異なる種類の上記修飾ヌクレオチドを含めてもよい。
本実施形態の模倣物質は、細胞内で発現させるか、あるいは、細胞内に導入すると、ＲＩＳＣ複合体に取り込まれ、天然のｍｉＲＮＡの転写後遺伝子発現調節機能を模倣するものであることが好ましい。
［阻害剤］
一実施形態において、本発明は、上述したポリヌクレオチドに対する阻害剤を提供する。すなわち、一態様において、本実施形態の阻害剤は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの阻害剤である。また、一態様において、本実施形態の阻害剤は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列からなり、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有するポリヌクレオチドの阻害剤である。また、一態様において、本実施形態の阻害剤は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して６０％以上、例えば７０％以上、例えば８０％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有するポリヌクレオチドの阻害剤である。本実施形態において、「コロナウイルス」、「配列同一性」については、上述したものと同様である。
本実施形態において、阻害剤とは、上述したポリヌクレオチド又は模倣物質の活性を抑制する物質である。本実施形態の阻害剤は、例えば、上述したポリヌクレオチド又は模倣物質に相補的に結合するポリヌクレオチドからなり、上述したポリヌクレオチド又は模倣物質に結合することにより、その機能を阻害するものであってもよい。あるいは、本実施形態の阻害剤は、例えば、上述したポリヌクレオチドを標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡであってもよい。
実施例において後述するように、本実施形態の阻害剤を用いてコロナウイルスの生活環を制御することができる。例えば、細胞中に、コロナウイルス及び本実施形態の阻害剤を共存させることにより、コロナウイルスの複製を抑制することができる。本実施形態の阻害剤によるウイルス複製阻害効果は、複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対しても有効であった。したがって、本実施形態の阻害剤を、ＣＯＶＩＤ－１９の治療薬として利用できる可能性がある。
本実施形態の阻害剤は、上述したポリヌクレオチド又は模倣物質に相補的な塩基配列を有する１本鎖又は２本鎖のポリヌクレオチドであってもよいし、環状型ポリヌクレオチドであってもよい。また、本実施形態の阻害剤は、天然型のポリヌクレオチドであってもよいし、化学修飾されたポリヌクレオチドであってもよい。化学修飾されたポリヌクレオチドとしては、上述した化学修飾されたＲＮＡ又は上述したヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチド等が挙げられる。
本実施形態の阻害剤は、細胞内で発現させるか、あるいは、細胞内に導入すると、上述したポリヌクレオチド又は模倣物質をトラップし、上述したポリヌクレオチド又は模倣物質がＲＩＳＣ複合体に取り込まれるのを抑制するものであってよい。
配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ１ａｂ）に対する具体的な阻害剤としては、実施例において後述する、配列番号１３の塩基配列を有するＲＮＡ鎖と、配列番号１４の塩基配列を有するＲＮＡ鎖とをハイブリダイズさせた２本鎖ポリヌクレオチドが挙げられる。
配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１）に対する具体的な阻害剤としては、実施例において後述する、配列番号１５の塩基配列を有するＲＮＡ鎖と、配列番号１６の塩基配列を有するＲＮＡ鎖とをハイブリダイズさせた２本鎖ポリヌクレオチドが挙げられる。
配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２）に対する具体的な阻害剤としては、実施例において後述する、配列番号１７の塩基配列を有するＲＮＡ鎖と、配列番号１８の塩基配列を有するＲＮＡ鎖とをハイブリダイズさせた２本鎖ポリヌクレオチドが挙げられる。
［コロナウイルスの複製促進剤］
一実施形態において、本発明は、上述したポリヌクレオチド又は模倣物質を有効成分とする、コロナウイルスの複製促進剤を提供する。
すなわち、一態様において、本実施形態の複製促進剤は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを有効成分とする。また、一態様において、本実施形態の複製促進剤は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列からなり、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有するポリヌクレオチドを有効成分とする。また、一態様において、本実施形態の複製促進剤は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して６０％以上、例えば７０％以上、例えば８０％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有するポリヌクレオチドを有効成分とする。
また、一態様において、本実施形態の複製促進剤は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドの模倣物質を有効成分とする。また、一態様において、本実施形態の複製促進剤は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列からなり、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有するポリヌクレオチドの模倣物質を有効成分とする。また、一態様において、本実施形態の複製促進剤は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して６０％以上、例えば７０％以上、例えば８０％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有するポリヌクレオチドの模倣物質を有効成分とする。本実施形態において、「コロナウイルス」、「配列同一性」、「模倣物質」については、上述したものと同様である。
実施例において後述するように、発明者らは、細胞中に、コロナウイルス及び本実施形態の複製促進剤を共存させることにより、コロナウイルスの複製を促進することができることを明らかにした。したがって、本実施形態の複製促進剤は、コロナウイルスに対する弱毒化ワクチン又は不活化ワクチンの原料としてコロナウイルスを大量培養する用途等に利用することができる。
［コロナウイルスの複製促進用組成物］
一実施形態において、本発明は、上述したポリヌクレオチドの２種以上の組み合わせ、上述した模倣物質の２種以上の組み合わせ、又は、それらの組み合わせを有効成分として含む、コロナウイルスの複製促進用組成物を提供する。本実施形態の組成物は、上述したポリヌクレオチドを３種以上含んでいてもよい。また、本実施形態の組成物は、上述した模倣物質を３種以上含んでいてもよい。また、本実施形態の組成物は、上述したポリヌクレオチド及び上述した模倣物質を組み合わせて含んでいてもよい。
上述したポリヌクレオチド又は上述した模倣物質を組み合わせることにより、上述したポリヌクレオチド又は上述した模倣物質を単独で使用する場合と比較して、コロナウイルスの複製を顕著に促進することができる。
実施例において後述するように、発明者らは、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１）の模倣物質、配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２）の模倣物質、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ１ａｂ）の模倣物質をそれぞれ単独で細胞に導入した場合と比較して、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１の模倣物質及びｓｖＲＮＡ １ａｂの模倣物質の組み合わせ、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２の模倣物質及びｓｖＲＮＡ １ａｂの模倣物質の組み合わせ、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１の模倣物質、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２の模倣物質及びｓｖＲＮＡ １ａｂの模倣物質の組み合わせを細胞に導入した場合に、コロナウイルスの複製が顕著に促進されることを明らかにした。
したがって、本実施形態の組成物において、ポリヌクレオチド又は模倣物質の組み合わせは、（ｉ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体若しくはそれらの模倣物質と、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体若しくはそれらの模倣物質との組み合わせ、（ｉｉ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体若しくはそれらの模倣物質と、配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体若しくはそれらの模倣物質との組み合わせ、（ｉｉｉ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体若しくはそれらの模倣物質と、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体若しくはそれらの模倣物質と、配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体若しくはそれらの模倣物質との組み合わせ、のいずれかであることが好ましい。
［コロナウイルスの複製抑制剤］
一実施形態において、本発明は、上述した阻害剤を有効成分とする、コロナウイルスの複製抑制剤を提供する。
すなわち、一態様において、本実施形態の複製抑制剤は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する阻害剤を有効成分とする。また、一態様において、本実施形態の複製抑制剤は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列からなり、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有するポリヌクレオチドに対する阻害剤を有効成分とする。また、一態様において、本実施形態の複製抑制剤は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して６０％以上、例えば７０％以上、例えば８０％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有するポリヌクレオチドの阻害剤を有効成分とする。本実施形態において、「コロナウイルス」、「配列同一性」、「阻害剤」については、上述したものと同様である。
