JP7699552B2 - カチオン性脂質及びその使用 - Google Patents

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Description

優先権
本出願は、２０１９年７月３日に提出された米国仮出願第６２／８７０，２４５号、２０１９年７月３０日に提出された米国仮出願第６２／８８０，４３５号、及び２０２０年５月１２日に提出された米国仮出願第６３／０２３，６５４号に対する優先権を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、部分的に、核酸を細胞に送達するための方法、組成物、及び生成物を含む、様々な新規脂質に関する。
電子的に提出されたテキストファイルの記載
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年７月３日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、ＦＡＢ－０１２ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名前であり、サイズは１，４４１，５９７バイトである。
リポソーム等の脂質ベースの材料は、医薬用及び他の生物学的用途のための生物学的担体として、例えば、薬剤を培養細胞株に導入するために使用される。脂質は、低血清または無血清条件下、例えば、トランスフェクションにおいて、インビトロで核酸を細胞に送達するために一般的に使用される。しかしながら、血清成分は、インビトロでもインビボでも多くの脂質の活性を阻害するため、血清存在下でのそれらの使用が制限される。
例えば、インビトロ及びインビボの両方で、より高レベルのトランスフェクションを達成するための、改善された脂質送達システムが望ましい。特に、血清の存在下で活性な脂質送達システムが必要とされている。トランスフェクションのレベルの改善により、治療効果のために、現在、脂質送達システムで達成可能な発現レベルよりも高いレベルの発現が必要とされる病状の治療が可能になる。別法として、より高いトランスフェクションレベルにより、比較可能な発現レベルを達成するのに材料の少量での使用が可能になり、それにより、潜在的毒性を低下させ、かつコストを減少させる。
当該技術分野では、新規脂質、脂質様材料、及び脂質ベースの送達システムが必要とされている。
したがって、本発明は、とりわけ、細胞への生物学的ペイロード、例えば、核酸の送達改善において利用される新たな脂質に関する。
態様では、本発明は、式（Ｉ）の化合物に関し、
式中、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、及びＱ４は、独立して、正電荷をとることができる原子または基であり、
Ａ１及びＡ２は、独立して、ヌル、Ｈ、または任意選択で置換されたＣ１－Ｃ６アルキルであり、
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、独立して、ヌル、結合、（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、（ハロ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、（アルコキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルカンジイル、複素環－ジイルであるか、または前述を任意に組み合わせたものであって、任意選択でエーテル、エステル、無水物、アミド、カルバマート、第二級アミン、第三級アミン、第四級アンモニウム、チオエーテル、尿素、カルボニル、もしくはイミンのうちの１つ以上により連結されているものであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、独立して、ヌル、Ｈ、（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（ハロ）（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（アルコキシ）（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（ハロ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（ヒドロキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（アルコキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニル、（ハロ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニル、（ヒドロキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニル、（アルコキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニルであり、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８のうちの少なくとも１つが少なくとも２つの不飽和結合を含み、かつ、ｘ、ｙ、及びｚは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
態様では、本発明は、式（ＩＩ）の化合物に関し、
式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７、及びＲ２８は、独立して、Ｈ、ハロ、ＯＨ、（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（ハロ）（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（アルコキシ）（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロであり、かつ
ｉ、ｊ、ｋ、ｍ、ｓ、及びｔは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
態様では、本発明は、式（ＩＩＩ）の化合物に関し、
式中、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、及びＬ７は、独立して、結合、（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、（ハロ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、（アルコキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルカンジイル、複素環－ジイル、－（ＣＨ２）ｖ１－Ｃ（Ｏ）－、－（（ＣＨ２）ｖ１－Ｏ）ｖ２－、または－（（ＣＨ２）ｖ１－Ｃ（Ｏ）－Ｏ）ｖ２－であり、
Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈ、（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（ハロ）（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（アルコキシ）（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（ハロ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（ヒドロキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（アルコキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニル、（ハロ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニル、（ヒドロキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニル、（アルコキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニルであり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも１つが少なくとも２つの不飽和結合を含み、
ｖ、ｖ１及びｖ２は、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
実施形態では、本発明は、式（ＩＶ）の化合物に関し、
式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
実施形態では、本発明は、式（Ｖ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（ＶＩＩ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（ＶＩＩＩ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（ＩＸ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（Ｘ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（ＸＩ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（ＸＩＩ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（ＸＩＩＩ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（ＸＩＶ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（ＸＶ）の化合物に関し、
式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
実施形態では、本発明は、式（ＸＶＩ）の化合物に関する
実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）は、医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体及び／または脂質核酸複合体及び／またはリポソーム及び／または脂質ナノ粒子の構成成分である。
実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）は、追加の脂質もしくはヘルパー脂質を必要としない医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体及び／または脂質核酸複合体及び／またはリポソーム及び／または脂質ナノ粒子の構成成分である。実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）は、中性脂質（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、またはコレステロール）及び／またはさらなるカチオン性脂質（例えば、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、または１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ））をさらに含む医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体及び／または脂質核酸複合体及び／またはリポソーム及び／または脂質ナノ粒子の構成成分である。
実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）は、粒径が定義されている医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体及び／または脂質核酸複合体及び／またはリポソーム及び／または脂質ナノ粒子の構成成分である。いくつかの実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）を含む粒子は、平均粒径及び多分散度を決定するよう特徴付けられる。いくつかの実施形態では、本願化合物を含む粒子は、平均流体力学的半径が５０ｎｍ未満、５０～１００ｎｍ、１００～１５０ｎｍ、１５０～２００ｎｍ、２００～２５０ｎｍ、２５０～５００ｎｍ、または５００ｎｍ超である。いくつかの実施形態では、平均粒径は、粒子形成の工程の条件（例えば、限定することなく、温度、インキュベーション時間、溶液のｐＨ、または溶液のイオン強度）に依存する。いくつかの実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）は、平均粒径が溶液のイオン強度もしくは溶液のｐＨに依存する医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体及び／または脂質核酸複合体及び／またはリポソーム及び／または脂質ナノ粒子の構成成分である。
実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）は、医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体及び／または脂質核酸複合体及び／またはリポソーム及び／または脂質ナノ粒子であって、核酸、例えば、ＤＮＡ（例えば、限定することなく、プラスミド、コスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクター）またはＲＮＡ（例えば、限定することなく、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、インビトロ転写ＲＮＡ、合成ＲＮＡ、及び／またはｍＲＮＡであるが、いずれの場合も、安定性を付与し、１つ以上のヌクレアーゼによる分解を回避し、及び／または実質的な細胞毒性を回避する１つ以上の非標準ヌクレオチドを含むか、あるいは非標準ヌクレオチドを含まない）を含むものの構成成分である。実施形態では、ＲＮＡは、目的のタンパク質、例えば、限定することなく、１つ以上のリプログラミング因子または遺伝子編集タンパク質をコードする。実施形態では、ＲＮＡは、免疫応答を誘発する抗原をコードする。
実施形態では、本発明は、コードされるタンパク質に対する免疫寛容を誘導する能力のある合成ＲＮＡ分子（例えば、限定することなく、マイクロＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ１４２ マイクロＲＮＡ結合部位等）を含む合成ＲＮＡ分子であって、そのようなマイクロＲＮＡ結合部位が任意選択で合成ＲＮＡ分子の３’－ＵＴＲ中に（任意選択で１つ以上のコピーで）存在しているもの）の送達に関する。実施形態では、本発明は、寛容を誘導する因子（例えば、限定することなく、ＩＬ２、ＩＬ１０、及び／またはｔｇｆ－β）の共送達による、コードされるタンパク質に対する免疫寛容を誘導する能力のある合成ＲＮＡ分子の送達に関する。特定の実施形態では、共送達された因子は、合成ＲＮＡ分子により発現される。実施形態では、合成ＲＮＡ分子は、本明細書に記載される１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードする。一実施形態では、合成ＲＮＡ分子は、１つ以上の遺伝子編集タンパク質の免疫寛容を誘導する。別の実施形態では、合成ＲＮＡ分子は、対象には通常は存在しないタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、対象は栄養障害型表皮水疱症を有する。他の実施形態では、合成ＲＮＡ分子は、そこに遺伝的ペイロードが挿入される二本鎖切断を作る１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝的ペイロードは、発現カセットを含む。他の実施形態では、発現カセットは、細胞が治療用タンパク質を発現するよう誘導する。さらに他の実施形態では、治療用タンパク質は、免疫寛容である。さらなる実施形態では、１つ以上の遺伝子編集タンパク質は、細胞が、タンパク質の機能型または半機能型を発現するよう誘導する。一実施形態では、タンパク質は、コラーゲン７である。特定の実施形態は、疾患、障害、または状態を治療するための組成物を対象とし、かかる組成物は、本発明の合成ＲＮＡ分子を含む。一実施形態では、疾患、障害、または状態は、栄養障害型表皮水疱症である。
実施形態では、医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体及び／または脂質核酸複合体及び／またはリポソーム及び／または脂質ナノ粒子は、注射、例えば、限定することなく、皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、皮内注射、皮下注射（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、筋肉内注射による投与、及び／または静脈内、髄腔内、腫瘍内、硝子体内、網膜下、脳室内、及び／または局所への投与及び／または注入に好適である。実施形態では、医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、約１０ｎｇ未満のＲＮＡまたは約１０ｎｇ～約２０００ｎｇのＲＮＡを含有する１回以上の注射としての投与に好適である。
態様では、本発明は、細胞に核酸をトランスフェクトするための方法に関し、細胞を、核酸と本明細書に記載の化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）との複合体と接触させることを含み、その場合、核酸と本明細書に記載の化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）との複合体は、任意選択で、細胞との接触前に形成される。
態様では、本発明は、分化細胞を、より未分化な状態にリプログラミングするための方法に関し、（ａ）分化細胞を提供すること、（ｂ）分化細胞を培養すること、及び（ｃ）分化細胞に、１つ以上の合成ＲＮＡ分子と本明細書に記載の化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）との複合体をトランスフェクトすることを含み、その場合、１つ以上の合成ＲＮＡ分子には、１つ以上のリプログラミング因子をコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子が含まれ、かつトランスフェクションにより、１つ以上のリプログラミング因子を発現する細胞がもたらされ、細胞がより未分化な状態にリプログラミングされる結果となる。実施形態では、ステップ（ｃ）は、分化細胞の、より未分化な状態へのリプログラミングを支持する成分を含有する培地の存在下で行われる。実施形態では、連続する５日の間にステップ（ｃ）を少なくとも２回繰り返すことをさらに含む。実施形態では、後の１回以上のトランスフェクションにおいてトランスフェクトされる１つ以上の合成ＲＮＡ分子の量は、前の１回以上のトランスフェクションにおいてトランスフェクトされる量よりも多い。実施形態では、ステップ（ａ）～（ｃ）は、フィーダー細胞を使用せずに実施され、フィーダー細胞条件培地の存在下で行われる。実施形態では、ステップ（ｃ）は、照射ヒト新生児線維芽細胞のフィーダー細胞を使用せずに実施され、フィーダー細胞条件培地の存在下で行われる。実施形態では、合成ＲＮＡ分子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、ｌ－Ｍｙｃ、Ｔｅｒｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｕｔｆ１、Ａｉｃｄａ、ｍｉＲ２００ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３０２ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３６７ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３６９ マイクロＲＮＡならびにその生物学的に活性な断片、類似体、バリアント及びファミリーメンバーから選択される１つ以上のリプログラミング因子（複数可）をコードする。
態様では、本発明は、非多能性細胞をリプログラミングするための方法に関し、（ａ）非多能性細胞を提供すること、（ｂ）細胞を培養すること、及び（ｃ）細胞に、１つ以上の合成ＲＮＡ分子と本明細書に記載の化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）との複合体をトランスフェクトすることを含み、その場合、１つ以上の合成ＲＮＡ分子には、１つ以上のリプログラミング因子をコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子が含まれ、かつトランスフェクトすることにより、１つ以上のリプログラミング因子を発現する細胞がもたらされて、細胞がリプログラミングされる結果となる。実施形態では、ステップ（ｃ）は、非多能性細胞のリプログラミングを支持する成分を含有する培地の存在下で行われる。実施形態では、連続する５日の間にステップ（ｃ）を少なくとも２回繰り返すことをさらに含む。実施形態では、後の１回以上のトランスフェクションにおいてトランスフェクトされる１つ以上の合成ＲＮＡ分子の量は、前の１回以上のトランスフェクションにおいてトランスフェクトされる量よりも多い。実施形態では、ステップ（ａ）～（ｃ）は、フィーダー細胞を使用せずに実施され、フィーダー細胞条件培地の存在下で行われる。実施形態では、ステップ（ｃ）は、照射ヒト新生児線維芽細胞のフィーダー細胞を使用せずに実施され、フィーダー細胞条件培地の存在下で行われる。実施形態では、合成ＲＮＡ分子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、ｌ－Ｍｙｃ、Ｔｅｒｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｕｔｆ１、Ａｉｃｄａ、ｍｉＲ２００ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３０２ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３６７ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３６９ マイクロＲＮＡならびにその生物学的に活性な断片、類似体、バリアント及びファミリーメンバーから選択される１つ以上のリプログラミング因子（複数可）をコードする。
態様では、本発明は、細胞に遺伝子編集を行うための方法に関し、細胞に、１つ以上の合成ＲＮＡ分子と本明細書に記載の化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）との複合体をトランスフェクトすることを含み、その場合、１つ以上の合成ＲＮＡ分子には、ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、ＷＯ２０１４／０７１２１９Ａ１に開示されている遺伝子編集タンパク質（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃａｓ９、ｘＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、クラス１のＣａｓタンパク質、クラス２のＣａｓタンパク質、及びＭＡＤ７、またはその天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片もしくは融合コンストラクトから選択される１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子が含まれる。
態様では、本発明は、細胞に、リプログラミング及び／または遺伝子編集を行うための方法に関し、細胞を、核酸と、本明細書に記載の化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２００９／０１４３５８３Ａ１に開示されている化合物との複合体と接触させることを含む。
態様では、本発明は、本発明の核酸と、本明細書に記載の化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２００９／０１４３５８３Ａ１に開示されている化合物とを含む医薬製剤に関する。
実施形態では、新たな脂質は、ワクチンの送達に有用である。態様では、本発明は、感染症（限定することなく、コロナウイルス感染症、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）に対してワクチン接種する方法に関し、細胞を、感染因子の抗原をコードする核酸と本明細書に記載の化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）との複合体と接触させることを含む。
態様では、本発明は、水素化アルミニウムリチウムと溶媒とを含有する反応物から有機化合物を抽出するための方法に関し、抽出された有機化合物が得られるよう、（ａ）水で反応を停止させること、（ｂ）溶媒を除去すること、（ｃ）過剰の水を除去すること、及び（ｄ）アルコール（任意選択でイソプロピルアルコール）で有機化合物を抽出することを含む。
態様では、本発明は、水反応性化合物と第１の溶媒とを含有する反応物から有機化合物を抽出するための方法に関し、抽出された有機化合物が得られるよう、（ａ）水で反応を停止させること、（ｂ）第１の溶媒を除去すること、（ｃ）過剰の水を除去すること、及び（ｄ）第２の溶媒で有機化合物を抽出することを含む。
態様では、本発明は、有機化合物と、フタルイミドまたはフタルイミド誘導体（任意選択でフタルヒドラジン）との混合物からの有機化合物を精製するための方法に関し、精製された有機化合物が得られるよう、（ａ）混合物をアセトンに溶解させて沈殿物を形成させること、（ｂ）沈殿物を遠心分離により除去すること、及び（ｃ）アセトンを除去することを含む。
本発明の詳細は、以下の付随する説明に記載されている。本明細書に記載される方法及び材料と類似または同等のものが本発明の実施または試験において使用され得るが、例示的な方法及び材料をここに記載する。本発明の他の特長、目的及び利点は、記載及び特許請求の範囲から明らかになる。本明細書及び添付の特許請求の範囲において、文脈で特に明確に指示されない限り、単数形に複数形も含まれる。別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明の属する分野の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を持つ。
本明細書に開示されるいかなる態様または実施形態も、本明細書に開示される他の任意の態様または実施形態と組み合わせることができる。
２４ウェルプレートで培養し、示されている脂質と、示されている脂質対ＲＮＡの質量比で複合体を形成している、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするインビトロ転写されたＲＮＡを１ウェルあたり４００ｎｇでトランスフェクトされた初代ヒト表皮角化細胞を示す。複合体形成はＤＭＥＭ中で実施され、トランスフェクションは１００％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で実施された。トランスフェクションの８時間後に撮像した。 図１の実験、及びＤＨＤＬｉｎＳを使用したトランスフェクション後の、示されている時点に測定した蛍光を示す。 図１と同様であるが、示されている量のＲＮＡ（単位：ナノグラム）及び示されている脂質対ＲＮＡの質量比（ＲＮＡ１マイクログラムあたりの脂質のマイクログラム）を用いて行った実験の結果を示す。トランスフェクションの１６時間後に撮像した。図に示すように、試験したＲＮＡ量及び脂質対ＲＮＡの質量比のすべてにおいて蛍光シグナルが得られた。 図１と同様であるが、角化細胞の代わりにヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）を用いて行った実験の結果を示す。トランスフェクションの１６時間後に撮像した。「ＬＦ３０００」は、市販のトランスフェクション試薬であるＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００をトランスフェクトされた細胞を示す。「Ｎｅｇ．」は、ＤＨＤＬｉｎＳをトランスフェクトされた細胞と比較したトランスフェクトされていない細胞を示す。 図４と同様であるが、ｈＰＢＭＣの代わりに初代ヒト表皮角化細胞のコンフルエントな層を用いて行った実験の結果を示す。トランスフェクションの２４時間後に撮像した。 図５Ａの実験を拡大表示したものを示す。 図４と同様であるが、ｈＰＢＭＣの代わりに初代ヒト成人皮膚線維芽細胞を用いて行った実験の結果を示す。トランスフェクションの１６時間後に撮像した。 図６の実験を拡大表示したものを示す。 図３と同様であるが、実施例６に記載のようにアセトンでの抽出により精製されたＤＨＤＬｉｎＳを用いて行った実験の結果を示す。 ＤＨＤＬｉｎＳと複合体を形成している、遺伝子編集タンパク質をコードするインビトロ転写されたＲＮＡを初代ヒト表皮角化細胞にトランスフェクトした実験の結果を示す。 ＧＦＰをコードし、かつ、ＤＬｉｎＤＨＳと複合体を形成しているインビトロ転写されたＲＮＡを、初代ヒト表皮角化細胞にトランスフェクトした実験の結果を示す。ＲＮＡ－ＤＬｉｎＤＨＳ複合体を、２０，０００のヒト表皮角化細胞の入った、無血清培地（０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））または５０％ＦＢＳに加えた。トランスフェクションの１６時間後に撮像した。「ＭＣ３ ＬＮＰ」は、モル比が３０：３０：３８．５：１．５のＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＰＥ－ＰＥＧで構成される脂質ナノ粒子内にマイクロ流体デバイスを使用して製剤化されたＧＦＰ ＲＮＡを使用してトランスフェクトされた細胞を意味する。 ＧＦＰをコードし、かつ、ＤＬｉｎＤＨＳと複合体を形成しているインビトロ転写されたＲＮＡを、初代ヒト皮膚線維芽細胞にトランスフェクトした実験の結果を示す。ＧＦＰをコードするＲＮＡのうち、２０％はＣｙ５で標識された。ＲＮＡ－ＤＬｉｎＤＨＳ複合体を、２０，０００のヒト皮膚線維芽細胞の入った１０％ＦＢＳに加えた。トランスフェクションの５０分後、１００分後、１５０分後、２００分後、２５０分後、及び３００分後に撮像した。 ＧＦＰをコードし、かつ、ＤＬｉｎＤＨＳと複合体を形成しているインビトロ転写されたＲＮＡを、初代ヒト皮膚線維芽細胞にトランスフェクトした実験の結果を示す。ＤＬｉｎＤＨＳのうち、１０％はＢＯＤＩＰＹ蛍光タグで標識された。ＲＮＡ－ＤＬｉｎＤＨＳ複合体を、２０，０００のヒト皮膚線維芽細胞の入った１０％ＦＢＳに加えた。トランスフェクション時（「０分」）、ならびにトランスフェクションの２０分後、４０分後、６０分後、８０分後、１００分後、１２０分後、及び１４０分後にＢＯＤＩＰＹチャネルで撮像した。 ＤＬｉｎＤＨＳの合成の概略図を示す。 ＧＦＰをコードし、かつ、ミリスチル、オレイル、リノレイル、及びリノレニル等の異なる脂肪酸由来尾部に結合させたジヒドロキシスペルミン頭部基を含む本発明の化合物と複合体を形成しているインビトロ転写されたＲＮＡを、初代ヒト表皮角化細胞にトランスフェクトした実験の結果を示す。グラフは、研究対象の複合体、及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００と複合体を形成したＲＮＡの、蛍光（ａ．ｕ．）対トランスフェクション後の時間（時間）を示す。 ＧＦＰをコードし、かつ、ジリノレイル脂肪酸由来尾部構造を含む本発明の化合物と複合体を形成しているインビトロ転写されたＲＮＡを、初代ヒト表皮角化細胞にトランスフェクトした実験の結果を示す。試験した化合物の構造は、示されているようにビス－（２－ヒドロキシ－３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイル－ジアミンであり、ラベルは、頭部基の中央のアミノ間炭素鎖の長さを示す（構造にあるｎ）。グラフは、研究対象の複合体、及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００と複合体を形成したＲＮＡの、蛍光（ａ．ｕ．）対トランスフェクション後の時間（時間）を示す。 複合体形成培地のイオン強度（［ＮａＣｌ］、ｍＭ）に対する、いくつかのＤＬｉｎＤＨＳ／ＲＮＡ複合体のＺ平均粒径（ｎｍ）及び多分散指数（ＰＤＩ）を示すグラフを示す。複合体形成培地（示されているイオン強度を有するＲＮＡ水溶液）に脂質を希釈することによって複合体を形成した。 示されているｐＨに調整された２０ｍＭの緩衝液に希釈したＤＬｉｎＤＨＳ／ＲＮＡ複合体のゼータ電位（ｍＶ）を示すグラフを示す。 ＲＮａｓｅ Ａによる処理をしないＤＬｉｎＤＨＳ／ＲＮＡ複合体（「無処理」）、複合体形成後にＲＮａｓｅ Ａにより処理したＤＬｉｎＤＨＳ／ＲＮＡ複合体（「複合体形成後にＲＮａｓｅ」）、及び複合体形成前にＲＮａｓｅ Ａにより処理したＲＮＡと複合体を形成しているＤＬｉｎＤＨＳ（「複合体形成前にＲＮａｓｅ」）の画像を示す。 初代ヒト皮膚線維芽細胞、活性化ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ヒト肺腺癌細胞、多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、及びラット胚性皮質ニューロンにおける、ＧＦＰをコードし、かつ、ＤＬｉｎＤＨＳと複合体を形成している、インビトロ転写されたＲＮＡのトランスフェクションの結果を示す。 インビトロ転写されたＲＮＡをＤＬｉｎＤＨＳとの複合体にし、ラットに皮内注射により投与した実験の結果を示す。注射部位の組織を固定してスライドに封入し、次いで、ヘマトキシリン（青色）及びウサギ抗ＧＦＰ抗体（茶色）で染色した。同一組織が２つの異なる倍率で示されている。 ＧＦＰをコードし、かつ、ＤＬｉｎＤＨＳと複合体を形成しているＲＮＡを皮内注射で投与してから４８時間後に蛍光共焦点顕微鏡により撮像された生検したヒトの皮膚を示す。 皮内注射によるヒト対象へのｍＲＮＡインビボ送達の実験の結果を示す。
本発明は、部分的に、とりわけ、例えば、トランスフェクション中の、細胞への核酸の送達を支持する優れた能力を示す新規脂質の発見に基づく。本発明は、そのような組成物、かかる組成物を作製する方法、及びかかる組成物を、例えば疾患の治療のために、細胞に核酸を導入するために使用する方法を提供する。
化合物及び合成方法
態様では、本発明は、式（Ｉ）の化合物に関し、
式中、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、及びＱ４は、独立して、正電荷をとることができる原子または基であり、
Ａ１及びＡ２は、独立して、ヌル、Ｈ、または任意選択で置換されたＣ１－Ｃ６アルキルであり、
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、独立して、ヌル、結合、（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、（ハロ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、（アルコキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルカンジイル、複素環－ジイルであるか、または前述を任意に組み合わせたものであって、任意選択でエーテル、エステル、無水物、アミド、カルバマート、第二級アミン、第三級アミン、第四級アンモニウム、チオエーテル、尿素、カルボニル、もしくはイミンのうちの１つ以上により連結されているものであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、独立して、ヌル、Ｈ、（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（ハロ）（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（アルコキシ）（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（ハロ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（ヒドロキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（アルコキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニル、（ハロ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニル、（ヒドロキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニル、（アルコキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニルであり、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８のうちの少なくとも１つが少なくとも２つの不飽和結合を含み、かつ、
ｘ、ｙ、及びｚは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
実施形態では、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、及びＱ４は、独立して、Ｎ、Ｂ、Ｐ、またはＦｅである。
実施形態では、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、及びＱ４は、Ｎである。
実施形態では、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、及びＱ４は、独立して、第一級アミン、第二級アミン、または第三級アミンである。
実施形態では、Ｑ１及びＱ４は第一級アミンであり、Ｑ２及びＱ３は、第三級アミンである。
実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、独立して、（Ｃ１－Ｃ６）アルカンジイルまたは（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ６）アルカンジイルである。
実施形態では、Ｌ１及びＬ３は、独立して、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ６）アルカンジイルであり、Ｌ２は、（Ｃ１－Ｃ６）アルカンジイルである。
実施形態では、Ｌ１及びＬ３は２－ヒドロキシプロパンジイルであり、Ｌ２は、（Ｃ１－Ｃ６）アルカンジイルである。
実施形態では、Ｌ１及びＬ３は２－ヒドロキシプロパンジイルであり、Ｌ２は、ブタンジイルである。
実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８のうちの１つ以上は、独立して、Ｈ、リノレイル、アルファ－リノレニル、ガンマ－リノレニル、リノエライジル（ｌｉｎｏｅｌａｉｄｙｌ）、アラキドニル、エイコサペンタエニル、及びドコサヘキサエニルから選択される。
実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８のうちの２つ以上は、独立して、Ｈ、リノレオイル、アルファ－リノレノイル、ガンマ－リノレノイル、リノエライドイル、アラキドノイル、エイコサペンタエノイル、及びドコサヘキサエノイルから選択される。
実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８のうちの１つ以上は、独立して、Ｈ、ミリストレイル、パルミトレイル、サピエニル（ｓａｐｉｅｎｙｌ）、オレイル、エライジル、バクセニル、エルシル、カプリリル、カプリル、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、ステアリル、アラキジル、ベヘニル、リグノセリル、及びセロチル（ｃｅｒｏｔｙｌ）から選択される。
実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８のうちの２つ以上は、独立して、Ｈ、ミリストレオイル、パルミトレオイル、サピエノイル、オレオイル、エライドイル、バクセノイル、エルコイル、カプリロイル、カプロイル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、アラキドイル、ベヘノイル、リグノセロイル、及びセロトイルから選択される。
実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７及びＲ８はＨであり、Ｒ４及びＲ６は、独立して、リノレイル、アルファ－リノレニル、ガンマ－リノレニル、リノエライジル（ｌｉｎｏｅｌａｉｄｙｌ）、アラキドニル、エイコサペンタエニル、及びドコサヘキサエニルから選択される。
実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７及びＲ８はＨであり、Ｒ４及びＲ６は、アルファ－リノレニルである。
実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７及びＲ８はＨであり、Ｒ４及びＲ６は、リノレイルである。
実施形態では、ｘ及びｚは、独立して、０または１であり、ｙは１である。
実施形態では、Ｑ１及びＱ４は第一級アミンであり、Ｑ２及びＱ３は第三級アミンであり、Ｌ１及びＬ３は２－ヒドロキシプロパンジイルであり、Ｌ２はブタンジイルであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７及びＲ８はＨであり、Ｒ４及びＲ６はリノレイルであり、ｘ、ｙ、及びｚは１である。
実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３のうちの１つ以上は、少なくとも１つのエステル部分を含む。
実施形態では、Ｒ２及びＲ４のうちの１つ以上は、少なくとも１つのエステル部分を含む。
実施形態では、Ａ１及びＡ２は、Ｈである。
態様では、本発明は、式（ＩＩ）の化合物に関し、
式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７、及びＲ２８は、独立して、Ｈ、ハロ、ＯＨ、（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（ハロ）（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（アルコキシ）（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロであり、
ｉ、ｊ、ｋ、ｍ、ｓ、及びｔは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
実施形態では、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８ Ｒ１９、及びＲ２０はＨであり、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、独立して、Ｈまたは（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであり、ｍは８であり、ｉは８であり、ｓは１であり、ｊは１であり、ｋは４であり、ｔは４である。
実施形態では、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８ Ｒ１９、及びＲ２０はＨであり、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、独立して、Ｈまたは（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであり、Ｒ２７及びＲ２８はメチルであり、ｍは８であり、ｉは８であり、ｓは１であり、ｊは１であり、ｋは４であり、ｔは４である。
実施形態では、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８ Ｒ１９、及びＲ２０はＨであり、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、独立して、Ｈであり、Ｒ２７及びＲ２８はメチルであり、ｍは８であり、ｉは８であり、ｓは１であり、ｊは１であり、ｋは４であり、ｔは４である。
実施形態では、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８ Ｒ１９、及びＲ２０はＨであり、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、独立して、Ｈであり、Ｒ２７及びＲ２８はメチルであり、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、及びＲ２６はＨであり、ｍは８であり、ｉは８であり、ｓは１であり、ｊは１であり、ｋは４であり、ｔは４である。
実施形態では、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８ Ｒ１９、及びＲ２０はＨであり、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、独立して、Ｈであり、Ｒ２７及びＲ２８はメチルであり、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、及びＲ２６はＨであり、ｍは９であり、ｉは９であり、ｓは１であり、ｊは１であり、ｋは４であり、ｔは４である。
実施形態では、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８ Ｒ１９、及びＲ２０はＨであり、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、独立して、Ｈであり、Ｒ２７及びＲ２８はメチルであり、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、及びＲ２６はＨであり、ｍは９であり、ｉは９であり、ｓは１であり、ｊは１であり、ｋは３であり、ｔは３である。
態様では、本発明は、式（ＩＩＩ）の化合物に関し、
式中、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、及びＬ７は、独立して、結合、（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、（ハロ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、（アルコキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルカンジイル、複素環－ジイル、－（ＣＨ２）ｖ１－Ｃ（Ｏ）－、または－（（ＣＨ２）ｖ１－Ｏ）ｖ２－、または－（（ＣＨ２）ｖ１－Ｃ（Ｏ）－Ｏ）ｖ２－であり、
Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈ、（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（ハロ）（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（アルコキシ）（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（ハロ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（ヒドロキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（アルコキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニル、（ハロ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニル、（ヒドロキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニル、（アルコキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニルであり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも１つが少なくとも２つの不飽和結合を含み、
ｖ、ｖ１及びｖ２は、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
実施形態では、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、及びＬ７は、－（ＣＨ２）３－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも２つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む。
実施形態では、Ｌ４及びＬ５は、－（ＣＨ２）３－であり、Ｌ６及びＬ７は、－（ＣＨ２）４－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも２つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む。
実施形態では、Ｌ４及びＬ６は、－（ＣＨ２）３－であり、Ｌ５及びＬ７は、－（ＣＨ２）４－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも２つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む。
実施形態では、Ｌ４及びＬ７は、－（ＣＨ２）３－であり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）４－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも２つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む。
実施形態では、Ｌ４及びＬ６は、－（ＣＨ２）３－であり、Ｌ５及びＬ７は、－（ＣＨ２）５－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも２つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む。
実施形態では、Ｌ４及びＬ７は、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイルであり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）３－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも２つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む。
実施形態では、Ｌ４及びＬ７は、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイルであり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）３－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも３つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む。
実施形態では、Ｌ４及びＬ７は、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイルであり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）４－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも３つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む。
実施形態では、Ｌ４及びＬ７は、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイルであり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）５－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも３つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む。
実施形態では、Ｌ４及びＬ７は、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイルであり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）６－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも３つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む。
実施形態では、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの２つ以上は、独立して、Ｈ、ミリストレオイル、パルミトレオイル、サピエノイル、オレオイル、エライドイル、バクセノイル、エルコイル、カプリロイル、カプロイル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、アラキドイル、ベヘノイル、リグノセロイル、及びセロトイルから選択される。
実施形態では、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの２つ以上は、独立して、Ｈ、リノレイル、アルファ－リノレニル、ガンマ－リノレニル、リノエライジル（ｌｉｎｏｅｌａｉｄｙｌ）、アラキドニル、エイコサペンタエニル、及びドコサヘキサエニルから選択される。
実施形態では、Ｌ４及びＬ７は２－ヒドロキシプロパンジイルであり、Ｌ２はブタンジイルであり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、及びＲ３２はＨであり、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５はリノレイルであり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）３－であり、ｖは１である。
実施形態では、Ｌ４及びＬ７は２－ヒドロキシプロパンジイルであり、Ｌ２はブタンジイルであり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、及びＲ３２はＨであり、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５はリノレイルであり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）４－であり、ｖは１である。
実施形態では、Ｌ４及びＬ７は２－ヒドロキシプロパンジイルであり、Ｌ２はブタンジイルであり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、及びＲ３２はＨであり、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５はリノレイルであり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）５－であり、ｖは１である。
実施形態では、Ｌ４及びＬ７は２－ヒドロキシプロパンジイルであり、Ｌ２はブタンジイルであり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、及びＲ３２はＨであり、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５はリノレイルであり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）６－であり、ｖは１である。
実施形態では、本発明は、式（ＩＶ）の化合物に関し、
式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
実施形態では、本発明は、式（Ｖ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（ＶＩ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（ＶＩＩ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（ＶＩＩＩ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（ＩＸ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（Ｘ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（ＸＩ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（ＸＩＩ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（ＸＩＩＩ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（ＸＩＶ）の化合物に関する
実施形態では、本発明は、式（ＸＶ）の化合物に関し、
式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
実施形態では、本発明は、式（ＸＶＩ）の化合物に関する
本発明はまた、化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び本発明の組成物を調製するための中間体及び合成方法に関する。
実施形態では、化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）、及び／または化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）を含む医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体及び／または脂質核酸複合体及び／またはリポソーム及び／または脂質ナノ粒子は、室温（例えば、約２０～２５℃）及び／または低温（例えば、約０℃、または約－１０℃、または約－２０℃、または約－３０℃、または約－４０℃、または約－５０℃、または約－６０℃、または約－７０℃、または約－８０℃）でアルコール（例えば、エチルアルコール）に可溶性である。
特定の合成方法、例えば、本明細書に記載の化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）の調製に有用な方法が発見された。特定の実施形態は、リチウム及び／またはアルミニウム化合物を含有する反応物から有機化合物を抽出するための方法に関する。他の実施形態は、還元剤を含有する反応物から有機化合物を抽出するための方法に関する。一実施形態では、還元剤は、金属水素化物である。別の実施形態では、還元剤は、水素化アルミニウムリチウムである。いくつかの実施形態では、反応を水で停止させて反応停止反応物を得る。他の実施形態では、反応停止反応物から１つ以上の溶媒を、例えば、蒸発により、除去する。一実施形態では、反応停止反応物を、例えば、加熱及び／または減圧下で乾燥させる。別の実施形態では、乾燥させた反応停止反応物を溶媒で抽出する。いくつかの実施形態では、溶媒は、アルコールである。一実施形態では、アルコールは、イソプロピルアルコールである。別の実施形態では、イソプロピルアルコールを約８０℃まで加熱する。さらなる実施形態では、有機化合物を含有する溶媒をデカント及び／またはろ過する。さらに別の実施形態では、溶媒を、例えば、蒸発により、除去して有機化合物を得る。
本発明の化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）を精製するための方法もまた発見された。したがって、特定の実施形態は、化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）を精製するための方法を対象とする。一実施形態では、化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）と１つ以上の不純物とを含有する試料を溶媒に懸濁させる。一実施形態では、溶媒はアセトンである。別の実施形態では、溶媒を加熱する。いくつかの実施形態では、化合物は、溶媒に可溶性である。他の実施形態では、１つ以上の不純物のうちの少なくとも１つは溶媒に不溶性である。一実施形態では、１つ以上の不純物は、フタルイミド誘導体を含む。一実施形態では、１つ以上の不純物は、フタルヒドラジンを含む。さらなる実施形態では、試料はアセトンに懸濁され、化合物は溶解し、１つ以上の不純物のうちの少なくとも１つが沈殿物を形成する。さらに別の実施形態では、沈殿物を、デカント、ろ過、及び／または遠心分離によって除去する。さらに別の実施形態では、溶媒を、例えば、蒸発により、除去して精製化合物を得る。