実施例において後述するように、発明者らは、細胞中に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び本実施形態の複製抑制剤を共存させることにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を抑制することができることを明らかにした。したがって、本実施形態の複製抑制剤を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を抑制する用途に利用することができる。また、本実施形態の複製抑制剤を、ＣＯＶＩＤ－１９の治療薬として利用できる可能性がある。
［コロナウイルスの複製抑制用組成物］
一実施形態において、本発明は、上述した阻害剤の２種以上の組み合わせを有効成分として含む、コロナウイルスの複製抑制用組成物を提供する。本実施形態の組成物は、上述した阻害剤を３種以上含んでいてもよい。
すなわち、一態様において、本実施形態の組成物は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する阻害剤の２種以上の組み合わせを有効成分として含む。また、一態様において、本実施形態の組成物は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列からなり、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有するポリヌクレオチドに対する阻害剤の２種以上の組み合わせを有効成分として含む。また、一態様において、本実施形態の複製抑制用組成物は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して６０％以上、例えば７０％以上、例えば８０％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有するポリヌクレオチドに対する阻害剤の２種以上の組み合わせを有効成分として含む。本実施形態において、「コロナウイルス」、「配列同一性」、「阻害剤」については、上述したものと同様である。
上述した阻害剤を組み合わせることにより、コロナウイルスの複製を顕著に抑制することができる。
実施例において後述するように、発明者らは、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ１ａｂ）に対する阻害剤及び配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１）に対する阻害剤の組み合わせ、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ１ａｂ）に対する阻害剤及び配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２）に対する阻害剤の組み合わせ、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ１ａｂ）に対する阻害剤、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１）に対する阻害剤及び配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド（ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２）に対する阻害剤の組み合わせを細胞に導入した場合に、ウイルスゲノムのコピー数が減少することを明らかにした。
したがって、本実施形態の組成物において、阻害剤の組み合わせは、（ｉ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する阻害剤及び配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する阻害剤の組み合わせ、（ｉｉ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する阻害剤及び配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する阻害剤の組み合わせ、（ｉｉｉ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する阻害剤、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する阻害剤及び配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する阻害剤の組み合わせ、のいずれかであることが好ましい。
［動物細胞］
一実施形態において、本発明は、上述したポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせを含む、動物細胞を提供する。
本実施形態の動物細胞にコロナウイルスを感染させてインキュベートすることにより、コロナウイルスの複製を促進し、より大量にコロナウイルスを得ることができる。すなわち、本実施形態の動物細胞は、コロナウイルスの複製促進用動物細胞、コロナウイルスの製造用動物細胞等ということができる。
一態様において、本実施形態の動物細胞は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせを含む。また、一態様において、本実施形態の動物細胞は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列を含み、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有するポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせを含む。また、一態様において、本実施形態の動物細胞は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して６０％以上、例えば７０％以上、例えば８０％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有する塩基配列、を含み、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有する、ポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせを含む。
一態様において、本実施形態の動物細胞は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせを含む。また、一態様において、本実施形態の動物細胞は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列からなり、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有するポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせを含む。また、一態様において、本実施形態の動物細胞は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して６０％以上、例えば７０％以上、例えば８０％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有する、ポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせを含む。
本実施形態の動物細胞において、「上述したポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせを含む」とは、動物細胞中に、上述したポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせが存在することを意味する。
一態様において、本実施形態の動物細胞は、上述したポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせを発現するように改変されていてもよい。例えば、上述したポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせをコードするコンストラクトを、一過性に又は安定的に動物細胞に導入し、動物細胞中で発現させたものであってもよい。コンストラクトは、ゲノム編集により動物細胞のゲノムに導入してもよいし、発現ベクターの形態で、動物細胞のゲノムに、又はエピソーマルに導入してもよい。
一態様において、本実施形態の動物細胞は、上述したポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせを直接導入したものであってもよい。
コンストラクト又はポリヌクレオチドの動物細胞への導入方法は特に限定されず、例えば、カチオン性脂質等のトランスフェクション試薬を用いたトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロキャピラリーを用いたインジェクション等により行うことができる。
本実施形態の動物細胞は、（ｉ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体と、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体との組み合わせ、（ｉｉ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体と、配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体との組み合わせ、（ｉｉｉ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体と、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体と、配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体との組み合わせ、のいずれかの組み合わせを発現する細胞であることがより好ましい。上述したように、これらの組み合わせを発現することにより、コロナウイルスの複製が更に促進される。
本実施形態の動物細胞はコロナウイルスが感染する細胞であれば特に制限されないが、例えば上皮細胞が挙げられる。上皮細胞としては、例えば気管支オルガノイド由来上皮細胞、株化された上皮細胞等が挙げられる。株化された上皮細胞としては、例えば、アフリカミドリザル腎臓上皮細胞由来のＶｅｒｏ細胞等が挙げられる。Ｖｅｒｏ細胞にはＴｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ，ｓｅｒｉｎｅ ２（ＴＭＰＲＳＳ２）遺伝子の発現ベクターが導入されていてもよい。あるいは、上皮細胞の代わりに、ｉＰＳ細胞を用いることもできる。ｉＰＳ細胞にはアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）２遺伝子の発現ベクターが導入されていてもよい。
［コロナウイルスの複製抑制方法］
一実施形態において、本発明は、動物細胞を、上述した複製抑制剤又は複製抑制用組成物と接触させる工程を含む、前記動物細胞におけるコロナウイルスの複製抑制方法を提供する。本実施形態の方法において、「コロナウイルス」、「複製抑制剤」、「複製抑制用組成物」については上述したものと同様である。
動物細胞に、上述した複製抑制剤又は複製抑制用組成物を接触させた結果、複製抑制剤又は複製抑制用組成物が動物細胞の細胞質内に導入され、コロナウイルスの複製抑制の機能を発揮する。本実施形態の複製抑制方法において、「動物細胞に接触させる」を「動物細胞に導入する」といいかえてもよい。