態様では、本発明は、水素化アルミニウムリチウムと溶媒とを含有する反応物から有機化合物を抽出するための方法に関し、抽出された有機化合物が得られるよう、（ａ）水で反応を停止させること、（ｂ）溶媒を除去すること、（ｃ）過剰の水を除去すること、及び（ｄ）アルコール（任意選択でイソプロピルアルコール）で有機化合物を抽出することを含む。
態様では、本発明は、水反応性化合物と第１の溶媒とを含有する反応物から有機化合物を抽出するための方法に関し、抽出された有機化合物が得られるよう、（ａ）水で反応を停止させること、（ｂ）第１の溶媒を除去すること、（ｃ）過剰の水を除去すること、及び（ｄ）第２の溶媒で有機化合物を抽出することを含む。
態様では、本発明は、有機化合物と、フタルイミドまたはフタルイミド誘導体（任意選択でフタルヒドラジン）との混合物からの有機化合物を精製するための方法に関し、精製された有機化合物が得られるよう、（ａ）混合物をアセトンに溶解させて沈殿物を形成させること、（ｂ）沈殿物を遠心分離により除去すること、及び（ｃ）アセトンを除去することを含む。
医薬組成物、脂質凝集体、脂質担体
実施形態では、本発明は、本明細書に記載の化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）を含む医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体及び／または脂質核酸複合体及び／またはリポソーム及び／または脂質ナノ粒子に関する。
実施形態では、医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体及び／または脂質核酸複合体及び／またはリポソーム及び／または脂質ナノ粒子は、例えば、脂質ナノ粒子、リポソーム、ミセル、交互に配された二重層（ｉｎｔｅｒｌｅａｖｅｄ ｂｉｌａｙｅｒ）等を含め、任意の物理的形態にある。
実施形態では、医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、リポソームである。実施形態では、リポソームは、大型単層小胞（ＬＵＶ）、多層小胞（ＭＬＶ）または小型単層小胞（ＳＵＶ）である。実施形態では、リポソームは、直径が最高で約５０～８０ｎｍである。実施形態では、リポソームは、直径が約８０～１０００ｎｍ超、またはそれ以上である。実施形態では、リポソームは、直径が約５０～１０００ｎｍ、例えば、約２００ｎｍ以下である。サイズは、形成された粒子のサイズ（直径）を示す。あるいは、サイズは、形成された粒子の流体力学的半径を示す場合がある。粒度分布は、サブミクロンパーティクルサイザーＮｉｃｏｍｐ Ｍｏｄｅｌ ３７０で準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）を使用して決定され得る。
特定の実施形態では、本発明は、核酸が脂質層内に封入されている、脂質に封入された核酸粒子を生成するための方法及び組成物に関する。ＲＮＡを組み込むことが含まれるがこれに限定されない、そのような核酸－脂質粒子は、薬物対脂質比、封入率（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）、粒径、及び多分散指数（ＰＤＩ）を含め、様々な生物物理学的パラメータを使用して特徴付けられる。高い薬物対脂質比、高い封入率、良好なヌクレアーゼ耐性と血清安定性及び制御可能な粒径、一般に、２００ｎｍ未満の直径が望ましい（これに限定されない）。
特定の実施形態では、トランスフェクション効率に影響を与え得る粒径は、複合体形成培地のイオン強度に依存する。他の実施形態では、粒径は、体液のイオン強度に依存し得る。実施形態では、粒径は、複合体形成培地のｐＨ、または体液のｐＨに依存する。様々な実施形態では、粒径は、複合体形成の時間もしくは温度、あるいは医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体及び／または脂質核酸複合体及び／またはリポソーム及び／または脂質ナノ粒子の構成成分の混合率に依存する。いくつかの実施形態では、粒径は、粒子分布の平均サイズを報告するＺ平均粒径として測定され得る。いくつかの実施形態では、望ましい粒径は、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、または約１５０ｎｍ～約２００ｎｍ、または約１５０ｎｍ～約１７５ｎｍ、または約１５５～約１６５ｎｍである。
本発明による脂質ナノ粒子の別の物理的特性は、それらの粒度分布の指標である多分散指数（ＰＤＩ）である。用語「多分散度」（または「分散度」）は、粒子の粒度分布の不均一性の程度を説明するために使用される。ＰＤＩは無次元であり、０．１５より小さい値が単分散と見なされるようスケーリングされる。Ｄａｎａｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．２０１８ Ｍａｙ １８；１０（２）：５７。０．７より大きいＰＤＩ値は、試料の粒度分布が非常に広く、動的光散乱法（ＤＬＳ）技術による分析に好適な場合があることを示す。同文献。０．３未満のＰＤＩ値は、脂質ベースの担体を使用する薬物送達用途において許容できると考えられ、０．２未満の値は一般的に、様々なポリマーベースのナノ粒子用の実施において許容できると考えられる。同文献．；Ｂａｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｇｅｓｔ Ｊ．Ｎａｎｏｍａｔｅｒ．Ｂｉｏｓｔｒｕｃｔ．２０１４，９，８３－９１、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０１１，４０８，２２３－２３４、Ｐｕｔｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７，１４，７９－８５も参照のこと。
いくつかの実施形態では、粒径という尺度（例えば、Ｚ平均粒径（ｎｍ）として測定）及びＰＤＩという尺度は、トランスフェクションについての脂質ナノ粒子の適合性を表す。実施形態では、本発明による脂質担体は、サイズが直径２００ｎｍ未満であり、ＰＤＩが０．２未満である。
いくつかの実施形態では、本発明による脂質担体は、ゼータ電位がｐＨ依存性である。ボルト（Ｖ）またはミリボルト（ｍＶ）で測定されるゼータ電位は、ナノ粒子の特徴付けのために決定され、表面電荷を推定するもので、これは、ナノ懸濁液の物理的安定性を理解するために使用することができる。ゼータ電位は、コロイド状分散液の安定性の重要な指標である。ゼータ電位は、粒子の二重層（ＤＬ）の境界またはずり面（ｓｈｅａｒ ｐｌａｎｅ）の電位であり、典型的には＋１００～－１００ｍＶの範囲の値を有する。静電的に安定化している懸濁液には、マイナス２０ｍＶ未満またはプラス２０ｍＶ超であるゼータ電位値が典型的には望ましい。ゼータ電位は、培地のｐＨの影響を受ける。他の要因としては、イオン強度、添加物（複数可）の濃度、及び温度が挙げられる。
いくつかの実施形態では、脂質粒子を含む医薬組成物のゼータ電位は、７．０超のｐＨで－２０ｍＶ未満、または７．１超のｐＨで－２０ｍＶ未満、または７．２超のｐＨで－２０ｍＶ未満、または７．３超のｐＨで－２０ｍＶ未満、または７．４超のｐＨで－２０ｍＶ未満、または７．５超のｐＨで－２０ｍＶ未満である。
実施形態では、本開示による化合物、医薬組成物、または脂質凝集体は、Ｚ平均粒径が約５０ｎｍ～約２０００ｎｍ、または約７００ｎｍ～約１５００ｎｍである。いくつかの実施形態では、Ｚ平均粒径は約７５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、Ｚ平均粒径は約２００ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、限定するわけではないが、化合物、または医薬組成物、または脂質凝集体が投与部位からインビボで透過する能力を決定するために、調整可能な（ｔｉｔｒａｂｌｅ）粒径が望ましい。
いくつかの実施形態では、本開示による化合物、医薬組成物、または脂質凝集体が形成される培地の特性を使用して、Ｚ平均粒径を制御する。
実施形態では、本開示による化合物、医薬組成物、または脂質凝集体が形成される培地のイオン強度を使用して、Ｚ平均粒径を制御する。
実施形態では、粒径は、脂質凝集体の形成培地中の任意の１つ以上の溶質（例えば、限定することなく、塩化ナトリウム、または塩化カルシウム、または塩化カリウム、またはリン酸ナトリウム）の濃度の制御により決定される。実施形態では、脂質凝集体は、溶質を何も加えずに脱イオン水中で形成され、これが、任意選択で、粒径を制御するために使用され得る。
実施形態では、本開示による化合物、医薬組成物、または脂質凝集体が形成される培地のイオン強度を使用して、粒径を２００ｎｍ以下に維持する。
実施形態では、本開示による化合物、医薬組成物、または脂質凝集体が形成される培地のｐＨを使用して、Ｚ平均粒径を制御する。
実施形態では、本開示による化合物、医薬組成物、または脂質凝集体は、安定した粒子分散液を含む。いくつかの実施形態では、安定した分散液は、ｐＨが約７．０～約８．０であるかまたはｐＨ約７．４である。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ等）と脂質ナノ粒子との複合体形成により、ヌクレアーゼ耐性が付与される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ、任意選択でＲＮａｓｅ Ａである。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅは、インビボで天然に存在する。
核酸対脂質比は、定義された体積の調製物中の核酸の量を、同体積中の脂質の量で割ったものである。これは、モル／モルに基づくか、または重量／重量に基づくか、または重量／モルに基づくか、またはモル／重量に基づき得る。最終の、すぐに投与できる製剤の場合、核酸：脂質比は、任意選択で、可能な限り多くの外部核酸が除去されるよう透析、クロマトグラフィー及び／または酵素（例えば、ヌクレアーゼ）消化が使用された後で計算され得る。
封入率とは、出発混合物の薬物（核酸を含む）対脂質比を、最終の、投与に適した製剤の薬物（核酸を含む）対脂質比で割ったものを指す。これは、相対的な効率の尺度である。絶対的な効率の尺度の場合、最終的に投与に適した製剤となるまでに出発混合物に加えられた核酸の総量も計算することができる。製剤過程で失われた脂質量も計算され得る。効率は、製剤の損失と費用の尺度である。
トランスフェクション
実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体には、細胞への巨大分子及び他の化合物の送達のための脂質凝集体における有用性がある。実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体には、細胞への核酸の送達に対する有用性がある。
実施形態では、細胞に核酸をトランスフェクトするための方法が提供され、細胞を、核酸と本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体との複合体と接触させることを含む。実施形態では、核酸と、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体との複合体は、細胞との接触前に形成される。
実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、核酸を高効率で封入する、及び／または薬物：脂質比が高い、及び／または封入核酸を血清での分解及び／またはクリアランスから保護する、及び／または全身送達に好適である、及び／または封入核酸の細胞内送達をもたらす。さらに、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、忍容性が高く、かつ、適切な治療指数を提供するため、有効用量の核酸での患者の治療は、患者に対する重大な毒性及び／またはリスクと関連しない。
実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、ポリカチオン性である。実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、様々なアニオン性巨大分子、例えば、ポリアニオン、例えば、核酸、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡと、安定複合体を形成する。これらの化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、様々な実施形態において、水に分散させると、それらのカチオン性部分を介してポリアニオンと強力に脂質凝集体を形成するという特性を有する。アニオン性化合物に対して過剰のカチオン電荷を使用することにより、ポリアニオン－脂質複合体は細胞膜に吸着され、それにより、細胞による所望の化合物の取り込みが促進され得る。
実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体及び／または脂質核酸複合体及び／またはリポソーム及び／または脂質ナノ粒子は、（ｉ）送達される核酸ペイロードを小さくし、理論に拘束されることを望むわけではないが、それをヌクレアーゼ分解から保護し、受容体介在性の取り込みを増強させること、（ｉｉ）負電荷を持つ細胞膜との会合を、理論に拘束されることを望むわけではないが、複合体に正電荷を与えることにより改善すること、（ｉｉｉ）エンドソーム膜との融合を促進し、理論に拘束されることを望むわけではないが、エンドソーム区画からの複合体の放出を促進すること、及び（ｉｖ）細胞質から核への輸送を増強させること、のうちの１つ以上を媒介する。
実施形態では、本発明は、トランスフェクション効率の高い、トランスフェクションのための本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体、またはトランスフェクションの方法に関する。実施形態では、トランスフェクション効率は、トランスフェクションプロトコルの間に集団全体と比較してトランスフェクトされた細胞の割合を評価することにより測定される。様々な実施形態では、本願の組成物及び方法のトランスフェクション効率は、約３０％超、または約４０％超、または約５０％超、または約６０％超、または約７０％超、または約８０％超、または約９０％超、または約９５％超である。様々な実施形態では、本願の組成物及び方法のトランスフェクション効率は、市販製品（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））のトランスフェクション効率より高い。様々な実施形態では、本願の組成物及び方法のトランスフェクション効率は、市販製品（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））のトランスフェクション効率より約５倍、または１０倍、または１５倍、または２０倍、または３０倍高い。
実施形態では、本発明は、高レベルのエンドソーム脱出を可能にする、トランスフェクションのための本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体、またはトランスフェクションの方法に関する。様々な実施形態では、本願の組成物及び方法のエンドソーム脱出は、市販製品（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））のエンドソーム脱出より多い。様々な実施形態では、本願の組成物及び方法のエンドソーム脱出は、市販製品（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））のエンドソーム脱出より約５倍、または１０倍、または１５倍、または２０倍、または３０倍多い。
実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、血清耐性である。実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、血清中で実質的に安定である。実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、血清耐性である。実施形態では、本願のトランスフェクション方法は、血清の存在下で機能することができる、及び／または血清不活化及び／または培地交換を必要としない。実施形態では、血清中の安定性及び／または血清耐性は、インビトロアッセイにより測定可能である。様々な量の血清でのトランスフェクション効率は、巨大分子（例えば、限定することなく、ＤＮＡまたはＲＮＡ）をトランスフェクトする能力を、任意選択で、市販製品（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））と比較して、評価するために使用され得る。
実施形態では、本発明は、毒性作用が低いかまたは低減されている、トランスフェクションのための本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体、またはトランスフェクションの方法に関する。実施形態では、本発明は、市販製品（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））と比較して毒性作用が低減されている、トランスフェクションのための本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体、またはトランスフェクションの方法に関する。様々な実施形態では、本願の組成物及び方法により、細胞は、トランスフェクション後の生存率が約５０％超、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％になり得る。様々な実施形態では、本願の組成物及び方法により、可能にする、細胞は、トランスフェクション後の生存率が市販製品（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））と比較して５倍、または１０倍、または１５倍、または２０倍、または３０倍高くなり得る。実施形態では、毒性作用には、細胞の形態及び／または生存能の破壊あるいは１つ以上の遺伝子の調節不全が含まれる。
実施形態では、本発明は、トランスフェクトされる核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）からの高レベルのタンパク質発現を可能にする、トランスフェクションのための本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体、またはトランスフェクションの方法に関する。様々な実施形態では、本願の組成物及び方法のタンパク質発現は、トランスフェクションされていない場合より約３０％超、または約４０％超、または約５０％超、または約６０％超、または約７０％超、または約８０％超、または約９０％超、または約９５％超多い。様々な実施形態では、本願の組成物及び方法で得られるタンパク質発現は、市販製品（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で得られるタンパク質発現より多い。様々な実施形態では、本願の組成物及び方法で得られるタンパク質発現は、市販製品（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で得られるタンパク質発現より約５倍、または１０倍、または１５倍、または２０倍、または３０倍多い。
実施形態では、本発明は、様々な細胞型における、本明細書に記載される効率的トランスフェクションを含むトランスフェクションを可能にする、トランスフェクションのための本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体、またはトランスフェクションの方法に関する。実施形態では、本発明は、樹立細胞株、トランスフェクトし難い細胞、初代細胞、幹細胞、及び血液細胞における、本明細書に記載される効率的トランスフェクションを含むトランスフェクションを可能にする、トランスフェクションのための本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体、またはトランスフェクションの方法に関する。実施形態では、細胞型は、角化細胞、線維芽細胞、またはＰＢＭＣである。
実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）、医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、インビトロまたはインビボでの標的細胞へのトランスフェクションまたは化合物の送達に好適である。
実施形態では、本発明は、追加のトランスフェクション用試薬、例えば、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を必要としない、トランスフェクションのための本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体、またはトランスフェクションの方法に関する。
実施形態では、本願化合物は、例えば、効率的トランスフェクションの場合に、追加の脂質またはヘルパー脂質を必要としない医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体の、構成成分である。例えば、実施形態では、例えば、効率的トランスフェクションのために、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ、コレステロール、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質（限定することなく含むか、あるいはＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ、及び／またはコレステロールのＰＥＧ化）のうちの１つ以上を必要としない、医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体。
実施形態では、本願化合物は、追加の脂質またはヘルパー脂質をさらに含む医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体の構成成分である。
実施形態では、追加の脂質またはヘルパー脂質は、カチオン性脂質、アニオン性脂質、中性脂質、多価荷電脂質、及び双性イオン脂質というカテゴリーのうちの１つ以上から選択される。場合によっては、核酸との電荷同士の相互作用を促進するためにカチオン性脂質を使用してよい。
実施形態では、追加の脂質またはヘルパー脂質は、中性脂質である。実施形態では、中性脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、またはコレステロールである。実施形態では、コレステロールは、植物の供給源に由来する。他の実施形態では、コレステロールは、動物、真菌、細菌または古細菌の供給源に由来する。
実施形態では、追加の脂質またはヘルパー脂質は、さらなるカチオン性脂質である。実施形態では、カチオン性脂質は、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－３－（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、または１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）である。
実施形態では、リン脂質、１８：０ ＰＣ、１８：１ ＰＣ、１８：２ ＰＣ、１８：２ ＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＯＰＥ、１８：２ ＰＥ、ＤＭＰＥ、またはその組み合わせをヘルパー脂質として使用する。実施形態では、追加の脂質またはヘルパー脂質は、ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥであり、任意選択で、約１：１の比である。実施形態では、追加の脂質またはヘルパー脂質は、ＤＨＤＯＳとＤＯＰＥであり、任意選択で、約１：１の比である。
実施形態では、追加の脂質またはヘルパー脂質は、市販製品（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））である。
実施形態では、追加の脂質またはヘルパー脂質は、式（Ａ）を有する化合物である。
その場合、Ｒ１及びＲ４は、１７個の炭素原子を有する直鎖アルケニルであり、Ｒ２及びＲ５は、－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ２であり、その場合、ｐは１～４であり、ｌは１～１０であり、かつ、Ｘａは、生理学的に許容されるアニオンである。
実施形態では、追加の脂質またはヘルパー脂質は、ＰＥＧ化脂質である。実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、それに共有結合で結合されたＰＥＧ分子を有し、その場合、ＰＥＧは、平均分子量が約１０ｋＤａ～約４００ｋＤａである。実施形態では、本発明での使用に好適なポリエチレングリコールは、平均分子量が少なくとも１０，０００ダルトンから４０，０００ダルトンのものである。実施形態では、ＰＥＧは、平均分子量が２０，０００～７００，０００ダルトンの範囲等、平均分子量が２０，０００ダルトンであり、例えば、３５，０００～５００，０００ダルトンの範囲等、２０，０００～６００，０００ダルトンの範囲であり、例えば、３５，０００～３５０，０００ダルトンの範囲等、３５，０００～４００，０００ダルトンの範囲であり、例えば、１００，０００～３００，０００ダルトンの範囲等、５０，０００～３５０，０００ダルトンの範囲であり、例えば、２００，０００～３００，０００ダルトンの範囲等、１５０，０００～３５０，０００ダルトンの範囲である。特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物及び方法での使用に好適なポリエチレングリコールは、平均分子量が、約１０，０００ダルトン、約１５，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン、約２５，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン、約３５，０００ダルトン、約５０，０００ダルトン、約７５，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約１５０，０００ダルトン、約２００，０００ダルトン、約２５０，０００ダルトン、約３００，０００ダルトン、約４００，０００ダルトン、１５０，０００ダルトン、２００，０００ダルトン、２５０，０００ダルトン、３００，０００ダルトン、４００，０００ダルトンから選択されるものである。本文脈において、ポリエチレングリコールの平均分子量に言及する「約」とは、＋／－３０％を意味する。実施形態では本明細書に記載される組成物及び方法に関して、共有結合で結合されているＰＥＧは、平均分子量が１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、または４０ｋＤａである。実施形態では、ＰＥＧは、分岐ＰＥＧ、星型ＰＥＧ、または櫛型ＰＥＧである。
一実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体には、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖が含まれ、任意選択で、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ８００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ３０００、及びＰＥＧ４０００から選択される。実施形態では、ＰＥＧは、ＰＥＧ２０００である。実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体には、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）またはその誘導体が含まれる。一実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、ＰＥＧ化脂質１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）を含み、別の実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ）を含み、さらに別の実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ）を含む。さらなる実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、ＰＥＧ化脂質または遊離ＰＥＧ鎖の混合物を含む。
実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、Ｎ－（カルボニル－エトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ）、完全水素化ホスファチジルコリン、コレステロール、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００、カチオン性脂質、ポリカチオン性脂質、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［葉酸塩（ポリエチレングリコール）－５０００］（ＦＡ－ＭＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ）のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＥＧ化ヘルパー脂質は、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）を含む医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体及び／またはリポソーム及び／または脂質ナノ粒子内に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化ヘルパー脂質の濃度、またはＰＥＧ化ヘルパー脂質と本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）のうちのいずれか１つ以上との比、またはＰＥＧ化ヘルパー脂質と核酸の比を使用して粒径に影響を与える。いくつかの実施形態では、粒径は、他の要因（例えば、限定することなく、粒子を含有する溶液のイオン強度、粒子を含有する溶液への塩の添加、粒子を含有する溶液への他の小分子の添加、粒子を含有する溶液のｐＨの調節）により決定される。いくつかの実施形態では、他の要因による粒径制御は、１つ以上のＰＥＧ化ヘルパー脂質と併せて、または１つ以上のＰＥＧ化ヘルパー脂質の代わりに使用される。
一実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、約３．２ｍｇ／ｍＬのＮ－（カルボニル－エトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＭＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ）、約９．６ｍｇ／ｍＬの完全水素化ホスファチジルコリン、約３．２ｍｇ／ｍＬのコレステロール、約２ｍｇ／ｍＬの硫酸アンモニウム、及び緩衝液としてのヒスチジンを含み、約０．２７ｍｇ／ｍＬの１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［葉酸塩（ポリエチレングリコール）－５０００］（ＦＡ－ＭＰＥＧ５０００－ＤＳＰＥ）が脂質混合物に加えられる。別の実施形態では、核酸は、約１μｇの核酸あたり１μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００を合わせ、室温で少なくとも約５分間インキュベートすることにより複合体化される。一実施形態では、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００は、脂質を約１ｍｇ／ｍＬの濃度で含む溶液である。実施形態では、核酸は、約１μｇの核酸あたり約１０μｇの本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体を合わせ、室温で約５分間インキュベートすることにより封入される。
実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、１つ以上のナノ粒子を含む。一実施形態では、ナノ粒子は、ポリマーナノ粒子である。様々な実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、テトラブロックコポリマー、及びマルチブロックコポリマーのうちの１つ以上を含む。様々な実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾ポリ乳酸（ＰＬＡ）ジブロックコポリマー（ＰＬＡ－ＰＥＧ）、ＰＥＧ－ポリプロピレングリコール－ＰＥＧ修飾ＰＬＡ－テトラブロックコポリマー（ＰＬＡ－ＰＥＧ－ＰＰＧ－ＰＥＧ）、及びポリ（乳酸－コ－グリコール酸）コポリマーを含むポリマーナノ粒子のうちの１つ以上を含む。別の実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、統計コポリマー、もしくは交互コポリマー、もしくは周期コポリマー、または他の任意の種類のポリマーを含む。
実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ／２０００／０２７７９５に記載されている１つ以上の脂質を含む。
実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６２７，１５９号に記載のようにＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（商標）（臭化ヘキサジメトリン）を含む。
様々な実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、１つ以上のポリマーを含む。ポリマーの例としては、臭化ヘキサジメトリン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（商標））、ＤＥＡＥ－デキストラン、プロタミン、硫酸プロタミン、ポリ－Ｌ－リジン、またはポリ－Ｄ－リジンが挙げられる。これらのポリマーをカチオン性脂質と組み合わせて使用し、細胞による取り込み、血清安定性（例えば、インビボでの安定性）を含めた、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体の安定性、エンドソーム脱出、細胞生存率、及びタンパク質発現に対する相乗効果がもたらされるようにしてよい。
実施形態では、本願化合物は、表１から選択される１つ以上の追加の脂質もしくはポリマーをさらに含む医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体の構成成分である。他の実施形態では、本発明の核酸は、表１から選択される１つ以上の脂質もしくはポリマーをさらに含む医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体の構成成分である。
様々な実施形態では、表１の脂質のうちの１つ以上、または２つ以上、または３つ以上、または４つ以上、または５つ以上は、本願化合物を用いた製剤に合わせられ、それらは、医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体の構成成分である。
本発明の医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体及び／または脂質核酸複合体及び／またはリポソーム及び／または脂質ナノ粒子中に存在し得る追加の構成成分としては、ポリアミドオリゴマー（例えば、米国特許第６，３２０，０１７号を参照のこと）、ペプチド、タンパク質、洗浄液、脂質－誘導体、例えば、ホスファチジルエタノールアミンに結合させたＰＥＧ及びセラミドに結合させたＰＥＧ（米国特許第５，８８５，６１３号を参照のこと）等のような、二重層を安定化させる構成成分が挙げられる。
実施形態では、本願脂質としては、さらなるカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、及び形成中の脂質粒子の凝集を低減するよう選択された脂質が含まれ、これは、形成中の電荷誘導性の凝集を防ぐ粒子の立体安定化によりもたらされ得る。形成中の粒子の凝集を低減する脂質の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質、モノシアロガングリオシド Ｇｍ１、及びポリアミドオリゴマー（「ＰＡＯ」）（米国特許第６，３２０，０１７号に記載もの等）が挙げられる。ＰＥＧ、Ｇｍ１またはＡＴＴＡのように、製剤化中の凝集を防ぐ、荷電していない親水性の立体障害部分を有する他の化合物もまた、本発明の方法及び組成物での場合のような使用のために脂質に結合させることもできる。ＡＴＴＡ－脂質は、例えば、米国特許第６，３２０，０１７号に記載されており、ＰＥＧ－脂質複合体は、例えば、米国特許第５，８２０，８７３号、同第５，５３４，４９９号及び同第５，８８５，６１３号に記載されている。典型的には、凝集を低減するよう選択された脂質成分の濃度は、（脂質のモルパーセントで）約０．１～１５％である。製剤化後に粒子が安定している場合は、対象への投与前にＰＥＧまたはＡＴＴＡを透析で除くことができる。
実施形態では、細胞型または組織に特異的な標的指向性部分を使用して、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体を指向させることが望ましい。リガンド、細胞表面の受容体、糖タンパク質、ビタミン（例えば、リボフラビン）及びモノクローナル抗体等の様々な標的指向性部分を使用した脂質粒子の標的指向がこれまでに報告されている（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号及び同第４，６０３，０４４号を参照のこと）。標的指向性部分は、タンパク質全体またはその断片を含むことができる。標的指向機構では一般に、標的部分が標的、例えば、細胞表面受容体との相互作用に利用可能であるように、標的指向物質が脂質粒子の表面に位置していることが必要とされる。様々な異なる標的指向物質及び方法が知られており、かつ当該技術分野で利用可能であり、例えば、Ｓａｐｒａ ａｎｄ Ａｌｌｅｎ，Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４２（５）：４３９－６２（２００３）、及びＡｂｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．１２：１－３，（２００２）に記載のものが挙げられる。標的物質を結合させるための標準的方法を使用することができる。例えば、標的物質の結合のために活性化され得るホスファチジルエタノールアミン、または脂質誘導体化ブレオマイシン等の誘導体化親油性化合物を使用することができる。抗体による標的指向リポソームは、例えば、プロテインＡが組み込まれているリポソーム（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１６３３７－１６３４２（１９９０）及びＬｅｏｎｅｔｔｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８７：２４４８－２４５１（１９９０）を参照のこと）を使用して構築することができる。抗体結合の他の例は、米国特許第６，０２７，７２６号に開示されており、その教示は、参照により本明細書に組み込まれる。標的指向性部分の例には、新生物または腫瘍と関連する抗原等、細胞成分に特異的な他のタンパク質も含まれ得る。標的指向性部分として使用されるタンパク質は、共有結合によりリポソームに結合され得る（Ｈｅａｔｈ，Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，１４９ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１１－１１９（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）を参照のこと）。他の標的指向方法には、ビオチン－アビジン系が含まれる。
実施形態では、本願の組成物及び方法には複合体形成培地が使用される。一実施形態では、複合体形成培地は、ｐＨが、約７超、または約７．２超、または約７．４超、または約７．６超、または約７．８超、または約８．０超、または約８．２超、または約８．４超、または約８．６超、または約８．８超、または約９．０超である。一実施形態では、複合体形成培地は、トランスフェリンを含む。さらなる実施形態では、複合体形成培地は、ＤＭＥＭを含む。さらに別の実施形態では、複合体形成培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む。
核酸
実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、例えば、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含め、核酸との会合に好適である。
実施形態では、核酸は、ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、免疫刺激核酸、アンチセンス、アンタゴｍｉｒ、アンチｍｉｒ、マイクロＲＮＡ模倣体、スーパーｍｉｒ、Ｕ１アダプター、またはアプタマーである。
実施形態では、核酸は、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体内に完全に封入されている。他の実施形態では、核酸は、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体内に部分的に封入されている。さらに他の実施形態では、核酸ならびに本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体はいずれも、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体内に核酸が封入されずに存在する。
完全に封入されていることは、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体にある核酸が、遊離核酸を大幅に分解する血清またはヌクレアーゼアッセイへの曝露後に大幅に分解されないことを示す。実施形態では、完全に封入されている系では、通常であれば遊離核酸の約１００％が分解される処理において粒子核酸の約２５％未満が分解される。実施形態では、粒子核酸の約１０％未満または約５％未満が分解される。
封入の程度は、Ｏｌｉｇｒｅｅｎアッセイにより決定され得る。Ｏｌｉｇｒｅｅｎは、溶液中のオリゴヌクレオチド及び一本鎖ＤＮＡを定量化するための超高感度蛍光核酸染色である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡより入手可能）。
完全に封入されていることはまた、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体が血清安定であること、すなわち、それらが、インビボ投与時にそれらの各構成成分に急速に分解されないことを示唆する。
実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体を核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）との複合体にし、その際、標的細胞型に応じて異なる比、一般には脂質（ｎｇ）：ＲＮＡ（ｎｇ）を約１：１６～約２５：１の範囲の比にする。例示的な脂質：ＲＮＡ比は、約１：１～約１０：１、例えば、限定することなく、約２．５：１、または約５：１である。
核酸濃度、緩衝液の種類と濃度等のような追加のパラメータがトランスフェクション効率に影響を与えるが、それらは、当業者が日常的な実験により改変可能である。
実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡから選択される。
実施形態では、ＤＮＡは、プラスミド、コスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターである。実施形態では、ベクター（またはプラスミド）とは、例えば、異種核酸の発現または複製のためにそれらを細胞に導入するため等に使用される、個別要素を指す。ベクターは、エピソームのまま留まることができるか、またはゲノム染色体への遺伝子もしくはその部分の組み込みをもたらすよう設計することもできる。酵母人工染色体及び哺乳類人工染色体等の人工染色体であるベクターも企図される。そのような媒体の選択及び使用は当業者に周知である。機能的に連結されているＤＮＡ断片の発現をもたらす能力があるプロモーター領域等の制御配列に機能的に連結されているＤＮＡを発現させる能力があるベクターが含まれる（例えば、発現ベクター）。したがって、ベクターとは、プラスミド等の組換えＤＮＡもしくはＲＮＡコンストラクト、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターであって、適切な宿主細胞への導入時にそのＤＮＡの発現をもたらすものを指す。適切なベクターは当業者に周知であり、それらには、真核細胞及び／または原核細胞で複製可能なもの、ならびにエピソームのまま留まるもの、または宿主細胞ゲノムに組み込まれるものが含まれる。
実施形態では、ＲＮＡは、合成ＲＮＡである。実施形態では、ＲＮＡは、化学合成のＲＮＡである。実施形態では、ＲＮＡは、インビトロ転写されたＲＮＡである。
実施形態では、ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、アプタマー、リボザイム及びｍＲＮＡから選択される。
実施形態では、合成ＲＮＡ（限定することなく、ｍＲＮＡを含む）は、非標準ヌクレオチドを含まない。
実施形態では、合成ＲＮＡ（限定することなく、ｍＲＮＡを含む）は、１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む。
実施形態では、１つ以上の非標準ヌクレオチドは、実質的な細胞毒性を回避する。実施形態では、１つ以上の非標準ヌクレオチドは、インビボ細胞毒性を実質的に回避する。実施形態では、１つ以上の非標準ヌクレオチドは、ヒト対象での免疫反応を実質的に回避する。例えば、免疫反応は、自然免疫系を介した免疫応答であり得る。当該技術分野で公知のマーカー（例えば、サイトカイン、インターフェロン、ＴＬＲ）を使用して免疫応答をモニターすることができる。実施形態では、有効用量により、残留毒性を緩和するため使用される免疫抑制剤（例えば、Ｂ１８Ｒ）によるヒト対象の治療の必要性が排除される。
実施形態では、免疫応答は、対応する未修飾核酸により誘導される免疫応答と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約９９．９％、または約９９．９％超低減される。実施形態では、１つ以上の免疫応答マーカーの上方制御は、対応する未修飾核酸により誘導される１つ以上の免疫応答マーカーの上方制御と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約９９．９％、または約９９．９％超低減される。実施形態では、免疫応答マーカーは、インターフェロン遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質産物を含み、これには、インターフェロンアルファ遺伝子、ＩＦＮＢ１、ＴＬＲ３、ＲＡＲＲＥＳ３、ＥＩＦ２ＡＫ２、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＩＦＩＴ１、ＩＦＩＴ２、ＩＦＩＴ３、ＩＦＩＴ５、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、ＯＡＳＬ、ＩＳＧ２０またはその断片、バリアント、類似体、もしくはファミリーメンバーが含まれる。実施形態では、免疫応答マーカーは、ＴＮＦ遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質産物を含み、これには、ＴＮＦアルファ遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ；ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ；ＬＴＢＲ；ＴＮＦＲＳＦ４；ＣＤ４０；ＦＡＳ；ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ；ＣＤ２７；ＴＮＦＲＳＦ８；ＴＮＦＲＳＦ９；ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ；ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ；ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ；ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ；ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ；ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ；ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ；ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ；ＴＮＦＲＳＦ１４；ＮＧＦＲ；ＴＮＦＲＳＦ１７；ＴＮＦＲＳＦ１８；ＴＮＦＲＳＦ１９；ＴＮＦＲＳＦ２１；ＴＮＦＲＳＦ２５；及びＥＤＡ２Ｒまたはその断片、バリアント、類似体、もしくはファミリーメンバーが含まれる。実施形態では、免疫応答マーカーは、インターロイキン遺伝子のｍＲＮＡまたはタンパク質産物を含み、これには、ＩＬ－６遺伝子、ＩＬ－１；ＩＬ－２；ＩＬ－３；ＩＬ－４；ＩＬ－５；ＩＬ－６；ＩＬ－７；ＩＬ－８もしくはＣＸＣＬ８；ＩＬ－９；ＩＬ－１０；ＩＬ－１１；ＩＬ－１２；ＩＬ－１３；ＩＬ－１４；ＩＬ－１５；ＩＬ－１６；ＩＬ－１７；ＩＬ－１８；ＩＬ－１９；ＩＬ－２０；ＩＬ－２１；ＩＬ－２２；ＩＬ－２３；ＩＬ－２４；ＩＬ－２５；ＩＬ－２６；ＩＬ－２７；ＩＬ－２８；ＩＬ－２９；ＩＬ－３０；ＩＬ－３１；ＩＬ－３２；ＩＬ－３３；ＩＬ－３５；ＩＬ－３６またはその断片、バリアント、類似体、もしくはファミリーメンバーが含まれる。
実施形態では、細胞死は、対応する未修飾核酸で観察される細胞死より約１０％、約２５％、約５０％、約７５％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９５％超少ない。さらに、細胞死は、修飾核酸と接触した細胞のうち約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％、約１％、約０．１％、約０．０１％または約０．０１％未満より少ない細胞を侵す場合がある。
特定の非標準ヌクレオチドは、ＲＮＡ分子に組み込まれた場合、理論に拘束されることを望むわけではないが、一部には、外来性核酸を検出するタンパク質、例えば、プロテインキナーゼＲ、Ｒｉｇ－１及びオリゴアデニル酸合成酵素ファミリーのタンパク質の、結合を妨げることによってＲＮＡ分子の毒性を低減させることができる。ＲＮＡ分子に組み込まれた場合に、そのＲＮＡ分子の毒性を低減させることが報告されている非標準ヌクレオチドとしては、プソイドウリジン、５－メチルウリジン、２－チオウリジン、５－メチルシチジン、Ｎ６－メチルアデノシン、及びそれらの特定の組み合わせが挙げられる。しかしながら、ＲＮＡ分子のインビボ毒性を低下させることができる非標準ヌクレオチドの化学的特徴は、この時点まで依然として不明であった。さらに、ほとんどの非標準ヌクレオチド、例えば、５－メチルウリジン、２－チオウリジン、５－メチルシチジン、及びＮ６－メチルアデノシンは、それらの大量の組み込みにより、ＲＮＡ分子がタンパク質に翻訳され得る効率を低下させ、タンパク質発現が必要とされる適用では、これらのヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子の有用性が制限され得る。さらに、プソイドウリジンは、合成ＲＮＡ分子がタンパク質に翻訳され得る効率を低下させることなくＲＮＡ分子のウリジンに完全に取って代わることができるが、特定の状況において、例えば、高頻度で繰り返しトランスフェクションを実施する場合には、アデノシン、グアノシン、シチジン、及びプソイドウリジンのみを含有する合成ＲＮＡ分子は、過渡の毒性を示し得る。
実施形態では、非標準ヌクレオチドは、ピリミジンについては２Ｃ位、４Ｃ位、及び５Ｃ位から選択される位置、またはプリンについては６Ｃ位、７Ｎ位及び８Ｃ位から選択される位置における１つ以上の置換を有する。
実施形態では、非標準ヌクレオチドは、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジン、プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヒドロキシプソイドウリジン、５－メチルプソイドウリジン、５－ヒドロキシメチルプソイドウリジン、５－カルボキシプソイドウリジン、５－ホルミルプソイドウリジン、及び５－メトキシプソイドウリジンのうちの１つ以上を、任意選択で、非標準ヌクレオチドの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％の量で含む。
実施形態では、シチジン残基の少なくとも約５０％は非標準ヌクレオチドであり、それらは、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、及び５－メトキシシチジンから選択される。
実施形態では、シチジン残基の少なくとも約７５％または少なくとも約９０％は非標準ヌクレオチドであり、非標準ヌクレオチドは、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、及び５－メトキシシチジンから選択される。
実施形態では、ウリジンの少なくとも約２０％、またはウリジン残基の少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約７５％、もしくは少なくとも約９０％は非標準ヌクレオチドであり、かかる非標準体は、プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヒドロキシプソイドウリジン、５－メチルプソイドウリジン、５－ヒドロキシメチルプソイドウリジン、５－カルボキシプソイドウリジン、５－ホルミルプソイドウリジン、及び５－メトキシプソイドウリジンから選択される。
実施形態では、ウリジン残基の少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％は非標準ヌクレオチドであり、非標準ヌクレオチドは、プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヒドロキシプソイドウリジン、５－メチルプソイドウリジン、５－ヒドロキシメチルプソイドウリジン、５－カルボキシプソイドウリジン、５－ホルミルプソイドウリジン、及び５－メトキシプソイドウリジンから選択される。
実施形態では、グアニン残基の少なくとも約１０％は非標準ヌクレオチドであり、非標準ヌクレオチドは、任意選択で、７－デアザグアノシンである。
実施形態では、合成ＲＮＡは、グアノシン残基の代わりに約５０％以下の７－デアザグアノシンを含む。
実施形態では、合成ＲＮＡは、アデノシン残基の代わりに非標準ヌクレオチドを含まない。
実施形態では、本発明は、ＲＮＡ分子であって、ピリミジンの場合は２Ｃ位及び／または４Ｃ位及び／または５Ｃ位、あるいはプリンの場合は６Ｃ位及び／または７Ｎ位及び／または８Ｃ位における１つ以上の置換を含む１つ以上の非標準ヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子は、一部には、これらの位置での置換が、外来性核酸を検出するタンパク質による合成ＲＮＡ分子の認識を妨げることができるため、標準ヌクレオチドのみを含有する合成ＲＮＡ分子よりも毒性が低い可能性があること、さらに、これらの位置での置換では、一部には、これらの位置での置換が塩基対形成及び塩基のスタッキング相互作用を妨げないため、合成ＲＮＡ分子がタンパク質に翻訳され得る効率への影響が最小限であり得ることに関する。
ピリミジンの場合は２Ｃ位及び／または４Ｃ位及び／または５Ｃ位、あるいはプリンの場合は６Ｃ位及び／または７Ｎ位及び／または８Ｃ位における１つ以上の置換を含む非標準ヌクレオチドの例としては、２－チオウリジン、５－アザウリジン、プソイドウリジン、４－チオウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルプソイドウリジン、５－アミノウリジン、５－アミノプソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－ヒドロキシプソイドウリジン、５－メトキシウリジン、５－メトキシプソイドウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－ヒドロキシメチルプソイドウリジン、５－カルボキシウリジン、５－カルボキシプソイドウリジン、５－ホルミルウリジン、５－ホルミルプソイドウリジン、５－メチル－５－アザウリジン、５－アミノ－５－アザウリジン、５－ヒドロキシ－５－アザウリジン、５－メチルプソイドウリジン、５－アミノプソイドウリジン、５－ヒドロキシプソイドウリジン、４－チオ－５－アザウリジン、４－チオプソイドウリジン、４－チオ－５－メチルウリジン、４－チオ－５－アミノウリジン、４－チオ－５－ヒドロキシウリジン、４－チオ－５－メチル－５－アザウリジン、４－チオ－５－アミノ－５－アザウリジン、４－チオ－５－ヒドロキシ－５－アザウリジン、４－チオ－５－メチルプソイドウリジン、４－チオ－５－アミノプソイドウリジン、４－チオ－５－ヒドロキシプソイドウリジン、２－チオシチジン、５－アザシチジン、プソイドイソシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、Ｎ４－アミノシチジン、Ｎ４－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－アミノシチジン、５－ヒドロキシシチジン、５－メトキシシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メチル－５－アザシチジン、５－アミノ－５－アザシチジン、５－ヒドロキシ－５－アザシチジン、５－メチルプソイドイソシチジン、５－アミノプソイドイソシチジン、５－ヒドロキシプソイドイソシチジン、Ｎ４－メチル－５－アザシチジン、Ｎ４－メチルプソイドイソシチジン、２－チオ－５－アザシチジン、２－チオプソイドイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチルシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシシチジン、２－チオ－５－メチルシチジン、２－チオ－５－アミノシチジン、２－チオ－５－ヒドロキシシチジン、２－チオ－５－メチル－５－アザシチジン、２－チオ－５－アミノ－５－アザシチジン、２－チオ－５－ヒドロキシ－５－アザシチジン、２－チオ－５－メチルプソイドイソシチジン、２－チオ－５－アミノプソイドイソシチジン、２－チオ－５－ヒドロキシプソイドイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチルプソイドイソシチジン、Ｎ４－メチル－５－メチルシチジン、Ｎ４－メチル－５－アミノシチジン、Ｎ４－メチル－５－ヒドロキシシチジン、Ｎ４－メチル－５－メチル－５－アザシチジン、Ｎ４－メチル－５－アミノ－５－アザシチジン、Ｎ４－メチル－５－ヒドロキシ－５－アザシチジン、Ｎ４－メチル－５－メチルプソイドイソシチジン、Ｎ４－メチル－５－アミノプソイドイソシチジン、Ｎ４－メチル－５－ヒドロキシプソイドイソシチジン、Ｎ４－アミノ－５－アザシチジン、Ｎ４－アミノプソイドイソシチジン、Ｎ４－アミノ－５－メチルシチジン、Ｎ４－アミノ－５－アミノシチジン、Ｎ４－アミノ－５－ヒドロキシシチジン、Ｎ４－アミノ－５－メチル－５－アザシチジン、Ｎ４－アミノ－５－アミノ－５－アザシチジン、Ｎ４－アミノ－５－ヒドロキシ－５－アザシチジン、Ｎ４－アミノ－５－メチルプソイドイソシチジン、Ｎ４－アミノ－５－アミノプソイドイソシチジン、Ｎ４－アミノ－５－ヒドロキシプソイドイソシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－アザシチジン、Ｎ４－ヒドロキシプソイドイソシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－メチルシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－アミノシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－ヒドロキシシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－メチル－５－アザシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－アミノ－５－アザシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－ヒドロキシ－５－アザシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－メチルプソイドイソシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－アミノプソイドイソシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－ヒドロキシプソイドイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－メチルシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－アミノシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－ヒドロキシシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－メチル－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－アミノ－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－ヒドロキシ－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－メチルプソイドイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－アミノプソイドイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－ヒドロキシプソイドイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノプソイドイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－メチルシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－アミノシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－ヒドロキシシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－メチル－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－アミノ－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－ヒドロキシ－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－メチルプソイドイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－アミノプソイドイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－ヒドロキシプソイドイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシ－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシプソイドイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシ－５－メチルシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－アミノシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシ－５－ヒドロキシシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシ－５－メチル－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシ－５－アミノ－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシ－５－ヒドロキシ－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシ－５－メチルプソイドイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシ－５－アミノプソイドイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシ－５－ヒドロキシプソイドイソシチジン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－アミノアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシアデノシン、７－デアザアデノシン、８－アザアデノシン、Ｎ６－メチル－７－デアザアデノシン、Ｎ６－メチル－８－アザアデノシン、７－デアザ－８－アザアデノシン、Ｎ６－メチル－７－デアザ－８－アザアデノシン、Ｎ６－アミノ－７－デアザアデノシン、Ｎ６－アミノ－８－アザアデノシン、Ｎ６－アミノ－７－デアザ－８－アザアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシ－７－デアザアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシ－８－アザアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシ－７－デアザ－８－アザアデノシン、６－チオグアノシン、７－デアザグアノシン、８－アザグアノシン、６－チオ－７－デアザグアノシン、６－チオ－８－アザグアノシン、７－デアザ－８－アザグアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザグアノシン、及び５－メトキシウリジンが挙げられるが、これらに限定されない。
実施形態では、本発明は、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジン、５－ヒドロキシウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン、プソイドウリジン、５－ヒドロキシプソイドウリジン、５－メチルプソイドウリジン、５－ヒドロキシメチルプソイドウリジン、５－カルボキシプソイドウリジン、５－ホルミルプソイドウリジン、及び５－メトキシプソイドウリジンから選択される１つ以上の非標準ヌクレオチドに関する。実施形態では、非標準ヌクレオチドの少なくとも５０％、または少なくとも５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン、プソイドウリジン、５－ヒドロキシプソイドウリジン、５－メチルプソイドウリジン、５－ヒドロキシメチルプソイドウリジン、５－カルボキシプソイドウリジン、５－ホルミルプソイドウリジン、及び５－メトキシプソイドウリジンのうちの１つ以上である。
実施形態では、シチジン残基の少なくとも約５０％、または少なくとも約５５％％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジンから選択される非標準ヌクレオチドである。
実施形態では、ウリジン残基の少なくとも約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または少なくとも約５５％、または少なくとも６０％、または少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または１００％は、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン、プソイドウリジン、５－ヒドロキシプソイドウリジン、５－メチルプソイドウリジン、５－ヒドロキシメチルプソイドウリジン、５－カルボキシプソイドウリジン、５－ホルミルプソイドウリジン、及び５－メトキシプソイドウリジンから選択される非標準ヌクレオチドである。
実施形態では、グアノシン残基の少なくとも約１０％（例えば、１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％）は非標準ヌクレオチドであり、非標準ヌクレオチドは、任意選択で、７－デアザグアノシンである。実施形態では、ＲＮＡは、グアノシン残基の代わりに約５０％以下の７－デアザグアノシンを含有する。
実施形態では、ＲＮＡは、アデノシン残基の代わりに非標準ヌクレオチドを含有しない。
特定の非標準ヌクレオチドには代替的命名体系が存在することに注意する。例えば、特定の状況では、５－メチルプソイドウリジンは、「３－メチルプソイドウリジン」または「Ｎ３－メチルプソイドウリジン」または「１－メチルプソイドウリジン」または「Ｎ１－メチルプソイドウリジン」と呼ばれ得る。
接頭辞「アミノ」を含むヌクレオチドは、ヌクレオチドの記述されている位置の原子に結合している窒素原子を含有する任意のヌクレオチドを指し得、例えば、５－アミノシチジンは、５－アミノシチジン、５－メチルアミノシチジン、及び５－ニトロシチジンを指し得る。同様に、接頭辞「メチル」を含むヌクレオチドは、ヌクレオチドの記述されている位置の原子に結合している炭素原子を含有する任意のヌクレオチドを指し得、例えば、５－メチルシチジンは、５－メチルシチジン、５－エチルシチジン、及び５－ヒドロキシメチルシチジンを指し得、接頭辞「チオ」を含むヌクレオチドは、ヌクレオチドの所与の位置の原子に結合しているイオウ原子を含有する任意のヌクレオチドを指し得、接頭辞「ヒドロキシ」を含むヌクレオチドは、ヌクレオチドの所与の位置の原子に結合している酸素原子を含有する任意のヌクレオチドを指し得、例えば、５－ヒドロキシウリジンは、５－ヒドロキシウリジン、及び酸素原子に結合しているメチル基を持つウリジンであって、酸素原子がウリジンの５Ｃ位の原子に結合しているものを指し得る。
したがって、特定の実施形態は、１つ以上の非標準ヌクレオチドを含むＲＮＡを対象とし、その場合、ＲＮＡ分子は、ピリミジンの場合は２Ｃ位及び／または４Ｃ位及び／または５Ｃ位、あるいはプリンの場合は６Ｃ位及び／または７Ｎ位及び／または８Ｃ位における１つ以上の置換が含まれる１つ以上のヌクレオチドを含有する。
実施形態では、非標準ヌクレオチドには、プソイドウリジン、２－チオウリジン、４－チオウリジン、５－アザウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－アミノウリジン、２－チオプソイドウリジン、４－チオプソイドウリジン、５－ヒドロキシプソイドウリジン、５－メチルプソイドウリジン、５－アミノプソイドウリジン、プソイドイソシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、２－チオシチジン、５－アザシチジン、５－ヒドロキシシチジン、５－アミノシチジン、５－メチルシチジン、Ｎ４－メチルプソイドイソシチジン、２－チオプソイドイソシチジン、５－ヒドロキシプソイドイソシチジン、５－アミノプソイドイソシチジン、５－メチルプソイドイソシチジン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、６－チオグアノシン、及び６－チオ－７－デアザグアノシンのうちの少なくとも１つが含まれる。別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドには、プソイドウリジン、２－チオウリジン、４－チオウリジン、５－アザウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－アミノウリジン、２－チオプソイドウリジン、４－チオプソイドウリジン、５－ヒドロキシプソイドウリジン、５－メチルプソイドウリジン、及び５－アミノプソイドウリジンのうちの少なくとも１つ、ならびにプソイドイソシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、２－チオシチジン、５－アザシチジン、５－ヒドロキシシチジン、５－アミノシチジン、５－メチルシチジン、Ｎ４－メチルプソイドイソシチジン、２－チオプソイドイソシチジン、５－ヒドロキシプソイドイソシチジン、５－アミノプソイドイソシチジン、及び５－メチルプソイドイソシチジンのうちの少なくとも１つが含まれる。さらに別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドには、プソイドウリジン、２－チオウリジン、４－チオウリジン、５－アザウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－アミノウリジン、２－チオプソイドウリジン、４－チオプソイドウリジン、５－ヒドロキシプソイドウリジン、及び５－メチルプソイドウリジン、５－アミノプソイドウリジンのうちの少なくとも１つ、ならびにプソイドイソシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、２－チオシチジン、５－アザシチジン、５－ヒドロキシシチジン、５－アミノシチジン、５－メチルシチジン、Ｎ４－メチルプソイドイソシチジン、２－チオプソイドイソシチジン、５－ヒドロキシプソイドイソシチジン、５－アミノプソイドイソシチジン、及び５－メチルプソイドイソシチジンのうちの少なくとも１つ、ならびに７－デアザグアノシン、６－チオグアノシン、６－チオ－７－デアザグアノシン、及び５－メトキシウリジンのうちの少なくとも１つが含まれる。さらに別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドには、５－メチルシチジン及び７－デアザグアノシンが含まれる。別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドには、プソイドウリジンまたは４－チオウリジンまたは５－メチルウリジンまたは５－アミノウリジンまたは４－チオプソイドウリジンまたは５－メチルプソイドウリジンまたは５－アミノプソイドウリジンも含まれる。さらに別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドには、７－デアザアデノシンも含まれる。別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドには、プソイドイソシチジン及び７－デアザグアノシン及び４－チオウリジンが含まれる。さらに別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドには、プソイドイソシチジンまたは７－デアザグアノシン及びプソイドウリジンが含まれる。さらに別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドには、５－メチルウリジン及び５－メチルシチジン及び７－デアザグアノシンが含まれる。さらなる実施形態では、１つ以上のヌクレオチドには、プソイドウリジンまたは５－メチルプソイドウリジン及び５－メチルシチジン及び７－デアザグアノシンが含まれる。別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドには、プソイドイソシチジン及び７－デアザグアノシン及びプソイドウリジンが含まれる。一実施形態では、１つ以上の非標準ヌクレオチドを含むＲＮＡはインビボで存在する。
特定の非標準ヌクレオチドは、インビトロ転写に一般に使用されるＲＮＡポリメラーゼにより、他の非標準ヌクレオチドよりも効率的にＲＮＡ分子内に組み込むことができ、これは、一部には、これらの特定の非標準ヌクレオチドが、標準的な塩基対形成相互作用と塩基のスタッキング相互作用に関与し、かつ、対応する標準ヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼと相互作用する方法と同様の方法でＲＮＡポリメラーゼと相互作用する傾向にあることによる。結果として、１つ以上の非標準ヌクレオチドを含有する特定のヌクレオチド混合物は、一部には、これらのヌクレオチド混合物を含有するインビトロ転写反応により大量のＲＮＡが生成され得ることから有益な場合がある。したがって、特定の実施形態は、ピリミジンの場合は２Ｃ位及び／または４Ｃ位及び／または５Ｃ位、あるいはプリンの場合は６Ｃ位及び／または７Ｎ位及び／または８Ｃ位における１つ以上の置換が含まれる１つ以上のヌクレオチドを含有するヌクレオチド混合物を対象とする。ヌクレオチド混合物としては（各ヌクレオチドの前にある数字は、インビトロ転写反応での非標準ヌクレオチド三リン酸の例示的な割合を示し、例えば、０．２ プソイドイソシチジンとは、アデノシン－５’－三リン酸、グアノシン－５’－三リン酸、ウリジン－５’－三リン酸、シチジン－５’－三リン酸、及びプソイドイソシチジン－５’－三リン酸を含有する反応であって、その場合、プソイドイソシチジン－５’－三リン酸が、モルまたは質量のいずれかに基づいて量を測定した場合に、反応中に存在するプソイドイソシチジン－５’－三リン酸とシチジン－５’－三リン酸とを合わせた総量の０．２倍とほぼ等しい量で反応中に存在するものを指し、ヌクレオシドの前にある２つ以上の数字は、例示的な割合の範囲を示す）、１．０ プソイドウリジン、０．１～０．８ ２－チオウリジン、０．１～０．８ ５－メチルウリジン、０．２～１．０ ５－ヒドロキシウリジン、０．２～１．０ ５－メトキシウリジン、０．１～１．０ ５－アミノウリジン、０．１～１．０ ４－チオウリジン、０．１～１．０ ２－チオプソイドウリジン、０．１～１．０ ４－チオプソイドウリジン、０．１～１．０ ５－ヒドロキシプソイドウリジン、０．２～１ ５－メチルプソイドウリジン、０．２～１．０ ５－メトキシプソイドウリジン、０．１～１．０ ５－アミノプソイドウリジン、０．２～１．０ ２－チオシチジン、０．１～０．８ プソイドイソシチジン、０．２～１．０ ５－メチルシチジン、０．２～１．０ ５－ヒドロキシシチジン、０．２～１．０ ５－ヒドロキシメチルシチジン、０．２～１．０ ５－メトキシシチジン、０．１～１．０ ５－アミノシチジン、０．２～１．０ Ｎ４－メチルシチジン、０．２～１．０ ５－メチルプソイドイソシチジン、０．２～１．０ ５－ヒドロキシプソイドイソシチジン、０．２～１．０ ５－アミノプソイドイソシチジン、０．２～１．０ Ｎ４－メチルプソイドイソシチジン、０．２～１．０ ２－チオプソイドイソシチジン、０．２～１．０ ７－デアザグアノシン、０．２～１．０ ６－チオグアノシン、０．２～１．０ ６－チオ－７－デアザグアノシン、０．２～１．０ ８－アザグアノシン、０．２～１．０ ７－デアザ－８－アザグアノシン、０．２～１．０ ６－チオ－８－アザグアノシン、０．１～０．５ ７－デアザアデノシン、及び０．１～０．５ Ｎ６－メチルアデノシンが挙げられるが、これらに限定されない。
実施形態では、１つ以上の非標準ヌクレオチド組成または合成ポリヌクレオチド組成を含むＲＮＡ（これは、例えば、インビトロ転写により調製され得る）は、実質的または全体に、アデニンまたは遺伝暗号で「Ａ」を有する位置に標準ヌクレオチドを含有する。この文脈での用語「実質的に」とは、少なくとも９０％を指す。これらの実施形態では、ＲＮＡ組成または合成ポリヌクレオチド組成は、遺伝暗号で「Ｇ」のある位置における７－デアザグアノシン及び対応する標準ヌクレオチド「Ｇ」をさらに含有し得（例えば、それからなり得）、Ｇのある位置における標準ヌクレオチド及び非標準ヌクレオチドは、５：１～１：５の範囲であり得るか、または実施形態では、２：１～１：２の範囲であり得る。これらの実施形態では、ＲＮＡ組成または合成ポリヌクレオチド組成は、遺伝暗号で「Ｃ」のある位置における５－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジン、及び標準ヌクレオチド「Ｃ」のうちの１つ以上（例えば、２つ、３つまたは４つ）をさらに含有し得（例えば、それからなり得）、Ｃのある位置における標準ヌクレオチド及び非標準ヌクレオチドは、５：１～１：５の範囲であり得るか、または実施形態では、２：１～１：２の範囲であり得る。実施形態では、「Ｃ」の位置における非標準ヌクレオチドのレベルは、先行段落に記載のとおりである。これらの実施形態では、ＲＮＡ組成または合成ポリヌクレオチド組成は、遺伝暗号で「Ｕ」のある位置における５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン、プソイドウリジン、５－ヒドロキシプソイドウリジン、５－メチルプソイドウリジン、５－ヒドロキシメチルプソイドウリジン、５－カルボキシプソイドウリジン、５－ホルミルプソイドウリジン、及び５－メトキシプソイドウリジンならびに標準ヌクレオチド「Ｕ」のうちの１つ以上（例えば、２つ、３つ、または４つ）をさらに含有し得（例えば、それからなり得）、「Ｕ」のある位置における標準ヌクレオチド及び非標準ヌクレオチドは、５：１～１：５の範囲であり得るか、またはいくつかの実施形態では、２：１～１：２の範囲であり得る。実施形態では、「Ｕ」の位置における非標準ヌクレオチドのレベルは、先行段落に記載のとおりである。
特定の非標準ヌクレオチドを合わせることは、一部には、ＲＮＡ分子の毒性を低下させることへの非標準ヌクレオチドの寄与が相加的であり得ることから有益な場合がある。したがって、実施形態は、ヌクレオチド混合物を対象とし、その場合、ヌクレオチド混合物は、上掲の非標準ヌクレオチドのうち２つ以上を含有し、例えば、ヌクレオチド混合物は、プソイドイソシチジンと７－デアザグアノシンの両方を含有するか、またはヌクレオチド混合物は、Ｎ４－メチルシチジンと７－デアザグアノシンの両方を含有する等である。一実施形態では、ヌクレオチド混合物は、上掲の非標準ヌクレオチドのうち２つ以上を含有し、かかる非標準ヌクレオチドの各々は、混合物中に上掲の割合で存在し、例えば、ヌクレオチド混合物は、０．１～０．８ プソイドイソシチジン及び０．２～１．０ ７－デアザグアノシンを含有するか、またはヌクレオチド混合物は、０．２～１．０ Ｎ４－メチルシチジン及び０．２～１．０ ７－デアザグアノシンを含有する等である。
特定の状況において、例えば、インビトロ転写反応の収量を最大限にする必要がないか、または望ましくない場合、上記以外のヌクレオチドの割合を使用してよい。上掲の例示的な割合及び割合の範囲は、典型的純度（９０％超の純度）のヌクレオチド三リン酸溶液に関する。これら及び他のヌクレオチドのより大きい割合は、より高い純度、例えば、約９５％超の純度または約９８％超の純度または約９９％超の純度または約９９．５％超の純度のヌクレオチド三リン酸溶液を使用することによって使用することができ、これは、例えば、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の既存の化学精製技術を使用してヌクレオチド三リン酸溶液を精製することによって、または他の手段によって達成することができる。一実施形態では、複数の異性体があるヌクレオチドを精製して、所望の異性体を濃縮する。
他の実施形態は、目的のタンパク質を発現するようインビボでの細胞を誘導するための方法であって、細胞を、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体、ならびにＲＮＡ分子であって、ピリミジンの場合は２Ｃ位及び／または４Ｃ位及び／または５Ｃ位、あるいはプリンの場合は６Ｃ位及び／または７Ｎ位及び／または８Ｃ位における１つ以上の置換が含まれる１つ以上の非標準ヌクレオチドを含有するものと接触させることにより行う方法を対象とする。さらに他の実施形態は、インビボでの細胞のトランスフェクション、リプログラミング、及び／または遺伝子編集を行うための方法であって、細胞を、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体、ならびにＲＮＡ分子であって、ピリミジンの場合は２Ｃ位及び／または４Ｃ位及び／または５Ｃ位、あるいはプリンの場合は６Ｃ位及び／または７Ｎ位及び／または８Ｃ位における１つ以上の置換が含まれる１つ以上の非標準ヌクレオチドを含有するものと接触させることにより行う方法を対象とする。一実施形態では、ＲＮＡ分子は、インビトロ転写により生成される。一実施形態では、ＲＮＡ分子は、１つ以上のリプログラミング因子をコードする。別の実施形態では、１つ以上のリプログラミング因子には、Ｏｃｔ４タンパク質が含まれる。別の実施形態では、細胞はまた、Ｓｏｘ２タンパク質をコードするＲＮＡ分子と接触させられる。さらに別の実施形態では、細胞はまた、Ｋｌｆ４タンパク質をコードするＲＮＡ分子と接触させられる。さらに別の実施形態では、細胞はまた、ｃ－Ｍｙｃタンパク質をコードするＲＮＡ分子と接触させられる。さらに別の実施形態では、細胞はまた、Ｌｉｎ２８タンパク質をコードするＲＮＡ分子と接触させられる。
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ等の酵素は、標準ヌクレオチドと非標準ヌクレオチドの両方を含有するインビトロ転写反応では標準ヌクレオチドを選択的に取り込み得る。結果として、特定の割合の非標準ヌクレオチドを含有するインビトロ転写反応では、反応の際に非標準ヌクレオチドが存在していた割合とは異なった、ときにそれより低い割合の非標準ヌクレオチドを含有するＲＮＡが生成される場合がある。したがって、特定の実施形態では、ヌクレオチド取り込みの割合への言及（例えば、「５０％のプソイドイソシチジンを含有する合成ＲＮＡ分子」または「０．１～０．８ プソイドイソシチジン」）は、記述されている割合のヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子を指すほか、たとえ記述されている割合のヌクレオチド（またはヌクレオチド誘導体、例えば、ヌクレオチド三リン酸）を含有する反応において、反応の際に非標準ヌクレオチドが存在していた割合とは異なった割合のヌクレオチドを含有するＲＮＡが生成される場合があっても、そのような反応で合成されたＲＮＡ分子も指し得る。
代替コドンを利用することによって、異なるヌクレオチド配列が同じタンパク質をコードすることができる。したがって、特定の実施形態では、ヌクレオチド取り込みの割合への言及は、記述されている割合のヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子、及び記述されている割合のヌクレオチドを含有する異なるＲＮＡ分子がコードするタンパク質と同じタンパク質をコードするＲＮＡ分子の両方を指し得る。
５－メチルシチジン脱メチル化経路の非標準ヌクレオチドメンバーは、合成ＲＮＡ内に取り込まれた場合、合成ＲＮＡがインビボでタンパク質に翻訳され得る効率を高めることができ、かつ、合成ＲＮＡのインビボでの毒性を減少させることができる。これらの非標準ヌクレオチドとしては、例えば、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－ホルミルシチジン、及び５－カルボキシシチジン（別名「シチジン－５－カルボン酸」）が挙げられる。したがって、特定の実施形態は、核酸を対象とする。実施形態では、核酸はインビボで存在する。一実施形態では、核酸は、合成ＲＮＡ分子である。別の実施形態では、核酸は、１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む。一実施形態では、核酸は、５－メチルシチジン脱メチル化経路の１つ以上の非標準ヌクレオチドメンバーを含む。別の実施形態では、核酸は、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－ホルミルシチジン、及び５－カルボキシシチジンのうちの少なくとも１つまたはそれらの誘導体を含む。さらなる実施形態では、核酸は、プソイドウリジン、５－メチルプソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、及び７－デアザグアノシンのうちの少なくとも１つまたはそれらの誘導体を含む。
５－メチルシチジン脱メチル化経路
非標準ヌクレオチドの特定の組み合わせは、合成ＲＮＡがインビボでタンパク質に翻訳され得る効率を高めることにおいて、及びインビボでの合成ＲＮＡの毒性を減少させることにおいて特に有効であり得、例えば、５－メチルウリジンと５－メチルシチジン、５－ヒドロキシウリジンと５－メチルシチジン、５－ヒドロキシウリジンと５－ヒドロキシメチルシチジン、５－メチルウリジンと７－デアザグアノシン、５－メチルシチジンと７－デアザグアノシン、５－メチルウリジン、５－メチルシチジン、及び７－デアザグアノシン、ならびに５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、及び７－デアザグアノシン、という組み合わせがある。したがって、特定の実施形態は、５－メチルウリジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、及び７－デアザグアノシンのうちの少なくとも２つ、またはそれらの１つ以上の誘導体を含む核酸を対象とする。他の実施形態は、５－メチルウリジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、及び７－デアザグアノシンのうちの少なくとも３つ、またはそれらの１つ以上の誘導体を含む核酸を対象とする。他の実施形態は、５－メチルウリジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、及び７－デアザグアノシンのすべて、またはそれらの１つ以上の誘導体を含む核酸を対象とする。一実施形態では、核酸は、１つ以上の５－メチルウリジン残基、１つ以上の５－メチルシチジン残基、及び１つ以上の７－デアザグアノシン残基または１つ以上の５－メチルウリジン残基、１つ以上の５－ヒドロキシメチルシチジン残基、ならびに１つ以上の７－デアザグアノシン残基を含む。
特定の割合の特定の非標準ヌクレオチド及びそれらの組み合わせを含有する合成ＲＮＡ分子は特に、インビボで高翻訳効率及び低毒性を示し得る。したがって、特定の実施形態は、１つ以上のウリジン残基、１つ以上のシチジン残基、及び１つ以上のグアノシン残基のうちの少なくとも１つを含み、かつ、１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む核酸を対象とする。一実施形態では、ウリジン残基の約２０％～約８０％が５－メチルウリジン残基である。別の実施形態では、ウリジン残基の約３０％～約５０％が５－メチルウリジン残基である。さらなる実施形態では、ウリジン残基の約４０％が５－メチルウリジン残基である。一実施形態では、シチジン残基の約６０％～約８０％が５－メチルシチジン残基である。別の実施形態では、シチジン残基の約８０％～約１００％が５－メチルシチジン残基である。さらなる実施形態では、シチジン残基の約１００％が５－メチルシチジン残基である。さらに別の実施形態では、シチジン残基の約２０％～約１００％が５－ヒドロキシメチルシチジン残基である。一実施形態では、グアノシン残基の約２０％～約８０％が７－デアザグアノシン残基である。別の実施形態では、グアノシン残基の約４０％～約６０％が７－デアザグアノシン残基である。さらなる実施形態では、グアノシン残基の約５０％が７－デアザグアノシン残基である。一実施形態では、シチジン残基の約２０％～約８０％または約３０％～約６０％または約４０％が、Ｎ４－メチルシチジン及び／またはＮ４－アセチルシチジン残基である。別の実施形態では、各シチジン残基が５－メチルシチジン残基である。さらなる実施形態では、シチジン残基の約１００％が、５－メチルシチジン残基及び／または５－ヒドロキシメチルシチジン残基及び／またはＮ４－メチルシチジン残基及び／またはＮ４－アセチルシチジン残基及び／またはそれらの１つ以上の誘導体である。さらに別の実施形態では、ウリジン残基の約４０％が５－メチルウリジン残基であり、シチジン残基の約２０％～約１００％が、Ｎ４－メチルシチジン及び／またはＮ４－アセチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％が７－デアザグアノシン残基である。一実施形態では、ウリジン残基の約４０％が５－メチルウリジン残基であり、シチジン残基の約１００％が５－メチルシチジン残基である。別の実施形態では、ウリジン残基の約４０％が５－メチルウリジン残基であり、グアノシン残基の約５０％が７－デアザグアノシン残基である。さらなる実施形態では、シチジン残基の約１００％が５－メチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％が７－デアザグアノシン残基である。さらなる実施形態では、ウリジン残基の約１００％が５－ヒドロキシウリジン残基である。一実施形態では、ウリジン残基の約４０％が５－メチルウリジン残基であり、シチジン残基の約１００％が５－メチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％が７－デアザグアノシン残基である。別の実施形態では、ウリジン残基の約４０％が５－メチルウリジン残基であり、シチジン残基の約２０％～約１００％が５－ヒドロキシメチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％が７－デアザグアノシン残基である。実施形態では、シチジン残基の１００％未満が５－メチルシチジン残基である。他の実施形態では、シチジン残基の１００％未満が５－ヒドロキシメチルシチジン残基である。一実施形態では、合成ＲＮＡ分子の各ウリジン残基は、プソイドウリジン残基または５－メチルプソイドウリジン残基である。別の実施形態では、ウリジン残基の約１００％が、プソイドウリジン残基及び／または５－メチルプソイドウリジン残基である。さらなる実施形態では、ウリジン残基の約１００％が、プソイドウリジン残基及び／または５－メチルプソイドウリジン残基であり、シチジン残基の約１００％が５－メチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％が７－デアザグアノシン残基である。
５－メチルウリジンの代わりにまたはそれと組み合わせて使用することができる他の非標準ヌクレオチドとしては、プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－ヒドロキシプソイドウリジン、５－メトキシウリジン、５－メトキシプソイドウリジン、５－カルボキシウリジン、５－カルボキシプソイドウリジン、５－ホルミルウリジン、５－ホルミルプソイドウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－ヒドロキシメチルプソイドウリジン、及び５－メチルプソイドウリジン（「１－メチルプソイドウリジン」、「Ｎ１－メチルプソイドウリジン」）またはそれらの１つ以上の誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。５－メチルシチジン及び／または５－ヒドロキシメチルシチジンの代わりにまたはそれと組み合わせて使用することができる他の非標準ヌクレオチドとしては、プソイドイソシチジン、５－メチルプソイドイソシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－ホルミルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－メトキシシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、Ｎ４－アセチルシチジンまたはそれらの１つ以上の誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、例えば、トランスフェクション、注射もしくは送達を１回のみ実施する場合、またはトランスフェクト、注射もしくは送達を受ける細胞、組織、器官もしくは患者が、トランスフェクション関連毒性もしくは自然免疫シグナル伝達に対して特に感受性ではない場合には、非標準ヌクレオチドの割合を減らすことができる。非標準ヌクレオチドの割合を減らすことは、一部には、非標準ヌクレオチドの割合を減らすことで核酸のコストを削減できることから有益な場合がある。特定の状況において、例えば、核酸の免疫原性が最小限所望される場合には、非標準ヌクレオチドの割合を増やすことができる。
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ等の酵素は、標準ヌクレオチドと非標準ヌクレオチドの両方を含有するインビトロ転写反応では標準ヌクレオチドを選択的に取り込み得る。結果として、特定の割合の非標準ヌクレオチドを含有するインビトロ転写反応では、反応の際に非標準ヌクレオチドが存在していた割合とは異なった、ときにそれより低い割合の非標準ヌクレオチドを含有するＲＮＡが生成される場合がある。したがって、特定の実施形態では、ヌクレオチド取り込みの割合への言及（例えば、「５０％の５－メチルウリジン」）は、記述されている割合のヌクレオチドを含有する核酸を指すほか、たとえ記述されている割合のヌクレオチド（またはヌクレオチド誘導体、例えば、ヌクレオチド三リン酸）を含有する反応において、反応の際に非標準ヌクレオチドが存在していた割合とは異なった割合のヌクレオチドを含有する核酸が生成される場合があっても、そのような反応で合成された核酸も指し得る。さらに、代替コドンを利用することによって、異なるヌクレオチド配列が同じタンパク質をコードすることができる。したがって、特定の実施形態では、ヌクレオチド取り込みの割合への言及は、記述されている割合のヌクレオチドを含有する核酸、及び記述されている割合のヌクレオチドを含有する異なる核酸がコードするタンパク質と同じタンパク質をコードする核酸の両方を指し得る。
特定の実施形態は、キャップ０、キャップ１、キャップ２、及びキャップ３から選択される５’－キャップ構造を含む核酸またはその誘導体を対象とする。一実施形態では、核酸は、１つ以上のＵＴＲを含む。別の実施形態では、１つ以上のＵＴＲは核酸の安定性を高める。さらなる実施形態では、１つ以上のＵＴＲは、アルファグロビンまたはベータグロビンの５’－ＵＴＲを含む。さらに別の実施形態では、１つ以上のＵＴＲは、アルファグロビンまたはベータグロビンの３’－ＵＴＲを含む。さらに別の実施形態では、合成ＲＮＡ分子は、アルファグロビンまたはベータグロビンの５’－ＵＴＲと、アルファグロビンまたはベータグロビンの３’－ＵＴＲと、を含む。特定の実施形態は、転写後調節エレメントを含む核酸を対象とする。一実施形態では、転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）、ニワトリリゾチームのマトリックス結合領域（ｃＭＡＲ）、及び５’－ＤＮａｓｅ Ｉ高感受性部位４（ｃＨＳ４）から選択される。別の実施形態では、１つ以上のＵＴＲには、ＷＰＲＥが含まれる。さらなる実施形態では、合成ＲＮＡ分子は、アルファグロビンまたはベータグロビンの５’－ＵＴＲと、ＷＰＲＥを含む３’－ＵＴＲと、を含む。さらに別の実施形態では、合成ＲＮＡ分子は、アルファグロビンまたはベータグロビンの５’－ＵＴＲと、アルファグロビンまたはベータグロビンの３’－ＵＴＲに加え、ＷＰＲＥの１つ以上のコピーを含む。本発明の例示的なＷＰＲＥエレメントは、配列番号８１３、配列番号８１４、配列番号８１５、配列番号８１６、配列番号８１７、及び配列番号８１８である。
一実施形態では、５’－ＵＴＲは、コザックコンセンサス配列と実質的に同様のコザック配列を含む。別の実施形態では、核酸は、３’－ポリ（Ａ）尾部を含む。さらなる実施形態では、３’－ポリ（Ａ）尾部は、約２０ｎｔ～約２５０ｎｔまたは約１２０ｎｔ～約１５０ｎｔの長さである。さらなる実施形態では、３’－ポリ（Ａ）尾部は、約２０ｎｔ、または約３０ｎｔ、または約４０ｎｔ、または約５０ｎｔ、または約６０ｎｔ、または約７０ｎｔ、または約８０ｎｔ、または約９０ｎｔ、または約１００ｎｔ、または約１１０ｎｔ、または約１２０ｎｔ、または約１３０ｎｔ、または約１４０ｎｔ、または約１５０ｎｔ、または約１６０ｎｔ、または約１７０ｎｔ、または約１８０ｎｔ、または約１９０ｎｔ、または約２００ｎｔ、または約２１０ｎｔ、または約２２０ｎｔ、または約２３０ｎｔ、または約２４０ｎｔ、または約２５０ｎｔの長さである。
ポリ（Ａ）ポリメラーゼにより生成されるポリ（Ａ）尾部は、反応時間及び酵素活性を含めた反応条件に応じて長さが異なる場合があり、また酵素による尾部付加反応（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｔａｉｌｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ）では、長さの異なるポリ（Ａ）尾部を有するＲＮＡ分子の混合物が生成される場合がある。特定の実施形態は、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、または約４００、または約４００超のヌクレオチドである尾部を含有する合成ＲＮＡ分子を対象とする。一実施形態では、尾部は、ポリ（Ａ）尾部である。他の実施形態は、約１０より少ないヌクレオチドを含有する尾部を対象とする。
尾部をコードする鋳型を使用してＲＮＡを合成することにより、尾部の長さに関する制御の増大、及び反応内または反応間のばらつきの減少が可能になる。したがって、特定の実施形態は、尾部をコードする鋳型を対象とする。特定の実施形態では、尾部は、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、または約４００のヌクレオチドを含有する。他の実施形態は、尾部をコードする鋳型を使用して合成された合成ＲＮＡ分子を対象とする。
尾部内にアデノシン以外のヌクレオチドを含めることにより、合成ＲＮＡ分子の安定性及び／または翻訳効率を高め、かつ細菌での鋳型ＤＮＡ生成の忠実性を改善することができる。したがって、いくつかの実施形態は、尾部を含む合成ＲＮＡ分子を対象とし、その場合、尾部は、アデノシンヌクレオチド及び１つ以上の他のヌクレオチドを含む。他の実施形態は、尾部をコードする鋳型を対象とし、その場合、尾部は、デオキシアデノシンヌクレオチド及び１つ以上の他のヌクレオチドを含む。一実施形態では、尾部には、グアノシンヌクレオチドが含まれる。別の実施形態では、尾部には、シトシンヌクレオチドが含まれる。さらなる実施形態では、尾部には、ウリジンヌクレオチドが含まれる。さらに別の実施形態では、尾部には、１つ以上の化学的に修飾されたヌクレオチド及び／または非標準ヌクレオチドが含まれる。様々な実施形態では、他のヌクレオチドは、規則正しく空いた間隔で、もしくはランダムな間隔で、または１つ以上のアデノシンヌクレオチドで間が区切られている隣接ヌクレオチドの対もしくはグループで組み込まれる。一実施形態では、尾部には、デオキシグアノシンヌクレオチドが含まれる。別の実施形態では、尾部には、デオキシシトシンヌクレオチドが含まれる。さらなる実施形態では、尾部には、デオキシウリジンヌクレオチドが含まれる。様々な実施形態では、他のヌクレオチドは、規則正しく空いた間隔で、もしくはランダムな間隔で、または１つ以上のデオキシアデノシンヌクレオチドで間が区切られている隣接ヌクレオチドの対もしくはグループで組み込まれる。実施形態では、尾部領域は、約２％～１０％の非ウリジンヌクレオチド、約１０％～２０％の非ウリジンヌクレオチド、約２０％～３５％の非ウリジンヌクレオチドで構成される。
尾部の前または後にステムループ構造を含めることにより、合成ＲＮＡ分子の安定性及び／または翻訳効率を高めることができる。したがって、いくつかの実施形態は、尾部とステムループ構造とを含む合成ＲＮＡ分子を対象とする。様々な実施形態では、ステムループ構造は、尾部の前、尾部の後、または尾部の前もしくは後に出現する。特定の実施形態では、ステムループ構造は、ヒストン３’ＵＴＲステムループである。特定の実施形態では、ステムループ構造の配列は、Ａ（Ｇ（Ｙ（Ｙ（Ｙ（ＵＵＹＵＮＡ）Ｒ）Ｒ）Ｒ）Ｃ）ＡまたはＭ（Ｇ（Ｇ（Ｃ（Ｙ（Ｃ（ＵＵＵＵＭＡ）Ｇ）Ｒ）Ｇ）Ｃ）Ｃ）ＡまたはＡ（Ｇ（Ｇ（Ｙ（Ｙ（Ｙ（ＵＨＨＵＨＡ）Ｒ）Ｒ）Ｒ）Ｃ）Ｃ）Ａである。
本発明の態様は、（ａ）タンパク質をコードする配列と、（ｂ）デオキシアデノシンヌクレオチド及び１つ以上の他のヌクレオチドを含む尾部領域と、（ｃ）制限酵素結合部位とを含むＤＮＡ鋳型を含む組成物である。
実施形態では、尾部領域の長さは、約８０塩基対～約１２０塩基対、約１２０塩基対～約１６０塩基対、約１６０塩基対～約２００塩基対、約２００塩基対～約２４０塩基対、約２４０塩基対～約２８０塩基対、または約２８０塩基対～約３２０塩基対である。
実施形態では、尾部領域の長さは、３２０塩基対より大きい。
実施形態では、尾部領域は、約１％、約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％のグアノシン残基を含む。
実施形態では、尾部領域は、約１％、約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％のシチジン残基を含む。
実施形態では、尾部領域は、約１％、約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％のウリジン残基を含む。
いずれの先行実施形態及び態様においても、尾部領域は、約９９％、約９８％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、または約５０％のアデノシン残基を含む。
実施形態では、合成ＲＮＡは、約２００ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチドを含む。
実施形態では、合成ＲＮＡは、約５００～約２０００ヌクレオチド、または約５００～約１５００ヌクレオチド、または約５００～約１０００ヌクレオチドを含む。
目的のタンパク質
実施形態では、本明細書に記載される化合物、医薬組成物、または脂質凝集体は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）と複合体を形成するかまたは会合し、かかる核酸は、目的の組換えタンパク質をコードする。
実施形態では、目的の組換えタンパク質は、可溶性タンパク質である。
実施形態では、目的のタンパク質は、表２Ｂから選択される。
実施形態では、可溶性タンパク質は、１つ以上のリプログラミング因子である。実施形態では、１つ以上のリプログラミング因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、ｌ－Ｍｙｃ、Ｔｅｒｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｕｔｆ１、Ａｉｃｄａ、ｍｉＲ２００ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３０２ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３６７ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３６９ マイクロＲＮＡならびにその生物学的に活性な断片、類似体、バリアント及びファミリーメンバーから選択される。
実施形態では、目的の組換えタンパク質は、遺伝子編集タンパク質である。実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃａｓ９、ｘＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、クラス１のＣａｓタンパク質、クラス２のＣａｓタンパク質、及びＭＡＤ７、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片もしくは融合コンストラクトから選択される。
実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、複数の反復配列を含むＤＮＡ結合ドメインを含み、反復配列のうちの少なくとも１つが、アミノ酸配列ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚα（配列番号８１９）を含み、ここで、「ｖ」、「ｗ」、「ｘ」、及び「ｙ」の各々は、独立して、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ及びヌルから選択され、「ｚ」は、ＧＧＲＰＡＬＥ（配列番号８２０）、ＧＧＫＱＡＬＥ（配列番号８２１）、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ（配列番号６３０）、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡ（配列番号６３１）、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ（配列番号８２４）、及びＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡ（配列番号８２５）から選択され、「α」は、任意の４連続アミノ酸であるかまたはヌルである。実施形態では、「ｖ」はＱ、ＤまたはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｘ」はＩ、Ｈ、Ｎ、またはＩであり、「ｙ」はＤ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｇまたはヌルであり、実施形態では、反復配列は、３６～３９アミノ酸長（例えば、３６、または３７、または３８、または３９アミノ酸長）である。
実施形態では、αは、少なくとも１つのグリシン（Ｇ）残基を含む。実施形態では、αは、少なくとも１つのヒスチジン（Ｈ）残基を含む。実施形態では、αは、３３、３４、または３５のいずれか１つの位置に少なくとも１つのヒスチジン（Ｈ）残基を含む。実施形態では、αは、少なくとも１つのアスパラギン酸（Ｄ）残基を含む。実施形態では、αは、グリシン（Ｇ）残基、ヒスチジン（Ｈ）残基、及びアスパラギン酸（Ｄ）残基のうちの少なくとも１つ、または２つ、または３つを含む。
実施形態では、αは、任意選択で、以下から選択される１つ以上の親水性残基を含む：任意選択で、アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）から選択される、正電荷を持つ極性の親水性アミノ酸；任意選択で、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、及びシステイン（Ｃ）から選択される、電気的に中性である極性の親水性アミノ酸；任意選択で、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸塩（Ｅ）から選択される、負電荷を持つ極性の親水性アミノ酸、ならびに任意選択で、ヒスチジン（Ｈ）から選択される、正電荷を持つ極性の親水性芳香族アミノ酸。
いくつかの実施形態では、αは、アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）から選択される、１つ以上の正電荷を持つ極性の親水性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、αは、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、及びシステイン（Ｃ）から選択される、１つ以上の電気的に中性である極性の親水性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、αは、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸塩（Ｅ）から選択される、１つ以上の負電荷を持つ極性の親水性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、αは、ヒスチジン（Ｈ）から選択される、１つ以上の正電荷を持つ極性の親水性芳香族アミノ酸を含む。
実施形態では、αは、１つ以上の疎水性残基を含み、任意選択で以下から選択される：任意選択でグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）から選択される疎水性脂肪族アミノ酸、ならびに任意選択でフェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、及びチロシン（Ｙ）から選択される疎水性芳香族アミノ酸。いくつかの実施形態では、αは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）から選択される、１つ以上の疎水性脂肪族アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、αは、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、及びチロシン（Ｙ）から選択される、１つ以上の芳香族アミノ酸を含む。
実施形態では、αは、ＧａｂＧにより定義され、その場合、「ａ」及び「ｂ」は、独立して、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ及びヌルから選択される。
実施形態では、αは、ＧＨＧＧ（配列番号８２８）、ＨＧＳＧ（配列番号８２９）、ＨＧＧＧ（配列番号８３０）、ＧＧＨＤ（配列番号８３１）、ＧＡＨＤ（配列番号８３２）、ＡＨＤＧ（配列番号８３３）、ＰＨＤＧ（配列番号８３４）、ＧＰＨＤ（配列番号８３５）、ＧＨＧＰ（配列番号８３６）、ＰＨＧＧ（配列番号８３７）、ＰＨＧＰ（配列番号８３８）、ＡＨＧＡ（配列番号８３９）、ＬＨＧＡ（配列番号８４０）、ＶＨＧＡ（配列番号８４１）、ＩＶＨＧ（配列番号８４２）、ＩＨＧＭ（配列番号８４３）、ＲＤＨＧ（配列番号８４５）、ＲＨＧＥ（配列番号８４６）、時間ＧＥ（配列番号８４７）、ＲＨＧＤ（配列番号８４８）、時間ＧＤ（配列番号８４９）、ＧＰＹＥ（配列番号８５０）、ＮＨＧＧ（配列番号８５１）、ＴＨＧＧ（配列番号８５２）、ＧＴＨＧ（配列番号８５３）、ＧＳＧＳ（配列番号８５４）、ＧＳＧＧ（配列番号８５５）、ＧＧＧＧ（配列番号８５６）、ＧＲＧＧ（配列番号８５７）、及びＧＫＧＧ（配列番号８５８）から選択される。
実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、複数の反復配列を含むＤＮＡ結合ドメインを含み、反復配列のうちの少なくとも１つが、アミノ酸配列：ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＧＨＧＧ（配列番号６２９）を含み、かつ、３６～３９アミノ酸長であり、ここで、「ｖ」はＱ、ＤまたはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｘ」はＨ、Ｎ、またはＩであり、「ｙ」はＤ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、またはヌルであり、「ｚ」は、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ（配列番号６３０）またはＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡ（配列番号６３１）である。
実施形態では、遺伝子編集タンパク質はさらに、ヌクレアーゼの触媒ドメインを含むヌクレアーゼドメインを含む。
実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、遺伝子に一本鎖または二本鎖の切断を作る能力がある。
実施形態では、一本鎖または二本鎖の切断は、遺伝子の持続的スプライシング変化を生じさせる。
合成ＲＮＡ分子の配列にマイクロＲＮＡ結合部位を組み込むことにより、コードされたタンパク質を免疫寛容にすることができることが今回発見された。したがって、特定の実施形態は、マイクロＲＮＡ結合部位を含む合成ＲＮＡ分子を対象とする。一実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ２２３ マイクロＲＮＡ結合部位である。別の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ１４２ マイクロＲＮＡ結合部位（ｍＩＲ－１４２は、配列番号８１０の配列を有する）である。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、合成ＲＮＡ分子の３’－ＵＴＲ内に存在する。他の実施形態では、合成ＲＮＡ分子の３’－ＵＴＲは、複数のマイクロＲＮＡ結合部位を含む。さらに他の実施形態では、合成ＲＮＡ分子の３’－ＵＴＲは、複数のｍｉＲ１４２ マイクロＲＮＡ結合部位を含む。特定の実施形態では、合成ＲＮＡ分子の３’－ＵＴＲは、複数のｍｉＲ２２３ マイクロＲＮＡ結合部位を含む。一実施形態では、ｍｉＲ１４２ マイクロＲＮＡ結合部位は、ＴＣＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＣＴＡＣＡ（配列番号８１１）である。別の実施形態では、合成ＲＮＡ分子の３’－ＵＴＲは、４コピーのｍｉＲ１４２ マイクロＲＮＡ結合部位（配列番号８１２）を含む。さらなる実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、２つ以上のヌクレオチドで間が区切られている。一実施形態では、コードされるタンパク質は、遺伝子編集タンパク質である。別の実施形態では、コードされるタンパク質は、非造血細胞に選択的に発現される。特定の実施形態では、コードされるタンパク質は、免疫寛容にされる。他の実施形態では、コードされるタンパク質は、対象において、存在しないかまたは正常よりも低いレベルで存在する。さらに他の実施形態では、コードされるタンパク質は遺伝子編集タンパク質であり、遺伝子を修復または挿入するためのベクターが細胞に送達される。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、免疫寛容にされる。
いくつかの実施形態は、免疫応答の誘発及び／または刺激及び／または伝播を対象とする。いくつかの実施形態では、目的の組換えタンパク質は、抗原である。いくつかの実施形態では、目的の組換えタンパク質は、１つ以上の疾患、任意選択で、感染症に対する獲得免疫を提供する。いくつかの実施形態では、免疫系は、目的の組換えタンパク質への応答を開始する。いくつかの実施形態では、目的の組換えタンパク質は、病原体または毒素に由来し、他のいくつかの実施形態では、目的の組換えタンパク質は、病原体または毒素の合成模倣体である。いくつかの実施形態では、目的の組換えタンパク質は融合タンパク質であり、任意選択で、独立して、病原体もしくは毒素に由来するか、もしくはそれを模倣する配列、及び／または免疫応答を刺激することが知られている配列を含む。いくつかの実施形態では、対象は目的の抗原をコードする合成ＲＮＡの投与後は、特定の病原体または毒素に対して免疫または耐性になっている。
様々な実施形態では、病原体は、コロナウイルスである。コロナウイルス（ＣｏＶ）は、ベータコロナウイルス及びアルファコロナウイルス－呼吸器病原体が含まれるＣｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーである。
実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、ベータコロナウイルスタンパク質またはアルファコロナウイルスタンパク質である。いくつかの実施形態では、ベータコロナウイルスタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、及びＨＣｏＶ－ＯＣ４３タンパク質、またはそれらの抗原断片から選択される。いくつかの実施形態では、アルファコロナウイルスタンパク質は、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－２２９Ｅタンパク質、またはそれらの抗原断片から選択される。
いくつかの実施形態では、コロナウイルスは、ベータコロナウイルスまたはアルファコロナウイルスである。いくつかの実施形態では、ベータコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、及びＨＣｏＶ－ＯＣ４３から選択される。実施形態では、アルファコロナウイルスは、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－２２９Ｅから選択される。実施形態では、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である。