本実施形態の複製抑制方法は、ヒト又は非ヒト動物の生体において、インビボで実施されてもよいし、インビトロで実施されてもよい。本実施形態の複製抑制方法がインビボで実施される場合、本実施形態の複製抑制方法はＣＯＶＩＤ－１９の予防又は治療方法であるということもできる。
本実施形態の複製抑制方法は、コロナウイルス感染前の動物細胞に上述した複製抑制剤又は複製抑制用組成物を接触させる工程を含むものであってもよい。あるいは、本実施形態の複製抑制方法は、コロナウイルス感染後の動物細胞に上述した複製抑制剤又は複製抑制用組成物を接触させる工程を含むものであってもよい。
動物細胞と複製抑制剤又は複製抑制用組成物との接触は、例えば、カチオン性脂質等のトランスフェクション試薬の存在下で行ってもよいし、エレクトロポレーション法の実施と共に行ってもよい。
［コロナウイルス感染症の予防及び／又は治療のための医薬組成物］
一実施形態において、本発明は、上述した複製抑制剤又は複製抑制用組成物を有効成分として含む、コロナウイルス感染症の予防及び／又は治療のための医薬組成物を提供する。本実施形態において、「コロナウイルス」、「複製抑制剤」、「複製抑制用組成物」については上述したものと同様である。
医薬製剤として製剤化された複製抑制剤又は複製抑制用組成物をヒト又は非ヒト動物の生体に投与することにより、コロナウイルス感染症の予防及び／又は治療を行うことができる。
製剤化は、有効成分（複製抑制剤又は複製抑制用組成物）及び薬学的に許容される担体を組み合わせて一般的な製剤技術により行うことができる。医薬製剤は、注射剤、点滴静注剤、吸入剤等の形態で非経口的に投与するものであることが好ましい。
薬学的に許容される担体としては、核酸医薬の製剤化において一般的に用いられるものを特に制限なく用いることができる。具体的な担体としては、例えば、カチオン性リポソーム、非カチオン性リポソーム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リポソーム、脂質ナノ粒子、ブロック共重合体等が挙げられる。
リポソーム又は脂質ナノ粒子の材料としては、例えば、コレステロール、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン（ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ）等が挙げられるがこれらに限定されない。
医薬製剤は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、通常医薬製剤に用いられるものを適宜用いることができ、例えば、トロメタモール、トロメタモール塩酸塩等の緩衝剤、氷酢酸、酢酸ナトリウム水和物等のｐＨ調整剤、精製白糖等の等張化剤が挙げられるがこれらに限定されない。
医薬製剤として製剤化された複製抑制剤又は複製抑制用組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、例えば、通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．１から３０ｍｇ程度の有効成分（複製抑制剤又は複製抑制用組成物）を、静脈注射、皮下注射、点滴静注、吸入等により投与することが考えられる。
［コロナウイルスの複製促進方法］
一実施形態において、本発明は、動物細胞に、上述した複製促進剤又は複製促進用組成物を接触させる工程と、前記工程の前又は後に前記動物細胞にコロナウイルスを感染させる工程と、を含む、前記動物細胞におけるコロナウイルスの複製促進方法を提供する。本実施形態において、「コロナウイルス」、「複製促進剤」、「複製促進用組成物」については上述したものと同様である。
すなわち、一態様において、本実施形態の方法は、動物細胞に、上述した複製促進剤又は複製促進用組成物を接触させる工程と、前記工程の後に前記動物細胞にコロナウイルス感染させる工程とを含む、複製促進方法であってよい。あるいは、一態様において、本実施形態の方法は、動物細胞にコロナウイルスを感染させる工程と、コロナウイルスを感染後の前記動物細胞に、上述した複製促進剤又は複製促進用組成物を接触させる工程とを含む、複製促進方法であってよい。
動物細胞に、上述した複製促進剤又は複製促進用組成物を接触させた結果、複製促進剤又は複製促進用組成物が動物細胞の細胞質内に導入され、コロナウイルスの複製促進の機能を発揮する。本実施形態の複製促進方法において、「動物細胞に接触させる」を「動物細胞に導入する」といいかえてもよい。
本実施形態の方法により、コロナウイルスの複製を促進し、例えば、コロナウイルスに対する弱毒化ワクチン又は不活化ワクチンの原料として、より大量のコロナウイルスを得ることができる。したがって、本実施形態の方法は、コロナウイルスの製造方法ということもできる。
［コロナウイルスの製造方法］
一実施形態において、本発明は、上述した動物細胞にコロナウイルスを感染させる工程と、コロナウイルスを感染させた前記動物細胞を培養する工程と、を含む、コロナウイルスの製造方法を提供する。
一態様において、本実施形態の製造方法における動物細胞は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせを含む。また、一態様において、本実施形態の製造方法における動物細胞は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列を含み、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有するポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせを含む。また、一態様において、本実施形態の製造方法における動物細胞は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して６０％以上、例えば７０％以上、例えば８０％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有する塩基配列、を含み、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有する、ポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせを含む。
一態様において、本実施形態の製造方法における動物細胞は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせを含む。また、一態様において、本実施形態の製造方法における動物細胞は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列からなり、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有するポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせを含む。また、一態様において、本実施形態の製造方法における動物細胞は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して６０％以上、例えば７０％以上、例えば８０％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つ、コロナウイルス感染細胞中に存在させるとコロナウイルスの複製を促進する活性を有する、ポリヌクレオチド又はその２種以上の組み合わせを含む。
一態様において、本実施形態の製造方法における動物細胞は、（ｉ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体と、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体との組み合わせ、（ｉｉ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体と、配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体との組み合わせ、（ｉｉｉ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体と、配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体と、配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド若しくはその変異体との組み合わせ、のいずれかの組み合わせを含む。
上述したように、これらの動物細胞では、コロナウイルスの複製が促進されるため、本実施形態の製造方法により、大量のコロナウイルスを製造することができる。
一態様において、本発明は、動物細胞を、上述した複製促進剤又は複製促進用組成物と接触させる工程と、前記工程の前又は後に前記動物細胞にコロナウイルスを感染させる工程と、前記動物細胞を培養し、その結果コロナウイルスが複製する工程と、を含む、コロナウイルスの製造方法を提供する。本実施形態の製造方法は、動物細胞を、複製促進剤又は複製促進用組成物と接触させる前に、動物細胞にコロナウイルスを感染させる場合を含む点において、上述したコロナウイルスの製造方法と主に異なる。
すなわち、コロナウイルスの製造方法において、動物細胞を、複製促進剤又は複製促進用組成物と接触させた後にコロナウイルスを感染させてもよいし、動物細胞にコロナウイルスを感染させ、その後に複製促進剤又は複製促進用組成物と接触させてもよい。いずれの場合であっても、大量のコロナウイルスを製造することができる。
本実施形態の製造方法は、コロナウイルスを動物細胞から分離する工程を更に含んでいてもよい。コロナウイルスの分離は、例えば動物細胞の培養上清を回収し、超遠心すること等により行うことができる。本実施形態の製造方法により製造したコロナウイルスは、例えば、弱毒化ワクチン又は不活化ワクチンの製造に好適に用いることができる。
［コロナウイルスに対するワクチンの製造方法］
一実施形態において、本発明は、コロナワクチンに対する不活化ワクチンの製造方法であって、上述した方法によりコロナウイルスを製造する工程と、製造したコロナウイルスを不活化する工程と、を含む、方法を提供する。コロナウイルスの不活化方法としては通常行われる方法を適宜使用することができ、例えば、過酢酸処理、加熱処理、有機溶剤処理、界面活性剤処理、紫外線照射、放射線照射等が挙げられる。
一実施形態において、本発明は、コロナワクチンに対する弱毒化ワクチンの製造方法であって、上述した方法により、コロナウイルスを製造する工程と、製造したコロナウイルスを弱毒化する工程と、を含む、方法を提供する。弱毒化したコロナウイルスが弱毒化ワクチンとなる。コロナウイルスの弱毒化方法としては、例えば、紫外線照射、放射線照射等が挙げられる。あるいは、初代培養細胞または培養細胞などで数十代以上にわたり継代培養を繰り返すことにより、病原性を弱毒化することもできる。
一実施形態において、本発明は、コロナワクチンに対する弱毒化ワクチンの製造方法であって、上述した方法により、弱毒化されたコロナウイルスを製造する工程を含む、方法を提供する。コロナウイルスの弱毒化方法としては、通常行われる方法を適宜使用することができ、例えば、コロナウイルスの長期培養（継代培養）により遺伝子変異を蓄積させ、感染性を維持したまま病原性が低下したコロナウイルス株を選別する方法等が挙げられる。あるいは、人為的な操作による遺伝子変異によって、感染性を維持したまま病原性が低下したコロナウイルス株を得ることもできる。
［その他の実施形態］
一実施形態において、本発明は、上述した阻害剤の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、コロナウイルス感染症の予防及び／又は治療方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、コロナウイルス感染症の予防及び／又は治療のための上述した阻害剤を提供する。
一実施形態において、本発明は、コロナウイルス感染症の予防剤及び／又は治療剤の製造のための上述した阻害剤の使用を提供する。
一実施形態において、本発明は、上述した阻害剤を含む、コロナウイルス感染症の予防及び／又は治療のための医薬組成物を提供する。
これらの実施形態において、コロナウイルス感染症としては、特にＣＯＶＩＤ－１９が挙げられる。また、これらの実施形態において、阻害剤は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその変異体に相補的に結合するポリヌクレオチドからなり、ポリヌクレオチドに結合することにより、その機能を阻害するものであってもよい。あるいは、阻害剤は、配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡであってもよい。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［材料及び方法］
本研究は、京都大学の研究倫理委員会によって承認された。ウイルス感染を含む全ての実験は、規制に厳密にしたがって、京都大学のバイオセーフティーレベル３の施設で行った。
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の調製）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｂ．１．１．２１４株（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＣｉＲＡ／ＫＰ５５７）は、ＣＯＶＩＤ－１９患者の鼻咽頭スワブ試料から単離した。ウイルスは、Ｖｅｒｏ／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１８、ＪＣＲＢ細胞バンク）中で増殖させ、－８０℃で保存した。Ｖｅｒｏ／ＴＭＰＲＳＳ２細胞は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ（ＭＥＭ、シグマアルドリッチ）中で培養した。
（気管支オルガノイド）
正常ヒト気管支上皮細胞（ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ、以下「ＮＨＢＥ」という場合がある、＃ＣＣ－２５４０、ロンザ）を用いてヒト気管支オルガノイド（ＢＯ）を作製した。
ＮＨＢＥを１０ｍｇ／ｍＬの冷やしたマトリゲル（成長因子低減、ＧＦＲ）に懸濁した。続いて、細胞懸濁液５０μＬずつの液滴を、予め３７℃に温めた２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）上で１０分間インキュベートし固化した。続いて、５００μＬの拡大培養培地を各ウェルに添加した。拡大培養培地の組成を下記表１に示す。表１中、「＋」は含有していることを示し、「－」は含有していないことを示す。培地は２日ごとに交換した。
ＢＯの継代は次のようにして行った。ＢＯを１ｍＬの０．５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ（ナカライテスク）に懸濁し、Ｐ１０００ピペットチップを用いて機械的にせん断した。続いて、２ｍＬのＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を懸濁液に加えた。続いて、室温で５分間インキュベートした後に、ＢＯを再びＰ１０００ピペットチップを用いて機械的にせん断した。続いて、７ｍＬの拡大培養培地を加えてチューブに移し、４００ｒｐｍで遠心した。続いて、オルガノイドの断片を冷やした拡大培養培地で再懸濁し、上述したように播種した。ＢＯは１０日ごとに継代した。
ＢＯを成熟させる場合には、拡大培養したＢＯを分化培地中で５日間培養した。分化培地の組成を下記表１に示す。
（阻害剤／模倣物質のトランスフェクション及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染）
ヒト気管支オルガノイド（ＢＯ）をＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（１×、フェノールレッド不含、サーモフィッシャーサイエンティフィック）で解離させ、ＢＯ由来気管支上皮細胞を９６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に播種し、分化培地中で２４時間培養した。
続いて、ＢＯ由来気管支上皮細胞にｓｖＲＮＡ模倣物質又はｓｖＲＮＡ阻害剤（終濃度３００ｎＭ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて４時間トランスフェクションした。続いて、ＢＯ由来気管支上皮細胞に、Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ）０．０１で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を２時間感染させた。
（ウイルスＲＮＡのコピー数の定量）
細胞培養上清を等容量の２×ＲＮＡ溶解バッファーと混合し、室温で１０分間インキュベートした。２×ＲＮＡ溶解バッファーは、０．４Ｕ／μＬのＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、４０％グリセロールを含む蒸留水であった。続いて、混合液を蒸留水で１０倍に希釈した。
ウイルスＲＮＡは、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＴＢ Ｇｒｅｅｎ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＰＬＵＳ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ、タカラバイオ）を使用し、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック）上で定量した。使用したプライマーの塩基配列は、5'-AGCCTCTTCTCGTTCCTCATCAC-3'（ｆｏｒｗａｒｄ、配列番号４）及び5'-CCGCCATTGCCAGCCATTC-3'（ｒｅｖｅｒｓｅ、配列番号５）であった。標準曲線は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ（１０５コピー／μＬ、日本遺伝子研究所）を用いて作成した。
（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑのためのウイルス）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／ＵＴ－ＮＣＧＭ０２／Ｈｕｍａｎ／２０２０／Ｔｏｋｙｏ（ＮＣＧＭ０２）株をＶｅｒｏ／ＴＭＰＲＳＳ２細胞（ＪＣＲＢ１８１８、ＪＣＲＢ細胞バンク）中で増殖させ、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑに用いた。
（細胞）
Ｖｅｒｏ／ＴＭＰＲＳＳ２細胞は、１０％ＦＢＳ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ナカライテスク）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ （サーモフィッシャーサイエンティフィック）中で培養した。また、Ｃａｌｕ－３細胞は、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２環境下でインキュベートした。
（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑのためのウイルスの接種）
Ｃａｌｕ－３細胞（ＨＴＢ－５５、ＡＴＣＣ）に、ＭＯＩ ０．００１でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＣＧＭ０２株を感染させた。１時間暴露した後、接種材料を洗浄し、細胞を、２％ＦＢＳ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ナカライテスク）中で３日間インキュベートした。
（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ）
ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用して、説明書にしたがって全ＲＮＡを抽出した。続いて、全ＲＮＡをＲＮＡｓｅフリー水で溶出した。続いて、ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で測定した。また、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレント）で全ＲＮＡの質を評価した。
続いて、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑのためのライブラリをＡＱ－ｓｅｑ法（Kim H., et al., Bias-minimized quantification of microRNA reveals widespread alternative processing and 3' end modification, Nucleic Acids Research, 47 (5), 2630-2640, 2019.）を少し改変した方法により作製した。まず、全ＲＮＡ（５μｇ）を１５％変性ポリアクリルアミドゲルで展開し、１７～２９ｎｔのｓｍａｌｌ ＲＮＡを切り出した。続いて、切り出したゲル小片をＧｅｌ Ｂｒｅａｋｅｒ Ｔｕｂｅｓ（コスモバイオ）で、２０，４００×ｇで１０分間遠心することにより断片化した。続いて、２５℃で１，５００ｒｐｍで一晩振とうすることにより、ゲル小片から、サイズで分画されたＲＮＡを０．３Ｍ ＮａＣｌ（ナカライテスク）に溶出した。続いて、酢酸ナトリウム（日本ジェネティクス）及びＧｌｙｃｏＢｌｕｅ Ｃｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）と共に、ＲＮＡをエタノール沈殿した。
続いて、サイズで分画されたＲＮＡを、反応液中で、３’ランダム化アダプターと２５℃で１６時間ライゲーションした。反応液は、０．２５μＭの３’ランダム化アダプター（5'-App/NNNNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG/ddC-3'、配列番号６、ＩＤＴ)、２００ＵのＴ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ ２， ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ＫＱ（ＮＥＢ）、１×Ｔ４ ＲＮＡ ｌｉｇａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、２０％ ＰＥＧ８０００（ＮＥＢ）、１０ＵのＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を含んでいた。続いて、アダプターがライゲーションされたＲＮＡを、１５％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、ライゲーションしなかったアダプターを除去した。続いて、上述した方法と同様にして、サイズで分画されたＲＮＡをゲル精製した。