いくつかの実施形態では、目的の組換えタンパク質は、コロナウイルスタンパク質である。様々な実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質等の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのタンパク質である。実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質は、スパイク表面糖タンパク質、膜糖タンパク質Ｍ、エンベロープタンパク質Ｅ、及びヌクレオカプシドリン酸化タンパク質Ｎ、またはそれらの抗原断片から選択される。実施形態では、スパイク表面糖タンパク質から選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質は、Ｓ１、Ｓ２及びＳ２’を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質は、以下のアミノ酸配列を含む：
ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣＶＮＬＴＴＲＴＱＬＰＰＡＹＴＮＳＦＴＲＧＶＹＹＰＤＫＶＦＲＳＳＶＬＨＳＴＱＤＬＦＬＰＦＦＳＮＶＴＷＦＨＡＩＨＶＳＧＴＮＧＴＫＲＦＤＮＰＶＬＰＦＮＤＧＶＹＦＡＳＴＥＫＳＮＩＩＲＧＷＩＦＧＴＴＬＤＳＫＴＱＳＬＬＩＶＮＮＡＴＮＶＶＩＫＶＣＥＦＱＦＣＮＤＰＦＬＧＶＹＹＨＫＮＮＫＳＷＭＥＳＥＦＲＶＹＳＳＡＮＮＣＴＦＥＹＶＳＱＰＦＬＭＤＬＥＧＫＱＧＮＦＫＮＬＲＥＦＶＦＫＮＩＤＧＹＦＫＩＹＳＫＨＴＰＩＮＬＶＲＤＬＰＱＧＦＳＡＬＥＰＬＶＤＬＰＩＧＩＮＩＴＲＦＱＴＬＬＡＬＨＲＳＹＬＴＰＧＤＳＳＳＧＷＴＡＧＡＡＡＹＹＶＧＹＬＱＰＲＴＦＬＬＫＹＮＥＮＧＴＩＴＤＡＶＤＣＡＬＤＰＬＳＥＴＫＣＴＬＫＳＦＴＶＥＫＧＩＹＱＴＳＮＦＲＶＱＰＴＥＳＩＶＲＦＰＮＩＴＮＬＣＰＦＧＥＶＦＮＡＴＲＦＡＳＶＹＡＷＮＲＫＲＩＳＮＣＶＡＤＹＳＶＬＹＮＳＡＳＦＳＴＦＫＣＹＧＶＳＰＴＫＬＮＤＬＣＦＴＮＶＹＡＤＳＦＶＩＲＧＤＥＶＲＱＩＡＰＧＱＴＧＫＩＡＤＹＮＹＫＬＰＤＤＦＴＧＣＶＩＡＷＮＳＮＮＬＤＳＫＶＧＧＮＹＮＹＬＹＲＬＦＲＫＳＮＬＫＰＦＥＲＤＩＳＴＥＩＹＱＡＧＳＴＰＣＮＧＶＥＧＦＮＣＹＦＰＬＱＳＹＧＦＱＰＴＮＧＶＧＹＱＰＹＲＶＶＶＬＳＦＥＬＬＨＡＰＡＴＶＣＧＰＫＫＳＴＮＬＶＫＮＫＣＶＮＦＮＦＮＧＬＴＧＴＧＶＬＴＥＳＮＫＫＦＬＰＦＱＱＦＧＲＤＩＡＤＴＴＤＡＶＲＤＰＱＴＬＥＩＬＤＩＴＰＣＳＦＧＧＶＳＶＩＴＰＧＴＮＴＳＮＱＶＡＶＬＹＱＤＶＮＣＴＥＶＰＶＡＩＨＡＤＱＬＴＰＴＷＲＶＹＳＴＧＳＮＶＦＱＴＲＡＧＣＬＩＧＡＥＨＶＮＮＳＹＥＣＤＩＰＩＧＡＧＩＣＡＳＹＱＴＱＴＮＳＰＲＲＡＲＳＶＡＳＱＳＩＩＡＹＴＭＳＬＧＡＥＮＳＶＡＹＳＮＮＳＩＡＩＰＴＮＦＴＩＳＶＴＴＥＩＬＰＶＳＭＴＫＴＳＶＤＣＴＭＹＩＣＧＤＳＴＥＣＳＮＬＬＬＱＹＧＳＦＣＴＱＬＮＲＡＬＴＧＩＡＶＥＱＤＫＮＴＱＥＶＦＡＱＶＫＱＩＹＫＴＰＰＩＫＤＦＧＧＦＮＦＳＱＩＬＰＤＰＳＫＰＳＫＲＳＦＩＥＤＬＬＦＮＫＶＴＬＡＤＡＧＦＩＫＱＹＧＤＣＬＧＤＩＡＡＲＤＬＩＣＡＱＫＦＮＧＬＴＶＬＰＰＬＬＴＤＥＭＩＡＱＹＴＳＡＬＬＡＧＴＩＴＳＧＷＴＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩＧＶＴＱＮＶＬＹＥＮＱＫＬＩＡＮＱＦＮＳＡＩＧＫＩＱＤＳＬＳＳＴＡＳＡＬＧＫＬＱＤＶＶＮＱＮＡＱＡＬＮＴＬＶＫＱＬＳＳＮＦＧＡＩＳＳＶＬＮＤＩＬＳＲＬＤＫＶＥＡＥＶＱＩＤＲＬＩＴＧＲＬＱＳＬＱＴＹＶＴＱＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫＭＳＥＣＶＬＧＱＳＫＲＶＤＦＣＧＫＧＹＨＬＭＳＦＰＱＳＡＰＨＧＶＶＦＬＨＶＴＹＶＰＡＱＥＫＮＦＴＴＡＰＡＩＣＨＤＧＫＡＨＦＰＲＥＧＶＦＶＳＮＧＴＨＷＦＶＴＱＲＮＦＹＥＰＱＩＩＴＴＤＮＴＦＶＳＧＮＣＤＶＶＩＧＩＶＮＮＴＶＹＤＰＬＱＰＥＬＤＳＦＫＥＥＬＤＫＹＦＫＮＨＴＳＰＤＶＤＬＧＤＩＳＧＩＮＡＳＶＶＮＩＱＫＥＩＤＲＬＮＥＶＡＫＮＬＮＥＳＬＩＤＬＱＥＬＧＫＹＥＱＹＩＫＷＰＷＹＩＷＬＧＦＩＡＧＬＩＡＩＶＭＶＴＩＭＬＣＣＭＴＳＣＣＳＣＬＫＧＣＣＳＣＧＳＣＣＫＦＤＥＤＤＳＥＰＶＬＫＧＶＫＬＨＹＴ（配列番号１００）。
いくつかの実施形態では、エンベロープタンパク質は、以下のアミノ酸配列を含む：
ＭＹＳＦＶＳＥＥＴＧＴＬＩＶＮＳＶＬＬＦＬＡＦＶＶＦＬＬＶＴＬＡＩＬＴＡＬＲＬＣＡＹＣＣＮＩＶＮＶＳＬＶＫＰＳＦＹＶＹＳＲＶＫＮＬＮＳＳＲＶＰＤＬＬＶ（配列番号１０１）。
いくつかの実施形態では、膜タンパク質は、以下のアミノ酸配列を含む：ＭＡＤＳＮＧＴＩＴＶＥＥＬＫＫＬＬＥＱＷＮＬＶＩＧＦＬＦＬＴＷＩＣＬＬＱＦＡＹＡＮＲＮＲＦＬＹＩＩＫＬＩＦＬＷＬＬＷＰＶＴＬＡＣＦＶＬＡＡＶＹＲＩＮＷＩＴＧＧＩＡＩＡＭＡＣＬＶＧＬＭＷＬＳＹＦＩＡＳＦＲＬＦＡＲＴＲＳＭＷＳＦＮＰＥＴＮＩＬＬＮＶＰＬＨＧＴＩＬＴＲＰＬＬＥＳＥＬＶＩＧＡＶＩＬＲＧＨＬＲＩＡＧＨＨＬＧＲＣＤＩＫＤＬＰＫＥＩＴＶＡＴＳＲＴＬＳＹＹＫＬＧＡＳＱＲＶＡＧＤＳＧＦＡＡＹＳＲＹＲＩＧＮＹＫＬＮＴＤＨＳＳＳＳＤＮＩＡＬＬＶＱ（配列番号１０２）。
いくつかの実施形態では、ヌクレオカプシドリン酸化タンパク質Ｎは、以下のアミノ酸配列を含む：
ＭＳＤＮＧＰＱＮＱＲＮＡＰＲＩＴＦＧＧＰＳＤＳＴＧＳＮＱＮＧＥＲＳＧＡＲＳＫＱＲＲＰＱＧＬＰＮＮＴＡＳＷＦＴＡＬＴＱＨＧＫＥＤＬＫＦＰＲＧＱＧＶＰＩＮＴＮＳＳＰＤＤＱＩＧＹＹＲＲＡＴＲＲＩＲＧＧＤＧＫＭＫＤＬＳＰＲＷＹＦＹＹＬＧＴＧＰＥＡＧＬＰＹＧＡＮＫＤＧＩＩＷＶＡＴＥＧＡＬＮＴＰＫＤＨＩＧＴＲＮＰＡＮＮＡＡＩＶＬＱＬＰＱＧＴＴＬＰＫＧＦＹＡＥＧＳＲＧＧＳＱＡＳＳＲＳＳＳＲＳＲＮＳＳＲＮＳＴＰＧＳＳＲＧＴＳＰＡＲＭＡＧＮＧＧＤＡＡＬＡＬＬＬＬＤＲＬＮＱＬＥＳＫＭＳＧＫＧＱＱＱＱＧＱＴＶＴＫＫＳＡＡＥＡＳＫＫＰＲＱＫＲＴＡＴＫＡＹＮＶＴＱＡＦＧＲＲＧＰＥＱＴＱＧＮＦＧＤＱＥＬＩＲＱＧＴＤＹＫＨＷＰＱＩＡＱＦＡＰＳＡＳＡＦＦＧＭＳＲＩＧＭＥＶＴＰＳＧＴＷＬＴＹＴＧＡＩＫＬＤＤＫＤＰＮＦＫＤＱＶＩＬＬＮＫＨＩＤＡＹＫＴＦＰＰＴＥＰＫＫＤＫＫＫＫＡＤＥＴＱＡＬＰＱＲＱＫＫＱＱＴＶＴＬＬＰＡＡＤＬＤＤＦＳＫＱＬＱＱＳＭＳＳＡＤＳＴＱＡ（配列番号１０３）。
実施形態では、スパイク表面糖タンパク質は、配列番号１００のアミノ酸配列を含み、膜糖タンパク質前駆体Ｍは、配列番号１０１のアミノ酸配列を含み、エンベロープタンパク質Ｅは、配列番号１０２のアミノ酸配列を含み、ヌクレオカプシドリン酸化タンパク質Ｎは、配列番号１０３のアミノ酸配列、または前述のうちいずれかとの同一性が少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列、あるいは前述のうちいずれかの抗原断片を含む。
様々な実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質の任意の既知の野生型アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約６１％、もしくは少なくとも約６２％、もしくは少なくとも約６３％、もしくは少なくとも約６４％、もしくは少なくとも約６５％、もしくは少なくとも約６６％、もしくは少なくとも約６７％、もしくは少なくとも約６８％、もしくは少なくとも約６９％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約７１％、もしくは少なくとも約７２％、もしくは少なくとも約７３％、もしくは少なくとも約７４％、もしくは少なくとも約７５％、もしくは少なくとも約７６％、もしくは少なくとも約７７％、もしくは少なくとも約７８％、もしくは少なくとも約７９％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約８１％、もしくは少なくとも約８２％、もしくは少なくとも約８３％、もしくは少なくとも約８４％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約８６％、もしくは少なくとも約８７％、もしくは少なくとも約８８％、もしくは少なくとも約８９％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９１％、もしくは少なくとも約９２％、もしくは少なくとも約９３％、もしくは少なくとも約９４％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％であるアミノ酸配列、または本明細書に開示のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列（例えば、約６０％、または約６１％、または約６２％、または約６３％、または約６４％、または約６５％、または約６６％、または約６７％、または約６８％、または約６９％、または約７０％、または約７１％、または約７２％、または約７３％、または約７４％、または約７５％、または約７６％、または約７７％、または約７８％、または約７９％、または約８０％、または約８１％、または約８２％、または約８３％、または約８４％、または約８５％、または約８６％、または約８７％、または約８８％、または約８９％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％の配列同一性）、例えば、配列番号１００、１０１、１０２、１０３のうちのいずれか１つに関連したもの、あるいはそれらの抗原断片を含み得る。
実施形態では、コロナウイルスタンパク質をコードする核酸、またはその抗原断片が提供される。コロナウイルスタンパク質は、ベータコロナウイルスタンパク質またはアルファコロナウイルスタンパク質を含め、いずれのコロナウイルスタンパク質でもあり得る。核酸は、限定することなく、ｍＲＮＡ等のＲＮＡを含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、核酸は、限定することなく、ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、コロナウイルスタンパク質をコードするＡＡＶ、またはその抗原断片と会合させることができる。
いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれるがこれらに限定されない、いかなる種類のヌクレオチドでも含むことができるベクターを含み、これは、一本鎖でも二本鎖でもよく、合成されたものでも、または天然由来物質から部分的に取得されたものでもよく、例示的態様では、天然、非天然または改変されたヌクレオチドを含有する。
実施形態では、ワクチンは、１つ以上の疾患、病原体、または毒素に対して提供される。いくつかの実施形態では、本開示の実施形態によるワクチンは、コードされた抗原に対する防御的抗体価及び／またはＴ細胞応答を生じさせる。コードされる抗原は、例えば、感染物質抗原、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の実施形態によるワクチンは、感染物質抗原、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原）であり得るコードされる抗原に対して特異的な抗原特異的抗体価（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ及び／またはＩｇＡ）を生じさせる。
タンパク質と併せて特定の因子を発現させることにより、コードされるタンパク質を免疫寛容にすることができることが今回発見された。実施形態では、本発明は、寛容を誘導する因子の共送達による、コードされるタンパク質に対する免疫寛容を誘導する能力のある合成ＲＮＡ分子の送達に関する。特定の実施形態では、共送達された因子は、合成ＲＮＡ分子により発現される。いくつかの実施形態では、共送達される因子は、ＩＬ２（配列番号５４８）である。いくつかの実施形態では、共送達される因子は、ＩＬ１０（配列番号２７２または配列番号２７３）（例えば、限定することなく、ＩＬ２、ＩＬ１０、及び／またはｔｇｆ－β）である。いくつかの実施形態では、共送達される因子は、ＴＧＦβ－１（配列番号１９０）である。いくつかの実施形態では、共送達される因子は、ＴＧＦβ－２（配列番号１９１）である。
遺伝子編集
態様では、本発明は、１つ以上の合成ＲＮＡ分子と本明細書に記載の化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）との複合体に関し、その場合、１つ以上の合成ＲＮＡ分子には、ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃａｓ９、ｘＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、クラス１のＣａｓタンパク質、クラス２のＣａｓタンパク質、及びＭＡＤ７、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片もしくは融合コンストラクトから選択される１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードする、少なくとも１つのＲＮＡ分子が含まれる。
態様では、本発明は、細胞に遺伝子編集を行うための方法に関し、細胞に、１つ以上の合成ＲＮＡ分子と本明細書に記載の化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）との複合体をトランスフェクトすることを含み、その場合、１つ以上の合成ＲＮＡ分子には、ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃａｓ９、ｘＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、クラス１のＣａｓタンパク質、クラス２のＣａｓタンパク質、及びＭＡＤ７、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片もしくは融合コンストラクトから選択される１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードする、少なくとも１つのＲＮＡ分子が含まれる。
いくつかの天然に存在するタンパク質は、特定のＤＮＡ配列、例えば、ジンクフィンガー（ＺＦ）及び転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）等を認識することができるＤＮＡ結合ドメインを含有している。これらのＤＮＡ結合ドメインのうちの１つ以上とＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの切断ドメインとを含有する融合タンパク質を使用して、細胞のＤＮＡの所望の領域に二本鎖切断を作ることができる（例えば、いずれもその内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第ＵＳ２０１２／００６４６２０号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０２３９３１５号、米国特許第８，４７０，９７３号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０２１７１１９号、米国特許第８，４２０，７８２号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０３０１０７３号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０１４５９４０号、米国特許第８，４５０，４７１号、米国特許第８，４４０，４３１号、米国特許第８，４４０，４３２号、及び米国特許出願公開第２０１３／０１２２５８１号を参照のこと）。他の遺伝子編集タンパク質としては、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質が挙げられる。しかしながら、細胞の遺伝子編集を行うための現在の方法は、効率が悪く、かつ制御されない変異誘発のリスクがあり、これがそれらを研究用、治療用または美容上の使用には望ましくないものにしている。
いくつかの実施形態は、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体を使用する、遺伝子編集及び／または遺伝子修正の方法を対象とする。例えば、実施形態では、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体は、遺伝子編集タンパク質をコードする合成ＲＮＡと会合し、生じた組成物は、細胞の遺伝子編集及び／または遺伝子修正を、例えば、エキソビボまたはインビボで行うために使用される。
いくつかの実施形態は、例えば、非標準ヌクレオチドを含むＲＮＡ、例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質 ＤＮＡ修復タンパク質、ＤＮＡ修飾タンパク質、塩基修飾タンパク質、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ脱メチル化を引き起こすタンパク質、ＤＮＡを基質とする酵素、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片もしくは融合コンストラクトのうちの１つ以上をコードするＲＮＡを用いる、合成ＲＮＡを用いた遺伝子編集及び／または遺伝子修正を包含する。実施形態では、遺伝子編集及び／または遺伝子修正の効率が高く、例えば、ＤＮＡを用いた遺伝子編集及び／または遺伝子修正よりも高い。実施形態では、遺伝子編集及び／または遺伝子修正の本願方法は、インビボでの適用に十分効率的である。実施形態では、遺伝子編集及び／または遺伝子修正の本願方法は、細胞選択（例えば、編集された細胞の選択）の必要がないほど十分効率的である。
実施形態では、本願方法の遺伝子編集の効率は、約１％、または約２％、または約３％、または約４％、または約５％、または約６％、または約７％、または約８％、または約９％、または約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約１００％である。様々な実施形態では、本願方法の遺伝子修正の効率は、約１％、または約２％、または約３％、または約４％、または約５％、または約６％、または約７％、または約８％、または約９％、または約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約１００％である。
いくつかの実施形態は、高効率の、操作されたヌクレアーゼ切断ドメインまたはＤＮＡ修飾ドメインを含む遺伝子編集タンパク質を対象とする。他の実施形態は、高忠実性の、操作されたヌクレアーゼ切断ドメインまたはＤＮＡ修飾ドメインを含む遺伝子編集タンパク質を対象とする。様々な実施形態は、高効率の、操作されたＤＮＡ結合ドメインを含む遺伝子編集タンパク質を対象とする。他の実施形態は、高忠実性の、操作されたＤＮＡ結合ドメインを含む遺伝子編集タンパク質を対象とする。さらに他の実施形態は、操作された反復配列を含む遺伝子編集タンパク質を対象とする。いくつかの実施形態は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ関連ファミリーメンバーを含む遺伝子編集タンパク質を対象とする。いくつかの実施形態は、細胞のＤＮＡ配列を変化させることを、細胞に遺伝子編集タンパク質をトランスフェクトするか、またはそれを発現するよう細胞を誘導することによって行うための方法を対象とする。他の実施形態は、インビトロ培養物中に存在する細胞のＤＮＡ配列を変化させるための方法を対象とする。別のさらなる実施形態では、インビボで存在する細胞のＤＮＡ配列を変化させるための方法を対象とする。
ＳｔｓＩエンドヌクレアーゼ切断ドメイン（配列番号１）を含む遺伝子編集タンパク質は、インビボでの高レベルのオンターゲット活性を維持しつつ、これまでに開示されている遺伝子編集タンパク質よりも実質的に低いインビボでのオフターゲット活性を示すことができる。他の新規の操作タンパク質（ＳｔｓＩ－ＨＡ（配列番号２）、ＳｔｓＩ－ＨＡ２（配列番号３）、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ（配列番号４）、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ２（配列番号５）、ＳｔｓＩ－ＨＦ（配列番号６）、及びＳｔｓＩ－ＵＨＦ（配列番号７））もまた、遺伝子編集タンパク質のヌクレアーゼドメインとして使用された場合に、インビボでの高オンターゲット活性、インビボでの低オフターゲット活性、小さいサイズ、溶解性、及び他の望ましい特性を示し得ることが発見された。ＳｔｓＩ－ＨＡ、ＳｔｓＩ－ＨＡ２（高活性）、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ、及びＳｔｓＩ－ＵＨＡ２（超高活性）は、一部には、Ｎ末端領域内部の３４位及び６１位における特定のアミノ酸置換により野生型ＳｔｓＩ及び野生型ＦｏｋＩのどちらよりも高いインビボでのオンターゲット活性を示し得、ＳｔｓＩ－ＨＦ（高忠実性）及びＳｔｓＩ－ＵＨＦ（超高忠実性）は、一部には、Ｃ末端領域内部の１４１位及び１５２位における特定のアミノ酸置換により野生型ＳｔｓＩ及び野生型ＦｏｋＩのどちらよりも低いインビボでのオフターゲット活性を示し得る。
したがって、特定の実施形態は、タンパク質を対象とする。実施形態では、タンパク質はインビボで存在する。他の実施形態では、タンパク質は、ヌクレアーゼドメインを含む。一実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの切断ドメイン（配列番号５３）、ＳｔｓＩエンドヌクレアーゼの切断ドメイン（配列番号１）、ＳｔｓＩ－ＨＡ（配列番号２）、ＳｔｓＩ－ＨＡ２（配列番号３）、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ（配列番号４）、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ２（配列番号５）、ＳｔｓＩ－ＨＦ（配列番号６）、及びＳｔｓＩ－ＵＨＦ（配列番号７）またはそれらの生物学的に活性な断片もしくはバリアントのうちの１つ以上を含む。
特定の新規反復配列を含むＤＮＡ結合ドメインを含む操作された遺伝子編集タンパク質は、インビボでの高レベルのオンターゲット活性を維持しつつ、これまでに開示されている遺伝子編集タンパク質よりも低いインビボでのオフターゲット活性を示すことができる。これらの操作された遺伝子編集タンパク質のうちの特定のものは、例えば、反復配列を接続するリンカー領域の柔軟性増大等、これまでに開示されている遺伝子編集タンパク質に対するいくつかの利点を提供することができ、それらは結合効率増加をもたらし得る。したがって、特定の実施形態は、複数の反復配列を含むタンパク質を対象とする。一実施形態では、反復配列のうちの少なくとも１つは、アミノ酸配列：ＧａｂＧを含有し、その場合、「ａ」及び「ｂ」はそれぞれ任意のアミノ酸を表す。一実施形態では、タンパク質は、遺伝子編集タンパク質である。別の実施形態では、反復配列のうちの１つ以上は、ＤＮＡ結合ドメイン内に存在する。さらなる実施形態では、「ａ」及び「ｂ」は、それぞれ独立して、Ｈ及びＧという群から選択される。さらに別の実施形態では、「ａ」及び「ｂ」はそれぞれ、Ｈ及びＧである。一実施形態では、アミノ酸配列は、反復配列のＣ末端の約５アミノ酸以内に存在する。別の実施形態では、アミノ酸配列は、反復配列のＣ末端に存在する。実施形態では、アミノ酸配列ＧａｂＧの１つ以上のＧは、Ｇ以外の１つ以上のアミノ酸、例えば、Ａ、ＨまたはＧＧで置き換えられる。一実施形態では、反復配列は、長さが約３２～約４０アミノ酸または約３３～約３９アミノ酸または約３４～３８アミノ酸または約３５～約３７アミノ酸または約３６アミノ酸または約３２アミノ酸超または約３３アミノ酸超または約３４アミノ酸超または約３５アミノ酸超である。他の実施形態は、１つ以上の転写活性化因子様エフェクタードメインを含むタンパク質を対象とする。一実施形態では、転写活性化因子様エフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、反復配列を含む。他の実施形態は、転写活性化因子様エフェクタードメインの反復配列のうち少なくとも２つの間に１つ以上のアミノ酸を挿入することによって生成される複数の反復配列を含むタンパク質を対象とする。一実施形態では、１つ以上のアミノ酸は、少なくとも１つの反復配列のＣ末端から、約１アミノ酸または約２アミノ酸または約３アミノ酸または約４アミノ酸または約５アミノ酸に挿入される。さらに他の実施形態は、複数の反復配列を含むタンパク質を対象とし、ここで、ほぼ１つおきの反復配列は、その反復配列の直前または直後の反復配列とは長さが異なる。一実施形態では、１つおきの反復配列は、約３６アミノ酸長である。別の実施形態では、１つおきの反復配列は、３６アミノ酸長である。さらに他の実施形態は、複数の反復配列を含むタンパク質を対象とし、ここで、複数の反復配列は、各々が少なくとも３６アミノ酸長である少なくとも２つの反復配列を含み、かつ、少なくとも３６アミノ酸長である反復配列のうち少なくとも２つは、３６アミノ酸長未満である少なくとも１つの反復配列で間が区切られている。いくつかの実施形態は、例えば、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、及び配列番号６０から選択される１つ以上の配列を含むタンパク質を対象とする。
他の実施形態は、ＤＮＡ結合ドメインを含むタンパク質を対象とする。実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、複数の反復配列を含む。一実施形態では、複数の反復配列により、標的ＤＮＡ分子内の結合部位の高特異性認識が可能になる。別の実施形態では、反復配列のうち少なくとも２つは、互いの相同性が少なくとも約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９８％、または約９９％である。さらなる実施形態では、反復配列のうちの少なくとも１つは、標的ＤＮＡ分子内の結合部位への結合能のある１つ以上の領域を含む。さらに別の実施形態では、結合部位は、長さが約１～約５塩基の定義された配列を含む。一実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーを含む。別の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を含む。さらなる実施形態では、複数の反復配列には、ＴＡＬＥとの相同性が少なくとも約５０％または約６０％または約７０％または約８０％または約９０％または約９５％または約９８％、または約９９％である少なくとも１つの反復配列が含まれる。さらに別の実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質を含む。一実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、核局在化配列を含む。別の実施形態では、核局在化配列は、アミノ酸配列：ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４７１）を含む。一実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、ミトコンドリア局在化配列を含む。別の実施形態では、ミトコンドリア局在化配列は、アミノ酸配列：ＬＧＲＶＩＰＲＫＩＡＳＲＡＳＬＭ（配列番号４７２）を含む。一実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、リンカーを含む。別の実施形態では、リンカーは、ＤＮＡ結合ドメインとヌクレアーゼドメインを接続する。さらなる実施形態では、リンカーは、約１～約１０アミノ酸長である。実施形態では、リンカーは、約１、約２、または約３、または約４、または約５、または約６、または約７、または約８、または約９、または約１０のアミノ酸長である。一実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、標的ＤＮＡ分子にニックまたは二本鎖切断を生成する能力がある。
実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、（ａ）ＤＮＡ結合ドメインであって、複数の反復配列を含み、かつ、反復配列のうちの少なくとも１つがアミノ酸配列：ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＧＨＧＧ（配列番号６２９）を含み、その場合、「ｖ」はＱ、ＤまたはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｘ」はＨ、Ｎ、またはＩであり、「ｙ」はＤ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、またはヌルであり、「ｚ」は、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ（配列番号６３０）またはＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡ（配列番号６３１）である、ＤＮＡ結合ドメイン、及び、任意選択で、（ｂ）ヌクレアーゼの触媒ドメインを含むヌクレアーゼドメインを含む。実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、別のヌクレアーゼドメインと二量体を形成する能力がある。実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、配列番号６３２のアミノ酸配列を含むタンパク質の触媒ドメインを含む。実施形態では、アミノ酸配列ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＧＨＧＧ（配列番号６２９）を含む反復配列のうちの少なくとも１つは、３６～３９アミノ酸長である。
特定の実施形態は、インビボでの細胞のゲノムを修飾するための方法を対象とし、かかる方法は、３６アミノ酸長の１つ以上の繰り返し単位を含む人工的転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター反復ドメインとエンドヌクレアーゼドメインとを含む天然には存在しない融合タンパク質をコードする核酸分子を、インビボでの細胞に導入することを含み、ここで、反復ドメインは、所定のヌクレオチド配列の認識のために操作され、融合タンパク質は、かかる所定のヌクレオチド配列を認識する。一実施形態では、細胞は、真核細胞である。別の実施形態では、細胞は、動物細胞である。さらなる実施形態では、細胞は、哺乳類細胞である。さらに別の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。一実施形態では、細胞は、植物細胞である。別の実施形態では、細胞は、原核細胞である。実施形態では、融合タンパク質により、細胞の核酸にエンドヌクレアーゼによる切断が導入され、それにより、細胞のゲノムが修飾される。
特定の実施形態は、核酸を含むインビボでの細胞のＤＮＡ配列を変化させるための組成物を対象とし、ここで、核酸は、遺伝子編集タンパク質をコードする。他の実施形態は、核酸混合物を含むインビボでの細胞のＤＮＡ配列を変化させるための組成物を対象とし、ここで、核酸混合物は、第１の遺伝子編集タンパク質をコードする第１の核酸と、第２の遺伝子編集タンパク質をコードする第２の核酸とを含む。一実施形態では、第１の遺伝子編集タンパク質の結合部位及び第２の遺伝子編集タンパク質の結合部位は、同じ標的ＤＮＡ分子内に存在する。別の実施形態では、第１の遺伝子編集タンパク質の結合部位と第２の遺伝子編集タンパク質の結合部位とは間が約５０未満の塩基、または約４０未満の塩基、または約３０未満の塩基または約２０未満の塩基、または約１０未満の塩基、または約１０塩基～約２５塩基または約１５塩基で区切られている。一実施形態では、第１の遺伝子編集タンパク質のヌクレアーゼドメイン及び第２の遺伝子編集タンパク質のヌクレアーゼドメインは、二量体形成能がある。別の実施形態では、二量体は、標的ＤＮＡ分子にニックまたは二本鎖切断を生成する能力がある。
特定の実施形態は、治療用組成物を対象とする。他の実施形態は、美容的組成物を対象とする。実施形態では、組成物は、修復鋳型を含む。さらなる実施形態では、修復鋳型は、一本鎖ＤＮＡ分子または二本鎖ＤＮＡ分子である。
他の実施形態は、タンパク質またはタンパク質をコードする核酸を合成するための製造物品を対象とする。一実施形態では、物品は核酸である。別の実施形態では、タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインを含む。さらなる実施形態では、核酸は、ＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、タンパク質は、ヌクレアーゼドメインを含む。別の実施形態では、核酸は、ヌクレアーゼドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、タンパク質は、複数の反復配列を含む。別の実施形態では、核酸は、複数の反復配列をコードする。さらなる実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩ、ＳｔｓＩ、ＳｔｓＩ－ＨＡ、ＳｔｓＩ－ＨＡ２、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ２、ＳｔｓＩ－ＨＦ、及びＳｔｓＩ－ＵＨＦまたはその天然もしくは操作されたバリアントもしくは生物学的に活性な断片から選択される。一実施形態では、核酸は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。別の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｔ７プロモーターまたはＳＰ６プロモーターである。さらなる実施形態では、核酸は、ウイルスプロモーターを含む。一実施形態では、核酸は、非翻訳領域を含む。別の実施形態では、核酸は、インビトロ転写の鋳型である。
特定の実施形態は、インビボでタンパク質を発現するよう細胞を誘導するための方法を対象とする。他の実施形態は、インビボでの細胞に遺伝子編集タンパク質をトランスフェクトすること、またはインビボで遺伝子編集タンパク質を発現するよう細胞を誘導することを含む、インビボでの細胞のＤＮＡ配列を変化させるための方法を対象とする。さらに他の実施形態は、インビボでの細胞における目的タンパク質の発現を低下させるための方法を対象とする。一実施形態では、細胞は、遺伝子編集タンパク質を発現するよう誘導され、ここで、遺伝子編集タンパク質は、標的ＤＮＡ分子にニックまたは二本鎖切断を生成する能力がある。別の実施形態では、ニックまたは二本鎖切断により、遺伝子の不活化がもたらされる。さらに他の実施形態は、インビボでタンパク質の不活性型、低活性型またはドミナントネガティブ型を生成させるための方法を対象とする。一実施形態では、タンパク質は、サバイビンである。さらに他の実施形態は、インビボでの細胞の１つ以上の変異を修復するための方法を対象とする。一実施形態では、細胞を修復鋳型と接触させる。別の実施形態では、修復鋳型は、ＤＮＡ分子である。さらなる実施形態では、修復鋳型は、遺伝子編集タンパク質の結合部位を含有しない。さらに別の実施形態では、修復鋳型は、遺伝子編集タンパク質の結合部位を含むＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列をコードする。
様々な実施形態では、修復鋳型は、約２０ヌクレオチド、または約３０ヌクレオチド、または約４０ヌクレオチド、または約５０ヌクレオチド、または約６０ヌクレオチド、または約７０ヌクレオチド、または約８０ヌクレオチド、または約９０ヌクレオチド、または約１００ヌクレオチド、または約１５０ヌクレオチド、または約２００ヌクレオチド、または約３００ヌクレオチド、または約４００のヌクレオチド、または約５００ヌクレオチド、または約７５０ヌクレオチド、または約１０００ヌクレオチドである。様々な実施形態では、修復鋳型は、約２０～１０００ヌクレオチド、または約２０～５００ヌクレオチド、または約２０～４００のヌクレオチド、または約２０～２００ヌクレオチド、または約２０～１００ヌクレオチド、または約８０～１００ヌクレオチド、または約５０～１００ヌクレオチドである。
様々な実施形態では、ＲＮＡ（例えば、遺伝子編集タンパク質をコードする合成ＲＮＡ）と修復鋳型の質量比は、約１：１０、または約１：９、または約１：８、または約１：７、または約１：６、または約１：５、または約１：４、または約１：３、または約１：２、または約１：１、または約２：１、または約３：１、または約４：１、または約５：１、または約６：１、または約７：１、または約８：１、または約９：１、または約１０：１である。
様々な実施形態では、ＲＮＡ（例えば、遺伝子編集タンパク質をコードする合成ＲＮＡ）と修復鋳型のモル比は、約１：１０、または約１：９、または約１：８、または約１：７、または約１：６、または約１：５、または約１：４、または約１：３、または約１：２、または約１：１、または約２：１、または約３：１、または約４：１、または約５：１、または約６：１、または約７：１、または約８：１、または約９：１、または約１０：１である。
様々な実施形態では、修復鋳型は二重の機能を有しており、遺伝子が編集された標的配列に修復を生じさせ、遺伝子編集タンパク質のさらなる結合を防ぎ、それにより、さらなる遺伝子編集を抑制または排除する（例えば、遺伝子編集タンパク質の結合部位であったものを、遺伝子編集タンパク質の結合にはもはや適さないようにさせる修復を生じさせる修復鋳型を介する）。したがって、いくつかの実施形態では、本願遺伝子編集方法は、標的部位ごとに単一の遺伝子編集を確実に行うよう調節可能である。
リプログラミング
態様では、本発明は、分化細胞を、より未分化な状態にリプログラミングするための方法に関し、（ａ）分化細胞または非多能性細胞を提供すること、（ｂ）分化細胞または非多能性細胞を培養すること、及び（ｃ）分化細胞または非多能性細胞に、１つ以上の合成ＲＮＡ分子と本明細書に記載の化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）との複合体をトランスフェクトすることを含み、その場合、１つ以上の合成ＲＮＡ分子には、１つ以上のリプログラミング因子をコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子が含まれ、かつトランスフェクトすることにより、１つ以上のリプログラミング因子を発現する細胞がもたらされ、細胞がより未分化な状態にリプログラミングされる結果となる。実施形態では、ステップ（ｃ）は、分化細胞の、より未分化な状態へのリプログラミングを支持する成分を含有する培地の存在下で行われる。実施形態では、連続する５日の間にステップ（ｃ）を少なくとも２回繰り返すことをさらに含む。実施形態では、後の１回以上のトランスフェクションにおいてトランスフェクトされる１つ以上の合成ＲＮＡ分子の量は、前の１回以上のトランスフェクションにおいてトランスフェクトされる量よりも多い。実施形態では、ステップ（ａ）～（ｃ）は、フィーダー細胞を使用せずに実施され、フィーダー細胞条件培地の存在下で行われる。実施形態では、ステップ（ｃ）は、照射ヒト新生児線維芽細胞のフィーダー細胞を使用せずに実施され、フィーダー細胞条件培地の存在下で行われる。実施形態では、合成ＲＮＡ分子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、ｌ－Ｍｙｃ、Ｔｅｒｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｕｔｆ１、Ａｉｃｄａ、ｍｉＲ２００ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３０２ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３６７ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３６９ マイクロＲＮＡならびにその生物学的に活性な断片、類似体、バリアント及びファミリーメンバーから選択される１つ以上のリプログラミング因子（複数可）をコードする。
実施形態では、分化細胞または非多能性細胞は、生検に由来する。実施形態では、分化細胞または非多能性細胞は、ヒト対象からのものである。実施形態では、分化細胞または非多能性細胞は、皮膚のパンチ生検標本に由来する。実施形態では、分化細胞または非多能性細胞は、角化細胞、線維芽細胞、またはＰＢＭＣである。
実施形態では、細胞を、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｌ－オルニチン、ＲＧＤペプチド、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、及びラミニンという群の少なくとも１つのメンバーと接触させることをさらに含む、リプログラミングするための方法。
実施形態では、リプログラミングするための方法では、免疫抑制剤を実質的に含まない培地を使用する。
細胞は、それらを特定の細胞外シグナル（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｕｅｓ）に曝露することによって、及び／または特定のタンパク質、ｍｉｃｒｏＲＮＡ等の異所発現によってリプログラミングされ得る。いくつかのリプログラミング方法がこれまでに報告されているが、異所発現に依存する大部分は、外因性ＤＮＡの導入を必要とし、これには、変異リスクが伴い得る。リプログラミングタンパク質の直接送達に基づくＤＮＡ不含のリプログラミング方法が報告されている。しかしながら、これらの方法は、商業利用にはあまりにも効率が悪く、信頼性が低い。さらに、ＲＮＡに基づくリプログラミング方法が報告されている（例えば、いずれもその内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎｇｅｌ．ＭＩＴ Ｔｈｅｓｉｓ．２００８．１－５６、Ａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ．２０１０．５，１０７、Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１０．７，６１８－６３０；Ａｎｇｅｌ．ＭＩＴ Ｔｈｅｓｉｓ．２０１１．１－８９、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１２．１５１，５４７－５５８を参照のこと）。しかしながら、既存のＲＮＡに基づくリプログラミング方法は、成熟細胞で実施すると時間がかかり、信頼性が低い上に効率が悪く、何回もトランスフェクションを必要とし（大幅な出費とエラーの機会をもたらす）、限られた数の細胞型にしかリプログラミングできず、限られた数の細胞型にしか細胞をリプログラミングできず、免疫抑制剤の使用を必要とし、かつ、血液由来ＨＳＡ及びヒト線維芽細胞フィーダー等、複数のヒト由来構成成分の使用を必要とする。これまでに開示されているＲＮＡに基づくリプログラミング方法の多くの欠点が、それらを研究用、治療用または美容上の使用には望ましくないものにしている。
リプログラミングは、細胞に、１つ以上のリプログラミング因子をコードする１つ以上の核酸をトランスフェクトすることによって実施することができる。リプログラミング因子の例としては、Ｏｃｔ４タンパク質、Ｓｏｘ２タンパク質、Ｋｌｆ４タンパク質、ｃ－Ｍｙｃタンパク質、ｌ－Ｍｙｃタンパク質、ＴＥＲＴタンパク質、Ｎａｎｏｇタンパク質、Ｌｉｎ２８タンパク質、Ｕｔｆ１タンパク質、Ａｉｃｄａタンパク質、ｍｉＲ２００ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３０２ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３６７ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３６９ マイクロＲＮＡならびにその生物学的に活性な断片、類似体、バリアント及びファミリーメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、特定の実施形態は、インビボでの細胞をリプログラミングするための方法を対象とする。一実施形態では、インビボでの細胞は、細胞に、１つ以上のリプログラミング因子をコードする１つ以上の核酸をトランスフェクトすることによってリプログラミングされる。一実施形態では、１つ以上の核酸には、Ｏｃｔ４タンパク質をコードするＲＮＡ分子が含まれる。別の実施形態では、１つ以上の核酸には、Ｓｏｘ２タンパク質、Ｋｌｆ４タンパク質、及びｃ－Ｍｙｃタンパク質をコードする１つ以上のＲＮＡ分子も含まれる。さらに別の実施形態では、１つ以上の核酸には、Ｌｉｎ２８タンパク質をコードするＲＮＡ分子も含まれる。一実施形態では、細胞はヒトの皮膚細胞であり、かかるヒトの皮膚細胞は、多能性幹細胞にリプログラミングされる。別の実施形態では、細胞はヒトの皮膚細胞であり、かかるヒトの皮膚細胞は、グルコース応答性インスリン産生細胞にリプログラミングされる。リプログラミングをされ得る他の細胞及び細胞がリプログラミングされてなり得る他の細胞の例としては、皮膚細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、β－細胞、網膜色素上皮細胞、造血細胞、心臓細胞、気道上皮細胞、神経幹細胞、ニューロン、グリア細胞、骨細胞、血液細胞、及び歯髄幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、細胞を、リプログラミングされた細胞を支持する培地と接触させる。一実施形態では、培地は細胞も支持する。
重要なことには、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ－Ｍｙｃをコードするウイルスに皮膚細胞を感染させ、それと併せて心筋細胞の成長を支持する培地でその細胞を培養すると、最初に皮膚細胞を多能性幹細胞にリプログラミングしなくても、心筋細胞への皮膚細胞のリプログラミングが生じることが報告されている（参照により内容が本明細書に組み込まれるＥｆｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１１；１３：２１５－２２を参照のこと）。特定の状況では、直接リプログラミング（ある体細胞を、多能性幹細胞へ最初にリプログラミングすることなく、その体細胞を別の体細胞にリプログラミングすることであり、「分化転換」としても知られる）が望ましい場合があり、これは、一部には、多能性幹細胞を培養することは時間を要する上に高価となり得、安定した多能性幹細胞株の樹立と特徴付けに伴う追加の取り扱いでは汚染のリスクが高くなり得、また、最初に多能性幹細胞を生成することに関連する培養での追加時間により、ゲノム不安定性、ならびに点変異、コピー数多型、及び核型異常を含めた変異の獲得のリスクが高くなり得るためである。したがって、特定の実施形態は、体細胞をインビボでリプログラミングするための方法を対象とし、ここで、細胞は、体細胞にリプログラミングされ、かつ、特徴付けられた多能性幹細胞株は生成されない。
特定の状況では、本発明の方法に従って細胞をリプログラミングするために必要とされる合計トランスフェクション回数は、他の方法に従った場合よりも少ない場合がある。したがって、特定の実施形態は、インビボでの細胞をリプログラミングするための方法を対象とし、ここで、連続する約２０日の間に約１～約１２回のトランスフェクションが実施されるか、または連続する約１５日の間に約４～約１０回のトランスフェクションが実施されるか、または連続する約１０日の間に約４～約８回のトランスフェクションが実施される。細胞を、核酸分子を含有する培地と接触させた場合、その細胞は、同時かまたは異なる時期に、２つ以上の核酸分子と接触する、及び／またはそれらを取り込む、と考えられ得ることが認識される。したがって、細胞を核酸含有培地と１回しか接触させない場合でも、細胞を核酸と２回以上、例えば、繰り返し、接触させることができる。
注目すべきことに、核酸は、本明細書に記載される１つ以上の非標準または「修飾された」残基を含有することができる。例えば、本明細書に記載される非標準ヌクレオチドのいずれかは、本願リプログラミング方法で使用することができる。一実施形態では、インビトロ転写反応においてウリジン－５’－三リン酸をプソイドウリジン－５’－三リン酸に置換して合成ＲＮＡを生成することができ、ここで、合成ＲＮＡのウリジン残基のうち最大で１００％がプソイドウリジン残基で置き換えられ得る。インビトロ転写では、ウリジン及びシチジンがそれぞれプソイドウリジン及び５－メチルシチジンに完全に置換されている場合でも、残留免疫原性のあるＲＮＡが生成され得る（例えば、参照により内容が本明細書に組み込まれるＡｎｇｅｌ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｈｕｍａｎ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ Ｕｓｉｎｇ ＲＮＡ ［Ｄｏｃｔｏｒａｌ Ｔｈｅｓｉｓ］．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ：ＭＩＴ；２０１１を参照のこと）。このため、細胞にＲＮＡをトランスフェクトする場合は、トランスフェクション培地に免疫抑制剤を加えることが一般的である。特定の状況では、トランスフェクション培地に免疫抑制剤を加えることが望ましくない場合があり、これは、一部には、こうした目的で最もよく使用される組換え免疫抑制剤のＢ１８Ｒが高価かつ製造困難であり得るためである。本発明の方法に従って細胞にインビボでトランスフェクト及び／またはリプログラミングを、Ｂ１８Ｒまたは他の任意の免疫抑制剤を使用せずに行うことができる。免疫抑制剤を使用せずに本発明の方法に従ってインビボでの細胞をリプログラミングすることは、短時間で効率的かつ信頼性があり得る。したがって、特定の実施形態は、インビボでの細胞にトランスフェクトするための方法を対象とし、ここで、トランスフェクション培地は、免疫抑制剤を含有していない。他の実施形態は、インビボでの細胞をリプログラミングするための方法を対象とし、ここで、トランスフェクション培地は、免疫抑制剤を含有していない。特定の状況において、例えば、高い細胞密度を使用する場合、トランスフェクション培地に免疫抑制剤を加えることが有益な場合がある。したがって、特定の実施形態は、インビボでの細胞にトランスフェクトするための方法を対象とし、ここで、トランスフェクション培地は、免疫抑制剤を含有する。他の実施形態は、インビボでの細胞をリプログラミングするための方法を対象とし、ここで、トランスフェクション培地は、免疫抑制剤を含有する。一実施形態では、免疫抑制剤は、Ｂ１８Ｒまたはその生物学的に活性な断片、類似体、バリアントもしくはファミリーメンバーあるいはデキサメタゾンまたはその誘導体である。一実施形態では、トランスフェクション培地は免疫抑制剤を含有せず、過渡の毒性を防ぐよう核酸用量が選択される。別の実施形態では、核酸用量は、組織１ｃｍ２あたり約１ｍｇ未満または１００，０００細胞あたり約１ｍｇ未満または１ｋｇあたり約１０ｍｇ未満である。
本発明の特定の実施形態に従って生成されたリプログラミングされた細胞は、それらが、望ましくない外因性ＤＮＡ配列を含有していないこと、またそれらが、定義されない場合があり、かつ、毒性及び／または病原性の汚染物質を含有している場合がある、動物由来またはヒト由来の産物に曝露されないことから、治療上及び／または美容上の用途に好適である。さらに、本発明の特定の実施形態の高速性、高効率、及び高信頼性により、変異及び他の染色体異常の獲得と蓄積のリスクが低減され得る。したがって、本発明の特定の実施形態を使用して、治療上及び／または美容上の用途での使用に適切な安全性プロファイルを有する細胞を生成することができる。例えば、ＲＮＡと、動物またはヒトに由来する構成成分を含有しない本発明の培地とを使用して細胞をリプログラミングすることにより、同種材料に曝露されていない細胞を得ることができる。したがって、特定の実施形態は、望ましい安全性プロファイルを有するリプログラミングされた細胞を対象とする。一実施形態では、リプログラミングされた細胞は正常核型を有する。別の実施形態では、リプログラミングされた細胞は、患者のゲノムと比べて約５未満のコピー数多型（ＣＮＶ）、例えば、患者のゲノムと比べて約３未満のコピー数多型を有するか、または患者のゲノムと比べてコピー数多型を有しない。さらに別の実施形態では、リプログラミングされた細胞は正常核型を有し、患者のゲノムと比べてコード領域に約１００未満の単一ヌクレオチドバリアント、または患者のゲノムと比べてコード領域に約５０未満の単一ヌクレオチドバリアント、または患者のゲノムと比べてコード領域に約１０未満の単一ヌクレオチドバリアントを有する。
エンドトキシン及びヌクレアーゼは、共精製すること、及び／または血清アルブミン等の他のタンパク質と結合した状態になることができる。特に、組換えタンパク質は、一部には、それらの生成中に起こり得る細胞の溶解のため、多くの場合、高レベルの結合したエンドトキシン及びヌクレアーゼを有し得る。エンドトキシン及びヌクレアーゼは、本発明の多くの方法によって低減させる、除去する、置き換えるか、そうでなければ不活性化することができ、例えば、アセチル化によるもの、オクタン酸ナトリウム等の安定化剤の添加、それに続く熱処理によるもの、アルブミン溶液及び／または培地へのヌクレアーゼ阻害剤の添加によるもの、結晶化によるもの、１つ以上のイオン交換樹脂との接触によるもの、木炭との接触によるもの、分取電気泳動によるものまたはアフィニティクロマトグラフィーによるものが含まれる。培地及び／または培地の１つ以上の構成成分からエンドトキシン及び／またはヌクレアーゼを部分的もしくは完全に低減させるか、除去するか、置き換えるか、そうでなければ不活性化することにより、細胞がトランスフェクト及びリプログラミングされ得る効率を高めることができる。したがって、特定の実施形態は、インビボでの細胞に１つ以上の核酸をトランスフェクトするための方法を対象とし、ここで、トランスフェクション培地は、１つ以上のエンドトキシン及び／またはヌクレアーゼが部分的もしくは完全に低減されるか、除去されるか、置き換えられるか、そうでなければ不活性化されるよう処理される。他の実施形態は、核酸の分解を最小限しか引き起こさない培地を対象とする。一実施形態では、培地は、約１ＥＵ／ｍＬ未満、または約０．１ＥＵ／ｍＬ未満、または約０．０１ＥＵ／ｍＬ未満を含有する。
特定の状況では、血清アルブミン等のタンパク質ベースの脂質担体を、メチル－ベータ－シクロデキストリン等の非タンパク質ベースの脂質担体で置き換えることができる。本発明の培地はまた、例えば、脂質担体の存在がなくてもよいか、または脂質担体の存在が有益とはならない場合がある方法、例えば、１つ以上の脂質ベースのトランスフェクション試薬、ポリマーベースのトランスフェクション試薬もしくはペプチドベースのトランスフェクション試薬を使用するか、または電気穿孔を使用する方法を使用してトランスフェクションが実施される場合に、脂質担体を用いずに使用することができる。金属等の多くのタンパク質結合分子は、インビボでは細胞にとって高毒性であり得る。この毒性は、生存率低下、及び変異の獲得を引き起こし得る。したがって、特定の実施形態には、毒性分子を含まない細胞を生成するという追加の利益がある。
タンパク質の結合分子成分は、タンパク質を溶液に懸濁させ、溶液の伝導度を測定することにより測定することができる。したがって、特定の実施形態は、タンパク質を含有する培地を対象とし、ここで、タンパク質の約１０％水溶液は、伝導度が約５００μｍｈｏ／ｃｍ未満である。一実施形態では、溶液は、伝導度が約５０μｍｈｏ／ｃｍ未満である。別の実施形態では、タンパク質の乾燥重量の約０．６５％未満は脂質で構成され、及び／またはタンパク質の乾燥重量の約０．３５％未満は遊離脂肪酸で構成される。
核酸の所望の効果を高めるために、インビボでの細胞に送達される核酸の量を増加することができる。ただし、インビボでの細胞に送達される核酸の量を特定のポイントを超えて増加させると、一部には、トランスフェクション試薬の毒性のため、細胞の生存率低下を引き起こし得る。核酸が、一定体積のインビボでの細胞集団（例えば、組織のある領域内の細胞）に送達される場合、各細胞に送達される核酸の量は、細胞の集団に送達される核酸の総量によって、また細胞の密度に合わせて異なり得、細胞密度が高いほど、各細胞に送達される核酸は少なくなる。特定の実施形態では、インビボでの細胞に、１つ以上の核酸を２回以上トランスフェクトする。特定の状況下、例えば、細胞を増殖させる場合、細胞密度はトランスフェクションごとに変化し得る。したがって、特定の実施形態は、インビボでの細胞に核酸をトランスフェクトするための方法を対象とし、ここで、細胞は、２回以上トランスフェクトされ、かつ、トランスフェクションのうち２回は細胞に送達される核酸の量が異なる。一実施形態では、トランスフェクションのうち２回の間に細胞は増殖し、細胞に送達される核酸の量は、２回のトランスフェクションのうちの１回目よりも２回のトランスフェクションのうちの２回目のほうが多い。別の実施形態では、細胞は、３回以上トランスフェクトされ、細胞に送達される核酸の量は、同じ３回のトランスフェクションのうちの１回目よりも３回のトランスフェクションのうちの２回目のほうが多く、細胞に送達される核酸の量は、同じ３回のトランスフェクションのうちの２回目よりも同じ３回のトランスフェクションのうちの３回目のほうが多い。さらに別の実施形態では、細胞は、２回以上トランスフェクトされ、各トランスフェクション中に細胞に送達される核酸の最大量は、少なくとも２回連続するトランスフェクションで少なくとも約８０％の生存率が得られる十分に低い量である。
一連のトランスフェクションにおいて増殖しているインビボでの細胞の集団に送達される核酸の量を調節することで、核酸効果増大及び細胞生存率上昇の両方がもたらされ得る。特定の状況では、一連のトランスフェクションにおいてインビボでの細胞を、１つ以上のリプログラミング因子をコードする１つ以上の核酸と接触させる場合、その一連のトランスフェクションのうちの少なくとも一部について、後のトランスフェクションで送達される核酸の量が前のトランスフェクションで送達される核酸の量より大きい場合、リプログラミングの効率が高くなり得る。したがって、特定の実施形態は、インビボでの細胞をリプログラミングするための方法を対象とし、ここで、１つ以上の核酸は、一連のトランスフェクションにおいて細胞に繰り返し送達され、細胞に送達される核酸の量は、少なくとも１回の前のトランスフェクションの場合よりも少なくとも１回の後で行われるトランスフェクションの場合のほうが多い。一実施形態では、細胞は、約２～約１０回、または約３～約８回、または約４～約６回トランスフェクトされる。別の実施形態では、１つ以上の核酸には、少なくとも１つのＲＮＡ分子が含まれ、細胞は約２～約１０回トランスフェクトされ、各トランスフェクションで細胞に送達される核酸の量は、以前のトランスフェクションのうち直近で細胞に送達された核酸の量と同じかまたはそれより多い。さらに別の実施形態では、１回目のトランスフェクションで細胞に送達される核酸の量は、約２０ｎｇ／ｃｍ２～約２５０ｎｇ／ｃｍ２、または１００ｎｇ／ｃｍ２～６００ｎｇ／ｃｍ２である。さらに別の実施形態では、細胞は、約１２～約４８時間の間隔で約５回トランスフェクトされ、細胞に送達される核酸の量は、１回目のトランスフェクションでは約２５ｎｇ／ｃｍ２、２回目のトランスフェクションでは約５０ｎｇ／ｃｍ２、３回目のトランスフェクションでは約１００ｎｇ／ｃｍ２、４回目のトランスフェクションでは約２００ｎｇ／ｃｍ２、及び５回目のトランスフェクションでは約４００ｎｇ／ｃｍ２である。さらに別の実施形態では、細胞は、５回目のトランスフェクション後に少なくとも１回さらにトランスフェクトされ、細胞に送達される核酸の量は、約４００ｎｇ／ｃｍ２である。
特定の実施形態は、インビボでの細胞に核酸をトランスフェクトするための方法を対象とし、ここで、核酸の量は、細胞密度を測定し、細胞密度の測定値に基づいてトランスフェクトするべき核酸の量を選択することによって決定される。一実施形態では、細胞密度は、光学的手段により測定される。別の実施形態では、細胞は、繰り返しトランスフェクトされ、細胞密度は２回のトランスフェクションの間で増加し、トランスフェクトされる核酸の量は、２回のトランスフェクションのうちの１回目よりも２回のトランスフェクションのうちの２回目のほうが多い。
患者で産生される血中タンパク質の量は、患者に核酸を複数の投与部位にて投与することによって増加し得る。特定の実施形態では、血中タンパク質の量は、患者に核酸を単一の注射部位にて投与することにより患者で産生される血中タンパク質の量と比べて増加する。一実施形態では、投与は注射により行われる。別の実施形態では、注射は、皮内注射である。さらに別の実施形態では、注射は、皮下注射または筋肉内注射である。実施形態では、複数の投与部位は、皮膚の投与部位を含む。他の実施形態では、複数の投与部位は、少なくとも約１または少なくとも約２または少なくとも約５または少なくとも約１０または少なくとも約２０または少なくとも約５０または少なくとも約１００の投与部位である。一実施形態では、投与は、少なくとも約５分または少なくとも約１０分または少なくとも約３０分または少なくとも約１時間または少なくとも約２時間または少なくとも約５時間または少なくとも約１２時間または少なくとも約１日以内に実施される。特定の実施形態では、血中タンパク質の量は、少なくとも約１０パーセントまたは少なくとも約２０パーセントまたは少なくとも約５０パーセントまたは少なくとも約１００パーセントまたは少なくとも約３倍または少なくとも約５倍または少なくとも約１０倍または少なくとも約２０倍または少なくとも約５０倍または少なくとも約１００倍または少なくとも約５００倍または少なくとも約１０００倍または１０００倍超、増加する。