続いて、アダプターがライゲーションされたＲＮＡを、０．１８μＭの５’ランダム化アダプター（5'-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCNNNN-3'、配列番号７、ＩＤＴ)、１４ＵのＴ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ １、１×Ｔ４ ＲＮＡ ｌｉｇａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、２０％ ＰＥＧ８０００（ＮＥＢ）、１ｍＭ ＡＴＰ、１４ＵのＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）と３７℃で１時間反応させ、その後６５℃で１５分間反応させて酵素を不活性化した。
続いて、アダプターがライゲーションされたＲＮＡを、２００ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ 逆転写酵素（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、１× ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ ｂｕｆｆｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、０．２μＭ ＲＴプライマー（ＲＴＰ、5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'、配列番号８)、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ（ＴｒｕＳｅｑ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｋｉｔ（イルミナ）に含まれていたもの）及び５ｍＭ ＤＴＴ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）と３７℃で１時間反応させた。
続いて、７０℃で１５分間反応させて、逆転写酵素を熱により不活性化させた。ｃＤＮＡライブラリを、１ＵのＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、１Ｘ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ ｂｕｆｆｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック），０．５μＭプライマー（ＲＰ１ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅ 及びＲＰＩＸ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ、ＴｒｕＳｅｑ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｋｉｔ、イルミナ）及び０．２ｍＭ ｄＮＴＰ（タカラバイオ）と反応させて増幅した。続いて、増幅したｃＤＮＡライブラリを、６％非変性ポリアクリルアミドゲルで分画し、アダプターダイマーを除去した。続いて、上述した方法と同様にして、サイズで分画されたｃＤＮＡライブラリをゲル精製し沈殿させた。続いて、ｃＤＮＡライブラリのサイズを、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレント）で評価し、濃度を、ＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で定量した。
続いて、プールされたｃＤＮＡライブラリを、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００／５５０ Ｈｉｇｈ Ｏｕｔｐｕｔ Ｋｉｔ ｖ２．５ （７５ ｃｙｃｌｅｓ、イルミナ）を用いてＮｅｘｔＳｅｑ ５００ ｐｌａｔｆｏｒｍ（イルミナ）でシーケンスした。
（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑのデータ解析）
アダプターのトリミング、クオリティフィルタリング、品質管理を、fastp ver. 0.20.1を用いて行った。５’末端及び３’末端の双方の４ｎｔの縮重配列を、cutadapt ver. 2．１０を用いて除去した。
続いて、前処理後のリードを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム（ＮＣＧＭ０２、欠失した配列はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムリファレンス配列（ＮＣ＿０４５５１２、ＮＣＢＩ）で補完した）のインデックスにマッピングした。マッピングにはＢＷＡ ｖｅｒ． ０．７．１７を使用し、以下のパラメータを使用した：bwa aln -n 1 -k 1 -o 0。
（ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐリアルタイム定量的ＲＴ－ＰＣＲによるｓｖＲＮＡの定量）
上述したものと同様の方法により、ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して全ＲＮＡを抽出した。
カスタムＴａｑＭａｎ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ａｓｓａｙｓ（Ｃａｔ＃４３９８９８７、サーモフィッシャーサイエンティフィック）ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ１ａｂ（5'-GUGAAAUCAUAGGAUACAAGG-3'、配列番号９）、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１（5'-UUCUUGGCACUGAUAACACUCGCUA-3'、配列番号１０）、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２（5'-GUGAGCUUUAUCACUACCAAGAGU-3'、配列番号１１）及びｎｅｇ（5'-GUGCUAUGAGGCCCAAUUUC-3'、配列番号１２）を発注して使用した。
ＴａｑＭａｎ Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ＲＮＵ６Ｂ（Ｃａｔ ＃ ４４２７９７５， Ａｓｓａｙ ＩＤ ００１０９３、サーモフィッシャーサイエンティフィック）をヒトＲＮＵ６Ｂの検出に使用し内部コントロールとして使用した。
ＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて、全ＲＮＡ（１０ｎｇ）を説明書にしたがって逆転写した。
ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用い、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用して、定量的ＲＴ－ＰＣＲを行った。
［実験例１］
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－由来ｓｍａｌｌ ｖｉｒａｌ ＲＮＡｓの同定）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－由来ｓｍａｌｌ ｖｉｒａｌ ＲＮＡｓ（ｓｖＲＮＡｓ）を同定した。Ｃａｌｕ－３細胞をｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＭＯＩ）０．００１でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＮＣＧＭ０２）に感染させた。続いて、感染から３日後に全ＲＮＡを抽出した。続いて、ＡＱ－ｓｅｑ法に基づいて、Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリを作製した。
続いて、次世代シーケンサーによる網羅的なｍｉＲＮＡ発現プロファイルの取得を行い、得られたリードをウイルスゲノム上にマップすることでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ｓｖＲＮＡを同定した。
図１は、解析したリードのうち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム（ＮＣＧＭ０２）上にマップされたリードの割合を示すグラフである。図１中、「Ｍｏｃｋ」はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させていないＣａｌｕ－３細胞の結果であることを示し、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｉｎｆｅｃｔｅｄ」はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたＣａｌｕ－３細胞の結果であることを示す。また、「Ｒｅｐｌｉｃａｔｅ １」、「Ｒｅｐｌｉｃａｔｅ ２」は、それぞれ２回の独立した実験の結果であることを示す。
図２は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたＣａｌｕ－３細胞の解析結果において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム上にマップされたリードを示す図である。２回の独立した実験の結果を示す。図２中、縦軸はウイルスゲノムの各塩基上にマップされたリードの数を示す。縦軸の値が高いほど発現量が高い。
図２の下部には、ウイルスゲノムの全長を示し、タンパク質をコードする領域（Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）を示す。「１ａｂ」はＯＲＦ１ａｂを示し、「Ｓ」はＳｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎを示し、「３」はＯＲＦ３を示し、「Ｅ」はＥｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎを示し、「Ｍ」はＭｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎを示し、「６」はＯＲＦ６を示し、「７ａ」はＯＲＦ７ａを示し、「７ｂ」はＯＲＦ７ｂを示し、「８」はＯＲＦ８を示し、「Ｎ」はＮｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎを示し、「１０」はＯＲＦ１０を示す。
図３及び図４は、図２における顕著なピークに着目して、その周辺領域を拡大表示した図である。図３は、ＯＲＦ１ａｂ領域にマップされたリードを示す図である。図３におけるピークに対応するｓｖＲＮＡを、以下、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ１ａｂという。ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ１ａｂは、塩基配列が5'-AAGUGAAAUCAUAGGAUACAAGG-3'（配列番号１）であり、長さが２３ｎｔであり、ウイルスゲノム（＋）鎖に由来するものであった。