特定の状況では、本発明の培地と接触した細胞のインビボでのトランスフェクション効率及び生存率は、培地を条件付けすることによって改善することができる。したがって、特定の実施形態は、培地を条件付けするための方法を対象とする。他の実施形態は、条件付けされる培地を対象とする。一実施形態では、フィーダーは線維芽細胞であり、培地は約２４時間条件付けされる。他の実施形態は、インビボでの細胞にトランスフェクトするための方法を対象とし、ここで、トランスフェクション培地は条件付けされる。他の実施形態は、インビボでの細胞にリプログラミング及び／または遺伝子編集を行うための方法を対象とし、ここで、培地は、条件付けされる。一実施形態では、フィーダーは、例えば、マイトマイシンＣ等の化学物質への曝露によるか、またはガンマ線への曝露によって、有糸分裂が不活性化されている。特定の実施形態では、一部には、理論に拘束されることを望むわけではないが、例えば、フィーダーから細胞または患者への疾病伝播のリスクを回避するために、自己材料のみを使用することが有益な場合がある。したがって、特定の実施形態は、インビボでの細胞にトランスフェクトするための方法を対象とし、ここで、トランスフェクション培地は条件付けされ、かつ、フィーダーは、細胞がトランスフェクトされる個体と同じ個体に由来する。他の実施形態は、インビボでの細胞にリプログラミング及び／または遺伝子編集を行うための方法を対象とし、ここで、培地は条件付けされ、かつ、フィーダーは、細胞がリプログラミング及び／または遺伝子編集される個体と同じ個体に由来する。
いくつかの分子は、条件付けにより培地に加えることができる。したがって、特定の実施形態は、条件培地中に存在する１つ以上の分子が添加される培地を対象とする。一実施形態では、培地には、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａまたはその生物学的に活性な断片、類似体、バリアント、アゴニスト、もしくはファミリーメンバーが添加される。別の実施形態では、培地には、ＴＧＦ－βまたはその生物学的に活性な断片、類似体、バリアント、アゴニスト、もしくはファミリーメンバーが添加される。さらに別の実施形態では、インビボでの細胞は、本発明の方法に従ってリプログラミングされ、ここで、培地には、約１～約５日間はＴＧＦ－βが添加されず、その後、少なくとも約２日間、ＴＧＦ－βが添加される。さらに別の実施形態では、培地には、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒまたはその生物学的に活性な断片、類似体、バリアント、アゴニスト、もしくはファミリーメンバーが添加される。さらに別の実施形態では、培地には、スフィンゴ脂質または脂肪酸が添加される。さらに別の実施形態では、スフィンゴ脂質は、リゾホスファチジン酸、リゾスフィンゴミエリン、スフィンゴシン－１－リン酸またはその生物学的に活性な類似体、バリアントもしくは誘導体である。
照射は、細胞の有糸分裂を不活性化させることに加え、特定の条件下で、細胞の遺伝子発現を変化させ、細胞に、例えば、Ｗｎｔファミリーのメンバーのタンパク質等、特定のタンパク質は非照射細胞の場合より少なく、また他の特定のタンパク質はより多く産生させることができる。さらに、特定のＷｎｔファミリーのメンバーのタンパク質は、細胞の増殖及び形質転換を促進することができる。特定の状況では、マイトマイシンｃで処理されたフィーダーではなく照射されたフィーダーを使用して条件付けされた培地とインビボでの細胞を接触させることによって、リプログラミングの効率を大きく高めることができる。照射されたフィーダーを使用した場合に観察されるリプログラミング効率の増加は、一部には、フィーダーにより分泌されるＷｎｔタンパク質によって引き起こされる。したがって、特定の実施形態は、インビボでの細胞をリプログラミングするための方法を対象とし、ここで、細胞を、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａまたはその生物学的に活性な断片、類似体、バリアント、ファミリーメンバーもしくはＷｎｔタンパク質の下流標的のアゴニスト等のアゴニスト、及び／またはＷｎｔタンパク質の生物学的作用のうちの１つ以上を模倣する薬剤、例えば、２－アミノ－４－［３，４－（メチレンジオキシ）ベンジルアミノ］－６－（３－メトキシフェニル）ピリミジンと接触させる。
ＤＮＡを用いた多くのリプログラミング方法は低効率であるため、これらの方法は、少数の細胞しか含有されていない可能性のある患者の試料に由来する細胞を用いて使用することが困難または不可能な場合がある。対照的に、本発明の特定の実施形態の高効率性により、単一細胞を含め、少数の細胞について信頼性の高いリプログラミングが可能になる。特定の実施形態は、少数の細胞をリプログラミングするための方法を対象とする。他の実施形態は、単一細胞をリプログラミングするための方法を対象とする。一実施形態では、細胞を、１つ以上の酵素と接触させる。別の実施形態では、酵素は、コラゲナーゼである。さらに別の実施形態では、コラゲナーゼは、動物由来成分を含まない。一実施形態では、コラゲナーゼは、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。別の実施形態では、細胞は、血液細胞である。さらに別の実施形態では、細胞を、患者の血液に由来する１つ以上のタンパク質を含有する培地と接触させる。さらに別の実施形態では、細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２ｍＭのＬ－アラニル－Ｌ－グルタミン＋約５％～約２５％の患者由来血清、または約１０％～約２０％の患者由来血清、または約２０％の患者由来血清を含む培地と接触させる。
特定の状況では、本発明の培地を使用して、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ－ＭｙｃをコードするＲＮＡの混合物をインビボでの細胞にトランスフェクトすることにより、細胞の増殖速度を上昇させることができる。細胞に送達されるＲＮＡの量が少なすぎて細胞のすべてに確実にトランスフェクトできない場合、わずかな量の細胞しか増殖速度の上昇を示さない場合がある。個別化治療薬を作製する場合等、特定の状況では、細胞の増殖速度を上昇させることが望ましい場合があり、これは、一部には、そうすることにより治療薬作製に必要な時間を短縮でき、そのため治療薬のコストを削減することができるためである。したがって、特定の実施形態は、インビボでの細胞に、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ－ＭｙｃをコードするＲＮＡの混合物をトランスフェクトするための方法を対象とする。一実施形態では、細胞は増殖速度上昇を示す。別の実施形態では、細胞はリプログラミングされる。
本明細書に記載されるように体細胞の遺伝子編集及びリプログラミングを同時または連続的に行うための方法もまた提供される。
治療方法
実施形態では、本発明は、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体を有する治療薬を送達することによる、疾患または障害の治療方法に関する。
実施形態では、本発明は、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体を有する核酸治療薬を送達することによる、疾患または障害の治療方法に関する。
実施形態では、本発明は、ＲＮＡ、例えば、合成ＲＮＡ、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体を有する治療薬を）を有する治療薬を送達することによる、疾患または障害の治療方法に関する。
実施形態では、本発明は、治療薬、例えば、核酸、例えば、ＲＮＡ、例えば、合成ＲＮＡ、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体を有する治療薬を、治療効果を有する目的タンパク質を発現させる方法で送達することによる、疾患または障害の治療方法に関する。
実施形態では、本発明は、治療薬、例えば、核酸、例えば、ＲＮＡ、例えば、合成ＲＮＡ、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体を有する治療薬を、治療効果（例えば、インビボ及び／またはエキソビボ等での、遺伝子編集または遺伝子修正）を有する遺伝子編集タンパク質を発現させる方法で送達することによる、疾患または障害の治療方法に関する。
実施形態では、本発明は、治療薬、例えば、核酸、例えば、ＲＮＡ、例えば、合成ＲＮＡ、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体を有する治療薬を、治療効果（例えば、エキソビボで）を有するリプログラミング因子を発現させる方法で送達することによる、疾患または障害の治療方法に関する。
実施形態では、本発明は、治療薬、例えば、核酸、例えば、ＲＮＡ、例えば、合成ＲＮＡ、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体を有する治療薬を、治療効果（例えば、インビボ及び／またはエキソビボ等での、遺伝子編集または遺伝子修正）を有する遺伝子編集タンパク質を発現させ、治療効果（例えば、エキソビボ）を有するリプログラミング因子を発現させる方法で送達することによる、疾患または障害の治療方法に関する。
特定の実施形態は、ａ．インビボで細胞に目的のタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトすることによって目的のタンパク質を発現するよう細胞を誘導すること、及び／またはｂ．インビボでの細胞をリプログラミングすることを含む、患者を治療するための方法を対象とする。一実施形態では、細胞は、より未分化な状態にリプログラミングされる。別の実施形態では、細胞は、１つ以上のリプログラミングタンパク質をコードする１つ以上の合成ＲＮＡ分子を細胞にトランスフェクトすることによってリプログラミングされる。さらなる実施形態では、細胞を分化させる。さらに別の実施形態では、細胞を、皮膚細胞、グルコース応答性インスリン産生細胞、造血細胞、心臓細胞、網膜細胞、腎細胞、神経細胞、間質細胞、脂肪細胞、骨細胞、筋細胞、卵母細胞、及び精細胞のうちの１つに分化させる。他の実施形態は、ａ．インビボで細胞に遺伝子編集タンパク質をコードする核酸をトランスフェクトすることによって遺伝子編集タンパク質を発現するよう細胞を誘導すること、及び／またはｂ．インビボでの細胞をリプログラミングすることを含む、患者を治療するための方法を対象とする。
実施形態では、治療により患者の症状のうちの１つ以上が改善される結果となる。
特定の実施形態は、希少疾患の治療のための方法及び組成物を対象とする。実施形態では、希少疾患は、稀な代謝性疾患、稀な心血管疾患、稀な皮膚疾患、稀な神経疾患、稀な発達障害、稀な遺伝性疾患、稀な肺疾患、稀な肝疾患、稀な腎疾患、稀な精神疾患、稀な生殖障害、稀な筋骨格疾患、稀な整形外科的疾患、先天性代謝異常、リソソーム蓄積症、及び稀な眼疾患のうちの１つ以上である。
本発明により治療され得る疾患の例としては、アルツハイマー病、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、嚢胞性線維症、虚血性及び拡張型の心筋症を含む心疾患、黄斑性変性、パーキンソン病、ハンチントン病、糖尿病、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ファンコニ貧血、色素性乾皮症、筋ジストロフィー、重症複合免疫不全症、遺伝性感覚ニューロパチー、がん、及びＨＩＶ／ＡＩＤＳが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明により治療され得る疾患のさらなる例としては、１型糖尿病、虚血性及び拡張型の心筋症を含む心疾患、黄斑性変性、パーキンソン病、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ファンコニ貧血、重症複合免疫不全症、遺伝性感覚ニューロパチー、色素性乾皮症、ハンチントン病、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、がん、ならびに肝炎及びＨＩＶ／ＡＩＤＳ等の感染症が挙げられるが、これらに限定されない。
実施形態では、本発明により治療され得る疾患の例には感染症が含まれる。いくつかの実施形態では、感染症は、病原体による感染症であり、任意選択で、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫から選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスは、（ａ）インフルエンザウイルスであり、任意選択で、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、及びＤ型インフルエンザウイルスから選択されるか、または（ｂ）Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーであり、任意選択でベータコロナウイルスから選択され、任意選択で、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、及びＨＣｏＶ－ＯＣ４３またはアルファコロナウイルスから選択され、任意選択で、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－２２９Ｅから選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、本明細書の他の箇所に記載があるように、２０１９－ｎＣｏＶタンパク質、その抗原断片、またはそれをコードする核酸等の抗原であり、任意選択で、スパイク表面糖タンパク質、膜糖タンパク質Ｍ、エンベロープタンパク質Ｅ、及びヌクレオカプシドリン酸化タンパク質Ｎから選択される。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、本明細書の他の箇所に記載があるように、スパイク表面糖タンパク質のＳ１またはＳ２サブユニット、またはその抗原断片等の抗原である。
様々な実施形態では、対象は新型コロナウイルス感染症（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９）（ＣＯＶＩＤ－１９）に罹患している。追加の実施形態では、対象は高齢者である、及び／または限定するわけではないが、高血圧及び／または糖尿病が含まれる、１つ以上の併存疾患に罹患している。コロナウイルス感染症に罹患している対象は、発熱、倦怠感、乾性咳嗽、うずきと疼痛、息切れと他の呼吸困難、下痢、上気道症状（例えば、くしゃみ、鼻水、鼻閉、咳嗽、咽喉痛）、肺炎、肺炎 呼吸不全、肝不全と腎不全、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、及びサイトカインバランスの乱れを含むが、これらに限定されない症状にかかり得る。
いくつかの実施形態では、ウイルスは、インフルエンザウイルスである。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、本明細書の他の箇所に記載があるように、インフルエンザウイルス抗原等の抗原であり、任意選択で、ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、マトリックス２（Ｍ２）タンパク質、及びノイラミニダーゼ、またはそれらの抗原断片、またはそれらをコードする核酸から選択される。
実施形態では、疾患または障害は、ジフテリア、破傷風、百日咳、インフルエンザ、肺炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、ポリオ、黄熱、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症、炭疽、狂犬病、日本脳炎、髄膜炎、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、胃腸炎、天然痘、腸チフス、水痘（ｖａｒｉｃｅｌｌａ）（水痘（ｃｈｉｃｋｅｎｐｏｘ））、ロタウイルス、及び帯状疱疹から選択される。いくつかの実施形態では、本発明は、肝炎の治療に関する。治療され得る例示的な肝炎としては、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、自己免疫性肝炎、アルコール性肝炎、急性肝炎、及び慢性肝炎が挙げられるが、これらに限定されない。
実施形態では、疾患または障害は、代謝障害である。実施形態では、代謝障害は、炭水化物代謝の障害、アミノ酸代謝の障害、尿素サイクルの障害、脂肪酸代謝の障害、ポルフィリン代謝の障害、リソソーム蓄積障害、ペルオキシソームの生合成障害、及びプリンまたはピリミジン代謝の障害から選択される。
実施形態では、代謝障害は、炭水化物代謝の障害であり、ここで、疾患はガラクトース血症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＧＡＬＴ、ＧＡＬＫ１、もしくはＧＡＬＥであるか、疾患は本態性フルクトース尿症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＫＨＫであるか、疾患は遺伝性フルクトース不耐性であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＬＤＯＢであるか、疾患は糖原病Ｉ型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＧ６ＰＣ、ＳＬＣ３７Ａ４、もしくはＳＬＣ１７Ａ３であるか、疾患は糖原病ＩＩ型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＧＡＡであるか、疾患は糖原病ＩＩＩ型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＧＬであるか、疾患は糖原病ＩＶ型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＧＢＥ１であるか、疾患は糖原病Ｖ型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＰＹＧＭであるか、疾患は糖原病ＶＩ型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＰＹＧＬであるか、疾患は糖原病ＶＩＩ型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＰＹＧＭであるか、疾患は糖原病ＩＸ型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＰＨＫＡ１、ＰＨＫＡ２、ＰＨＫＢ、ＰＨＫＧ１、もしくはＰＨＫＧ２であるか、疾患は糖原病ＸＩ型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＳＬＣ２Ａ２であるか、疾患は糖原病ＸＩＩ型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＬＤＯＡであるか、疾患は糖原病ＸＩＩＩ型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＥＮＯ１、ＥＮＯ２、もしくはＥＮＯ３であるか、疾患は糖原病０型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＧＹＳ１もしくはＧＹＳ２であるか、疾患はピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＰＣであるか、疾患はピルビン酸キナーゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＰＫＬＲであるか、疾患はトランスアルドラーゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＴＡＬＤＯ１であるか、疾患はトリオースリン酸イソメラーゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＴＰＩ１であるか、疾患はフルクトースビスホスファターゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＦＢＰ１であるか、疾患は高シュウ酸尿症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＧＸＴもしくはＧＲＨＰＲであるか、疾患はヘキソキナーゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＨＫ１であるか、疾患はグルコース－ガラクトース吸収不全であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＳＬＣ５Ａ１であるか、または疾患はグルコース－６－リン酸脱水素酵素欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＧ６ＰＤである。
実施形態では、代謝障害は、アミノ酸代謝の障害であり、ここで、疾患はアルカプトン尿症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＨＧＤであるか、疾患はアスパルチルグルコサミン尿症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＧＡであるか、疾患はメチルマロン酸血症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＭＵＴ、ＭＣＥＥ、ＭＭＡＡ、ＭＭＡＢ、ＭＭＡＣＨＣ、ＭＭＡＤＨＣ、もしくはＬＭＢＲＤ１であるか、疾患はメープルシロップ尿症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＢＣＫＤＨＡ、ＢＣＫＤＨＢ、ＤＢＴ、もしくはＤＬＤであるか、疾患はホモシスチン尿症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＣＢＳであるか、疾患はチロシン血症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＦＡＨ、ＴＡＴ、もしくはＨＰＤであるか、疾患はトリメチルアミン尿症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＦＭＯ３であるか、疾患はハートナップ病であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＳＬＣ６Ａ１９であるか、疾患はビオチニダーゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＢＴＤであるか、疾患はオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＯＴＣであるか、疾患はカルバモイルリン酸合成酵素Ｉ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＣＰＳ１であるか、疾患はシトルリン血症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＳＳもしくはＳＬＣ２５Ａ１３であるか、疾患は高アルギニン血症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＲＧ１であるか、疾患は高ホモシステイン血症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＭＴＨＦＲであるか、疾患は高メチオニン血症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＭＡＴ１Ａ、ＧＮＭＴ、もしくはＡＨＣＹであるか、疾患は高リジン血症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＡＳＳであるか、疾患は非ケトン性高グリシン血症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＧＬＤＣ、ＡＭＴ、もしくはＧＣＳＨであるか、疾患はプロピオン酸血症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＰＣＣＡもしくはＰＣＣＢであるか、疾患は高プロリン血症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＬＤＨ４Ａ１もしくはＰＲＯＤＨであるか、疾患はシスチン尿症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＳＬＣ３Ａ１もしくはＳＬＣ７Ａ９であるか、疾患はジカルボン酸アミノ酸尿症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＳＬＣ１Ａ１であるか、疾患はグルタル酸血症２型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＥＴＦＡ、ＥＴＦＢ、もしくはＥＴＦＤＨであるか、疾患はイソ吉草酸血症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＩＶＤであるか、または疾患は２－ヒドロキシグルタル酸尿症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＬ２ＨＧＤＨもしくはＤ２ＨＧＤＨである。
実施形態では、代謝障害は、尿素サイクルの障害であり、ここで、疾患はＮ－アセチルグルタミン酸合成酵素欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＮＡＧＳであるか、疾患はアルギニノコハク酸尿症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＳＬであるか、または疾患はアルギニン血症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＲＧ１である。
実施形態では、代謝障害は、脂肪酸代謝の障害であり、ここで、疾患は極長鎖アシル補酵素Ａ脱水素酵素欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＣＡＤＶＬであるか、疾患は長鎖３－ヒドロキシアシル補酵素Ａ脱水素酵素欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＨＡＤＨＡであるか、疾患は中鎖アシル補酵素Ａ脱水素酵素欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＣＡＤＭであるか、疾患は短鎖アシル補酵素Ａ脱水素酵素欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＣＡＤＳであるか、疾患は３－ヒドロキシアシル補酵素Ａ脱水素酵素欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＨＡＤＨであるか、疾患は２，４ジエノイル－ＣｏＡレダクターゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＮＡＤＫ２であるか、疾患は３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡリアーゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＨＭＧＣＬであるか、疾患はマロニル－ＣｏＡデカルボキシラーゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＭＬＹＣＤであるか、疾患は全身性原発性カルニチン欠乏症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＳＬＣ２２Ａ５であるか、疾患はカルニチン－アシルカルニチントランスロカーゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＳＬＣ２５Ａ２０であるか、疾患はカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＣＰＴ１Ａであるか、疾患はカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩＩ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＣＰＴ２であるか、疾患はリソソーム酸リパーゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＬＩＰＡであるか、または疾患はゴーシェ病であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＧＢＡである。
実施形態では、代謝障害は、ポルフィリン代謝の障害であり、ここで、疾患は急性間欠性ポルフィリン症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＨＭＢＳであるか、疾患はギュンター病であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＵＲＯＳであるか、疾患は晩発性皮膚ポルフィリン症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＵＲＯＤであるか、疾患は肝骨髄性ポルフィリン症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＵＲＯＤであるか、疾患は遺伝性コプロポルフィリン症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＣＰＯＸであるか、疾患は異型ポルフィリン症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＰＰＯＸであるか、疾患は骨髄性プロトポルフィリン症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＦＥＣＨであるか、または疾患はアミノレブリン酸デヒドラターゼ欠損性ポルフィリン症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＬＡＤである。
実施形態では、代謝障害は、リソソーム蓄積の障害であり、ここで、疾患はファーバー病であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＳＡＨ１であるか、疾患はクラッベ病であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＧＡＬＣであるか、疾患はガラクトシアリドーシスであり、欠陥遺伝子は、任意選択でＣＴＳＡであるか、疾患はファブリー病であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＧＬＡであるか、疾患はシンドラー病であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＮＡＧＡであるか、疾患はＧＭ１ガングリオシドーシスであり、欠陥遺伝子は、任意選択でＧＬＢ１であるか、疾患はテイ・サックス病であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＨＥＸＡであるか、疾患はサンドホフ病であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＨＥＸＢであるか、疾患はＧＭ２－ガングリオシドーシス、ＡＢ異型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＧＭ２Ａであるか、疾患はニーマン・ピック病であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＳＭＰＤ１、ＮＰＣ１、またはＮＰＣ２であるか、疾患は異染性白質ジストロフィーであり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＲＳＡまたはＰＳＡＰであるか、疾患はマルチプルスルファターゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＳＵＭＦ１であるか、疾患はハーラー症候群であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＩＤＵＡであるか、疾患はハンター症候群であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＩＤＳであるか、疾患はサンフィリッポ症候群であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＨＧＳＮＡＴ、またはＧＮＳであるか、疾患はモルキオ症候群であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＧＡＬＮＳまたはＧＬＢ１であるか、疾患はマロトー・ラミー症候群であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＲＳＢであるか、疾患はスライ症候群であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＧＵＳＢであるか、疾患はシアリドーシスであり、欠陥遺伝子は、任意選択でＮＥＵ１、ＮＥＵ２、ＮＥＵ３、またはＮＥＵ４であるか、疾患はＩ－ｃｅｌｌ病であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＧＮＰＴＡＢまたはＧＮＰＴＧであるか、疾患はムコリピドーシスＩＶ型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＭＣＯＬＮ１であるか、疾患は乳児神経セロイドリポフスチン症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＰＰＴ１またはＰＰＴ２であるか、疾患はＪａｎｓｋｙ－Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ病であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＴＰＰ１であるか、疾患はバッテン病であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＣＬＮ１、ＣＬＮ２、ＣＬＮ３、ＣＬＮ５、ＣＬＮ６、ＭＦＳＤ８、ＣＬＮ８、またはＣＴＳＤであるか、疾患はクフス病Ａ型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＣＬＮ６またはＰＰＴ１であるか、疾患はクフス病Ｂ型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＤＮＡＪＣ５またはＣＴＳＦであるか、疾患はアルファ－マンノシドーシスであり、欠陥遺伝子は、任意選択でＭＡＮ２Ｂ１、ＭＡＮ２Ｂ２、またはＭＡＮ２Ｃ１であるか、疾患はベータ－マンノシドーシスであり、欠陥遺伝子は、任意選択でＭＡＮＢＡであるか、疾患はフコシドーシスであり、欠陥遺伝子は、任意選択でＦＵＣＡ１であるか、疾患はシスチン症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＣＴＮＳであるか、疾患は濃化異骨症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＣＴＳＫであるか、疾患はサラ病であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＳＬＣ１７Ａ５であるか、疾患は乳児性遊離シアル酸蓄積症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＳＬＣ１７Ａ５であるか、または疾患はダノン病であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＬＡＭＰ２である。
実施形態では、代謝障害は、ペルオキシソームの生合成障害であり、ここで、疾患はツェルウェーガー症候群であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＰＥＸ１、ＰＥＸ２、ＰＥＸ３、ＰＥＸ５、ＰＥＸ６、ＰＥＸ１２、ＰＥＸ１４、またはＰＥＸ２６であるか、疾患は乳児レフサム病であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＰＥＸ１、ＰＥＸ２、またはＰＥＸ２６であるか、疾患は新生児副腎脳白質ジストロフィーであり、欠陥遺伝子は、任意選択でＰＥＸ５、ＰＥＸ１、ＰＥＸ１０、ＰＥＸ１３、またはＰＥＸ２６であるか、疾患はＲＣＤＰ１型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＰＥＸ７であるか、疾患はピペコリン酸血症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＰＡＨＸであるか、疾患は無カタラーゼ症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＣＡＴであるか、疾患は高シュウ酸尿症１型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＧＸＴであるか、疾患はアシルＣｏＡオキシダーゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＣＯＸ１であるか、疾患はＤ－二頭酵素欠損症（Ｄ－ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＨＳＤ１７Ｂ４であるか、疾患はジヒドロキシアセトンリン酸アシルトランスフェラーゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＧＮＰＡＴであるか、疾患はＸ連鎖副腎白質ジストロフィーであり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＢＣＤ１であるか、疾患はα－メチルアシルＣｏＡラセマーゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＭＡＣＲであるか、疾患はＲＣＤＰ２型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＤＨＡＰＡＴであるか、疾患はＲＣＤＰ３型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＧＰＳであるか、疾患は成人レフサム病－１であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＰＨＹＨであるか、または疾患はマリブレー低身長症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＴＲＩＭ３７である。
実施形態では、代謝障害は、プリンまたはピリミジン代謝の障害であり、ここで、疾患はレッシュ・ナイハン症候群であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＨＰＲＴであるか、疾患はアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＰＲＴであるか、疾患はアデノシンデアミナーゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＤＡであるか、疾患はアデノシン一リン酸デアミナーゼ欠損症１型であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＭＰＤ１であるか、疾患はアデニロコハク酸リアーゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＡＤＳＬであるか、疾患はジヒドロピリミジン脱水素酵素欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＤＰＹＤであるか、疾患はミラー症候群であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＤＨＯＤＨであるか、疾患はオロト酸尿症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＵＭＰＳであるか、疾患はプリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＰＮＰであるか、または疾患はキサンチン尿症であり、欠陥遺伝子は、任意選択でＸＤＨ、ＭＯＣＳ１、またはＭＯＣＳ２、ＧＥＰＨである。
実施形態では、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）を調節するための方法に関する。ＴＴＲをコードする合成ＲＮＡを有効量にて対象に投与するステップを含む方法であり、合成ＲＮＡは、実質的な細胞毒性を回避する１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む。
実施形態では、調節することにより、対象においてＴＴＲ量の増加がもたらされる。
実施形態では、調節することにより、対象においてＴＴＲ量の減少がもたらされる。
実施形態では、調節することにより、アミロイド病、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）、及び家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）のうちの１つ以上の治療がもたらされる。
実施形態では、非標準ヌクレオチドは、ピリミジンについては２Ｃ位、４Ｃ位、及び５Ｃ位から選択される位置、またはプリンについては６Ｃ位、７Ｎ位及び８Ｃ位から選択される位置における１つ以上の置換を有する。
実施形態では、本発明は、疼痛、例えば、手術後疼痛及び／または慢性疼痛の治療または軽減を、それを必要とする対象に対して、電位依存性ナトリウムチャネル１型（ＮａＶ１）遺伝子、例えば、ＮａＶ１．３、ＮａＶ１．７、ＮａＶ１．８、及び／またはＮａＶ１．９に二本鎖切断を作る能力がある遺伝子編集タンパク質をコードする合成ＲＮＡを有効量にて投与することによって行う。
実施形態では、投与は、中枢神経系（ＣＮＳ）または末梢神経系（ＰＮＳ）、例えば、ＣＮＳまたはＰＮＳのニューロン及びグリア細胞を対象とする。
実施形態では、疾患または障害は、肺の疾患または障害である。実施形態では、疾患または障害は、肺の疾患または障害と関連する炎症である。実施形態では、肺の疾患または障害は、石綿症、喘息、気管支拡張症、気管支炎、慢性咳嗽、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、感冒、クループ、嚢胞性線維症、ハンタウイルス、特発性肺線維症、インフルエンザ、肺癌、新型インフルエンザ、百日咳、胸膜炎、肺炎、肺塞栓症、肺高血圧症、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、サルコイドーシス、睡眠時無呼吸、肺活量測定、乳幼児突然死症候群（ＳＩＤＳ）、及び結核から選択される。
さらにまた、いくつかの実施形態では、本願組成物は、尋常性座瘡、夏季座瘡、集簇性座瘡、化粧品性座瘡、電撃性座瘡、項部ケロイド座瘡（ａｃｎｅ ｋｅｌｏｉｄａｌｉｓ ｎｕｃｈａｅ）、機械性座瘡（ａｃｎｅ ｍｅｃｈａｎｉｃａ）、薬物性座瘡、壊死性粟粒状座瘡（ａｃｎｅ ｍｉｌｉａｒｉｓ ｎｅｃｒｏｔｉｃａ）、壊死性座瘡（ａｃｎｅ ｎｅｃｒｏｔｉｃａ）、酒さ性座瘡、日光角化症、尋常性座瘡、夏季座瘡、集簇性座瘡、化粧品性座瘡、電撃性座瘡、項部ケロイド座瘡（ａｃｎｅ ｋｅｌｏｉｄａｌｉｓ ｎｕｃｈａｅ）、機械性座瘡（ａｃｎｅ ｍｅｃｈａｎｉｃａ）、薬物性座瘡、壊死性粟粒状座瘡（ａｃｎｅ ｍｉｌｉａｒｉｓ ｎｅｃｒｏｔｉｃａ）、壊死性座瘡（ａｃｎｅ ｎｅｃｒｏｔｉｃａ）、酒さ性座瘡、急性蕁麻疹、アレルギー性接触皮膚炎、円形脱毛症、血管浮腫、足白癬、アトピー性皮膚炎、自家感作性湿疹、新生児座瘡（ｂａｂｙ ａｃｎｅ）、脱毛、バストミセス症（ｂａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ）、黒色面疱、あざ及び他の皮膚色素沈着の問題、おでき、挫傷、虫の咬傷と刺傷、熱傷、蜂窩織炎、ツツガムシ類、塩素座瘡、コリン性またはストレス性蕁麻疹、慢性蕁麻疹、寒冷蕁麻疹、融合性細網状乳頭腫、鶏眼、嚢胞、ふけ、疱疹状皮膚炎、皮膚描記症、異汗性湿疹、おむつ皮膚炎、乾燥皮膚、発汗異常、外胚葉異形成症、例えば、無汗性外胚葉異形成症とＸ連鎖無汗性外胚葉異形成症、湿疹、疣贅状表皮発育異常症、結節性紅斑、掻破座瘡、運動誘発アナフィラキシー毛包炎、過剰皮脂、毛包炎、そばかす、凍傷、爪真菌症、髪密度、発毛速度、ハロゲン座瘡、脱毛、あせも、血腫、単純ヘルペス感染（例えば、生殖器以外）、化膿性汗腺炎、蕁麻疹、多汗症、色素過剰、無汗性外胚葉異形成症、色素減少、膿痂疹、内生毛、温熱性蕁麻疹、足の陥入爪、乳児座瘡または新生児座瘡、そう痒、刺激性接触皮膚炎、いんきんたむし、ケロイド、毛孔性角化症、扁平苔癬、硬化性苔癬、顔面播種状粟粒性狼瘡、肝斑、ほくろ、伝染性軟属腫、爪の成長速度、爪の健康、神経皮膚炎、貨幣状湿疹、職業性座瘡、油疹、爪真菌症、物理性蕁麻疹、毛巣嚢胞、ばら色粃糠疹、癜風、ツタウルシ、ポマード座瘡、鬚毛部仮性毛包炎または項部ケロイド座瘡（ａｃｎｅ ｋｅｌｏｉｄａｌｉｓ ｎｕｃｈａｅ）、乾癬、乾癬性関節炎、圧蕁麻疹または遅延性圧蕁麻疹、切り傷とかすり傷等の刺創、皮疹、稀なまたは水性の蕁麻疹、鼻形成、白癬、酒さ、ロスムンド・トムソン症候群、皮膚のたるみ、疥癬、瘢痕、脂漏、脂漏性皮膚炎、帯状疱疹、皮膚癌、スキンタッグ、日光蕁麻疹、クモ刺咬傷、皮膚線条、日焼け、タール座瘡、熱帯性座瘡、皮膚の菲薄化、鵞口瘡、癜風、一過性棘融解性皮膚症、ｔｙｃｏｏｎ’ｓ ｃａｐまたは粟粒状壊死性座瘡（ａｃｎｅ ｎｅｃｒｏｔｉｃａ）、皮膚の不均等な色調、静脈瘤、静脈性湿疹、振動性血管浮腫、白斑、疣贅、ウェーバー・クリスチャン病、しわ、ｘ連鎖無汗性外胚葉異形成症、乾燥性湿疹、酵母菌感染症及び加齢の全身兆候等であるが、これらに限定されない、疾患、障害及び／または状態の治療、管理、もしくは予防に使用され得る、及び／または疾患、障害及び／または状態を患う対象の外皮系のメンバーの外観を改変、修飾し得るか、もしくは変化させ得る。
本発明の例示的ながん及び／または腫瘍としては、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳及び中枢神経系のがん；乳癌；腹膜のがん；子宮頸癌；絨毛癌；結腸・直腸癌；結合組織のがん；消化器系のがん；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部のがん；胃癌（消化管癌を含む）；膠芽腫；肝癌（ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；肝癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）；上皮内腫瘍；腎癌（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ）または腎癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）；喉頭癌；白血病；肝癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺偏平上皮癌）；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（口唇、舌、口、及び咽頭）；卵巣癌；膵癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器のがん；唾液腺癌；肉腫；皮膚癌；扁平上皮癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮癌または子宮内膜癌；泌尿器系のがん；外陰癌；ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫が含まれるリンパ腫、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中等度／濾胞性ＮＨＬ；中等度びまん性ＮＨＬ；高度免疫芽球性ＮＨＬ；高度リンパ芽球性ＮＨＬ；高度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ（ｈｉｇｈ ｇｒａｄｅ ｓｍａｌｌ ｎｏｎ－ｃｌｅａｖｅｄ ｃｅｌｌ ＮＨＬ）；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；ならびに他の癌腫及び肉腫；及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（脳腫瘍と関連するもの等）、及びメイグス症候群に関連した血管増殖異常が挙げられるが、これらに限定されない。
実施形態では、１つ以上の希少疾患は、本願組成物により治療、管理または予防され、それらには、例として、骨髄性プロトポルフィリン症、ヘイリー・ヘイリー病、表皮水疱症（ＥＢ）、色素性乾皮症、エーラス・ダンロス症候群、皮膚弛緩症、プロテインＣ＆プロテインＳ欠乏症、アルポート症候群、線状掌蹠角化症、致死性棘融解性ＥＢ、弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）、尋常性魚鱗癬、尋常性天疱瘡、及び基底細胞母斑症候群が含まれる。
実施形態では、本願組成物は、炎症、急性炎症、慢性炎症、呼吸器疾患、アテローム性動脈硬化、再狭窄、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、敗血症性ショック、関節リウマチ、炎症性腸疾患、炎症性骨盤疾患、疼痛、眼炎症性疾患、セリアック病、リー症候群、グリセロールキナーゼ欠損症、家族性好酸球増加症（ＦＥ）、常染色体劣性痙性運動失調、喉頭炎症性疾患；結核、慢性胆嚢炎、気管支拡張症、珪肺症及び他の塵肺症等の、１つ以上の炎症性の疾患または状態を治療、管理または予防するために使用される。
実施形態では、本願組成物は、多発性硬化症、真性糖尿病、狼瘡、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、ギラン－バレー症候群、強皮症、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性てんかん、ラスムッセン脳炎、原発性硬化性胆管炎、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、アジソン病、橋本甲状腺炎、線維筋痛、メニエール症候群；移植拒絶（例えば、同種移植片拒絶予防）悪性貧血、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、及び他の自己免疫疾患等の、１つ以上の自己免疫性の疾患または状態を治療、管理または予防するために使用される。
実施形態では、本願組成物は、ＡＤＨＤ、ＡＩＤＳ－神経学的合併症、透明中隔の欠損、後天性てんかん様失語症、急性散在性脳脊髄炎、副腎脳白質ジストロフィー、脳梁欠損症、失認症、アイカルディ症候群、アレキサンダー病、アルパース病、交互性片麻痺、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、無脳症、動脈瘤、アンジェルマン症候群、血管腫症、無酸素症、失語症、失行症、クモ膜嚢胞、クモ膜炎、アーノルド－キアリ奇形、動静脈奇形、アスパルタム、アスペルガー症候群、毛細血管拡張性失調症、運動失調、注意欠陥多動性障害、自閉症、自律神経機能障害、背部痛、バース症候群、バッテン病、ベーチェット病、ベル麻痺、良性本態性眼瞼痙攣、良性限局性筋萎縮症、良性頭蓋内圧亢進症、ベルンハルト‐ロート症候群、ビンスワンガー病、眼瞼痙攣、ブロッホ・サルツバーガー症候群、腕神経叢出生時損傷、腕神経叢損傷、ラッドベリー－エッグルストン症候群、脳動脈瘤、脳損傷、脳及び脊髄の腫瘍、ブラウン－セカール症候群、球脊髄性筋萎縮症、カナバン病、手根管症候群、カウザルギー、海綿腫、海綿状血管腫、海綿状奇形、中心性頸髄症候群、脊髄中心症候群、中枢性疼痛症候群、頭部障害、小脳変性、小脳形成不全、脳動脈瘤、脳動脈硬化、脳動脈瘤、脳性脚気、脳性巨人症、脳低酸素症、脳性麻痺、脳・眼・顔・骨格症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、キアリ奇形、舞踏病、有棘赤血球舞踏病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性起立耐性失調、慢性疼痛、コケイン症候群ＩＩ型、コフィン・ローリー症候群、遷延性植物状態を含む昏睡、複合性局所疼痛症候群、先天性両側顔面神経麻痺、先天性筋無力症、先天性ミオパチー、先天性海綿状血管奇形、皮質基底核変性症、頭部動脈炎、頭蓋骨癒合症、クロイツフェルト・ヤコブ病、進行性外傷傷害症候群、クッシング症候群、巨細胞性封入体病（ＣＩＢＤ）、サイトメガロウイルス感染症、ダンシングアイズ－ダンス足症候群、ダンディー・ウォーカー症候群、ドーソン病（Ｄａｗｓｏｎ Ｄｉｓｅａｓｅ）、ドモルシア（Ｄｅ Ｍｏｒｓｉｅｒ’ｓ）症候群、デジェリン・クルンプケ麻痺、多発脳梗塞性認知症、皮質下認知症、レビー小体型認知症、皮膚筋炎、発達性協調運動障害、デビック病、糖尿病性神経障害、びまん性硬化症、ドラベ症候群、自律神経障害、書字障害、失読症、嚥下障害、統合運動障害、ジストニア、早期乳児てんかん性脳症、エンプティセラ症候群、嗜眠性脳炎、脳炎と髄膜炎、脳瘤、脳障害、脳三叉神経血管腫症、てんかん、エルブ麻痺、エルブ・デュシェンヌ麻痺とデジェリン・クルンプケ麻痺、ファブリー病、ファール症候群、失神、家族性自律神経障害、家族性血管腫、家族性特発性大脳基底核石灰化症、家族性痙性麻痺、熱性痙攣（例えば、ＧＥＦＳ及びＧＥＦＳプラス）、フィッシャー症候群、筋緊張低下児症候群、フリードライヒ運動失調症、ゴーシェ病、ゲルストマン症候群、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、巨細胞動脈炎、巨細胞性封入体症、グロボイド細胞白質ジストロフィー、舌咽神経痛、ギラン－バレー症候群、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症、ハレルフォルデン‐スパッツ病、頭部外傷、頭痛、持続性片側頭痛、片側顔面痙攣、交代性片麻痺、遺伝性ニューロパチー、遺伝性痙性対麻痺、遺伝性多発神経炎性失調、耳帯状疱疹、帯状疱疹、平山症候群、全前脳胞症、ハンチントン病、水無脳症、正常圧水頭症、水頭症、水脊髄症、副腎皮質機能亢進症、過眠症、筋緊張亢進、筋緊張低下、低酸素症、免疫介在性脳脊髄炎、封入体筋炎、色素失調症、乳児筋緊張低下、乳児フィタン酸蓄積症、乳児レフサム病、乳児痙攣、炎症性ミオパチー、腸性脂肪異栄養症、頭蓋内嚢胞、頭蓋内高血圧、アイザックス症候群、ジュベール症候群、カーンズ－セイアー症候群、ケネディ病、Ｋｉｎｓｂｏｕｒｎｅ症候群、クライネ・レビン症候群、クリッペル・ファイル症候群、クリッペル・トレノネー・ウェーバー症候群（ＫＴＳ）、クリューバー・ビューシー症候群、コルサコフ健忘症候群、クラッベ病、クーゲルベルグ・ウェランダー病、クールー病、ランバート・イートン筋無力症候群、ランドウ・クレフナー症候群、外側大腿皮神経神経絞扼、延髄外側症候群、学習障害、リー病、レノックス－ガストー症候群、レッシュ－ナイハン症候群、白質ジストロフィー、レバイン・クリッチュリー症候群（Ｌｅｖｉｎｅ－Ｃｒｉｔｃｈｌｅｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、レビー小体型認知症、脳回欠損、とじ込め症候群、ルー・ゲーリック病、狼瘡－神経学的後遺症、ライム病－神経学的合併症、マシャド・ジョセフ病、大脳症、巨脳症、メルカーソン・ローゼンタール症候群、髄膜炎、メンケス病、異常感覚性大腿神経痛、異染性白質ジストロフィー、小頭症、片頭痛、ミラーフィッシャー症候群、軽度の脳卒中、ミトコンドリアミオパチー、メビウス症候群、一側下腿筋萎縮症、運動ニューロン疾患、もやもや病、ムコリピドーシス、ムコ多糖症、多発梗塞認知症、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症、起立性低血圧を伴う多系統萎縮症、多系統萎縮症、筋ジストロフィー、先天性筋無力症、重症筋無力症、脱髄性びまん性硬化症、乳児ミオクロニー脳症、ミオクロヌス、ミオパチー－先天性、ミオパチー－甲状腺中毒性、ミオパチー、先天性筋強直症、筋強直症、ナルコレプシー、神経有棘赤血球症、脳内鉄沈着を伴う神経変性症、神経線維腫症、悪性症候群、ＡＩＤＳの神経学的合併症、ポンペ病の神経症状、視神経脊髄炎、神経性筋強直症、神経セロイドリポフスチン症、神経細胞移動障害、遺伝性ニューロパチー、神経サルコイドーシス、神経毒性、海綿状母斑、ニーマン・ピック病、オサリバン・マクラウド症候群（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ－ＭｃＬｅｏｄ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、後頭神経痛、潜在性脊椎癒合不全続発（Ｏｃｃｕｌｔ Ｓｐｉｎａｌ Ｄｙｓｒａｐｈｉｓｍ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、大田原症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、オプソクローヌス・ミオクローヌス、起立性低血圧症、過度使用症候群、慢性疼痛、腫瘍随伴症候群、感覚異常症、パーキンソン病、先天性パルニオトニア（Ｐａｒｎｙｏｔｏｎｉａ Ｃｏｎｇｅｎｉｔａ）、発作性舞踏アテトーゼ、発作性片側頭痛、パリー・ロンベルグ、ペリツェウス－メルツバッハー病、ペナ・ショッカーＩＩ症候群、神経周膜嚢腫、周期性四肢麻痺、末梢性ニューロパチー、脳室周囲白質軟化症、遷延性植物状態、広汎性発達障害、フィタン酸蓄積症、ピック病、梨状筋症候群、下垂体腫瘍、多発性筋炎、ポンペ病、脳空洞症、ポリオ後症候群、帯状疱疹後神経痛、感染後脳脊髄炎、起立性低血圧、体位性起立性頻拍症候群、体位性頻拍症候群、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性顔面半側萎縮症、進行性歩行運動失調、進行性多巣性白質脳症、進行硬化性灰白質ジストロフィー、進行性核上性麻痺、偽性脳腫瘍、ピリドキシン依存性及びピリドキシン反応性発作障害、ラムゼイ・ハント症候群Ｉ型、ラムゼイ・ハント症候群ＩＩ型、ラスムッセン脳炎及び他の自己免疫性てんかん、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、乳児レフサム病、レフサム病、反復運動障害、反復性ストレス障害、レストレスレッグス症候群、レトロウイルス関連脊髄症、レット症候群、ライ症候群、ライリー－デイ症候群、ＳＵＮＣＴ頭痛、仙骨神経根嚢胞、舞踏病（Ｓａｉｎｔ Ｖｉｔｕｓ Ｄａｎｃｅ）、唾液腺疾患、サンドホフ病、シルダー病、裂脳症、発作障害、中隔視神経形成異常症、乳児重症ミオクロニーてんかん（ＳＭＥＩ）、乳幼児揺さぶられ症候群、帯状疱疹、シャイ－ドレーガー症候群、シェーグレン症候群、睡眠時無呼吸、睡眠病、ソトス症候群、痙縮、二分脊髄、脊髄梗塞、脊髄損傷、脊髄腫瘍、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳萎縮、スティール－リチャードソン－オルシェウスキー症候群、スティッフパーソン症候群、線条体黒質変性症、脳卒中、スタージ－ウェーバー症候群、亜急性硬化性全脳炎、皮質下動脈硬化性脳症、嚥下障害、シデナム舞踏病、失神、梅毒性脊髄硬化症、水脊髄空洞症（Ｓｙｒｉｎｇｏｈｙｄｒｏｍｙｅｌｉａ）、脊髄空洞症、全身性エリテマトーデス、脊髄癆、遅発性ジスキネジア、ターロブ嚢胞、テイ・サックス病、側頭動脈炎、脊髄係留症候群、トムゼン病、胸郭口症候群、甲状腺中毒性ミオパチー、疼痛性チック、トッド麻痺、トゥレット症候群、一過性脳虚血発作、伝染性海綿状脳症、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、振戦、三叉神経痛、熱帯性痙性不全対麻痺症、結節性硬化症、勃起性血管腫（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｒｅｃｔｉｌｅ Ｔｕｍｏｒ）、側頭動脈炎を含む血管炎、フォン‐エコーノモ病、フォン・ヒッペル・リンドウ病（ＶＨＬ）、フォン・レックリングハウゼン病、ワレンベルグ症候群、ウェルドニッヒ・ホフマン病、ウェルニッケ・コルサコフ症候群、ウェスト症候群、ウィップル病、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、Ｘ連鎖球脊髄性筋萎縮症、及びツェルウェーガー症候群が含まれる、１つ以上の神経疾患を治療、管理または予防するために使用される。