図４は、ＯＲＦ７ａ領域にマップされたリードを示す図である。図４における２つのピークに対応するｓｖＲＮＡを、以下、それぞれ、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１、ＯＲＦ７ａ－２という。ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１は、塩基配列が5'-CUUUUCUUGGCACUGAUAACACUCGCUA-3'（配列番号２）であり、長さが２８ｎｔであり、ウイルスゲノム（＋）鎖に由来するものであった。ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２は、塩基配列が5'-GUGAGCUUUAUCACUACCAAGAGU-3'（配列番号３）であり、長さが２４ｎｔであり、ウイルスゲノム（＋）鎖に由来するものであった。
［実験例２］
（定量的ＲＴ－ＰＣＲによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ｓｖＲＮＡの発現の確認１）
成熟ｓｖＲＮＡに特異的な逆転写プライマーとＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させていないＣａｌｕ－３細胞、及び、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたＣａｌｕ－３細胞におけるｓｖＲＮＡの発現量を定量した。ＭＯＩ ０．００１でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させ、感染から３日後に、各細胞におけるｓｖＲＮＡの発現量を定量した。
図５Ａ～図５Ｄは、定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。それぞれ、２回の独立した実験の結果を示す。図５ＡはｓｖＲＮＡ ＯＲＦ１ａｂの発現定量結果を示す。図５ＢはｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１の発現定量結果を示す。図５ＣはｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２の発現定量結果を示す。図５ＤはｓｖＲＮＡ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ領域（ｎｅｇ）の発現定量結果を示す。ｍｉＲＮＡ－ｓｅｑの結果、マップされたリードが最も少ない２０塩基の配列をウイルスゲノムから選択し、ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ領域として利用した。図５Ａ～図５Ｄ中、黒いバーは２回の実験の平均値を示す。内部標準としてＲＮＵ６Ｂを使用した。縦軸は、ＲＮＵ６Ｂの発現量に対する発現量の相対値を示す（標準化された発現量）。４０サイクルのＰＣＲ後もシグナルの増幅が見られなかった場合は、Ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄとした。図５Ａ～図５Ｄ中、「Ｍｏｃｋ」はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させていないＣａｌｕ－３細胞の結果であることを示し、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｉｎｆｅｃｔｅｄ」はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたＣａｌｕ－３細胞の結果であることを示す。
［実験例３］
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ｓｖＲＮＡとその周辺領域の２次構造予測）
一般にｍｉＲＮＡの前駆体はヘアピン様のｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ構造を持ち、そこから種々のタンパク質によって成熟ｍｉＲＮＡが切り出される。ｓｖＲＮＡ前駆体が、ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ構造を持つか否かを確かめるために、ｓｖＲＮＡとその周辺の２次構造をＲＮＡｆｏｌｄ（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）を使用して予測した。
図６及び図７は予測した２次構造を示す図である。図６は、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ１ａｂ、その１００ｎｔ上流及び１００ｎｔ下流の領域の２次構造を示す。図７は、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２、それらの１００ｎｔ上流及び１００ｎｔ下流の領域の２次構造を示す。その結果、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ１ａｂ、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２はｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ構造に含まれることが明らかとなった。
［実験例４］
（ｓｖＲＮＡ阻害剤及びｓｖＲＮＡ模倣物質の作製）
ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ１ａｂ、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１、及び、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２に対する阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）及び模倣物質（ｍｉｍｉｃ）を、味の素バイオファーマサービス（https://www.ajioligos.com/products/mirna-mimic-inhibitor/）に外注して作製した。
図８は、ｓｖＲＮＡ阻害剤の構造を示す模式図である。作製したｓｖＲＮＡ阻害剤は、２つのｓｖＲＮＡ結合部位を有する２’－Ｏ－メチル化二本鎖ＲＮＡであり、細胞内でｓｖＲＮＡに結合し、その機能を阻害するものであった。
ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ１ａｂに対する阻害剤は、5'-GACGGCGCUAGGAUCAUCAACCCUUGUAUCCUAUGAUUUCACUUCAAGUAUUCUGGU-3'（配列番号１３）の塩基配列を有するＲＮＡ鎖と、5'-ACCAGAAUACAACCCUUGUAUCCUAUGAUUUCACUUCAAGAUGAUCCUAGCGCCGUC-3'（配列番号１４）の塩基配列を有するＲＮＡ鎖とをハイブリダイズさせたものであった。これらのＲＮＡ鎖は全長にわたって２’－Ｏ－メチル化されていた。
ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１に対する阻害剤は、5'-GACGGCGCUAGGAUCAUCAACUAGCGAGUGUUAUCAGUGCCAAGAAAAGCAAGUAUUCUGGU-3'（配列番号１５）の塩基配列を有するＲＮＡ鎖と、5'-ACCAGAAUACAACUAGCGAGUGUUAUCAGUGCCAAGAAAAGCAAGAUGAUCCUAGCGCCGUC-3'（配列番号１６）の塩基配列を有するＲＮＡ鎖とをハイブリダイズさせたものであった。これらのＲＮＡ鎖は全長にわたって２’－Ｏ－メチル化されていた。
ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２に対する阻害剤は、5'-GACGGCGCUAGGAUCAUCAACACUCUUGGUAGUGAUAAAGCUCACCAAGUAUUCUGGU-3'（配列番号１７）の塩基配列を有するＲＮＡ鎖と、5'-ACCAGAAUACAACACUCUUGGUAGUGAUAAAGCUCACCAAGAUGAUCCUAGCGCCGUC-3'（配列番号１８）の塩基配列を有するＲＮＡ鎖とをハイブリダイズさせたものであった。これらのＲＮＡ鎖は全長にわたって２’－Ｏ－メチル化されていた。
図９左は、ｓｖＲＮＡ模倣物質の構造を示す模式図である。作製したｓｖＲＮＡ模倣物質は、化学修飾された二本鎖ＲＮＡであり、図９右に示すようにＲＩＳＣ複合体に取り込まれ、天然のｍｉＲＮＡの転写後遺伝子発現調節機能を模倣するものであった。
ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ１ａｂの模倣物質、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１の模倣物質、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２の模倣物質は、それぞれ、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ１ａｂの塩基配列、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１の塩基配列、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２の塩基配列に基づいて、ジーンデザイン社に設計及び合成を依頼した。
［実験例５］
（ｓｖＲＮＡ阻害剤及びｓｖＲＮＡ模倣物質がウイルス複製に与える影響の検討）
ｓｖＲＮＡ阻害剤及びｓｖＲＮＡ模倣物質がウイルス複製に与える影響を検討した。図１０は実験スケジュールを説明する図である。まず、気管支オルガノイド由来上皮細胞に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ｓｖＲＮＡ阻害剤又はｓｖＲＮＡ模倣物質を４時間トランスフェクションした。続いて、各細胞にＭＯＩ ０．０１でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を２時間感染させた。続いて、ウイルス感染させた気管支オルガノイド由来上皮細胞を、分化培地中で４８時間培養した。図１０中、「ｄｐｉ」はウイルス感染後の日数（ｄａｙｓ ｐｏｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を示す。続いて、細胞培養上清中のウイルスＲＮＡのコピー数を定量的ＲＴ－ＰＣＲで測定した。したがって、本実験は、ｓｖＲＮＡ阻害剤によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製の予防効果を検討したものであるということができる。
図１１は、ｓｖＲＮＡ阻害剤を単独で又は組み合わせて導入した場合に、細胞培養上清中に含まれるウイルスゲノムのコピー数を定量した結果を示すグラフである。図１１中、「Ｎ．Ｃ．」はネガティブコントロールを示し、「７ａ－１」はｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１に対する阻害剤を示し、「７ａ－２」はｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２に対する阻害剤を示し、「１ａｂ」はｓｖＲＮＡ １ａｂに対する阻害剤を示し、「Ａｌｌ」は、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１に対する阻害剤、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２に対する阻害剤及びｓｖＲＮＡ １ａｂに対する阻害剤の組み合わせを示す。データは平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示す。
その結果、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１に対する阻害剤及びｓｖＲＮＡ １ａｂに対する阻害剤の組み合わせ、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２に対する阻害剤及びｓｖＲＮＡ １ａｂに対する阻害剤の組み合わせ、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１に対する阻害剤、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２に対する阻害剤及びｓｖＲＮＡ １ａｂに対する阻害剤の組み合わせを細胞に導入した場合に、ウイルスゲノムのコピー数が減少したことが明らかとなった。
続いて、気管支オルガノイド由来上皮細胞の代わりに、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）２を過剰発現させたｉＰＳ細胞（ＡＣＥ２－ｉＰＳ）を用いて同様の実験を行った。その結果、ＡＣＥ２－ｉＰＳ細胞を用いた場合においても、ｓｖＲＮＡ阻害剤の導入により細胞培養上清中のウイルスＲＮＡのコピー数が減少したことが明らかとなった。
また、ＴＣＩＤ５０（Ｍｅｄｉａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｏｓｅ、５０％感染量）アッセイにより、細胞培養上清中に含まれる感染可能なウイルスの力価を測定した。その結果、ｓｖＲＮＡ阻害剤を加えた条件では、ネガティブコントロールに比べてウイルスの力価が低下することが確認できた。
また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複数のバリアント（α、β、γ、δ型）を用いて同様の実験を行った。その結果、いずれのバリアントに対しても、ｓｖＲＮＡ阻害剤の併用によるウイルス複製阻害効果を確認できた。
これらの結果から、ｓｖＲＮＡ阻害剤は、ウイルス感染細胞においてウイルス複製を抑制する阻害剤として利用できる可能性が示唆された。
図１２は、ｓｖＲＮＡ模倣物質を単独で又は組み合わせて導入した場合に、細胞培養上清中に含まれるウイルスゲノムのコピー数を定量した結果を示すグラフである。図１２中、「Ｎ．Ｃ．」はネガティブコントロールを示し、「７ａ－１」はｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１の模倣物質を示し、「７ａ－２」はｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２の模倣物質を示し、「１ａｂ」はｓｖＲＮＡ １ａｂの模倣物質を示し、「Ａｌｌ」は、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１の模倣物質、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２の模倣物質及びｓｖＲＮＡ １ａｂの模倣物質の組み合わせを示す。データは平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示す。
その結果、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１の模倣物質、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２の模倣物質、ｓｖＲＮＡ １ａｂの模倣物質をそれぞれ単独で細胞に導入した場合、及び、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１の模倣物質及びｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２の模倣物質の組み合わせを細胞に導入した場合に、ネガティブコントロールよりもウイルスゲノムのコピー数が増加したことが明らかとなった。
更に、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１の模倣物質及びｓｖＲＮＡ １ａｂの模倣物質の組み合わせ、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２の模倣物質及びｓｖＲＮＡ １ａｂの模倣物質の組み合わせ、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１の模倣物質、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２の模倣物質及びｓｖＲＮＡ １ａｂの模倣物質の組み合わせを細胞に導入した場合に、ウイルスゲノムのコピー数がより顕著に増加したことが明らかとなった。
［実験例６］
（ｓｖＲＮＡ阻害剤によるＣＯＶＩＤ－１９の治療効果の検討）
ｓｖＲＮＡ阻害剤によるＣＯＶＩＤ－１９の治療効果を検討した。図１３は実験スケジュールを説明する図である。まず、気管支オルガノイド由来上皮細胞に、ＭＯＩ ０．１でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた。続いて、ウイルス感染させた気管支オルガノイド由来上皮細胞を、分化培地中で２４時間培養した。続いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ｓｖＲＮＡ阻害剤を４時間トランスフェクションした。ｓｖＲＮＡ阻害剤の濃度は３００ｎＭであった。続いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ｓｖＲＮＡ阻害剤をトランスフェクションした気管支オルガノイド由来上皮細胞を、分化培地中で４８時間培養した。図１３中、「ｄｐｉ」はウイルス感染後の日数（ｄａｙｓ ｐｏｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を示す。続いて、細胞培養上清中のウイルスＲＮＡのコピー数を定量的ＲＴ－ＰＣＲで測定した。したがって、本実験は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後に、ｓｖＲＮＡ阻害剤によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製の抑制効果を検討したものである。すなわち、本実験は、ｓｖＲＮＡ阻害剤によるＣＯＶＩＤ－１９の治療効果を検討したものであるということができる。
図１４は、ｓｖＲＮＡ阻害剤を単独で又は組み合わせて導入した場合に、細胞培養上清中に含まれるウイルスゲノムのコピー数を定量した結果を示すグラフである。図１４中、「Ｎ．Ｃ．」はネガティブコントロールを示し、「７ａ－１」はｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１に対する阻害剤を示し、「７ａ－２」はｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２に対する阻害剤を示し、「１ａｂ」はｓｖＲＮＡ １ａｂに対する阻害剤を示し、「Ａｌｌ」は、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１に対する阻害剤、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２に対する阻害剤及びｓｖＲＮＡ １ａｂに対する阻害剤の組み合わせを示す。データは平均値±標準偏差（ｎ＝３）で示す。
その結果、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１に対する阻害剤及びｓｖＲＮＡ １ａｂに対する阻害剤の組み合わせ、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２に対する阻害剤及びｓｖＲＮＡ １ａｂに対する阻害剤の組み合わせ、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１に対する阻害剤、ｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２に対する阻害剤及びｓｖＲＮＡ １ａｂに対する阻害剤の組み合わせを細胞に導入した場合に、ウイルスゲノムのコピー数が減少したことが明らかとなった。
この結果から、ｓｖＲＮＡ阻害剤は、ウイルス感染細胞においてウイルス複製を抑制する治療剤として利用できることが示された。
［実験例７］
（定量的ＲＴ－ＰＣＲによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ｓｖＲＮＡの発現の確認２）
成熟ｓｖＲＮＡに特異的な逆転写プライマーとＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させていない気管支オルガノイド由来上皮細胞、及び、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた気管支オルガノイド由来上皮細胞におけるｓｖＲＮＡの発現量を定量した。ＭＯＩ ０．１でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させ、感染後４日目まで経時的に各細胞におけるｓｖＲＮＡの発現量を定量した。
図１５Ａ～図１５Ｃは、定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。図１５ＡはｓｖＲＮＡ ＯＲＦ１ａｂの発現定量結果を示す。図１５ＢはｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１の発現定量結果を示す。図１５ＣはｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２の発現定量結果を示す。図１５Ａ～図１５Ｃ中、丸は３つの異なるウェルの平均値を示す。内部標準としてＲＮＵ６Ｂを使用した。縦軸は、ＲＮＵ６Ｂの発現量に対する発現量の相対値を示す（標準化された発現量）。また、「Ｍｏｃｋ」はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させていない気管支オルガノイド由来上皮細胞の結果であることを示し、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた気管支オルガノイド由来上皮細胞の結果であることを示す。また、「ｄｐｉ」はウイルス感染後の日数（ｄａｙｓ ｐｏｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を示す。
［実験例８］
（定量的ＲＴ－ＰＣＲによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来ｓｖＲＮＡの発現の確認３）
気管支オルガノイド由来上皮細胞の代わりに、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）２を過剰発現させたｉＰＳ細胞（ＡＣＥ２－ｉＰＳ）を用いて実験例７と同様の実験を行った。
成熟ｓｖＲＮＡに特異的な逆転写プライマーとＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させていないＡＣＥ２－ｉＰＳ、及び、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたＡＣＥ２－ｉＰＳにおけるｓｖＲＮＡの発現量を定量した。ＭＯＩ ０．１でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させ、感染後４日目まで経時的に各細胞におけるｓｖＲＮＡの発現量を定量した。