実施形態では、本願組成物は、疼痛、例えば、手術後疼痛または慢性疼痛を治療及び軽減するために使用される。
実施形態では、本願組成物は、ハンチントン病を治療するために使用される。
実施形態では、本願組成物は、鎌状赤血球貧血またはサラセミアを治療するために使用される。
実施形態では、本願組成物は、疾患または障害に関連するエクソンのＲＮＡスプライシングを変化させる。実施形態では、疾患または障害は、アルポート症候群、アルツハイマー病、ベスレムミオパチー及びウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー（Ｕｌｌｒｉｃｈ ｓｃｌｅｒｏａｔｏｎｉｃ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、フリードライヒ失調症、ハンチントン病、接合部型表皮水疱症、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）、ならびに様々なミオパチー及びジストロフィーから選択される。
実施形態では、本願組成物は、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支拡張症、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、肺血管収縮、炎症、アレルギー、呼吸阻害（ｉｍｐｅｄｅｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ）、呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、肺高血圧症、肺血管収縮、気腫、ハンタウイルス肺症候群（ＨＰＳ）、レフラー症候群、グッドパスチャー症候群、胸膜炎、肺炎、肺水腫、肺線維症、サルコイドーシス、呼吸器多核体ウイルス感染症に関連した合併症、及び他の呼吸器疾患等の、１つ以上の呼吸器疾患を治療するために使用される。
実施形態では、本願組成物は、冠動脈心疾患（ＣＨＤ）、脳血管疾患（ＣＶＤ）、大動脈弁狭窄症、末梢血管疾患、アテローム性動脈硬化、動脈硬化、心筋梗塞（心臓発作）、脳血管疾患（脳卒中）、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、狭心症（安定及び不安定）、心房細動、不整脈、弁膜症、及び／またはうっ血性心不全が含まれるが、これらに限定されない、心臓及び脈管系を侵す疾患もしくは状態等の心血管疾患を治療、管理または予防するために使用される。
実施形態では、本願組成物は、１つ以上の代謝関連障害を治療、管理または予防するために使用される。実施形態では、本発明は、１型糖尿病及び２型糖尿病ならびに肥満に関連した糖尿病を含めた糖尿病の治療、管理または予防に有用である。本発明の組成物及び方法は、糖尿病性腎症、高血糖症、耐糖能異常、インスリン抵抗性、肥満、脂質障害、脂質異常症、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、ＨＤＬ低値、ＬＤＬ高値、アテローム性動脈硬化とその後遺症、血管再狭窄、過敏性腸症候群、クローン病と潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、他の炎症性状態、膵炎、腹部肥満、神経変性疾患、網膜症、腫瘍性疾患、脂肪細胞系腫瘍、脂肪肉腫等の脂肪細胞系癌、前立腺癌及び他のがん（胃癌、乳癌、膀胱癌及び結腸癌を含む）、血管新生、アルツハイマー病、乾癬、高血圧、メタボリックシンドローム（例えば、以下の障害のうち３つ以上を有する人：腹部肥満、高トリグリセリド血症、ＨＤＬコレステロール低値、高血圧、及び空腹時血漿グルコース濃度高値）、卵巣性高アンドロゲン症（多嚢胞性卵巣症候群）、ならびに睡眠時無呼吸等の、インスリン抵抗性が要素である他の障害が含まれるが、これらに制限されない糖尿病関連障害の治療または予防に有用である。本発明の組成物及び方法は、遺伝もしくは環境による肥満を含む肥満及び肥満関連障害の治療、管理、または予防に有用である。ここでの肥満関連障害は、肥満に関連しているか、それにより生じるか、またはそれに起因する。肥満関連障害の例としては、肥満、糖尿病、過食、むちゃ食い、及び過食症、高血圧、血漿インスリン濃度上昇とインスリン抵抗性、脂質異常症、高脂血症、子宮内膜癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌及び結腸癌、変形性関節症、閉塞性睡眠時無呼吸、胆石、心疾患、心調律異常と不整脈、心筋梗塞、うっ血性心不全、冠動脈心疾患、突然死、脳卒中、多嚢胞性卵巣疾患、頭蓋咽頭腫、プラダー・ウィリー症候群、フレーリッヒ症候群、ＧＨ分泌不全対象、正常変異低身長、ターナー症候群、ならびに代謝活性低下または総除脂肪体重に対するパーセンテージで表した安静時エネルギー消費量の減少を示す他の病的状態、例えば、急性リンパ芽球性白血病の小児が挙げられる。肥満関連障害のさらなる例は、メタボリックシンドローム、インスリン抵抗症候群、生殖ホルモン異常、性機能及び生殖機能障害（生殖障害、不妊症、男性の性腺機能低下症及び女性の多毛症等）、母体肥満に関連した胎児欠陥、肥満関連胃食道逆流等の消化管運動障害、肥満－低喚気症候群（ピックウイキアン症候群）等の呼吸障害、息切れ、心血管疾患、炎症、例えば、血管系の全身性炎症、動脈硬化、高コレステロール血症、下背部痛、胆嚢疾患、高尿酸血症、痛風、及び腎臓癌、ならびに麻酔リスクの上昇である。本発明の組成物及び方法はまた、アルツハイマー病を治療するために有用である。
核酸を含有するリポソーム製剤を含め、核酸は、インビボで送達された場合に肝臓及び／または脾臓に蓄積し得る。タンパク質をコードする核酸は、肝臓及び脾臓でのタンパク質発現を調節することができること、及びこのように使用される核酸は、肝臓及び脾臓の疾患の治療用の潜在的治療薬となり得ることが今回発見された。したがって、特定の実施形態は、目的のタンパク質をコードする核酸を患者に送達することによって肝臓及び／または脾臓の疾患を治療するための方法を対象とする。他の実施形態は、肝臓及び／または脾臓の疾患の治療用の、目的のタンパク質をコードする核酸を含む治療用組成物を対象とする。治療され得る肝臓及び／または脾臓の疾患及び状態としては、肝炎、アルコール誘発性肝疾患、薬物誘発性肝疾患、エプスタイン－バーウイルス感染症、アデノウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、トキソプラズマ症、ロッキー山紅斑熱、非アルコール性脂肪性肝疾患、血色素症、ウィルソン病、ジルベール病、ならびに肝臓及び／または脾臓のがんが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本願の組成物及び方法は、１型糖尿病、虚血性及び拡張型の心筋症を含む心疾患、黄斑性変性、パーキンソン病、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ファンコニ貧血、重症複合免疫不全症、遺伝性感覚ニューロパチー、色素性乾皮症、ハンチントン病、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、がん、ならびに肝炎及びＨＩＶ／ＡＩＤＳ等の感染症の治療に関する。
実施形態では、本願の方法及び組成物は、１つ以上の代謝性の疾患または障害を治療または予防するのに使用される。実施形態では、本願の方法及び組成物は、炭水化物代謝の疾患または障害．アミノ酸代謝の疾患または障害、尿素サイクルの疾患または障害、脂肪酸代謝の疾患または障害、ポルフィリン代謝の疾患または障害、リソソーム蓄積症、ペルオキシソームの生合成障害、及びプリンもしくはピリミジン代謝の疾患または障害のうちの１つ以上を治療または予防するのに使用される。
実施形態では、本願の方法及び組成物は、１つ以上の眼疾患もしくは障害を治療または予防するのに使用され、それらには、糖尿病網膜症、ドライアイ、白内障、網膜静脈閉塞、黄斑浮腫、黄斑性変性（滲出型及び萎縮型）、屈折障害及び調節障害、円錐角膜、弱視、緑内障、シュタルガルト病、眼内炎、結膜炎、ブドウ膜炎、網膜剥離、角膜潰瘍、涙嚢炎、デュアン眼球後退症候群、及び視神経炎が含まれるが、これらに制限されない。
実施形態では、眼疾患または眼障害は、中心性漿液性網膜症（ＣＳＲ）、成人卵黄様疾患（ａｄｕｌｔ ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ ｄｉｓｅａｓｅ）、ブドウ膜炎、原発性全身性疾患と続発性全身性疾患（例えば、非限定的な例として、サルコイド、リウマチ様疾患、関節炎等）、白点症候群（ＭＥＷＤＳ（（ＭＥＷＤＳ（多発消失性白点症候群）を含む）、匐行性脈絡膜症（ｓｅｒｐｉｇｉｎｏｕｓ ｃｈｏｒｏｉｄｏｐａｔｈｙ）、ＡＭＰＰＥ（急性後部多発性小板状上皮症）、ＰＯＨＳ（推定眼ヒストプラスマ症）、または匐行性網脈絡膜症である。いくつかの実施形態では、疾患は、非限定的な例としてシュタルガルト病等の、黄斑症または錐体ジストロフィーであり得る。いくつかの実施形態では、疾患は、網膜色素変性症（ＲＰ）等の遺伝性変性疾患であり得る。いくつかの実施形態では、眼疾患は、眼の黒色腫、眼腫瘍または浸潤性腫瘍であり得る。
実施形態では、眼の疾患または障害は、フックス角膜ジストロフィーである。実施形態では、眼の疾患または障害は、レーバー先天性黒内障である。
実施形態では、本願の方法及び組成物は、表２Ａ、表２Ｂ、及び／または表２Ｃのタンパク質のいずれかを標的とするか、または疾患もしくは障害のいずれかを治療するのに使用される。
様々な実施形態では、本願の方法及び組成物には、合成ＲＮＡを含め、核酸医薬を、本明細書に記載される疾患、障害及び／または状態の診断、治療、予防もしくは改善において使用することが含まれる。様々な実施形態では、本願の方法及び組成物には、合成ＲＮＡを含め、核酸医薬を、組織（例えば、美容上）の改変、修飾及び／または変化において使用することが含まれる。
一般的に言えば、様々な実施形態では、本明細書に記載される合成ＲＮＡは、本明細書に記載される特定の用量でヒトに投与され、合成ＲＮＡは、治療用タンパク質であり得る目的のタンパク質をコードする、ときに標的配列と呼ばれる配列を含む。
標準ヌクレオチドのみを含む合成ＲＮＡは、パターン認識受容体に結合することができ、病原体関連分子パターンとして認識され得、かつ、細胞に強力な免疫応答を誘発することができ、これにより、翻訳阻止、炎症性サイトカインの分泌、及び細胞死をもたらすことができる。特定の非標準ヌクレオチドを含む合成ＲＮＡは、自然免疫系による検出を回避することができ、ヒト等においてタンパク質に高効率で翻訳され得る。例えば、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジン、プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－メトキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－ヒドロキシプソイドウリジン、５－メチルプソイドウリジン、５－ヒドロキシメチルプソイドウリジン、５－カルボキシプソイドウリジン、５－メトキシプソイドウリジン、及び５－ホルミルプソイドウリジンという群のメンバー等、本明細書に記載される非標準ヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含む合成ＲＮＡは、自然免疫系による検出を回避することができ、ヒト等においてタンパク質に高効率で翻訳され得る。したがって、特定の実施形態は、細胞を合成ＲＮＡと接触させることを含む、目的のタンパク質を発現するよう細胞を誘導するための方法を対象とする。他の実施形態は、細胞を、１つ以上の合成ＲＮＡ分子を含む溶液と接触させることを含む、細胞に合成ＲＮＡをトランスフェクトするための方法を対象とする。さらに他の実施形態は、患者に合成ＲＮＡを投与することを含む、患者を治療するための方法を対象とする。一実施形態では、合成ＲＮＡは、例えば、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジン、プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－メトキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－ヒドロキシプソイドウリジン、５－メチルプソイドウリジン、５－ヒドロキシメチルプソイドウリジン、５－カルボキシプソイドウリジン、５－メトキシプソイドウリジン、及び５－ホルミルプソイドウリジンという群のメンバー等、本明細書に記載される非標準ヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含む。別の実施形態では、合成ＲＮＡは、目的のタンパク質をコードする。例示的なＲＮＡは、本明細書の他の箇所に記載されているような非標準ヌクレオチド及び非標準ヌクレオチドの組み合わせとレベルを含有し得る。実施形態では、方法により、目的のタンパク質の発現がもたらされる。実施形態では、方法により、患者の皮膚における目的のタンパク質の発現がもたらされる。
他の実施形態は、インビボでの細胞に核酸を送達するための方法を対象とする。さらに他の実施形態は、目的のタンパク質を発現するようインビボでの細胞を誘導するための方法を対象とする。さらに他の実施形態は、患者を治療するための方法を対象とする。一実施形態では、方法は、角質層を破壊することを含む。別の実施形態では、方法は、細胞を核酸と接触させることを含む。さらに別の実施形態では、方法により、核酸を取り込む細胞がもたらされる。さらなる実施形態では、方法により、目的のタンパク質を発現する細胞がもたらされる。さらに別の実施形態では、方法により、患者における目的のタンパク質の発現がもたらされる。さらに別の実施形態では、方法により、患者の症状のうちの１つ以上の改善がもたらされる。さらに別の実施形態では、患者は、目的のタンパク質を必要としている。さらに別の実施形態では、患者は、目的のタンパク質が欠損している。
さらに他の実施形態は、患者に組成物を送達することを含む、患者を治療するための方法を対象とする。別の実施形態では、組成物は、１つ以上の核酸分子を含む。さらに別の実施形態では、１つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、目的のタンパク質をコードする。実施形態では、核酸は、合成ＲＮＡである。他の実施形態では、方法により、患者の症状のうちの１つ以上の改善がもたらされる。他の実施形態は、細胞または患者に、タンパク質またはペプチドをコードする核酸を送達することによって適応症を治療するための方法を対象とする。さらに他の実施形態は、タンパク質またはペプチドをコードする核酸を含む組成物を対象とする。本発明の方法及び組成物を使用して治療され得る適応症、ならびに本発明の組成物によりコードされ得るタンパク質及びペプチドは、表２Ａ、表２Ｂ、及び／または表２Ｃに記載されているが、それらは例として記載されているもので、限定するものではない。一実施形態では、適応症は、表２Ａ、表２Ｂ、及び／または表２Ｃから選択される。別の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、表２Ａ、表２Ｂ、及び／または表２Ｃから選択される。さらに別の実施形態では、適応症及びタンパク質またはペプチドは、表２Ａ、表２Ｂ、及び／または表２Ｃの同じ行から選択される。別の実施形態では、タンパク質は、遺伝子編集タンパク質である。さらに別の実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、疾患の表現型に少なくとも部分的に関与する遺伝子を標的とする。さらに別の実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、表２Ａ、表２Ｂ、及び／または表２Ｃから選択されるタンパク質をコードする遺伝子を標的とする。さらに別の実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、単独で、または他の１つ以上の分子もしくは遺伝子編集タンパク質と組み合わされて、疾患の表現型に少なくとも部分的に関与する変異を修正または除去する。
様々な実施形態では、本発明は、表２Ａ、表２Ｂ、及び／または表２Ｃに開示されているタンパク質のいずれかの前駆体形態及び／または成熟形態及び／またはアイソフォーム及び／または変異体ならびにそのようなタンパク質を標的とすることを企図している。実施形態では、前駆体形態及び／または成熟形態及び／またはアイソフォーム及び／または変異体のいずれも、対応する野生型タンパク質と比べて分泌が増強されている。実施形態では、前駆体形態及び／または成熟形態及び／またはアイソフォーム及び／または変異体のいずれも、半減期（例えば、血清中、血漿中、細胞内）が改変されている、例えば、半減期がより長く、またはより短くなっている。実施形態では、これは、野生型と比べたものである。
表２Ｂは、いずれも例示的な識別子（例えば、遺伝子配列番号及びリファレンスは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
様々な実施形態では、本願の方法及び組成物は、下表の疾患または障害のうちの１つ以上を治療または予防するのに使用される。様々な実施形態では、本願の方法及び組成物は、下表の疾患または障害のうちの１つ以上を、例えば、下表の疾患と関連する遺伝子を調節することによって、治療または予防するのに使用される。実施形態では、本願の方法及び組成物は、本願組成物を使用して下表２Ｃに記載の遺伝子を遺伝子編集するのに使用される。
上記表に記載されているＥｎｔｒｅｚエントリーは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の追加の例示的標的には、国際特許公開第ＷＯ２０１３／１５１６７１号の表６に記載されている美容上の標的が含まれ、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
さらに、いくつかの実施形態では、本願の方法及び組成物は、表２Ａ、表２Ｂ、及び／または表２Ｃのタンパク質のいずれかを標的とするか、もしくは疾患もしくは障害のいずれかを治療するのに使用される。様々な実施形態では、本発明は、表２Ｂに開示されているタンパク質のいずれかの全長型及び／または切断型を標的とすることを企図している。様々な実施形態では、本発明は、表２Ａ、表２Ｂ、及び／または表２Ｃに開示されているタンパク質のいずれかの前駆体形態及び／または成熟形態及び／またはアイソフォームを標的とすることを企図している。
様々な実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるタンパク質配列（例えば、表２Ａ、表２Ｂ、及び／または表２Ｃ内）のうちのいずれかとの配列同一性が約６０％（例えば、約６０％、または約６１％、または約６２％、または約６３％、または約６４％、または約６５％、または約６６％、または約６７％、または約６８％、または約６９％、または約７０％、または約７１％、または約７２％、または約７３％、または約７４％、または約７５％、または約７６％、または約７７％、または約７８％、または約７９％、または約８０％、または約８１％、または約８２％、または約８３％、または約８４％、または約８５％、または約８６％、または約８７％、または約８８％、または約８９％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％）であるタンパク質を標的とすることを企図している。
様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるタンパク質配列（例えば、表２Ａ、表２Ｂ、及び／または表２Ｃ内）のうちのいずれかに対して１つ以上のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を標的とすることを企図している。例えば、本発明は、本明細書に記載されるタンパク質配列（例えば、表２Ａ、表２Ｂ、及び／または表２Ｃ内）のうちのいずれかに対して１つ、または２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つ、または７つ、または８つ、または９つ、または１０、または１１、または１２のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を標的とすることを企図している。実施形態では、１つ以上のアミノ酸変異は、置換、挿入、欠失、及び切断から独立して選択され得る。
実施形態では、アミノ酸変異はアミノ酸置換であり、保存的及び／または非保存的な置換が含まれ得る。
「保存的置換」は、例えば、関わっているアミノ酸残基の、極性、電荷、サイズ、溶解性、疎水性、親水性、及び／または両親媒性に関する類似性に基づいて行われ得る。２０の天然に存在するアミノ酸は、以下の６つの標準アミノ酸群に分類することができる：（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ、（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び（６）芳香性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
本明細書で使用される場合、「保存的置換」は、あるアミノ酸を、上記の６つの標準アミノ酸群の同一群内に記載されている別のアミノ酸により交換することと定義される。例えば、ＡｓｐのＧｌｕによる交換では、そのように修飾されたポリペプチドにおいて１つの負電荷が保持される。さらに、グリシン及びプロリンは、それらがα－ヘリックスを破壊する能力に基づいて互いに置換され得る。
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、あるアミノ酸を、上記の６つの標準アミノ酸群（１）～（６）の異なる群に記載されている別のアミノ酸により交換することと定義される。
様々な実施形態では、置換にはまた、非古典的アミノ酸（例えば、セレノシステイン、ピロリシン、Ｎ－ホルミルメチオニン β－アラニン、ＧＡＢＡ及びδ－アミノレブリン酸、４－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、一般的アミノ酸のＤ－異性体、２，４－ジアミノ酪酸、α－アミノイソ酪酸、４－アミノ酪酸、Ａｂｕ、２－アミノ酪酸、γ－Ａｂｕ、ε－Ａｈｘ、６－アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２－アミノイソ酪酸、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコスメ（ｓａｒｃｏｓｍｅ）、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β－アラニン、フルオロ－アミノ酸、βメチルアミノ酸、Ｃ α－メチルアミノ酸、Ｎ α－メチルアミノ酸、及び一般的アミノ酸類似体等のデザイナーアミノ酸）も含まれ得る。
製造方法
本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体の化学合成方法は、本明細書の他の箇所で記載されている。
本発明の方法及び組成物では、特定のカチオン性脂質を使用し、その合成、調製及び特徴付けは、本明細書の他の箇所及び付随する実施例に記載されている。さらに、本発明は、治療薬、例えば、核酸と関連するものを含め、脂質凝集体及び／または脂質担体を調製する方法を提供する。
実施形態では、本願の脂質凝集体及び／または脂質担体、例えば、リポソームは、マイクロ流体を使用して作製される。実施形態では、本願の脂質凝集体及び／または脂質担体は、Ｎａｎｏａｓｓｅｍｂｌｒ装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して製造される。実施形態では、シリンジポンプを使用して有機溶液と水溶液を特定の流量で混合する。任意選択で、水溶液の流量と有機溶液の流量の比は、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約８：１、または約１０：１から選択され得る。実施形態では、有機溶液は、エタノール、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、トルエン、及びクロロホルム、またはその混合物のうちの１つ以上を含む。他の実施形態では、他の溶媒を使用する
実施形態では、本願の脂質凝集体及び／または脂質担体は、ある溶液を別の溶液に滴下混合することにより製造される。実施形態では、本願の脂質凝集体及び／または脂質担体は、噴霧機構を用いるか、または溶媒蒸発によるか、または超音波処理によるか、または１つ以上のメンブレンによるエクストルージョンによるか、または自己組織化のプロセスによるか、または方法の組み合わせによって製造される。
本明細書に記載される方法では、脂質の混合物を核酸の緩衝水溶液と合わせて、脂質粒子内に封入された核酸を含有する中間体混合物を生成し、ここで、封入された核酸は、約３ｗｔ％～約２５ｗｔ％、例えば、５～１５ｗｔ％の核酸／脂質比で存在する。中間体混合物は、任意選択で、脂質部分が、例えば、３０～１５０ｎｍ、例えば、約４０～９０ｎｍの直径を有する単層小胞である、脂質内封入核酸粒子が得られるようサイズ調整され得る。その後、ｐＨを上昇させて脂質－核酸粒子上の表面電荷の少なくとも一部分を中和させることで、少なくとも部分的に表面が中和された脂質内封入核酸の組成物が提供される。
いくつかのカチオン性脂質は、アミノ基のｐＫａ未満のｐＨで荷電され、かつｐＫａを超えるｐＨで実質的に中性なアミノ脂質である。これらのカチオン性脂質は、滴定可能なカチオン性脂質と呼ばれ、２段階工程を使用して本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体に使用することができる。最初に、滴定可能なカチオン性脂質及び他の小胞成分を核酸の存在下で用いてより低いｐＨで脂質小胞を形成することができる。このようにすることで、小胞に核酸が封入及び捕捉される。第２に、培地のｐＨを、存在している滴定可能なカチオン性脂質のｐＫａを超えるレベルまで、すなわち、生理的ｐＨ以上のレベルまで増大させることにより、新たに形成された小胞の表面電荷を中和することができる。この工程の特に有利な側面としては、表面に吸着されたあらゆる核酸の除去が容易であること、及び中性表面を有する核酸送達ビヒクルが得られることの両方が挙げられる。中性表面を有する、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体及び／またはリポソーム及び／または脂質粒子は、循環からの急速なクリアランスを回避すること、及びカチオン性リポソーム調製物に関連する特定の毒性を回避することが予想される。そのような滴定可能なカチオン性脂質を、核酸－脂質粒子の製剤においてこのように使用することに関する追加の詳細は、米国特許第６，２８７，５９１号及び米国特許第６，８５８，２２５号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
このような方法で形成された小胞により、核酸含有量の高い小胞サイズが均一な製剤が提供される。さらに、小胞は、サイズの範囲が約３０～約１５０ｎｍ、例えば、約３０～約９０ｎｍである。
いかなる特定の理論にも拘束されるわけではないが、非常に高効率の核酸封入は、低ｐＨでの静電相互作用の結果であると考えられる。酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ４．０）では、小胞表面は荷電されており、静電相互作用を介して核酸の一部分と結合する。外部の酸性緩衝液を、より中性の緩衝液（例えば、ｐＨ７．５）と交換すると、脂質粒子またはリポソームの表面が中和され、任意の外部核酸を除去することができる。製剤工程に関するさらに詳細な情報は、様々な刊行物（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号及び米国特許第６，８５８，２２５号）に記載されている。
実施形態では、本発明は、脂質／核酸製剤を調製する方法を提供する。本明細書に記載される方法では、脂質の混合物を核酸の緩衝水溶液と合わせて、脂質粒子内に封入された核酸を含有する中間体混合物を生成し、例えば、ここで、封入された核酸は、約１０ｗｔ％～約５０ｗｔ％の核酸／脂質比で存在する。中間体混合物は、任意選択で、脂質部分が、例えば、３０～１５０ｎｍ、または約４０～９０ｎｍの直径を有する単層小胞である、脂質内封入核酸粒子が得られるようサイズ調整され得る。その後、ｐＨを上昇させて脂質－核酸粒子上の表面電荷の少なくとも一部分を中和させることで、少なくとも部分的に表面が中和された脂質内封入核酸の組成物が提供される。
実施形態では、脂質の混合物には、少なくとも２つの脂質成分、すなわち、脂質が、ｐＫａ未満のｐＨではカチオン性であり、ｐＫａを超えるｐＨで中性であるようなｐＫａを有する脂質の中から選択される、第１の本発明の脂質成分、及び脂質－核酸粒子形成時の粒子凝集を防ぐ脂質の中から選択される、第２の脂質成分が含まれる。実施形態では、アミノ脂質は、本発明の新規カチオン性脂質である。
本発明の核酸－脂質粒子の調製においては、脂質の混合物は典型的に、有機溶媒中の脂質溶液である。その後、この脂質混合物を乾燥させて薄膜を形成するか、または凍結乾燥させて粉末を形成してから、水性緩衝液で水和させてリポソームを形成することができる。別法として、ある方法では、脂質混合物をエタノール等の水混和性アルコールに可溶化させ、このエタノール溶液を水性緩衝液に加えて自発的なリポソーム形成を生じさせることができる。実施形態では、アルコールは、それが市販されている形態で使用される。例えば、エタノールを、無水エタノール（１００％）として使用するか、または９５％エタノールとして、残部を水にして使用することができる。この方法は、米国特許第５，９７６，５６７号に詳述されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
実施形態では、脂質の混合物は、アルコール溶媒に入れたカチオン性脂質、中性脂質（カチオン性脂質以外）、ステロール（例えば、コレステロール）及びＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－ＤＭＡ）の混合物である。実施形態では、脂質混合物は、本質的に、アルコール、例えば、エタノールに入れたカチオン性脂質、中性脂質、コレステロール及びＰＥＧ修飾脂質からなる。実施形態では、第１の溶液は、上記脂質混合物からなり、モル比は、約２０～７０％のカチオン性脂質：５～４５％の中性脂質：２０～５５％のコレステロール１：０．５～１５％のＰＥＧ修飾脂質である。実施形態では、第１の溶液は、本質的に、表１から選ばれる脂質と、ＤＳＰＣと、Ｃｈｏｌと、ＰＥＧ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－ＤＭＡからなり、例えば、モル比は、約２０～６０％のカチオン性脂質：５～２５％のＤＳＰＣ：２５～５５％のＣｈｏｌ：０．５～１５％のＰＥＧ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－ＤＭＡである。実施形態では、脂質モル比は、約４０／１０／４０／１０（カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－ＤＭＡのｍｏｌ％）、３５／１５／４０／１０（カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－ＤＭＡのｍｏｌ％）または５２／１３／３０／５（カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ－ＤＭＧまたはＰＥＧ－ＤＭＡのｍｏｌ％）である。実施形態では、これらの組成にある中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭで置き換えられる。
実施形態では、脂質混合物を、核酸を含有し得る緩衝水溶液と合わせる。緩衝水溶液は典型的に、緩衝液が脂質混合物中のプロトン化可能な脂質のｐＫａより低いｐＨを有する溶液である。好適な緩衝液の例としては、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、及びＭＥＳが挙げられる。緩衝液は、封入される核酸の化学に応じて１～１０００ｍＭの範囲のアニオンであり、高ローディングレベルを達成するには、緩衝液濃度の最適化が重要であり得る（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号及び米国特許第６，８５８，２２５号を参照のこと）。別法として、塩化物、硫酸塩等でｐＨ５～６に酸性化された純水が有用な場合がある。この場合、５％グルコースを加えるか、または粒子を、エタノールの除去、ｐＨ上昇のために透析するか、もしくは通常の生理食塩水等の薬学的に許容される担体と混合する際に粒子膜を介した浸透ポテンシャルを平衡化させる別の非イオン性の溶質を加えることが好適であり得る。緩衝液中の核酸の量は変動し得るが、典型的には、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約２００ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．５ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬである。
脂質の混合物と、治療用核酸の緩衝水溶液とを合わせて中間体混合物を得る。中間体混合物は典型的には、封入核酸を有する脂質粒子の混合物である。さらに、中間体混合物はまた、負電荷を持つ核酸と、脂質粒子表面の正電荷を持つ脂質（アミノ脂質またはプロトン化可能な第１の脂質成分を構成する他の脂質は、脂質上のプロトン化可能基のｐＫａより低いｐＨを有する緩衝液中では正電荷を持つ）とのイオン引力により脂質粒子（リポソームまたは脂質小胞）の表面に結合している幾分かの核酸も含有し得る。実施形態では、脂質の混合物は、脂質のアルコール溶液であり、溶液それぞれの体積は、合わせた際に、得られるアルコール含有量が約２０体積％～約４５体積％となるよう調整される。混合物を合わせる方法には、多種多様なプロセスのいずれもが含まれ得、生産される製剤の規模に応じて異なることが多い。例えば、総体積が約１０～２０ｍＬ以下である場合は、溶液を試験管内で合わせ、ボルテックスミキサーを使用して一緒に撹拌することができる。大規模なプロセスは、好適な生産規模のガラス製品で行うことができる。
任意選択で、脂質混合物と治療薬（例えば、核酸）の緩衝水溶液とを合わせることにより生成される脂質内封入治療薬（例えば、核酸）複合体は、所望のサイズ範囲及び比較的狭い分布の脂質粒径を達成するようサイズ調整することができる。実施形態では、本明細書で提供される組成物は、約７０～約２００ｎｍ、例えば、約９０～約１３０ｎｍの平均直径にサイズ調整される。リポソームを所望のサイズにサイズ調整するためにいくつかの技術が利用可能である。１つのサイズ調整方法は、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。リポソーム懸濁液を浴型またはプローブ型の超音波処理によって超音波処理することで、段階的にサイズが縮小され、サイズが約０．０５ミクロン未満の小さい単層小胞（ＳＵＶ）が生成される。均一化は、大きなリポソームをより小さなリポソームに断片化するためにせん断エネルギーに依存する別の方法である。典型的な均一化手法では、多層小胞は、標準的なエマルジョン・ホモジナイザーに通され、選択されたリポソームサイズ、典型的には約０．１～０．５ミクロンが観察されるまで再循環される。いずれの方法においても、粒度分布は、従来のレーザービームによる粒径測定によりモニターされ得る。本明細書の特定の方法の場合、均一な小胞サイズを得るためにエクストルージョンが使用される。
小細孔ポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を介したリポソーム組成物のエクストルージョンにより、比較的明確に定義された粒度分布がもたらされる。典型的には、所望のリポソーム複合体の粒度分布が達成されるまで懸濁液を１回以上膜に通して循環させる。リポソームは、リポソームサイズの段階的縮小を達成するため、連続的に、より小さい細孔膜を通って押し出され得る。場合によっては、形成された脂質－核酸組成物を、サイズ調整せずに使用することができる。
実施形態では、本発明の方法はさらに、脂質－核酸組成物の脂質部分の表面電荷のうち少なくとも一部を中和するステップを含む。表面電荷を少なくとも部分的に中和することにより、封入されていない核酸が脂質粒子表面から除かれ、従来技術を使用して組成物から除去することができる。実施形態では、封入されずに表面に吸着した核酸は、緩衝液の交換により、得られた組成物から除去される。例えば、クエン酸緩衝液（ｐＨ約４．０、組成物の形成に使用）をＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ ｐＨ約７．５）溶液で置き換えることにより、リポソーム表面の中和及び表面からの核酸の遊離がもたらされる。遊離核酸は、その後、標準的方法を使用してクロマトグラフィーにより除去し、次いで、使用脂質のｐＫａを超えるｐＨの緩衝液に切り替えることができる。
任意選択で脂質小胞（すなわち、脂質粒子）を水性緩衝液中での水和により形成させ、上記方法のいずれかを使用してサイズ調整してから核酸を加えることができる。上記のように、水性緩衝液は、アミノ脂質のｐＫａ未満のｐＨのものであるべきである。その後、核酸の溶液を、これらのサイズ調整された予備形成小胞に加えることができる。そのような予備形成された小胞への核酸の封入を可能にするため、混合物にはエタノール等のアルコールが含有されるべきである。エタノールの場合、約２０％（ｗ／ｗ）～約４５％（ｗ／ｗ）の濃度で存在すべきである。さらに、脂質小胞の組成及び核酸の性質に応じて、予備形成小胞と核酸含有水性緩衝液－エタノール混合物との混合物を約２５℃～約５０℃の温度まで加温することが必要な場合がある。脂質小胞の核酸の所望レベルを達成するための封入プロセスの最適化には、エタノールの濃度と温度等の可変要素の操作を必要とすることは、当業者には明らかであろう。核酸が、実施された小胞内に封入されたら、外部ｐＨを上昇させて、表面電荷を少なくとも部分的に中和することができる。その後、封入されずに表面に吸着した核酸を除去することができる。
ワクチン及びアジュバント
いくつかの実施形態では、本発明の化合物及び組成物は、タンパク質または核酸の抗原組成物と関連している。例えば、本願脂質（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのいずれか１つ）は、タンパク質または核酸のワクチン抗原（例えば、本明細書に記載される目的のタンパク質のいずれか）と関連し得る。例えば、本発明は、本願脂質（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのいずれか１つ）をタンパク質または核酸の抗原組成物（例えば、本明細書に記載される目的のタンパク質のいずれか）と併せて投与することによって、本明細書に記載される感染症のいずれかを含む疾患に対してワクチン接種する方法に関し得る。
実施形態では、タンパク質または核酸の抗原は、ベータコロナウイルスタンパク質もしくはアルファコロナウイルスタンパク質、またはその抗原断片、またはそれをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ベータコロナウイルスタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、及びＨＣｏＶ－ＯＣ４３タンパク質、またはそれらの抗原断片、またはそれをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはＤＮＡ）から選択される。いくつかの実施形態では、アルファコロナウイルスタンパク質は、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－２２９Ｅタンパク質、またはその抗原断片、またはそれをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはＤＮＡ）から選択される。
いくつかの実施形態では、タンパク質または核酸の抗原は、コロナウイルスタンパク質、またはその抗原断片、またはそれをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはＤＮＡ）である。様々な実施形態では、コロナウイルスタンパク質は、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質等の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのタンパク質である。実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質は、スパイク表面糖タンパク質、膜糖タンパク質Ｍ、エンベロープタンパク質Ｅ、及びヌクレオカプシドリン酸化タンパク質Ｎ、またはそれらの抗原断片、またはそれをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはＤＮＡ）から選択される。実施形態では、スパイク表面糖タンパク質から選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２タンパク質は、Ｓ１、Ｓ２及びＳ２’を含む。
いくつかの実施形態では、コロナウイルスは、ベータコロナウイルスまたはアルファコロナウイルスである。いくつかの実施形態では、ベータコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、及びＨＣｏＶ－ＯＣ４３から選択される。実施形態では、アルファコロナウイルスは、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－２２９Ｅから選択される。実施形態では、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である。
実施形態では、タンパク質または核酸の抗原は、インフルエンザウイルス抗原であり、任意選択で、ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、マトリックス２（Ｍ２）タンパク質、及びノイラミニダーゼ、またはそれらの抗原断片、またはそれをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはＤＮＡ）から選択される。
実施形態では、ワクチン接種が行われる疾患または障害は、ジフテリア、破傷風、百日咳、インフルエンザ、肺炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、ポリオ、黄熱、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症、炭疽、狂犬病、日本脳炎、髄膜炎、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、胃腸炎、天然痘、腸チフス、水痘（ｖａｒｉｃｅｌｌａ）（水痘（ｃｈｉｃｋｅｎｐｏｘ））、ロタウイルス、及び帯状疱疹から選択される。いくつかの実施形態では、本発明は、肝炎の治療に関する。治療され得る例示的な肝炎としては、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、自己免疫性肝炎、アルコール性肝炎、急性肝炎、及び慢性肝炎が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物、組成物、またはワクチンはさらにアジュバントを含み、任意選択で、アルミニウムゲルまたは塩から選択される。実施形態では、アルミニウムゲルまたは塩は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及び硫酸アルミニウムから選択される。いくつかの実施形態では、アジュバントは、本明細書に記載されるようなキメラタンパク質またはキメラタンパク質複合体をコードする核酸である。
いくつかの実施形態では、追加のアジュバントは、水中油型エマルジョン製剤、サポニンアジュバント、オボアルブミン、フロイントアジュバント、サイトカイン、及びキトサンから選択される。例示的な追加のアジュバントとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：（１）生化学的研究にしばしば使用される、オボアルブミン（例えば、ＥＮＤＯＦＩＴ）；（２）水中油型エマルジョン製剤（ムラミルペプチドもしくは細菌細胞壁構成成分等の他の特定の免疫刺激剤を含むか、または含まない）であって、例えば（ａ）５％スクアラン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、及び０．５％Ｓｐａｎ８５（任意選択で様々な量のＭＴＰ－ＰＥを含有）を含有し、例えば、Ｍｏｄｅｌ ＨＯｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）等のマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化されているＭＦ５９（ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１４８３７号）、（ｂ）１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、及びｔｈｒ－ＭＤＰを含有し、サブミクロンエマルジョンにマイクロ流体化されるか、またはより大きい粒径のエマルジョンが生成されるようボルテックスにかけられたＳＡＦ、（ｃ）２％スクアラン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、及び、任意選択で、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標））を含めた、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）という群からの１つ以上の細菌細胞壁構成成分を含有する、ＲＩＢＩアジュバント系（ＲＡＳ）、（ＲＩＢＩ ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＯ．）；ならびに（ｄ）ＡＤＤＡＶＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような水中油型エマルジョン製剤；（３）ＳＴＩＭＵＬＯＮ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓ．）等のサポニンアジュバントが使用され得るか、またはそれから生成されたＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）等の粒子；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）インターロイキン（非限定的な例として、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２等）、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等のようなサイトカイン；（６）キトサン及びキチンの他の誘導体またはＮ－アセチル基が加水分解により高い割合で除去されているポリ－Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（例えば、粘膜吸収促進物質としてキトサンが含まれる医薬製剤を開示している、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる欧州特許出願第ＥＰ０４６００２０号を参照のこと）；ならびに（７）免疫刺激剤として作用して組成物の有効性を高める他の物質、例えば、モノホスホリルリピドＡ。他の実施形態では、追加のアジュバントは、アルミニウム塩またはゲル、パターン認識受容体（ＰＲＲ）アゴニスト、ＣｐＧ ＯＤＮ及びイミダゾキノリンのうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、追加のアジュバントは、環状［Ｇ（３’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（例えば、３’３’－ｃＧＡＭＰ ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ）；環状［Ｇ（２’、５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］２’３’（例えば、２’３’ ｃＧＡＭＰ ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ）；環状［Ｇ（２’、５’）ｐＡ（２’、５’）ｐ］（例えば、２’２’－ｃＧＡＭＰ ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ）、環状ジアデニル酸一リン酸（例えば、ｃ－ジ－ＡＭＰ ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ）；環状ジグアニル酸一リン酸（例えば、ｃ－ジ－ＧＭＰ ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ）；ＴＬＲ７アゴニスト－イミダゾキノリン化合物（例えば、ＴＬＲ７アゴニスト、例えば、ガーディキモド ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ、イミキモド ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ、Ｒ８４８ ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ等）；リポ多糖（例えば、ＴＬＲ４アゴニスト）、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ０１１１：Ｂ４株からのもの（例えば、ＬＰＳ－ＥＢ ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ）；モノホスホリルリピドＡ（例えば、ＭＰＬＡ－ＳＭ ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ及びＭＰＬＡ合成ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ）；Ｎ－グリコリル化ムラミルジペプチド（例えば、Ｎ－グリコリル－ＭＤＰ ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ）；ＣｐＧ ＯＤＮ、クラスＡ及び／またはＣｐＧ ＯＤＮ、クラスＢ及び／またはＣｐＧ ＯＤＮ、クラスＣ（例えば、ＯＤＮ１５８５ ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ、ＯＤＮ１８２６ ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ、ＯＤＮ２００６ ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ、ＯＤＮ２３９５ ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ）、トリアシル化リポタンパク質（例えば、Ｐａｍ３ＣＳＫ４ ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ）；ポリイノシン酸－ポリシチジル酸（例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＨＭＷ）ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ）；及びコードファクター（すなわち、マイコバクテリア細胞壁構成成分トレハロース６，６’ジミコラート（ＴＤＭ、））またはその類似体（例えば、ＴＤＢ ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ、ＴＤＢ－ＨＳ１５ ＶＡＣＣＩＧＲＡＤＥ）のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、追加のアジュバントは、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ１、及び／またはＴＬＲ２、及び／またはＴＬＲ３、及び／またはＴＬＲ４、及び／またはＴＬＲ５、及び／またはＴＬＲ６、及び／またはＴＬＲ７、及び／またはＴＬＲ８、及び／またはＴＬＲ９、及び／またはＴＬＲ１０、及び／またはＴＬＲ１１、及び／またはＴＬＲ１２、及び／またはＴＬＲ１３）、ヌクレオチド結合性多量体ドメイン（ＮＯＤ）アゴニスト、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）リガンド、または関連物質である。
いくつかの実施形態では、追加のアジュバントは、ミネラルアジュバント、ゲルベースアジュバント、テンソ活性剤（ｔｅｎｓｏａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）、細菌産物、油エマルジョン、粒子化アジュバント、融合タンパク質、及びリポペプチドのうちの１つ以上である。他の箇所で記載されているアルミニウムアジュバント以外の他の無機塩アジュバントとしては、カルシウムの塩（例えば、リン酸カルシウム）、鉄の塩及びジルコニウムの塩が挙げられる。他の箇所で記載されているアルミニウムゲルベースアジュバント以外の他のゲルベースアジュバントとしては、アセマンナンが挙げられる。テンソ活性物質（Ｔｅｎｓｏａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）としては、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ樹皮からの水性抽出物に由来するサポニンである、Ｑｕｉｌ Ａ；核に連結されている炭水化物鎖を持つトリテルペノイド構造をした疎水性核を含有するテンソ活性（ｔｅｎｓｏａｃｔｉｖｅ）グリコシド、及びＱＳ－２１が挙げられる。細菌産物としては、グラム陰性菌の細胞壁ペプチドグリカンまたはリポ多糖類（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｃ．ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからのもの）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ＭＤＰ）、ＭＤＰに由来する異なる化合物（例えば、トレオニル－ＭＤＰ）、リポ多糖（ＬＰＳ）（例えば、グラム陰性菌の細胞壁からのもの）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、及びＣｐＧモチーフ含有ＤＮＡが挙げられる。油エマルジョンとしては、ＦＩＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ、アジュバント６５、Ｌｉｐｏｖａｎｔ、油性アジュバントのｍｏｎｔａｎｉｄｅファミリー、及び各種リポソームが挙げられる。粒子化系及びポリマー系の中でも、ポリ（ＤＬ－ラクチド－コグリコリド）ミクロ粒子は広く研究されており、本明細書で利用される。
いくつかの実施形態では、追加のアジュバントは、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｖｉｒａｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓ－Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｉｎ：Ｂｒｏｗｎ Ｆ，Ｈａａｈｅｉｍ ＬＲ，（ｅｄｓ）．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ，Ｖｏｌ．９２．Ｂａｓｅｌ：Ｋａｒｇｅｒ １９９８；１９－２８及び／またはＳａｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２；２０１２：８３１４８６、及び／またはＰｅｔｒｏｖｓｋｙ ａｎｄ Ａｇｕｉｌａｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００４）８２，４８８－４９６に記載されており、それらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
投与／投与量／添加剤
本発明によるこれらの組成物の投与は、一般的な経路で、その経路を介して標的組織が利用可能であれば、いずれの経路を介してもよい。これには、経口、経鼻、または口腔が含まれる。別法として、投与は、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、門脈内もしくは静脈内への注射によるものでも、または罹患組織、例えば、がん組織内への直接注射によるものでもよい。本明細書に開示される薬剤はまた、カテーテル系によっても投与され得る。そのような組成物は、通常の場合、本明細書に記載されるような薬学的に許容される組成物として投与される。
実施形態では、本願組成物は、非経口で、例えば、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内に投与される。実施形態では、医薬組成物は、静脈内または腹腔内にボーラス注射により投与される。
いくつかの実施形態では、脂質－核酸組成物を、エアロゾル吸入により肺に投与することができ（Ｂｒｉｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｓｃｉ．２９８（４）：２７８－２８１（１９８９）を参照のこと）、任意選択で、振動型メッシュ式ネブライザー（例えば、限定することなく、ＡＥＲＯＧＥＮ ＳＯＬＯ（Ｇａｌｗａｙ，Ｉｒｅｌａｎｄ））の使用により行うことができる。いくつかの実施形態では、脂質－核酸組成物を、罹患部位での直接注射により投与することができる（Ｃｕｌｖｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＭａｒｙＡｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ，Ｉｎｃ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．ｐｐ．７０－７１（１９９４））。
本明細書に記載される組成物の投与は、例えば、注射、局所投与、点眼投与、及び鼻腔内投与によるものであり得る。いくつかの実施形態では、注射は、電気力に連結され得る（例えば、電気化学療法に用いられるデバイスを用いることを含む、電気穿孔（例えば、ＣＬＩＮＩＰＯＲＡＴＯＲ，ＩＧＥＡ Ｓｒｌ，Ｃａｒｐｉ ［ＭＯ］，Ｉｔａｌｙ））。局所投与は、クリーム、ローション、軟膏、ゲル、噴霧、溶液等であり得るが、これらに限定されない。局所投与にはさらに、透過促進剤、例えば、限定することなく、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、非キレート非界面活性剤、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテル、脂肪酸及び／または塩と胆汁酸及び／または塩との組み合わせ、ナトリウム塩とラウリン酸、カプリン酸及びＵＤＣＡとの組み合わせ等が含まれ得る。局所投与には、着香剤、着色剤、サンスクリーン、抗菌薬、及び／または保湿剤も含まれ得る。本明細書に記載される組成物は、例えば、限定することなく、額、頭皮、毛包、毛髪、上眼瞼、下眼瞼、眉毛、睫毛、眼窩下領域、眼窩周囲領域、側頭、鼻、鼻架橋、頬、舌、鼻唇溝、口唇、眼周囲領域、顎のライン、耳、頸部、乳房、前腕、上腕、手掌、手、指、爪、背中、腹部、側部、臀部、大腿、ふくらはぎ、足、足趾等の、少なくとも１つの部位に投与され得る。
投与経路としては、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、脳内、腟内、経皮、門脈内、直腸内、吸入、または局所、特に、耳、鼻、眼、または皮膚への投与が挙げられる。実施形態では、投与は、経口または非経口注射により実施される。
製剤時、溶液は、本明細書に記載されるように、用量剤形に適合する方法、かつ治療的に有効であるような量で投与され得る。製剤は、注射液、薬物放出カプセル等のような様々な剤形で容易に投与され得る。水溶液での非経口投与の場合、例えば、溶液は一般に好適に緩衝され、液体希釈剤が最初に、例えば、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。そのような水溶液は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内への投与に使用され得る。好ましくは、当業者に公知であるように、特に本開示に鑑みて、無菌水性媒体が使用される。