図１６Ａ～図１６Ｃは、定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。図１６ＡはｓｖＲＮＡ ＯＲＦ１ａｂの発現定量結果を示す。図１６ＢはｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－１の発現定量結果を示す。図１６ＣはｓｖＲＮＡ ＯＲＦ７ａ－２の発現定量結果を示す。図１６Ａ～図１６Ｃ中、丸は３つの異なるウェルの平均値を示す。内部標準としてＲＮＵ６Ｂを使用した。縦軸は、ＲＮＵ６Ｂの発現量に対する発現量の相対値を示す（標準化された発現量）。また、「Ｍｏｃｋ」はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させていないＡＣＥ２－ｉＰＳの結果であることを示し、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させたＡＣＥ２－ｉＰＳの結果であることを示す。また、「ｄｐｉ」はウイルス感染後の日数（ｄａｙｓ ｐｏｓｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を示す。
本発明によれば、コロナウイルスの生活環を制御する技術を提供することができる。この技術は、コロナウイルスによる感染症の予防や治療に適用することができる。

Claims (9)

  1. （ｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列、
    （ｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列、若しくは
    （ｉｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列
    を含み、且つ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞中に存在させるとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を促進する活性を有する、ポリヌクレオチド、
    又は、
    （ｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列、
    （ｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列、若しくは
    （ｉｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列
    からなり、且つ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞中に存在させるとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を促進する活性を有する、ポリヌクレオチド、
    を有効成分とする、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製促進剤。
  2. （ｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列、
    （ｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列、若しくは
    （ｉｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列
    を含み、且つ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞中に存在させるとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を促進する活性を有する、ポリヌクレオチド、
    又は、
    （ｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列、
    （ｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列、若しくは
    （ｉｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列
    からなり、且つ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞中に存在させるとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を促進する活性を有する、ポリヌクレオチド、
    の２種以上の組み合わせを有効成分として含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製促進用組成物。
  3. （ｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列、
    （ｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列、若しくは
    （ｉｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列
    を含み、且つ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞中に存在させるとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を促進する活性を有する、ポリヌクレオチド、
    又は、
    （ｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列、
    （ｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列、若しくは
    （ｉｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列
    からなり、且つ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞中に存在させるとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を促進する活性を有する、ポリヌクレオチド、
    の模倣物質を有効成分とし、
    前記模倣物質は、前記ポリヌクレオチドとその相補鎖のポリヌクレオチドとがハイブリダイズした２本鎖ポリヌクレオチドである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製促進剤。
  4. 配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する阻害剤と、配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する阻害剤との組み合わせ、
    配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する阻害剤と、配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する阻害剤との組み合わせ、又は
    配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する阻害剤と、配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する阻害剤と、配列番号３に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する阻害剤の組み合わせ、
    を有効成分とし、
    前記阻害剤は、前記ポリヌクレオチドに相補的に結合するポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドを標的とするｓｉＲＮＡ若しくはｓｈＲＮＡである、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製抑制剤。
  5. 請求項４に記載の複製抑制剤を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防用及び／又は治療用医薬組成物。
  6. インビトロで、動物細胞を、請求項４に記載の複製抑制剤と接触させる工程を含む、前記動物細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製抑制方法。
  7. インビトロで、動物細胞を、請求項１に記載の複製促進剤又は請求項２に記載の複製促進用組成物と接触させる工程と、
    前記工程の前又は後に前記動物細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させる工程と、
    を含む、前記動物細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製促進方法。
  8. （ｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列、
    （ｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列、若しくは
    （ｉｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列
    を含み、且つ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞中に存在させるとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を促進する活性を有する、ポリヌクレオチド、
    又は、
    （ｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列、
    （ｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列において、１～３個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加した塩基配列、若しくは
    （ｉｉｉ）配列番号１～３のいずれかに記載の塩基配列に対して９０％以上の配列同一性を有する塩基配列
    からなり、且つ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞中に存在させるとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を促進する活性を有する、ポリヌクレオチド、
    又は、前記ポリヌクレオチドの２種以上の組み合わせ、
    を含む動物細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させる工程と、
    ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた前記動物細胞を培養する工程と、を含む、
    ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の製造方法。
  9. 請求項７に記載の方法によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を複製させる工程と、
    複製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を前記動物細胞から分離する工程と、を含む、
    ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の製造方法。
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