実施形態では、核酸及び本願脂質は局所投与され、任意選択で、皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、皮内注射、皮下注射（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）及び筋肉内注射のうちの１つ以上により行われ、約４ｍｍ２～約１５０ｍｍ２の表面積（例えば、約４ｍｍ２、もしくは約５ｍｍ２、もしくは約６ｍｍ２、もしくは約７ｍｍ２、もしくは約８ｍｍ２、もしくは約１０ｍｍ２、もしくは約２０ｍｍ２、もしくは約５０ｍｍ２、もしくは約１００ｍｍ２、もしくは約１５０ｍｍ２、またはこれら以下）に合わせて有効用量が投与される。様々な実施形態では、核酸及び本願脂質は局所投与され、任意選択で、皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、皮内注射、皮下注射（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）及び筋肉内注射のうちの１つ以上により行われ、約４ｍｍ２以下、または約５ｍｍ２以下、または約６ｍｍ２以下、または約７ｍｍ２以下、または約８ｍｍ２以下、または約１０ｍｍ２以下、または約２０ｍｍ２以下、または約５０ｍｍ２以下、または約１００ｍｍ２以下、または約１５０ｍｍ２以下の表面積に合わせて有効用量が投与される。様々な実施形態では、核酸及び本願脂質は局所投与され、任意選択で、皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、皮内注射、皮下注射（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）及び筋肉内注射のうちの１つ以上により行われ、約４ｍｍ２、または約５ｍｍ２、または約６ｍｍ２、または約７ｍｍ２、または約８ｍｍ２、または約１０ｍｍ２、または約２０ｍｍ２、または約５０ｍｍ２、または約１００ｍｍ２、または約１５０ｍｍ２の表面積に合わせて有効用量が投与される。
様々な実施形態では、核酸及び本願脂質は局所投与され、任意選択で、皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、皮内注射、皮下注射（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）及び筋肉内注射のうちの１つ以上により行われ、有効用量（ＲＮＡ重量／注射の表面積）は、約３５ｎｇ／ｃｍ２～約７０００ｎｇ／ｃｍ２である。様々な実施形態では、核酸及び本願脂質は局所投与され、任意選択で、皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、皮内注射、皮下注射（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）及び筋肉内注射のうちの１つ以上により行われ、有効用量（ＲＮＡ重量／注射の表面積）は、約３５ｎｇ／ｃｍ２以下、または約５０ｎｇ／ｃｍ２以下、または約７５ｎｇ／ｃｍ２以下、または約１００ｎｇ／ｃｍ２以下、または約１２５ｎｇ／ｃｍ２以下、または約１５０ｎｇ／ｃｍ２以下、または約１７５ｎｇ／ｃｍ２以下、または約２００ｎｇ／ｃｍ２以下、または約２２５ｎｇ／ｃｍ２以下、または約２５０ｎｇ／ｃｍ２以下、または約５００ｎｇ／ｃｍ２以下、または約１０００ｎｇ／ｃｍ２以下、または約２０００ｎｇ／ｃｍ２以下、または約５０００ｎｇ／ｃｍ２以下、または約７０００ｎｇ／ｃｍ２以下である。様々な実施形態では、核酸及び本願脂質は局所投与され、任意選択で、皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、皮内注射、皮下注射（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）及び筋肉内注射のうちの１つ以上により行われ、有効用量（ＲＮＡ重量／注射の表面積）は、約３５ｎｇ／ｃｍ２、または約５０ｎｇ／ｃｍ２、または約７５ｎｇ／ｃｍ２、または約１００ｎｇ／ｃｍ２、または約１２５ｎｇ／ｃｍ２、または約１５０ｎｇ／ｃｍ２、または約１７５ｎｇ／ｃｍ２、または約２００ｎｇ／ｃｍ２、または約２２５ｎｇ／ｃｍ２、または約２５０ｎｇ／ｃｍ２、または約５００ｎｇ／ｃｍ２、または約１０００ｎｇ／ｃｍ２、または約２０００ｎｇ／ｃｍ２、または約５０００ｎｇ／ｃｍ２、または約７０００ｎｇ／ｃｍ２である。
いくつかの実施形態では、有効用量は、約１００ｎｇ～約５０００ｎｇ（例えば、約１００ｎｇ、もしくは約２００ｎｇ、もしくは約３００ｎｇ、もしくは約４００ｎｇ、もしくは約５００ｎｇ、もしくは約６００ｎｇ、もしくは約７００ｎｇ、もしくは約８００ｎｇ、もしくは約９００ｎｇ、もしくは約１０００ｎｇ、もしくは約１１００ｎｇ、もしくは約１２００ｎｇ、もしくは約１３００ｎｇ、もしくは約１４００ｎｇ、もしくは約１５００ｎｇ、もしくは約１６００ｎｇ、もしくは約１７００ｎｇ、もしくは約１８００ｎｇ、もしくは約１９００ｎｇ、もしくは約２０００ｎｇ、もしくは約３０００ｎｇ、もしくは約４０００ｎｇ、もしくは約５０００ｎｇ、またはこれら以下）である。他の実施形態では、有効用量は約１００ｎｇ未満である。特定の実施形態では、有効用量は、約１０ｎｇ～約１００ｎｇ（例えば、約１０ｎｇ、もしくは約２０ｎｇ、もしくは約３０ｎｇ、もしくは約４０ｎｇ、もしくは約５０ｎｇ、もしくは約６０ｎｇ、もしくは約７０ｎｇ、もしくは約８０ｎｇ、もしくは約９０ｎｇ、もしくは約１００ｎｇ、またはこれら以下）である。
いくつかの実施形態では、有効用量は、約１．４ｎｇ／ｋｇ～約３０ｎｇ／ｋｇ（例えば、約１．４ｎｇ／ｋｇ、もしくは約２．５ｎｇ／ｋｇ、もしくは約５ｎｇ／ｋｇ、もしくは約１０ｎｇ／ｋｇ、もしくは約１５ｎｇ／ｋｇ、もしくは約２０ｎｇ／ｋｇ、もしくは約２５ｎｇ／ｋｇ、もしくは約３０ｎｇ／ｋｇ、またはこれら以下）である。他の実施形態では、有効用量は約１．５ｎｇ／ｋｇ未満である。特定の実施形態では、有効用量は、約０．１４ｎｇ／ｋｇ～約１．４ｎｇ／ｋｇ（例えば、約０．１４ｎｇ／ｋｇ、もしくは約０．２５ｎｇ／ｋｇ、もしくは約０．５ｎｇ／ｋｇ、もしくは約０．７５ｎｇ／ｋｇ、もしくは約１ｎｇ／ｋｇ、もしくは約１．２５ｎｇ／ｋｇ、もしくは約１．４ｎｇ／ｋｇ、またはこれら以下）である。
いくつかの実施形態では、有効用量は、約３５０ｎｇ／ｃｍ２～約７０００ｎｇ／ｃｍ２（例えば、約３５０ｎｇ／ｃｍ２、もしくは約５００ｎｇ／ｃｍ２、もしくは約７５０ｎｇ／ｃｍ２、もしくは約１０００ｎｇ／ｃｍ２、もしくは約２０００ｎｇ／ｃｍ２、もしくは約３０００ｎｇ／ｃｍ２、もしくは約４０００ｎｇ／ｃｍ２、もしくは約５０００ｎｇ／ｃｍ２、もしくは約６０００ｎｇ／ｃｍ２、もしくは約７０００ｎｇ／ｃｍ２、またはこれら以下）である。他の実施形態では、有効用量は約３５０ｎｇ／ｃｍ２未満である。特定の実施形態では、有効用量は、約３５ｎｇ／ｃｍ２～約３５０ｎｇ／ｃｍ２（例えば、約３５ｎｇ／ｃｍ２、もしくは約５０ｎｇ／ｃｍ２、もしくは約７５ｎｇ／ｃｍ２、もしくは約１００ｎｇ／ｃｍ２、もしくは約１５０ｎｇ／ｃｍ２、もしくは約２００ｎｇ／ｃｍ２、もしくは約２５０ｎｇ／ｃｍ２、もしくは約３００ｎｇ／ｃｍ２、もしくは約３５０ｎｇ／ｃｍ２、またはこれら以下）である。
いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡを含め、核酸薬物の有効用量は、約１ｎｇ～約２０００ｎｇ、または約１０ｎｇ～約２０００ｎｇ、または約１００ｎｇ～約２０００ｎｇ、または約２００ｎｇ～約１９００ｎｇ、または約３００ｎｇ～約１８００ｎｇ、または約４００ｎｇ～約１７００ｎｇ、または約５００ｎｇ～約１６００ｎｇ、または約６００ｎｇ～約１５００ｎｇ、または約７００ｎｇ～約１４００ｎｇ、または約８００ｎｇ～約１３００ｎｇ、または約９００ｎｇ～約１２００ｎｇ、または約１０００ｎｇ～約１１００ｎｇ、または約５００ｎｇ～約２０００ｎｇ、または約５００ｎｇ～約１５００ｎｇ、または約５００ｎｇ～約１０００ｎｇ、または約１０００ｎｇ～約１５００ｎｇ、または約１０００ｎｇ～約２０００ｎｇ、または約１５００ｎｇ～約２０００ｎｇ、または約１００ｎｇ～約５００ｎｇ、または約２００ｎｇ～約４００ｎｇ、または約１０ｎｇ～約１００ｎｇ、または約２０ｎｇ～約９０ｎｇ、または約３０ｎｇ～約８０ｎｇ、または約４０ｎｇ～約７０ｎｇ、または約５０ｎｇ～約６０ｎｇである。
いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡを含め、核酸薬物の有効用量は、約１ｎｇ以下、約１０ｎｇ以下、約３０ｎｇ以下、約５０ｎｇ以下、または約１００ｎｇ、または約２００ｎｇ、または約３００ｎｇ、または約４００ｎｇ、または約５００ｎｇ、または約６００ｎｇ、または約７００ｎｇ、または約８００ｎｇ、または約９００ｎｇ、または約１０００ｎｇ、または約１１００ｎｇ、または約１２００ｎｇ、または約１３００ｎｇ、または約１４００ｎｇ、または約１５００ｎｇ、または約１６００ｎｇ、または約１７００ｎｇ、または約１８００ｎｇ、または約１９００ｎｇ、または約２０００ｎｇ、または約３０００ｎｇ、または約４０００ｎｇ、または約５０００ｎｇである。
いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡを含め、核酸薬物の有効用量は、約１ｎｇ、または約１０ｎｇ、または約３０ｎｇ、または約５０ｎｇ、または約１００ｎｇ、または約２００ｎｇ、または約３００ｎｇ、または約４００ｎｇ、または約５００ｎｇ、または約６００ｎｇ、または約７００ｎｇ、または約８００ｎｇ、または約９００ｎｇ、または約１０００ｎｇ、または約１１００ｎｇ、または約１２００ｎｇ、または約１３００ｎｇ、または約１４００ｎｇ、または約１５００ｎｇ、または約１６００ｎｇ、または約１７００ｎｇ、または約１８００ｎｇ、または約１９００ｎｇ、または約２０００ｎｇ、または約３０００ｎｇ、または約４０００ｎｇ、または約５０００ｎｇである。
いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡを含め、核酸薬物の有効用量は、約０．０２８ｐｍｏｌ、または約０．０５ｐｍｏｌ、または約０．１ｐｍｏｌ、または約０．２ｐｍｏｌ、または約０．３ｐｍｏｌ、または約０．４ｐｍｏｌ、または約０．５ｐｍｏｌ、または約０．６ｐｍｏｌ、または約０．７ｐｍｏｌ、または約０．８ｐｍｏｌ、または約０．９ｐｍｏｌ、または約１．０ｐｍｏｌ、または約１．２ｐｍｏｌ、または約１．４ｐｍｏｌ、または約１．６ｐｍｏｌ、または約１．８ｐｍｏｌ、または約２．０ｐｍｏｌ、または約２．２ｐｍｏｌ、または約２．４ｐｍｏｌ、または約２．６ｐｍｏｌ、または約２．８ｐｍｏｌ、または約３．０ｐｍｏｌ、または約３．２ｐｍｏｌ、または約３．４ｐｍｏｌ、または約３．６ｐｍｏｌ、または約３．８ｐｍｏｌ、または約４．０ｐｍｏｌ、または約４．２ｐｍｏｌ、または約４．４ｐｍｏｌ、または約４．６ｐｍｏｌ、または約４．８ｐｍｏｌ、または約５．０ｐｍｏｌ、または約５．５ｐｍｏｌ、または約５．７ｐｍｏｌである。
いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡを含め、核酸薬物は、約０．１ｎＭ、または約０．２５ｎＭ、または約０．５ｎＭ、または約０．７５ｎＭ、または約１ｎＭ、または約２．５ｎＭ、または約５ｎＭ、または約７．５ｎＭ、または約１０ｎＭ、または約２０ｎＭ、または約３０ｎＭ、または約４０ｎＭ、または約５０ｎＭ、または約６０ｎＭ、または約７０ｎＭ、または約８０ｎＭ、または約９０ｎＭ、または約１００ｎＭ、または約１１０ｎＭ、または約１２０ｎＭ、または約１５０ｎＭ、または約１７５ｎＭ、または約２００ｎＭの濃度で投与される。
いくつかの実施形態では、核酸薬物の有効用量は、約３５０ｎｇ／ｃｍ２、または約５００ｎｇ／ｃｍ２、または約７５０ｎｇ／ｃｍ２、または約１０００ｎｇ／ｃｍ２、または約２０００ｎｇ／ｃｍ２、または約３０００ｎｇ／ｃｍ２、または約４０００ｎｇ／ｃｍ２、または約５０００ｎｇ／ｃｍ２、または約６０００ｎｇ／ｃｍ２、または約７０００ｎｇ／ｃｍ２である。他の実施形態では、有効用量は約３５０ｎｇ／ｃｍ２未満である。特定の実施形態では、有効用量は、約３５ｎｇ／ｃｍ２、または約５０ｎｇ／ｃｍ２、または約７５ｎｇ／ｃｍ２、または約１００ｎｇ／ｃｍ２、または約１５０ｎｇ／ｃｍ２、または約２００ｎｇ／ｃｍ２、または約２５０ｎｇ／ｃｍ２、または約３００ｎｇ／ｃｍ２、または約３５０ｎｇ／ｃｍ２である。
いくつかの実施形態では、核酸薬物の有効用量は、約３５ｎｇ／ｃｍ２～約７０００ｎｇ／ｃｍ２、または約５０ｎｇ／ｃｍ２～約５０００ｎｇ／ｃｍ２、または約１００ｎｇ／ｃｍ２～約３０００ｎｇ／ｃｍ２、または約５００ｎｇ／ｃｍ２～約２０００ｎｇ／ｃｍ２、または約７５０ｎｇ／ｃｍ２～約１５００ｎｇ／ｃｍ２、または約８００ｎｇ／ｃｍ２～約１２００ｎｇ／ｃｍ２、または約９００ｎｇ／ｃｍ２～約１１００ｎｇ／ｃｍ２である。
いくつかの実施形態では、核酸薬物の有効用量は、約１ピコモル／ｃｍ２、または約２ピコモル／ｃｍ２、または約３ピコモル／ｃｍ２、または約４ピコモル／ｃｍ２、または約５ピコモル／ｃｍ２、または約６ピコモル／ｃｍ２、または約７ピコモル／ｃｍ２、または約８ピコモル／ｃｍ２、または約９ピコモル／ｃｍ２、または約１０ピコモル／ｃｍ２、または約１２ピコモル／ｃｍ２、または約１４ピコモル／ｃｍ２、または約１６ピコモル／ｃｍ２、または約１８ピコモル／ｃｍ２、または約２０ピコモル／ｃｍ２である。他の実施形態では、有効用量は約１ピコモル／ｃｍ２未満である。特定の実施形態では、有効用量は、約０．１ピコモル／ｃｍ２、または約０．２ピコモル／ｃｍ２、または約０．３ピコモル／ｃｍ２、または約０．４ピコモル／ｃｍ２、または約０．５ピコモル／ｃｍ２、または約０．６ピコモル／ｃｍ２、または約０．７ピコモル／ｃｍ２、または約０．８ピコモル／ｃｍ２、または約０．９ピコモル／ｃｍ２、または約１ピコモル／ｃｍ２である。
いくつかの実施形態において、核酸薬物の有効用量は、約０．１ピコモル／ｃｍ２～約２０ピコモル／ｃｍ２、または約０．２ピコモル／ｃｍ２～約１５ピコモル／ｃｍ２、または約０．５ピコモル／ｃｍ２～約１０ピコモル／ｃｍ２、または約０．８ピコモル／ｃｍ２～約８ピコモル／ｃｍ２、または約１ピコモル／ｃｍ２～約５ピコモル／ｃｍ２、または約２ピコモル／ｃｍ２～約４ピコモル／ｃｍ２である。
例えば、本願組成物は、薬学的に許容される塩形態であり得る。そのような塩としては、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＪ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．６６，２－１９（１９７７）及びＴｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ．Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｖｅｒｌａｇ，Ｚｕｒｉｃｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）２００２に記載されているものが挙げられる。薬学的に許容される塩の非限定的な例としては、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩（ｇｅｎｔｉｓｉｎａｔｅ）、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩（ｇｌｕｃａｒｏｎａｔｅ）、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸塩、パモ酸塩、フェニル酢酸、トリフルオロ酢酸塩、アクリル酸塩、クロロ安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ｏ－アセトキシ安息香酸塩、ナフタレン－２－安息香酸塩、イソ酪酸塩、フェニル酪酸塩、α－ヒドロキシ酪酸塩、ブチン－１，４－ジカルボキシラート、ヘキシン－１，４－ジカルボキシラート、カプリン酸塩、カプリル酸塩、ケイ皮酸塩、グリコール酸塩、ヘプタン酸塩、馬尿酸塩、リンゴ塩酸、ヒドロキシマレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、ニコチン酸塩、フタル酸塩、テラフタル酸塩、プロピオル酸塩、プロピオン酸塩、フェニルプロピオン酸塩、セバシン酸塩、スベリン酸塩、ｐ－ブロモベンゼンスルホン酸塩、クロロベンゼンスルホン酸塩、エチルスルホン酸塩、２－ヒドロキシエチルスルホン酸塩、メチルスルホン酸塩、ナフタレン－１－スルホン酸塩、ナフタレン－２－スルホン酸塩、ナフタレン－１，５－スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、酒石酸塩、ナトリウム、カリウム、及びリチウム等のアルカリ金属の水酸化物；カルシウム及びマグネシウム等のアルカリ土類金属の水酸化物；アルミニウム及び亜鉛等の他の金属の水酸化物；アンモニア、及び非置換またはヒドロキシ置換のモノ－、ジ－、もしくはトリ－アルキルアミン等の有機アミン、ジシクロヘキシルアミン；トリブチルアミン；ピリジン；Ｎ－メチル、Ｎ－エチルアミン；ジエチルアミン；トリエチルアミン；モノ－、ビス－、もしくはトリス－（２－ＯＨ－低級アルキルアミン）、例えば、モノ－；ビス－、もしくはトリス－（２－ヒドロキシエチル）アミン、２－ヒドロキシ－ｔｅｒｔ－ブチルアミン、またはトリス－（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジ－低級アルキル－Ｎ－（ヒドロキシル－低級アルキル）－アミン、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アミンまたはトリ－（２－ヒドロキシエチル）アミン；Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン；及びアルギニン、リジン等のアミノ酸等が挙げられる。
本願医薬組成物は添加剤を含むことができ、これには、水、及び石油、動物油、植物油、または合成油を含めた油、例えば、ピーナツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等のような液剤が含まれる。医薬品添加剤は、例えば、生理食塩水、アカシアガム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素等であり得る。さらに、助剤、安定化剤、増粘剤、滑沢剤、及び着色剤を使用することができる。一実施形態では、薬学的に許容される添加剤は、対象に投与される際に無菌である。好適な医薬品添加剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等も挙げられる。本明細書に記載されるいずれの薬剤も、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含むことができる。
対象／患者／宿主
例示的な対象または患者または宿主とは、任意の脊椎動物を指し、限定することなく、ヒト及び他の霊長類（例えば、チンパンジー及び他の類人猿及びサル種）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマ）、家畜哺乳類（例えば、イヌ及びネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、及びモルモット等のげっ歯類）、ならびに鳥類（例えば、家畜、野鳥及び狩猟鳥類、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ及び他の家禽鳥類、アヒル、ガチョウ等）が含まれる。実施形態では、対象は哺乳類である。実施形態では、対象はヒトである。特定の実施形態では、対象は無脊椎動物である。他の実施形態では、対象は植物である。
キット
本発明はまたは、本明細書に記載される核酸のトランスフェクションを簡便化することができるキットを提供する。本発明の例示的なキットは、本願化合物（例えば、式Ｉ～ＸＶＩのもの）及び／または医薬組成物及び／または脂質凝集体及び／または脂質担体のうちの１つ以上を含む。キットには、トランスフェクション培地、トランスフェクション試薬、及び／または細胞培養用の様々な容器も含まれ得る。
定義
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は一般に、単数形と複数形の両方を含むと解釈される。
用語「Ｈ」は、単一の水素原子を意味する。このラジカルは、例えば、酸素原子に結合されてヒドロキシルラジカルを形成し得る。
用語「アルキル」が、単独で、または「ハロアルキル」または「アルキルアミノ」等の他の用語内で使用される場合、この用語は、Ｃ１－Ｃ２０アルキルとして示される、１個から約２０個の炭素原子を有する直鎖または分岐のラジカルを包含する。そのようなラジカルの例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソアミル、ヘキシル等が挙げられる。用語「アルキレニル」、「アルキレン」、または「アルカンジイル」は、メチレニルまたはエチレニル等の架橋二価アルキルラジカルを包含する。
用語「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有する２個～約６０個の炭素原子の直鎖または分岐のラジカルを包含する。場合によっては、「アルケニル」ラジカルは、結合している場合としていない場合がある２つの炭素－炭素二重結合を有する。場合によっては、「アルケニル」ラジカルは、独立して、結合している場合としていない場合がある、３つ以上の炭素－炭素二重結合を有する。場合によっては、「アルケニル」ラジカルは、結合している場合としていない場合がある、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合及び少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を有する。アルケニルラジカルの例としては、エテニル、プロペニル、アリル、プロペニル、ブテニル及び４－メチルブテニルが挙げられる。用語「アルケニル」は、「ｃｉｓ」及び「ｔｒａｎｓ」配向、あるいは「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有するラジカルを包含する。
用語「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を有し、かつ２個～約６０個の炭素原子を有する直鎖または分岐のラジカルを意味する。そのようなラジカルの例としては、プロパルギル、及びブチニル等が挙げられる。
アルキル、アルキレニル、アルケニル、及びアルキニルのラジカルは、任意選択で、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、シアノ、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、及びヘテロシクロ等のような１つ以上の官能基で置換され得る。
用語「ハロ」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子等のハロゲンを意味する。
用語「ハロアルキル」は、アルキル炭素原子のうちのいずれか１つ以上が、上記で定義されているようなハロで置換されているラジカルを包含する。具体的には、ペルハロアルキルを含めて、モノハロアルキル、ジハロアルキル及びポリハロアルキルのラジカルが包含される。例えば、モノハロアルキルラジカルは、ラジカル内に、ヨード、ブロモ、クロロまたはフルオロのいずれかの原子を有し得る。ジハロラジカル及びポリハロアルキルラジカルは、同一ハロ原子または異なるハロラジカルの組み合わせのうち２つ以上を有し得る。１個～３個の炭素原子を有する低級ハロアルキルラジカルがより一層好ましい。ハロアルキルラジカルの例としては、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロクロロメチル、ジクロロフルオロメチル、ジフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロエチル及びジクロロプロピルが挙げられる。
用語「ヒドロキシアルキル」は、炭素原子のうちのいずれか１個が１つ以上のヒドロキシルラジカルで置換され得る、１個から約１０個の炭素原子を有する直鎖または分岐のアルキルラジカルを包含する。そのようなラジカルの例としては、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、ヒドロキシブチル及びヒドロキシヘキシルが挙げられる。
用語「アルコキシ」は、直鎖または分岐のオキシ含有ラジカルを包含し、それぞれが、１個～約２０個の炭素原子のアルキル部分を有する。そのようなラジカルの例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ及びｔｅｒｔ－ブトキシが挙げられる。１個～１２個の炭素原子を有する低級アルコキシラジカルがより一層好ましい。アルコキシラジカルは、「ハロアルコキシ」ラジカルを得るために、フルオロ、クロロまたはブロモ等の１つ以上のハロ原子でさらに置換され得る。そのようなラジカルの例としては、フルオロメトキシ、クロロメトキシ、トリフルオロメトキシ、トリフルオロエトキシ、フルオロエトキシ及びフルオロプロポキシが挙げられる。
用語「アリール」は、単独でも組み合わせの場合でも、１つまたは２つの環を含有する炭素環式芳香族系を意味し、そのような環は、縮合された状態で共に結合し得る。用語「アリール」は、フェニル、ナフチル、インデニル、テトラヒドロナフチル、及びインダニル等の芳香族ラジカルを包含する。より好ましいアリールはフェニルである。「アリール」基は、アルキル、ヒドロキシル、ハロ、ハロアルキル、ニトロ、シアノ、アルコキシ、及びアルキルアミノ等のような１つ以上の置換基を有し得る。用語「アリーレン」は、ベンジレン、フェニレン等のような架橋二価アリールラジカルを包含する。
用語「ヘテロシクリル」（または「ヘテロシクロ」）は、飽和、部分的飽和及び不飽和のヘテロ原子含有環ラジカルを包含し、その場合、ヘテロ原子は、窒素、イオウ及び酸素から選択され得る。「ヘテロシクリル」基は、ヒドロキシル、Ｂｏｃ、ハロ、ハロアルキル、シアノ、低級アルキル、低級アラルキル、オキソ、低級アルコキシ、アミノ及び低級アルキルアミノ等の１～４つの置換基を有し得る。
飽和複素環式ラジカルの例としては、１～４個の窒素原子を含有する飽和３～６員複素単環式基［例えば、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル］；１～２個の酸素原子及び１～３個の窒素原子を含有する飽和３～６員複素単環式基［例えば、モルホリニル］；１～２個のイオウ原子及び１～３個の窒素原子を含有する飽和３～６員複素単環式基［例えば、チアゾリジニル］が挙げられる。部分的飽和ヘテロシクリルラジカルの例としては、ジヒドロチエニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロフリル及びジヒドロチアゾリルが挙げられる。
「ヘテロアリール」ラジカルとも呼ばれる不飽和複素環式ラジカルの例としては、１～４個の窒素原子を含有する不飽和５～６員ヘテロモノシクリル基、例えば、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、２－ピリジル、３－ピリジル、４－ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアゾリル［例えば、４Ｈ－１，２，４－トリアゾリル、１Ｈ－１，２，３－トリアゾリル、２Ｈ－１，２，３－トリアゾリル］；酸素原子を含有する不飽和５－～６員複素単環式基、例えば、ピラニル、２－フリル、３－フリル等；イオウ原子を含有する不飽和５～６員複素単環式基、例えば、２－チエニル、３－チエニル等；１～２個の酸素原子及び１～３個の窒素原子を含有する不飽和５－～６員複素単環式基、例えば、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル［例えば、１，２，４－オキサジアゾリル、１，３，４－オキサジアゾリル、１，２，５－オキサジアゾリル］；１～２個のイオウ原子及び１～３個の窒素原子を含有する不飽和５～６員複素単環式基、例えば、チアゾリル、チアジアゾリル［例えば、１，２，４－チアジアゾリル、１，３，４－チアジアゾリル、１，２，５－チアジアゾリル］が挙げられる。
用語ヘテロシクリル、（またはヘテロシクロ）はまた、複素環式ラジカルがアリールラジカルと縮合／縮合している（ｆｕｓｅｄ／ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ）ラジカル：１～５個の窒素原子を含有する不飽和縮合複素環基、例えば、インドリル、イソインドリル、インドリジニル、ベンゾイミダゾリル、キノリル、イソキノリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、テトラゾロピリダジニル（ｔｅｔｒａｚｏｌｏｐｙｒｉｄａｚｉｎｙｌ）［例えば、テトラゾロ［１，５－ｂ］ピリダジニル］；１～２個の酸素原子及び１～３個の窒素原子を含有する不飽和縮合複素環基［例えば、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル］；１～２個のイオウ原子及び１～３個の窒素原子を含有する不飽和縮合複素環基［例えば、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル］；ならびに１～２個の酸素原子またはイオウ原子を含有する飽和、部分的不飽和及び不飽和の縮合複素環基［例えば、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、２，３－ジヒドロ－ベンゾ［１，４］ジオキシニル及びジヒドロベンゾフリル］を包含する。好ましい複素環式ラジカルには、５～１０員の縮合または非縮合ラジカルが含まれる。ヘテロアリールラジカルのより好ましい例としては、キノリル、イソキノリル、イミダゾリル、ピリジル、チエニル、チアゾリル、オキサゾリル、フリル及びピラジニルが挙げられる。他の好ましいヘテロアリールラジカルは、イオウ、窒素及び酸素から選択される１個または２個のヘテロ原子を含有する、５員または６員のヘテロアリールであり、チエニル、フリル、ピロリル、インダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、トリアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、ピリジル、ピペリジニル及びピラジニルから選択される。
窒素不含のヘテロアリールの特定の例としては、ピラニル、２－フリル、３－フリル、２－チエニル、３－チエニル、ベンゾフリル、及びベンゾチエニル等が挙げられる。
部分的飽和及び飽和のヘテロシクリルの特定の例としては、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピラゾリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、テトラヒドロピラニル、チアゾリジニル、ジヒドロチエニル、２，３－ジヒドロ－ベンゾ［１，４］ジオキサニル、インドリニル、イソインドリニル、ジヒドロベンゾチエニル、ジヒドロベンゾフリル、イソクロマニル、クロマニル、１，２－ジヒドロキノリル、１，２，３，４－テトラヒドロ－イソキノリル、１，２，３，４－テトラヒドロ－キノリル、２，３，４，４ａ，９，９ａ－ヘキサヒドロ－１Ｈ－３－アザ－フルオレニル、５，６，７－トリヒドロ－１，２，４－トリアゾロ［３，４－ａ］イソキノリル、３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ベンゾ［１，４］オキサジニル、ベンゾ［１，４］ジオキサニル、２，３－ジヒドロ－１Ｈ－１λ’－ベンゾ［ｄ］イソチアゾール－６－イル、ジヒドロピラニル、ジヒドロフリル及びジヒドロチアゾリル等が挙げられる。
したがって、用語「ヘテロシクロ」は、以下の環系を包含する：
用語「カルボニル」は、単独で使用されるか、または「アミノカルボニル」のように他の用語と共に使用されるかにかかわらず、－（Ｃ＝Ｏ）－と表される。
用語「ヘテロシクリルアルキレニル」及び「ヘテロシクリルアルキル」は、複素環式置換アルキルラジカルを包含する。より好ましいヘテロシクリルアルキルラジカルは、１～６個の炭素原子のアルキル部分を有する「５員または６員のヘテロアリールアルキル」ラジカル、及び５員または６員のヘテロアリールラジカルである。１～３個の炭素原子のアルキル部分を有する低級ヘテロアリールアルキレニルラジカルがより一層好ましい。例としては、ピリジルメチル及びチエニルメチルのようなラジカルが挙げられる。
用語「シクロアルキル」には、飽和炭素環式基が含まれる。好ましいシクロアルキル基にはＣ３－Ｃ６環が含まれる。より好ましい化合物としては、シクロペンチル、シクロプロピル、及びシクロヘキシルが挙げられる。
用語「シクロアルケニル」には、「シクロアルキルジエニル」化合物等、１つ以上の炭素－炭素二重結合を有する炭素環式基が含まれる。好ましいシクロアルケニル基にはＣ３－Ｃ６環が含まれる。より好ましい化合物としては、例えば、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル及びシクロヘプタジエニルが挙げられる。
用語「脂質」は、水に不溶性であるが有機溶媒に可溶性であり、天然物質に由来し、及び／または合成により生成されている、生体分子、ならびにそのような生体分子の非天然の類似体及び誘導体を包含するが、これに限定されない。脂質の例には、限定することなく、他の場合には「脂質様」または「リピドイド」と記載される化合物、及び式Ｉ～ＸＶＩの化合物が含まれる。脂質の他の例には、限定することなく、天然脂質、それらの誘導体、及びそれらの類似体を含む合成分子が含まれ、たとえ当該合成分子がそれ自体、水溶性であっても含まれる。脂質の他の例としては、限定することなく、１つ以上のＣ５－Ｃ２０アルキル基、ステロール、脂肪酸、ならびにそれらの類似体及び誘導体を含む分子が挙げられる。
「分子」とは、分子実体（分子、イオン、複合体等）を意味する。
「ＲＮＡ分子」とは、ＲＮＡを含む分子を意味する。
「合成ＲＮＡ分子」とは、細胞の外側で生成されるか、またはバイオエンジニアリングを使用して細胞の内側で生成されるＲＮＡ分子を意味し、非限定的な例としては、インビトロ転写反応で生成されるＲＮＡ分子、直接化学合成により生成されるＲＮＡ分子、または遺伝子操作されたＥ．ｃｏｌｉ細胞で生成されるＲＮＡ分子がある。
「トランスフェクション」とは、細胞を分子と接触させることを意味し、かかる分子が細胞により取り込まれる。
「トランスフェクション時」とは、トランスフェクション中またはトランスフェクション後を意味する。
「培地」とは、溶媒または溶媒と溶質とを含む溶液を意味し、非限定的な例としては、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、生理食塩水または水がある。
「複合体形成培地」とは、トランスフェクション試薬及びトランスフェクトされるべき分子が加えられ、そこでトランスフェクション試薬がそのトランスフェクトされるべき分子と会合する培地を意味する。
「トランスフェクション培地」とは、トランスフェクションに使用することができる培地を意味し、非限定的な例としては、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、生理食塩水または水がある。
「組換えタンパク質」とは、動物またはヒト産生されないタンパク質またはペプチドを意味する。非限定的な例としては、細菌で産生されるヒトトランスフェリン、マウス細胞のインビトロ培養で産生されるヒトフィブロネクチン、及び稲で産生されるヒト血清アルブミンが挙げられる。
「Ｏｃｔ４タンパク質」とは、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子によってコードされるタンパク質、またはその天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片もしくは融合コンストラクトを意味し、非限定的な例としては、ヒトＯｃｔ４タンパク質（配列番号８）、マウスＯｃｔ４タンパク質、Ｏｃｔ１タンパク質、ＰＯＵ５Ｆ１偽遺伝子２によりコードされるタンパク質、Ｏｃｔ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたはＯｃｔ４－ＧＦＰ融合タンパク質がある。実施形態では、Ｏｃｔ４タンパク質は、配列番号８との同一性が少なくとも７０％であるか、または他の実施形態において、配列番号８との同一性が少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％であるアミノ酸配列を含む。実施形態では、Ｏｃｔ４タンパク質は、配列番号８に関してアミノ酸の挿入、欠失、または置換を（集合的に）１～２０有するアミノ酸配列を含む。あるいは、他の実施形態では、Ｏｃｔ４タンパク質は、配列番号８に関してアミノ酸の挿入、欠失、または置換を（集合的に）１～１５または１～１０有するアミノ酸配列を含む。
「Ｓｏｘ２タンパク質」とは、ＳＯＸ２遺伝子によってコードされるタンパク質、またはその天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片もしくは融合コンストラクトを意味し、非限定的な例としては、ヒトＳｏｘ２タンパク質（配列番号９）、マウスＳｏｘ２タンパク質、Ｓｏｘ２タンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたはＳｏｘ２－ＧＦＰ融合タンパク質がある。実施形態では、Ｓｏｘ２タンパク質は、配列番号９との同一性が少なくとも７０％であるか、または他の実施形態において、配列番号９との同一性が少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％であるアミノ酸配列を含む。実施形態では、Ｓｏｘ２タンパク質は、配列番号９に関してアミノ酸の挿入、欠失、または置換を（集合的に）１～２０有するアミノ酸配列を含む。あるいは、他の実施形態では、Ｓｏｘ２タンパク質は、配列番号９に関してアミノ酸の挿入、欠失、または置換を（集合的に）１～１５または１～１０有するアミノ酸配列を含む。
「Ｋｌｆ４タンパク質」とは、ＫＬＦ４遺伝子によってコードされるタンパク質、またはその天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片もしくは融合コンストラクトを意味し、非限定的な例としては、ヒトＫｌｆ４タンパク質（配列番号１０）、マウスＫｌｆ４タンパク質、Ｋｌｆ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたはＫｌｆ４－ＧＦＰ融合タンパク質がある。実施形態では、Ｋｌｆ４タンパク質は、配列番号１０との同一性が少なくとも７０％であるか、または他の実施形態において、配列番号１０との同一性が少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％であるアミノ酸配列を含む。実施形態では、Ｋｌｆ４タンパク質は、配列番号１０に関してアミノ酸の挿入、欠失、または置換を（集合的に）１～２０有するアミノ酸配列を含む。あるいは、他の実施形態では、Ｋｌｆ４タンパク質は、配列番号１０に関してアミノ酸の挿入、欠失、または置換を（集合的に）１～１５または１～１０有するアミノ酸配列を含む。
「ｃ－Ｍｙｃタンパク質」とは、ＭＹＣ遺伝子によってコードされるタンパク質、またはその天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片もしくは融合コンストラクトを意味し、非限定的な例としては、ヒトｃ－Ｍｙｃタンパク質（配列番号１１）、マウスｃ－Ｍｙｃタンパク質、ｌ－Ｍｙｃタンパク質、ｃ－Ｍｙｃ（Ｔ５８Ａ）タンパク質、ｃ－Ｍｙｃタンパク質のＤＮＡ結合ドメインまたはｃ－Ｍｙｃ－ＧＦＰ融合タンパク質がある。実施形態では、ｃ－Ｍｙｃタンパク質は、配列番号１１との同一性が少なくとも７０％であるか、または他の実施形態において、配列番号１１との同一性が少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％であるアミノ酸配列を含む。実施形態では、ｃ－Ｍｙｃタンパク質は、配列番号１１に関してアミノ酸の挿入、欠失、または置換を（集合的に）１～２０有するアミノ酸を含む。あるいは、他の実施形態では、ｃ－Ｍｙｃタンパク質は、配列番号１１に関してアミノ酸の挿入、欠失、または置換を（集合的に）１～１５または１～１０有するアミノ酸配列を含む。
「リプログラミング」とは、細胞の表現型に変化を引き起こすことを意味し、非限定的な例としては、β－細胞前駆細胞を成熟β－細胞に分化させること、線維芽細胞を多能性幹細胞に脱分化させること、角化細胞を心臓幹細胞へ分化転換させること、細胞のテロメアを伸長させること、またはニューロンの軸索を成長させることである。
「リプログラミング因子」とは、分子であって、細胞を、その分子及び／またはその分子を発現する細胞と接触させた場合に、単独または他の分子との組み合わせのいずれでもリプログラミングを引き起こすことができる分子を意味し、非限定的な例としては、Ｏｃｔ４タンパク質、Ｔｅｒｔタンパク質、またはエリスロポエチンがある。
「生殖細胞」とは、精細胞または卵細胞を意味する。
「多能性幹細胞」とは、インビボで、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）のいずれの細胞へも分化することができる細胞を意味する。
「体細胞」とは、多能性幹細胞または生殖細胞ではない細胞を意味し、非限定的な例として皮膚細胞がある。
「造血細胞」とは、血液細胞または血液細胞に分化することができる細胞を意味し、非限定的な例としては、造血幹細胞、または白血球がある。
「心臓細胞」とは、心臓細胞または心臓細胞に分化することができる細胞を意味し、非限定的な例としては、心臓幹細胞、または心筋細胞がある。
「網膜細胞」とは、網膜の細胞または網膜の細胞に分化することができる細胞を意味し、非限定的な例としては、網膜色素上皮細胞がある。
「皮膚細胞」とは、通常は皮膚に見られる細胞を意味し、非限定的な例としては、線維芽細胞、角化細胞、メラニン細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞または血液細胞がある。
「免疫抑制剤」とは、免疫系の１つ以上の局面を抑制することができ、かつ、哺乳類には通常は存在しない物質を意味し、非限定的な例としては、Ｂ１８Ｒまたはデキサメタゾンがある。
「一本鎖切断」とは、１本または２本の鎖のうちの１本において、ヌクレオチドを連結している共有結合のうちの１つ以上が切断されている、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの領域を意味する。
「二本鎖切断」とは、２本の鎖の各々において、ヌクレオチドを連結している共有結合のうちの１つ以上が切断されている、二本鎖ＤＮＡの領域を意味する。
「ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドまたはその断片もしくは誘導体を意味し、非限定的な例としては、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド三リン酸等がある。
「ヌクレオシド」とは、ヌクレオチドまたはその断片もしくは誘導体を意味し、非限定的な例としては、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド三リン酸等がある。
「遺伝子編集」とは、細胞のＤＮＡ配列を変化させることを意味し、非限定的な例としては、細胞に、細胞のＤＮＡに変異を引き起こすタンパク質をトランスフェクトすることによるか、または細胞に、細胞のＤＮＡに化学変化を引き起こすタンパク質をトランスフェクトすることによるものがある。
「遺伝子編集タンパク質」とは、単独または１つ以上の他の分子との組み合わせのいずれでも、細胞のＤＮＡ配列を変化させることができるタンパク質を意味し、非限定的な例としては、ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、ＷＯ２０１４／０７１２１９Ａ１に開示されている遺伝子編集タンパク質（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、ＤＮＡ修飾タンパク質、塩基修飾タンパク質、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ脱メチル化を引き起こすタンパク質、ＤＮＡを基質とする酵素、またはその天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、ドメイン、断片または融合コンストラクトがある。
「修復鋳型」とは、遺伝子編集タンパク質の標的部位の１０ｋｂ以内の配列との相同性が少なくとも約７０％である領域を含有する核酸を意味する。
「反復配列」とは、あるタンパク質内に、少なくとも約１０％の相同性内に２コピー以上で存在するアミノ酸配列を意味し、非限定的な例としては、転写活性化因子様エフェクターのモノマーリピートがある。
「ＤＮＡ結合ドメイン」とは、ＤＮＡ分子への結合能がある分子の領域を意味し、非限定的な例としては、１つ以上のジンクフィンガーを含むタンパク質ドメイン、１つ以上の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター反復配列を含むタンパク質ドメインまたはＤＮＡ分子への結合能がある小分子の結合ポケットがある。
「結合部位」とは、遺伝子編集タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合ドメインまたはその生物学的に活性な断片もしくはバリアントによって認識され得る核酸配列、あるいは核酸配列であって、それに対して、遺伝子編集タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合ドメインまたはその生物学的に活性な断片もしくはバリアントが高親和性であるものを意味し、非限定的な例としては、ヒトＢＩＲＣ５遺伝子のエクソン１にあるＤＮＡの約２０－塩基対配列がある。
「標的」とは、結合部位を含有する核酸を意味する。
「リポソーム」とは、水性環境において少なくとも一過性に安定な、両親媒性分子、疎水性分子、またはその混合物を含有する実体を意味し、非限定的な例としては、ミセル、水性内部を有する単層二重層、多層二重層、脂質ナノ粒子、前述のうちいずれかが１つ以上の核酸と複合体を形成しているもの、または安定な核酸脂質粒子がある。
「ＰＥＧ化」とは、任意の長さまたは任意の分子量のポリ（エチレングリコール）鎖に共有結合または他の方法で安定して結合していることを意味する。
ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮは、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１（ｗ／ｗ）の混合物である。
ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥは、ポリカチオン性脂質の２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセタート（ＤＯＳＰＡ）とＤＯＰＥの３：１（ｗ／ｗ）の混合物である。
ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００は、ポリカチオン性脂質のＮ１，Ｎ４－ジミリスチル－Ｎ１，Ｎ４－ジ－（２－ヒドロキシ－３－アミノプロピル）－ジアミノブタン（ＤＨＤＭＳ）とコレステロールの２：３の混合物である。
ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００は、ポリカチオン性脂質（ＤＨＤＭＳ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１の混合物である。
「ＤＬｉｎＤＨＳ」または「ＤＨＤＬｉｎＳ」とは、Ｎ１，Ｎ４－ジリノレイル－Ｎ１，Ｎ４－ジ－（２－ヒドロキシ－３－アミノプロピル）－ジアミノブタンを意味する。
本発明を、以下の非限定的な実施例によりさらに説明する。
番号付き実施形態
実施形態１：式（Ｉ）の化合物
［式中、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、及びＱ４は、独立して、正電荷をとることができる原子または基であり、
Ａ１及びＡ２は、独立して、ヌル、Ｈ、または任意選択で置換されたＣ１－Ｃ６アルキルであり、
Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、独立して、ヌル、結合、（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、（ハロ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、（アルコキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルカンジイル、複素環－ジイル、または前述を任意に組み合わせたものであって、任意選択でエーテル、エステル、無水物、アミド、カルバマート、第二級アミン、第三級アミン、第四級アンモニウム、チオエーテル、尿素、カルボニル、もしくはイミンのうちの１つ以上により連結されているものであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８は、独立して、ヌル、Ｈ、（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（ハロ）（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（アルコキシ）（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（ハロ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（ヒドロキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（アルコキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニル、（ハロ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニル、（ヒドロキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニル、（アルコキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニルであり、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８のうちの少なくとも１つが少なくとも２つの不飽和結合を含み、かつ、
ｘ、ｙ、及びｚは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である］。
実施形態２：Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、及びＱ４は、独立して、Ｎ、Ｂ、Ｐ、またはＦｅである、実施形態１に記載の化合物。
実施形態３：Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、及びＱ４は、Ｎである、実施形態２に記載の化合物。
実施形態４：Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、及びＱ４は、独立して、第一級アミン、第二級アミン、または第三級アミンである、実施形態３に記載の化合物。
実施形態５：Ｑ１及びＱ４は第一級アミンであり、Ｑ２及びＱ３は、第三級アミンである、実施形態４に記載の化合物。
実施形態６：Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３は、独立して、（Ｃ１－Ｃ６）アルカンジイルまたは（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ６）アルカンジイルである、実施形態１に記載の化合物。
実施形態７：Ｌ１及びＬ３は、独立して、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ６）アルカンジイルであり、Ｌ２は、（Ｃ１－Ｃ６）アルカンジイルである、実施形態６に記載の化合物。
実施形態８：Ｌ１及びＬ３は２－ヒドロキシプロパンジイルであり、Ｌ２は、（Ｃ１－Ｃ６））アルカンジイルである、実施形態７に記載の化合物。
実施形態９：Ｌ１及びＬ３は２－ヒドロキシプロパンジイルであり、Ｌ２は、ブタンジイルである、実施形態８に記載の化合物。
実施形態１０：Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８のうちの１つ以上は、独立して、Ｈ、リノレイル、アルファ－リノレニル、ガンマ－リノレニル、リノエライジル（ｌｉｎｏｅｌａｉｄｙｌ）、アラキドニル、エイコサペンタエニル、及びドコサヘキサエニルから選択される、実施形態１に記載の化合物。
実施形態１１：Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８のうちの２つ以上は、独立して、Ｈ、リノレオイル、アルファ－リノレノイル、ガンマ－リノレノイル、リノエライドイル、アラキドノイル、エイコサペンタエノイル、及びドコサヘキサエノイルから選択される、実施形態１に記載の化合物。
実施形態１２：Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８のうちの１つ以上は、独立して、Ｈ、ミリストレイル、パルミトレイル、サピエニル（ｓａｐｉｅｎｙｌ）、オレイル、エライジル、バクセニル、エルシル、カプリリル、カプリル、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、ステアリル、アラキジル、ベヘニル、リグノセリル、及びセロチル（ｃｅｒｏｔｙｌ）から選択される、実施形態１に記載の化合物。
実施形態１３：Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８のうちの２つ以上は、独立して、Ｈ、ミリストレオイル、パルミトレオイル、サピエノイル、オレオイル、エライドイル、バクセノイル、エルコイル、カプリロイル、カプロイル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、アラキドイル、ベヘノイル、リグノセロイル、及びセロトイルから選択される、実施形態１に記載の化合物。
実施形態１４：Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７及びＲ８はＨであり、Ｒ４及びＲ６は、独立して、リノレイル、アルファ－リノレニル、ガンマ－リノレニル、リノエライジル（ｌｉｎｏｅｌａｉｄｙｌ）、アラキドニル、エイコサペンタエニル、及びドコサヘキサエニルから選択される、実施形態１０に記載の化合物。
実施形態１５：Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７及びＲ８はＨであり、Ｒ４及びＲ６は、アルファ－リノレニルである、実施形態１４に記載の化合物。
実施形態１６：Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７及びＲ８はＨであり、Ｒ４及びＲ６は、リノレイルである、実施形態１４に記載の化合物。
実施形態１７：ｘ及びｚは、独立して、０または１であり、ｙは１である、実施形態１に記載の化合物。
実施形態１８：Ｑ１及びＱ４は第一級アミンであり、Ｑ２及びＱ３は第三級アミンであり、Ｌ１及びＬ３は２－ヒドロキシプロパンジイルであり、Ｌ２はブタンジイルであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７及びＲ８はＨであり、Ｒ４及びＲ６はリノレイルであり、ｘ、ｙ、及びｚは１である、実施形態１に記載の化合物。
実施形態１９：Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３のうちの１つ以上は、少なくとも１つのエステル部分を含む、実施形態１に記載の化合物。
実施形態２０：Ｒ２及びＲ４のうちの１つ以上は、少なくとも１つのエステル部分を含む、実施形態１に記載の化合物。
実施形態２１：Ａ１及びＡ２は、Ｈである、実施形態１に記載の化合物。
実施形態２２：式（ＩＩ）の化合物
［式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７、及びＲ２８は、独立して、Ｈ、ハロ、ＯＨ、（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（ハロ）（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（アルコキシ）（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロであり、
ｉ、ｊ、ｋ、ｍ、ｓ、及びｔは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である］。
実施形態２３：Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８ Ｒ１９、及びＲ２０はＨであり、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、独立して、Ｈまたは（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであり、ｍは８であり、ｉは８であり、ｓは１であり、ｊは１であり、ｋは４であり、ｔは４である、実施形態２２に記載の化合物。
実施形態２４：Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８ Ｒ１９、及びＲ２０はＨであり、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、独立して、Ｈまたは（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであり、Ｒ２７及びＲ２８はメチルであり、ｍは８であり、ｉは８であり、ｓは１であり、ｊは１であり、ｋは４であり、ｔは４である、実施形態２２に記載の化合物。
実施形態２５：Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８ Ｒ１９、及びＲ２０はＨであり、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、１３及びＲ１４は、独立して、Ｈであり、Ｒ２７及びＲ２８はメチルであり、ｍは８であり、ｉは８であり、ｓは１であり、ｊは１であり、ｋは４であり、ｔは４である、実施形態２２に記載の化合物。
実施形態２６：Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８ Ｒ１９、及びＲ２０はＨであり、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、独立して、Ｈであり、Ｒ２７及びＲ２８はメチルであり、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、及びＲ２６はＨであり、ｍは８であり、ｉは８であり、ｓは１であり、ｊは１であり、ｋは４であり、ｔは４である、実施形態２２に記載の化合物。
実施形態２７：Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８ Ｒ１９、及びＲ２０はＨであり、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、独立して、Ｈであり、Ｒ２７及びＲ２８はメチルであり、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、及びＲ２６はＨであり、ｍは９であり、ｉは９であり、ｓは１であり、ｊは１であり、ｋは４であり、ｔは４である、実施形態２２に記載の化合物。
実施形態２８：Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８ Ｒ１９、及びＲ２０はＨであり、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、独立して、Ｈであり、Ｒ２７及びＲ２８はメチルであり、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、及びＲ２６はＨであり、ｍは９であり、ｉは９であり、ｓは１であり、ｊは１であり、ｋは３であり、ｔは３である、実施形態２２に記載の化合物。
実施形態２９：式（ＩＩＩ）の化合物
［式中、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、及びＬ７は、独立して、結合、（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、（ハロ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、（アルコキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイル、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルカンジイル、複素環－ジイル、－（ＣＨ２）ｖ１－Ｃ（Ｏ）－、－（（ＣＨ２）ｖ１－Ｏ）ｖ２－、または－（（ＣＨ２）ｖ１－Ｃ（Ｏ）－Ｏ）ｖ２－であり、
Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈ、（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（ハロ）（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（アルコキシ）（Ｃ１－Ｃ６０）アルキル、（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（ハロ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（ヒドロキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（アルコキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニル、（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニル、（ハロ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニル、（ヒドロキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニル、（アルコキシ）（Ｃ２－Ｃ６０）アルキニルであり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも１つが少なくとも２つの不飽和結合を含み、
ｖ、ｖ１及びｖ２は、独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である］。
実施形態３０：Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、及びＬ７は、－（ＣＨ２）３－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも２つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む、実施形態２９に記載の化合物。
実施形態３１：Ｌ４及びＬ５は、－（ＣＨ２）３－であり、Ｌ６及びＬ７は、－（ＣＨ２）４－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及び３５のうちの少なくとも２つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む、実施形態２９に記載の化合物。
実施形態３２：Ｌ４及びＬ６は、－（ＣＨ２）３－であり、Ｌ５及びＬ７は、－（ＣＨ２）４－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも２つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む、実施形態２９に記載の化合物。
実施形態３３：Ｌ４及びＬ７は、－（ＣＨ２）３であり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）４－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも２つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む、実施形態２９に記載の化合物。
実施形態３４：Ｌ４及びＬ６は、－（ＣＨ２）３－であり、Ｌ５及びＬ７は、－（ＣＨ２）５－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも２つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む、実施形態２９に記載の化合物。
実施形態３５：Ｌ４及びＬ７は、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイルであり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）３－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも２つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む、実施形態２９に記載の化合物。
実施形態３６：Ｌ４及びＬ７は、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイルであり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）３－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも３つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む、実施形態２９に記載の化合物。
実施形態３７：Ｌ４及びＬ７は、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイルであり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）４－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも３つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む、実施形態２９に記載の化合物。
実施形態３８：Ｌ４及びＬ７は、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイルであり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）５－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０）アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも３つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む、実施形態２９に記載の化合物。
実施形態３９：Ｌ４及びＬ７は、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ２０）アルカンジイルであり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）６－であり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５は、独立して、Ｈまたは（Ｃ２－Ｃ６０））アルケニルであり、ｖは１であり、ここで、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの少なくとも３つは、少なくとも２つの不飽和結合を含む、実施形態２９に記載の化合物。
実施形態４０：Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの２つ以上は、独立して、Ｈ、ミリストレオイル、パルミトレオイル、サピエノイル、オレオイル、エライドイル、バクセノイル、エルコイル、カプリロイル、カプロイル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、アラキドイル、ベヘノイル、リグノセロイル、及びセロトイルから選択される、実施形態２９に記載の化合物。
実施形態４１：Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５のうちの２つ以上は、独立して、Ｈ、リノレイル、アルファ－リノレニル、ガンマ－リノレニル、リノエライジル（ｌｉｎｏｅｌａｉｄｙｌ）、アラキドニル、エイコサペンタエニル、及びドコサヘキサエニルから選択される、実施形態２９に記載の化合物。
実施形態４２：Ｌ４及びＬ７は２－ヒドロキシプロパンジイルであり、Ｌ２はブタンジイルであり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、及びＲ３２はＨであり、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５はリノレイルであり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）３－であり、ｖは１である、実施形態２９に記載の化合物。
実施形態４３：Ｌ４及びＬ７は２－ヒドロキシプロパンジイルであり、Ｌ２はブタンジイルであり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、及びＲ３２はＨであり、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５はリノレイルであり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）４－であり、ｖは１である、実施形態２９に記載の化合物。
実施形態４４：Ｌ４及びＬ７は２－ヒドロキシプロパンジイルであり、Ｌ２はブタンジイルであり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、及びＲ３２はＨであり、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５はリノレイルであり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）５－であり、ｖは１である、実施形態２９に記載の化合物。
実施形態４５：Ｌ４及びＬ７は２－ヒドロキシプロパンジイルであり、Ｌ２はブタンジイルであり、Ｒ２９、Ｒ３０、Ｒ３１、及びＲ３２はＨであり、Ｒ３３、Ｒ３４、及びＲ３５はリノレイルであり、Ｌ５及びＬ６は、－（ＣＨ２）６－であり、ｖは１である、実施形態２９に記載の化合物。
実施形態４６：式（ＩＶ）の化合物
［式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である］。
実施形態４７：式（Ｖ）の化合物
実施形態４８：式（ＶＩ）の化合物
実施形態４９：式（ＶＩＩ）の化合物
実施形態５０：式（ＶＩＩＩ）の化合物
実施形態５１：式（ＩＸ）の化合物
実施形態５２：式（Ｘ）の化合物
実施形態５３：式（ＸＩ）の化合物
実施形態５４：式（ＸＩＩ）の化合物
実施形態５５：式（ＸＩＩＩ）の化合物
実施形態５６：式（ＸＩＶ）の化合物
実施形態５７：式（ＸＶ）の化合物
［式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である］。
実施形態５８：式（ＸＶＩ）の化合物
実施形態５９：実施形態１～５８のいずれか１つに記載の化合物と、薬学的に許容される担体または添加剤とを含む、医薬組成物。
実施形態６０：実施形態１～５８のいずれか１つに記載の化合物または実施形態５９に記載の医薬組成物を含む、脂質凝集体。
実施形態６１：前記脂質凝集体が、１つ以上の追加の脂質またはポリマーを含まない、実施形態６０に記載の脂質凝集体。
実施形態６２：表１から選択される１つ以上の追加の脂質またはポリマーをさらに含む、実施形態６０に記載の脂質凝集体。
実施形態６３：前記１つ以上の追加の脂質が中性脂質である、実施形態６０または６１に記載の脂質凝集体。
実施形態６４：前記中性脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、またはコレステロールである、実施形態６３に記載の脂質凝集体。
実施形態６５：前記中性脂質が、ＤＯＰＥまたはコレステロールを含む、実施形態６３に記載の脂質凝集体。
実施形態６６：前記中性脂質が、ＤＯＰＥ及びコレステロールを含む、実施形態６３に記載の脂質凝集体。
実施形態６７：前記化合物が、式（ＩＶ）を含む、実施形態６３に記載の脂質凝集体。
実施形態６８：前記１つ以上の追加の脂質がカチオン性脂質である、実施形態６０～６７のいずれか１つに記載の脂質凝集体。
実施形態６９：前記カチオン性脂質が、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－３－（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、または１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）である、実施形態６８に記載の脂質凝集体。
実施形態７０：ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥを約１：１の比で、及び／またはＮ１，Ｎ４－ジオレイル－Ｎ１，Ｎ４－ジ－（２－ヒドロキシ－３－アミノプロピル）－ジアミノブタン（ＤＨＤＯＳ）とＤＯＰＥを約１：１の比でさらに含む、実施形態６０～６９のいずれか１つに記載の脂質凝集体。
実施形態７１：式（Ａ）
［式中、
Ｒ１及びＲ４は、１７個の炭素原子を有する直鎖アルケニルであり、
Ｒ２及びＲ５は、－（ＣＨ２）ｐ－ＮＨ２であり、その場合、ｐは１～４であり、
ｌは１～１０であり、かつ
Ｘａは、生理学的に許容されるアニオンである］
を有する化合物をさらに含む、実施形態６０に記載の脂質凝集体。
実施形態７２：ＰＥＧ化脂質をさらに含む、実施形態１～７１のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態７３：Ｚ平均粒径が約５０ｎｍ～約２０００ｎｍである、実施形態１～７２のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態７４：前記Ｚ平均粒径が約７００ｎｍ～約１５００ｎｍである、実施形態１～７２のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態７５：前記Ｚ平均粒径が約７５０ｎｍである、実施形態１～７２のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態７６：前記Ｚ平均粒径が約２００ｎｍ未満である、実施形態１～７２のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態７７：前記Ｚ平均粒径を制御するために、前記化合物、医薬組成物、または脂質凝集体が形成される培地のパラメータが使用される、実施形態１～７２のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態７８：前記Ｚ平均粒径を制御するために、前記化合物、医薬組成物、または脂質凝集体が形成される培地のイオン強度が使用される、実施形態１～７２のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態７９：前記Ｚ平均粒径を制御するために、そのような化合物、医薬組成物、または脂質凝集体が形成される培地のｐＨが使用される、実施形態１～７２のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態８０：粒径を２００ｎｍ以下に維持するために、前記化合物、医薬組成物、または脂質凝集体が形成される培地のイオン強度が使用される、実施形態１～７１のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態８１：安定した粒子分散液をさらに含む、実施形態１～８０のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態８２：前記安定した分散液が、ｐＨが約７．０～約８．０であるかまたはｐＨ約７．４である、実施形態８１に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態８３：インスリン、トランスフェリン、及び／またはアルブミンをさらに含む、実施形態１～８２のいずれか１つに記載の医薬組成物または脂質凝集体。
実施形態８４：核酸をさらに含む、実施形態１～８３のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態８５：前記核酸が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、実施形態４に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態８６：ＲＮＡは、合成ＲＮＡである、実施形態８５に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態８７：前記合成ＲＮＡが、非標準ヌクレオチドを含まない、実施形態８６に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態８８：前記合成ＲＮＡが、任意選択で実質的な細胞毒性を回避する非標準ヌクレオチドの組み合わせを含む、実施形態８６に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態８９：前記非標準ヌクレオチドが、ピリミジンについては２Ｃ位、４Ｃ位、及び５Ｃ位から選択される位置、またはプリンについては６Ｃ位、７Ｎ位及び８Ｃ位から選択される位置における１つ以上の置換を有する、実施形態８８に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態９０：前記非標準ヌクレオチドが、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジン、プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヒドロキシプソイドウリジン、５－メチルプソイドウリジン、５－ヒドロキシメチルプソイドウリジン、５－カルボキシプソイドウリジン、５－ホルミルプソイドウリジン、及び５－メトキシプソイドウリジンのうちの１つ以上を、任意選択で、前記非標準ヌクレオチドの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％の量で含む、実施形態８９に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態９１：シチジン残基の少なくとも約５０％は非標準ヌクレオチドであり、それらは、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、及び５－メトキシシチジンから選択される、実施形態８８～９０のいずれか１つの実施形態に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態９２：シチジン残基の少なくとも約７５％または少なくとも約９０％は非標準ヌクレオチドであり、前記非標準ヌクレオチドが、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、及び５－メトキシシチジンから選択される、実施形態８８～９１のいずれか１つの実施形態に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態９３：ウリジンの少なくとも約２０％、またはウリジン残基の少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約７５％、もしくは少なくとも約９０％は非標準ヌクレオチドであり、前記非標準体が、プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヒドロキシプソイドウリジン、５－メチルプソイドウリジン、５－ヒドロキシメチルプソイドウリジン、５－カルボキシプソイドウリジン、５－ホルミルプソイドウリジン、及び５－メトキシプソイドウリジンから選択される、実施形態８８～９２のいずれか１つの実施形態に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態９４：ウリジン残基の少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％は非標準ヌクレオチドであり、前記非標準ヌクレオチドが、プソイドウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヒドロキシプソイドウリジン、５－メチルプソイドウリジン、５－ヒドロキシメチルプソイドウリジン、５－カルボキシプソイドウリジン、５－ホルミルプソイドウリジン、及び５－メトキシプソイドウリジンから選択される、実施形態８８～９３のいずれか１つの実施形態に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態９５：グアニン残基の少なくとも約１０％は非標準ヌクレオチドであり、前記非標準ヌクレオチドが、任意選択で、７－デアザグアノシンである、実施形態８８～９４のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態９６：前記ＲＮＡが、グアノシン残基の代わりに約５０％以下の７－デアザグアノシンを含有する、実施形態８８～９５のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態９７：前記ＲＮＡが、アデノシン残基の代わりに非標準ヌクレオチドを含有しない、実施形態８８～９６のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態９８：前記ＲＮＡが、５’キャップ構造を含む、実施形態８８～９７のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態９９：ＲＮＡ ５’－ＵＴＲは、コザックコンセンサス配列を含む、実施形態８８～９８のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１００：前記ＲＮＡ ５’－ＵＴＲが、ＲＮＡのインビボ安定性を高める配列を含み、前記５’－ＵＴＲが、アルファグロビンまたはベータグロビンの５’－ＵＴＲを含み得る、実施形態８８～９９のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１０１：ＲＮＡ ３’－ＵＴＲは、ＲＮＡのインビボ安定性を高める配列を含み、前記３’－ＵＴＲが、アルファグロビンまたはベータグロビンの３’－ＵＴＲを含み得る、実施形態８８～１００のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１０２：前記合成ＲＮＡ分子がマイクロＲＮＡ結合部位を含み、前記マイクロＲＮＡ結合部位が、任意選択で、ｍｉＲ１４２ マイクロＲＮＡ結合部位（任意選択で配列番号８１１及び配列番号８１２のうちの１つである）もしくそのバリアントである、及び／または前記合成ＲＮＡ分子の３’－ＵＴＲ中に１つ以上のコピーで存在する、実施形態８８～１０１のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１０３：前記ＲＮＡが、３’ポリ（Ａ）尾部を含み、任意選択で、前記ＲＮＡ ３’ポリ（Ａ）尾部が、約２０ヌクレオチド長～約２５０ヌクレオチド長である、実施形態８８～１０２のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１０４：前記ＲＮＡが、約２００ヌクレオチド長～約５０００ヌクレオチド長である、実施形態８８～１０３のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１０５：前記ＲＮＡが、約５００～約２０００ヌクレオチド長、または約５００～約１５００ヌクレオチド長、または約５００～約１０００ヌクレオチド長である、実施形態８８～１０４のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１０６：前記ＲＮＡが、インビトロ転写により調製される、実施形態８８～１０５のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１０７：前記組成物が、皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、皮内注射、皮下注射（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、筋肉内注射、静脈内投与、髄腔内投与、腫瘍内投与、及び局所投与に好適である、実施形態１～１０６のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１０８：前記組成物が、約１ｎｇ～約２０００ｎｇのＲＮＡを含有する１回以上の注射としての投与に好適である、実施形態１～１０７のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１０９：前記合成ＲＮＡがｍＲＮＡである、実施形態８８～１０８のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１１０：前記ｍＲＮＡが、目的のタンパク質をコードする、実施形態１０９に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１１１：前記目的のタンパク質が可溶性タンパク質であり、任意選択で表２Ｂから選択される、実施形態１１０に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１１２：前記可溶性タンパク質が、１つ以上のリプログラミング因子である、実施形態１１１に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１１３：前記１つ以上のリプログラミング因子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、ｌ－Ｍｙｃ、Ｔｅｒｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｕｔｆ１、Ａｉｃｄａ、ｍｉＲ２００ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３０２ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３６７ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３６９ マイクロＲＮＡならびにその生物学的に活性な断片、類似体、バリアント及びファミリーメンバーから選択される、実施形態１１２に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１１４：前記目的のタンパク質が遺伝子編集タンパク質である、実施形態１１０に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１１５：前記遺伝子編集タンパク質が、ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃａｓ９、ｘＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、クラス１のＣａｓタンパク質、クラス２のＣａｓタンパク質、及びＭＡＤ７、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片もしくは融合コンストラクトから選択される、実施形態１１４に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１１６：前記遺伝子編集タンパク質が、複数の反復配列を含むＤＮＡ結合ドメインを含み、前記反復配列のうちの少なくとも１つは、アミノ酸配列：ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＧＨＧＧ（配列番号６２９）を含み、かつ３６～３９アミノ酸長であり、ここで、「ｖ」はＱ、ＤまたはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｘ」はＨ、Ｎ、またはＩであり、「ｙ」はＤ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、またはヌルであり、「ｚ」は、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ（配列番号６３０）またはＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡ（配列番号６３１）である、実施形態１１５に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１１７：前記遺伝子編集タンパク質が、ヌクレアーゼの触媒ドメインを含むヌクレアーゼドメインをさらに含む、実施形態１１６に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１１８：前記遺伝子編集タンパク質が、遺伝子に一本鎖または二本鎖の切断を作る能力がある、実施形態１１４～１１７のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１１９：前記一本鎖または二本鎖の切断が、遺伝子の持続的スプライシング変化を生じさせる、実施形態１１８に記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１２０：遺伝子の機能性コピーをさらに含む、実施形態１１４～１１９のいずれか１つに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体。
実施形態１２１：細胞に核酸をトランスフェクトするための方法であって、前記細胞を、前記核酸と、上記実施形態のいずれかに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体との複合体と接触させることを含む、前記方法。
実施形態１２２：前記複合体が、前記細胞との接触前に形成される、実施形態１２１に記載の方法。
実施形態１２３：前記方法により、（ａ）トランスフェクション高効率、（ｂ）高レベルのエンドソーム脱出、（ｃ）血清耐性、低毒性作用、（ｄ）高レベルのタンパク質発現、（ｅ）様々な細胞型でトランスフェクションが可能であること、及び（ｆ）追加の脂質またはトランスフェクション用試薬を用いずにトランスフェクションが可能であること、という特徴のうちの１つが提供される、実施形態１２１または１２２に記載の方法。
実施形態１２４：前記特徴が、前記核酸と、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＡＰ、及びＤＯＰＥ、及びコレステロール、及びそれらの組み合わせとの複合体を細胞にトランスフェクトする方法に関する、実施形態１２１～１２３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２５：前記特徴が、前記核酸と、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００との複合体を細胞にトランスフェクトする方法に関する、実施形態１２１～１２４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２６：分化細胞または非多能性細胞を、より未分化な状態へリプログラミングするための方法であって、（ａ）分化細胞または非多能性細胞を提供すること、（ｂ）前記分化細胞または非多能性細胞を培養すること、（ｃ）前記分化細胞または非多能性細胞に、１つ以上の合成ＲＮＡ分子と、上記実施形態のいずれかに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体との複合体をトランスフェクトすることを含み、ここで、前記１つ以上の合成ＲＮＡ分子には、１つ以上のリプログラミング因子をコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子が含まれ、かつ、前記トランスフェクトすることにより、前記１つ以上のリプログラミング因子を発現する細胞がもたらされ、前記細胞がより未分化な状態にリプログラミングされる結果となる、前記方法。
実施形態１２７：ステップ（ｃ）が、前記分化または非多能性をより未分化な状態にリプログラミングすることを支持する成分を含有する培地の存在下で行われる、実施形態１２６に記載の方法。
実施形態１２８：連続する５日の間にステップ（ｃ）を少なくとも２回繰り返すことをさらに含む、実施形態１２６または１２７に記載の方法。
実施形態１２９：後の１回以上のトランスフェクションにおいてトランスフェクトされる１つ以上の合成ＲＮＡ分子の量は、前の１回以上のトランスフェクションにおいてトランスフェクトされる量よりも多い、実施形態１２８に記載の方法。
実施形態１３０：ステップ（ａ）～（ｃ）は、フィーダー細胞を使用せずに実施され、フィーダー細胞条件培地の存在下で行われる、実施形態１２６～１２９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３１：ステップ（ｃ）は、照射ヒト新生児線維芽細胞のフィーダー細胞を使用せずに実施され、フィーダー細胞条件培地の存在下で行われる、実施形態１２６～１３０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３２：前記合成ＲＮＡ分子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、１－Ｍｙｃ、Ｔｅｒｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｕｔｆ１、Ａｉｃｄａ、ｍｉＲ２００ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３０２ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３６７ マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３６９ マイクロＲＮＡならびにその生物学的に活性な断片、類似体、バリアント及びファミリーメンバーから選択される１つ以上のリプログラミング因子（複数可）をコードする、実施形態１２６～１３１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１３３：前記分化細胞または非多能性細胞が生検に由来する、実施形態１２６に記載の方法。
実施形態１３４：前記分化細胞または非多能性細胞がヒト対象からのものである、実施形態１２６に記載の方法。
実施形態１３５：前記分化細胞または非多能性細胞が皮膚のパンチ生検標本に由来する、実施形態１２６に記載の方法。
実施形態１３６：前記分化細胞または非多能性細胞が皮膚細胞である、実施形態１２６に記載の方法。
実施形態１３７：前記細胞を、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｌ－オルニチン、ＲＧＤペプチド、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、及びラミニンという群の少なくとも１つのメンバーと接触させることをさらに含む、実施形態１２６に記載の方法。
実施形態１３８：前記合成ＲＮＡ分子が、少なくとも１つの非標準ヌクレオチドを含有する、実施形態１２６に記載の方法。
実施形態１３９：前記合成ＲＮＡ分子が、いかなる非標準ヌクレオチドをも欠く、実施形態１２６に記載の方法。
実施形態１４０：前記培地が免疫抑制剤を実質的に含まない、実施形態１２６に記載の方法。
実施形態１４１：細胞に遺伝子編集を行うための方法であって、前記細胞に、１つ以上の合成ＲＮＡ分子と、上記実施形態のいずれかに記載の化合物、医薬組成物、または脂質凝集体との複合体をトランスフェクトすることを含み、ここで、前記１つ以上の合成ＲＮＡ分子には、ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、クラスター化され規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃａｓ９、ｘＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１４、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、クラス１のＣａｓタンパク質、クラス２のＣａｓタンパク質、及びＭＡＤ７、またはそれらの天然もしくは操作されたバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、断片もしくは融合コンストラクトから選択される１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードする、少なくとも１つのＲＮＡ分子が含まれる、前記方法。
実施形態１４２：前記遺伝子編集タンパク質が、複数の反復配列を含むＤＮＡ結合ドメインを含み、前記反復配列のうちの少なくとも１つが、アミノ酸配列：ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚＧＨＧＧ（配列番号６２９）を含み、ここで、「ｖ」はＱ、ＤまたはＥであり、「ｗ」はＳまたはＮであり、「ｘ」はＨ、Ｎ、またはＩであり、「ｙ」はＤ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、またはヌルであり、「ｚ」は、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ（配列番号６３０）またはＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡ（配列番号６３１）である、実施形態１４１に記載の方法。
実施形態１４３：前記遺伝子編集タンパク質が、３６～３９アミノ酸長である、実施形態１４１または１４２に記載の方法。
実施形態１４４：前記遺伝子編集タンパク質が、ヌクレアーゼの触媒ドメインを含むヌクレアーゼドメインを含む、実施形態１４１～１４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４５：前記ヌクレアーゼが、ＳｔｓＩ及びＦｏｋＩから選択される、実施形態１４１～１４４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１４６：水素化アルミニウムリチウムと溶媒とを含有する反応物から有機化合物を抽出するための方法であって、抽出された有機化合物が得られるよう、（ａ）水で反応を停止させること、（ｂ）前記溶媒を除去すること、（ｃ）過剰の水を除去すること、及び（ｄ）アルコールで前記有機化合物を抽出することを含む、前記方法。
実施形態１４７：前記アルコールがイソプロピルアルコールである、実施形態１４６に記載の方法。
実施形態１４８：水反応性化合物と第１の溶媒とを含有する反応物から有機化合物を抽出するための方法であって、抽出された有機化合物が得られるよう、（ａ）水で反応を停止させること、（ｂ）前記第１の溶媒を除去すること、（ｃ）過剰の水を除去すること、及び（ｄ）第２の溶媒で前記有機化合物を抽出することを含む、前記方法。
実施形態１４９：前記有機化合物と、フタルイミドまたはフタルイミド誘導体との混合物からの有機化合物を精製するための方法であって、精製された有機化合物が得られるよう、（ａ）前記混合物をアセトンに溶解させて沈殿物を形成させること、（ｂ）前記沈殿物を遠心分離により除去すること、及び（ｃ）前記アセトンを除去することを含む、前記方法。
実施形態１５０：前記フタルイミドまたはフタルイミド誘導体がフタルヒドラジンである、実施形態１４９に記載の方法。
実施例１：塩化リノレオイルの合成（１）
塩化オキサリル（４７．０ｍＬ、５５５ｍｍｏｌ）を、Ｎ２雰囲気下、０℃でリノール酸（７０．０ｇ、２５０ｍｍｏｌ）の無水塩化メチレン溶液（５８０ｍＬ）に加えた。反応物を室温に加温し、２４時間激しく撹拌した。溶媒及び塩化オキサリルを減圧下で除去して、塩化リノレオイルを褐色油状物として得、これをそれ以上精製せずに使用した。
実施例２：α－リノレノイルクロリドの合成（２）
実施例１のプロトコルに従って、塩化オキサリル（３．３６ｍＬ、５０．４ｍｍｏｌ）を、α－リノレン酸（５．００ｇ、１８．０ｍｍｏｌ）含有無水塩化メチレン（３５ｍＬ）に加えた。２４時間後、溶媒及び塩化オキサリルを除去して、４．１ｇのα－リノレノイルクロリドを黄褐色油状物として得た。
実施例３：Ｎ１，Ｎ４－ジリノレオイル－ジアミノブタンの合成（３）
０℃の氷浴で、１，４－ジアミノブタン（０．４２８ｇ、４．８６ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２．０３ｍＬ、１４．６ｍｍｏｌ）の無水塩化メチレン溶液（１ｍＬ）を、塩化リノレオイル（２．９８ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）の無水塩化メチレン溶液（３０ｍＬ）にゆっくりと加えた。反応混合物を磁気撹拌子で激しく撹拌した。添加完了後、氷浴を撤去し、混合物を室温で２．５日撹拌した。反応物を４℃に冷却し、溶液から白色固体が沈殿した。過剰の塩化リノレオイルを吸引ろ過により除去した。沈殿物を１０ｍＬの塩化メチレンで２回洗浄した。母液を濃縮し、さらなる生成物が沈殿した。この沈殿物をろ過し、前の沈殿物と合わせた。得られた固体を４時間真空乾燥した。所望の生成物、Ｎ１，Ｎ４－ジリノレオイル－ジアミノブタンの白色固体が合計１．９ｇ得られた。
実施例４：Ｎ１，Ｎ４－ジリノレイル－ジアミノブタンの合成（４）
水素化アルミニウムリチウム（０．６ｇ、９５％、１６ｍｍｏｌ）を、Ｎ１，Ｎ４－ジリノレオイル－ジアミノブタン（１．８ｇ、２．９ｍｍｏｌ）の無水ジエチルエーテル懸濁液（５０ｍＬ）に０℃で慎重に加えた。添加完了後、氷浴を撤去した。反応混合物をゆっくりと室温まで加温した後、適切な濃縮装置で穏やかに加熱して還流させ、１２時間撹拌した。反応混合物を冷却し、５ｍＬの水で０℃にて慎重に反応を停止させた。ジエチルエーテルを減圧下で除去し、反応混合物を真空下で乾燥させた。乾燥した反応混合物を２５ｍＬのイソプロピルアルコールで８０℃にて３回抽出した。イソプロピルアルコールを除去して、１．６ｇの無色油状のＮ１，Ｎ４－ジリノレイル－ジアミノブタンを得た。
実施例５：Ｎ１，Ｎ４－ジリノレイル－Ｎ１，Ｎ４－ジ－［２－ヒドロキシ－３－（Ｎ－フタルアミド）プロピル］－ジアミノブタンの合成（５）
ジイソプロピルエチルアミン（１．１５ｍＬ、１２．０ｍｍｏｌ）を、Ｎ１，Ｎ４－ジリノレイル－ジアミノブタン（１．６ｇ、２．７ｍｍｏｌ）及びＮ－（２，３－エポキシプロピル）－フタルイミド（１．６ｇ、７．９ｍｍｏｌ）の乾燥Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド懸濁液（１２ｍＬ）に加えた。窒素でパージした後、反応混合物を丸底フラスコ内に密封し、約９０℃に２４時間加熱した。Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド及びジイソプロピルエチルアミンを除去し、黄色油状物が得られた。追加の精製をせずに合成を継続した。
実施例６：Ｎ１，Ｎ４－ジリノレイル－Ｎ１，Ｎ４－ジ－（２－ヒドロキシ－３－アミノプロピル）－ジアミノブタンの合成（６）
Ｎ１，Ｎ４－ジリノレイル－Ｎ１，Ｎ４－ジ－［２－ヒドロキシ－３－（Ｎ－フタルアミド）プロピル］－ジアミノブタンの粗油状物全部を２５ｍＬの無水エタノールに溶解した。ヒドラジン（０．５ｍＬ、６４～６５％水溶液、１０．３ｍｍｏｌ）を室温で加えた。適切な濃縮装置で、反応混合物を加熱しして還流させた。油浴を８５℃に設定した。１５分後、溶液から白色固体が沈殿した。反応混合物を４時間還流撹拌してから－２０℃まで冷却した。白色固体を重力ろ過により除去した。残渣を冷エタノールで２回洗浄した。合わせたエタノール溶液を濃縮し、真空下で一晩乾燥させた。粗生成物をアセトンで抽出した。合わせたアセトン溶液を濃縮し、真空下で一晩乾燥させた。１．０ｇの油状物、Ｎ１，Ｎ４－ジリノレイル－Ｎ１，Ｎ４－ジ－（２－ヒドロキシ－３－アミノプロピル）－ジアミノブタン（以下、ＤＨＤＬｉｎＳまたはＤＬｉｎＤＨＳとする）が得られた。ＤＬｉｎＤＨＳの合成プロセスは図１２に概略的に示されている。
実施例７ 脂質の合成
以下の化合物は、実施例１から６の方法により、対応するアミン及びアシルの塩化物を使用して合成される。
Ｎ１，Ｎ４－ジリノレニル－Ｎ１，Ｎ４－ジ－（２－ヒドロキシ－３－アミノプロピル）－ジアミノブタン（７）；
Ｎ１，Ｎ２－ジリノレイル－Ｎ１，Ｎ２－ジ－（２－ヒドロキシ－３－アミノプロピル）－ジアミノエタン（８）；
Ｎ１，Ｎ３－ジリノレイル－Ｎ１，Ｎ３－ジ－（２－ヒドロキシ－３－アミノプロピル）－ジアミノプロパン（９）；
Ｎ１，Ｎ５－－ジリノレイル－Ｎ１，Ｎ５－ジ－（２－ヒドロキシ－３－アミノプロピル）－ジアミノペンタン（１０）；
Ｎ１，Ｎ６－ジリノレイル－Ｎ１，Ｎ６－ジ－（２－ヒドロキシ－３－アミノプロピル）－ジアミノヘキサン（１１）；
リノレイル－ビス（Ｎ－リノレイル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－アミノプロピル）－２－アミノエチル）アミン（１２）；
Ｎ１，Ｎ３－ジリノレイル－Ｎ１－（Ｎ－リノレイル－Ｎ－［２－ヒドロキシ－３－アミノプロピル］－２－アミノエチル）－Ｎ３－［２－ヒドロキシ－３－アミノプロピル］－１，３－ジアミノプロパン（１３）；
リノレイル－ビス（Ｎ－リノレイル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－アミノプロピル）－２－アミノプロピル）アミン（１４）；
Ｎ１，Ｎ４－ジリノレイル－Ｎ１－（Ｎ－リノレイル－Ｎ－［２－ヒドロキシ－３－アミノプロピル］－３－アミノプロピル）－Ｎ４－［２－ヒドロキシ－３－アミノプロピル］－１，４－ジアミノブタン（１５）；
Ｎ１，Ｎ４－ビス（Ｎ－リノレイル－Ｎ－［２－ヒドロキシ－３－アミノプロピル］－アミノプロピル）－１，４－ジアミノブタン（１６）。
実施例８：発明の脂質を用いたトランスフェクション
脂質のエタノール溶液ストックを、２０ｍｇ／ｍＬ及び５ｍｇ／ｍＬで調製し、－２０℃で保存した。トランスフェクションを実施するため、最初に核酸をＤＭＥＭ（５０μＬのＤＭＥＭに１μｇの核酸）に希釈し、次いで、所望の量の脂質溶液ストックを加えた。脂質を加えた後、溶液を完全に混合し、約５分～２５分間複合体を形成させてから細胞に加えた。図１から図６に示されている実験では、脂質は、実施例６に記載のアセトン精製をせずに使用された。
図１は、様々な脂質と複合体を形成した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするインビトロ転写されたＲＮＡによる初代ヒト表皮角化細胞のトランスフェクションを示す。図に示すように、細胞に、ＤＨＤＬｉｎＳが高効率でトランスフェクトされた。
図２は、図１の実験の経時変化、すなわち、ＤＨＤＬｉｎＳを使用したトランスフェクション後の、示されている時点に測定した蛍光を示す。蛍光シグナルはトランスフェクションの１時間後に検出され、シグナル強度及び蛍光細胞数のいずれも、トランスフェクション後、数時間増大した。
図３は、示されている様々な量のＲＮＡ（単位：ナノグラム）と脂質対ＲＮＡの質量比（ＲＮＡ１マイクログラムあたりの脂質のマイクログラム）によるトランスフェクションを示す。図に示すように、試験したＲＮＡ量及び脂質対ＲＮＡの質量比のすべてにおいて蛍光シグナルが得られた。一般に、ＲＮＡの量が多いほど、より強いシグナル及び／またはより多い蛍光細胞数が得られ、５μｇ／μｇより大きい脂質対ＲＮＡの質量比で、最小限の蛍光シグナルの増大が観察された。
図４は、角化細胞の代わりにヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）を用いたトランスフェクション実験を示す。図に示すように、ＤＨＤＬｉｎＳは、試験した脂質対ＲＮＡの質量比の両方においてｈＰＢＭＣに効果的にトランスフェクトされたが、市販のトランスフェクション試薬であるＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００（「ＬＦ３０００」）ではトランスフェクションは観察されなかった。
図５Ａでは、トランスフェクションの結果を、ｈＰＢＭＣの代わりに初代ヒト表皮角化細胞のコンフルエントな層まで拡大している。図に示すように、ＤＨＤＬｉｎＳは、試験した脂質対ＲＮＡの質量比の両方においてコンフルエントな初代ヒト表皮角化細胞に効果的にトランスフェクトされたが、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００で処理された細胞では効率的にトランスフェクトされなかった。図５Ｂは、これを高倍率で示す。図に示すように、ＤＨＤＬｉｎＳは、試験した脂質対ＲＮＡの質量比の両方においてコンフルエントな初代ヒト表皮角化細胞に効果的にトランスフェクトされたが、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００で処理された細胞では効率的にトランスフェクトされなかった。
図６は、図４と同様であるが、ｈＰＢＭＣの代わりに初代ヒト成人皮膚線維芽細胞を用いて行った実験の結果を示す。図に示すように、ＤＨＤＬｉｎＳは、試験した脂質対ＲＮＡの質量比の両方において初代ヒト成人皮膚線維芽細胞に効果的にトランスフェクトされたが、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００で処理された細胞では効率的にトランスフェクトされなかった。図７は、この実験を高倍率で示す。図に示すように、ＤＨＤＬｉｎＳは、試験した脂質対ＲＮＡの質量比の両方において初代ヒト成人皮膚線維芽細胞に効果的にトランスフェクトされたが、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ３０００で処理された細胞では効率的にトランスフェクトされなかった。
図８は、図３と同様であるが、実施例６に記載のようにアセトンでの抽出により精製されたＤＨＤＬｉｎＳを用いて行った実験の結果を示す。図に示すように、蛍光シグナルの最小限の増大は、２μｇ／μｇより大きい脂質対ＲＮＡの質量比で観察された。
図９は、ＤＨＤＬｉｎＳと複合体を形成している、遺伝子編集タンパク質をコードするインビトロ転写されたＲＮＡを初代ヒト表皮角化細胞にトランスフェクトした実験の結果を示す。標的配列を含有し、トランスフェクトされた細胞のゲノムＤＮＡから生成されたアンプリコンと、未処理細胞から生成された、同一の方法で調製されたアンプリコンとをハイブリダイズし、その後、Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼで消化させることによって、遺伝子編集効率を測定した。図に示すように、細胞は、高効率で遺伝子編集された。各レーンの上の数字は、トランスフェクトされた細胞数、及びトランスフェクトされたＲＮＡの量を示す。
図１０は、ＧＦＰをコードし、かつ、２．５μｇ／μｇの脂質対ＲＮＡの質量比でＤＬｉｎＤＨＳと複合体を形成しているインビトロ転写されたＲＮＡを実施例８に記載のように初代ヒト表皮角化細胞にトランスフェクトした実験の結果を示す。ｍＲＮＡ－ＤＬｉｎＤＨＳ複合体を、２０，０００のヒト表皮角化細胞の入った、無血清培地（０％ＦＢＳ）または５０％ＦＢＳに加えた。トランスフェクションの１６時間後に撮像した。測定した蛍光の結果が右パネルに示されており、ＤＬｉｎＤＨＳが５０％血清中でｍＲＮＡを効率的に送達することを示している。左パネルは、比較用に、血清が、ＬＮＰを使用したｍＲＮＡ送達を阻害することを示す。特に、ＧＦＰをコードするｍＲＮＡは、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ（モル比で３０：３０：３８．５：１．５）で構成されるＬＮＰに配合された。ｍＲＮＡ－ＬＮＰ（３００ｎｇの最終ｍＲＮＡ）を、２０，０００のヒト表皮角化細胞の入った、無血清培地（０％ＦＢＳ）または５０％ＦＢＳに加えた。トランスフェクションの１６時間後に撮像した。
図１１Ａは、実施例８に記載のように、ＧＦＰをコードし、かつ、２．５μｇ／μｇの脂質対ＲＮＡの質量比でＤＬｉｎＤＨＳと複合体を形成しているインビトロ転写されたＲＮＡを、初代ヒト皮膚線維芽細胞にトランスフェクトした実験の結果を示す。１００ｎｇの、ＧＦＰをコードするｍＲＮＡ（そのうちの２０％はＣｙ５で標識されている）を、２０，０００ヒト皮膚線維芽細胞の入った１０％ＦＢＳに加えた。蛍光画像をトランスフェクション後の１０時間にわたって、１０分間隔で撮像し、Ｃｙ５標識ＲＮＡとＧＦＰは別々のチャンネルに分割された。図１１Ａの画像は、ＤＬｉｎＤＨＳリポプレックスとの接触の５０分以内に細胞質でｍＲＮＡが検出されたこと、及びタンパク質発現がトランスフェクションの２．５時間以内に開始されたことを示す。
図１１Ｂは、初代ヒト皮膚線維芽細胞に、ＧＦＰをコードし、かつ、標識ＤＬｉｎＤＨＳと複合体を形成しているインビトロ転写されたＲＮＡをトランスフェクトした実験の結果を示す。ＤＬｉｎＤＨＳと、ＢＯＤＩＰＹ－ＮＨＳエステルフルオロフォア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）とを、ＤＬｉｎＤＨＳとフルオロフォアのモル比を１０：１にして結合させ、実施例８に記載のようにＲＮＡと複合体を形成させた。２００ｎｇのＧＦＰをコードするｍＲＮＡを細胞に加えた。蛍光画像をトランスフェクション後の４時間にわたって、複合体の投与直後（「０分」）を含めて２０分間隔で撮像し、ＢＯＤＩＰＹ標識ＤＬｉｎＤＨＳとＧＦＰは別々のチャンネルに分割された。図１１Ｂの画像は、ＤＬｉｎＤＨＳがトランスフェクション後数分以内に細胞と接触すること、及びほとんどの細胞が複数のリポプレックスによる接触を受けていることを示す。
実施例９：ＤＬｉｎＤＨＳの脂肪酸尾部における頭部基のサイズと不飽和度の影響の調査
試験は、一部には、ＤＬｉｎＤＨＳのジヒドロキシスペルミン（ＤＨＳ）頭部基のサイズ、及びＤＬｉｎＤＨＳの脂肪酸尾部の不飽和度の影響を評価するために行われた。
図１３は、ＧＦＰをコードし、かつ、ミリスチル、オレイル、リノレイル、及びリノレニル等の異なる脂肪酸由来尾部に結合させたジヒドロキシスペルミン頭部基を含む本発明の化合物と複合体を形成しているインビトロ転写されたＲＮＡを、初代ヒト表皮角化細胞にトランスフェクトした実験の結果を示す。この実験では、１００ｎｇの、ＧＦＰをコードするＲＮＡの、上記の脂質との複合体、及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００との複合体（対照として）を、２０，０００の角化細胞の入った５０％ＦＢＳに加えた。結果を、トランスフェクション後の時間（時間）に対する蛍光（ａ．ｕ．）として図１３のグラフに示す。
図１４は、ＧＦＰをコードし、かつ、ジリノレイル脂肪酸由来尾部構造を含む本発明の化合物と複合体を形成しているインビトロ転写されたＲＮＡを、初代ヒト表皮角化細胞にトランスフェクトした実験の結果を示す。試験した化合物の構造は、図示されているように、ビス－（２－ヒドロキシ－３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイル－ジアミンであり、ラベルは、頭部基の中央のアミノ間炭素鎖の長さを示す（Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、及びＣ１２）。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００は対照として使用された。この実験では、１００ｎｇの、ＧＦＰをコードするｍＲＮＡの、本発明の脂質との複合体またはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００との複合体を、２０，０００の角化細胞の入った５０％ＦＢＳに加えた。結果を図１４のグラフに示し、トランスフェクション後の時間（時間）に対する蛍光（ａ．ｕ．）を示している。
実施例１０：ＤＬｉｎＤＨＳ／ｍＲＮＡリポプレックスが、イオン強度依存性粒径及びｐＨ依存性ゼータ電位を示す能力の調査
図１５は、ＤＬｉｎＤＨＳリポプレックスの粒径がイオン強度依存性であることを示す。エタノールストックからの脂質を、塩化ナトリウムの濃度が異なるｍＲＮＡ水溶液に希釈してＤＬｉｎＤＨＳ／ＲＮＡ複合体を形成させた。動的光散乱法（ＤＬＳ）により粒径を測定した。図１５のグラフは、９つの異なる複合体形成培地で形成された、ＤＬｉｎＤＨＳ／ＲＮＡ複合体のＺ平均粒径（ｎｍ）と多分散指数（ＰＤＩ）を示す。
図１６は、ＤＬｉｎＤＨＳリポプレックスがｐＨ依存性のゼータ電位を有することを示す。ＧＦＰをコードするインビトロ転写されたＲＮＡをＤＬｉｎＤＨＳと、実施例８に記載のように、２．５μｇ／μｇの脂質対ＲＮＡの質量比で複合体形成させ、次いで、２０ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ３．０～６．０、または２０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．４に希釈した）。グラフは、希釈緩衝液のｐＨの関数としてのゼータ電位（ｍＶ）を示す。本試験では、ｐＨ７．４における－２２．１ｍＶのゼータ電位が安定した分散であることを意味する。
実施例１１：ＤＬｉｎＤＨＳがｍＲＮＡをＲＮａｓｅ Ａ分解から保護する能力の調査
本試験は、ＤＬｉｎＤＨＳがｍＲＮＡをＲＮａｓｅ Ａ分解から保護するかどうかを評価するために行われた。実施例８に記載のように、ＧＦＰをコードし、かつ、２．５μｇ／μｇの脂質対ＲＮＡの質量比でＤＬｉｎＤＨＳと複合体を形成しているインビトロ転写されたＲＮＡを初代ヒト表皮角化細胞にトランスフェクトした。実験用に、ＧＦＰをコードするｍＲＮＡを、ＤＬｉｎＤＨＳとの複合体形成の前または後にＲＮａｓｅ Ａと共にインキュベートした。複合体を、２０，０００の角化細胞の入った無血清培地に加えた。図１７は、ＲＮａｓｅ Ａによる処理をしないＤＬｉｎＤＨＳ／ＲＮＡ複合体（「無処理」）、複合体形成後にＲＮａｓｅ Ａにより処理したＤＬｉｎＤＨＳ／ＲＮＡ複合体（「複合体形成後にＲＮａｓｅ」）、及び複合体形成前にＲＮａｓｅ Ａにより処理したＲＮＡと複合体を形成しているＤＬｉｎＤＨＳ（「複合体形成前にＲＮａｓｅ」）をトランスフェクトされた細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。示されているように、複合体形成後にＲＮａｓｅで処理されたＤＬｉｎＤＨＳ／ｍＲＮＡ複合体では、ＲＮＡは分解から保護されており、ＧＦＰ発現が、ＲＮａｓｅで処理されていないＤＬｉｎＤＨＳ／ｍＲＮＡ複合体のＧＦＰ発現と同様であった。
実施例１２：様々な型の細胞へのｍＲＮＡ送達の調査
本試験は、レポータータンパク質を使用して、様々な細胞型におけるＤＬｉｎＤＨＳと複合体を形成したｍＲＮＡの送達効率を評価するために行われた。実施例８に記載のように、ＧＦＰをコードし、かつ、２．５μｇ／μｇの脂質対ＲＮＡの質量比でＤＬｉｎＤＨＳと複合体を形成しているインビトロ転写されたＲＮＡを、初代ヒト皮膚線維芽細胞、活性化ヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）、ヒト肺腺癌細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、及びラット胚性皮質ニューロンにトランスフェクトした。図１８（上のパネル、「ＧＦＰ」）は、ＤＬｉｎＤＨＳリポプレックスと複合体を形成している、ＧＦＰをコードするインビトロ転写されたＲＮＡをトランスフェクトされた５つの型の細胞の結果を示す。図１８の下のパネル（「Ｎｅｇ．」）は、ＲＮＡが送達されなかった陰性対照実験を示す。
実施例１３：ラットにおける複数の組織へのｍＲＮＡ送達の調査
試験は、一部には、ラットにおいて、複数の経路による送達後の、本発明の脂質と複合体を形成したｍＲＮＡの取り込みを評価するために行われた。実施例８に記載のように、ＧＦＰをコードし、かつ、２．５μｇ／μｇの脂質対ＲＮＡの質量比でＤＬｉｎＤＨＳと複合体を形成しているインビトロ転写されたＲＮＡは、以下の試験パラメータに従ってラットに投与される。
収集したスライドをヘマトキシリン及びウサギ抗ＧＦＰ抗体で染色し、採取された目的の組織におけるレポータータンパク質発現の局在と程度を決定した。
図１９は、ラット組織の８０μｍスケールでの画像（左パネル）、及びラット組織の２０μｍスケールでの画像（右パネル）を示す。図１９に示されるように、レポータータンパク質（ＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡと複合体を形成したＤＬｉｎＤＨＳの皮内注射では、皮層での局所的発現がもたらされた。
実施例１４：皮内注射によるヒト対象へのインビボｍＲＮＡ送達の調査
本試験は、ヒト対象への皮内注射後の、本発明の脂質と複合体を形成しているｍＲＮＡの取り込みを評価するために行われた。実施例８に記載のように、ＤＬｉｎＤＨＳと２．５μｇ／μｇの脂質対ＲＮＡの質量比で複合体を形成している、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）をコードするインビトロ転写されたＲＮＡを、皮内注射により（２０μＬの総体積中４００ｎｇのＲＮＡ）ヒト男性の腹側前腕に投与した。４８時間後、注射部位からの皮膚を生検し、共焦点蛍光顕微鏡で撮像した。図２０Ａは、ＤＬｉｎＤＨＳ／ｍＲＮＡ複合体が注射された皮膚（上のパネル）、及び陰性対照（下のパネル）の画像を示す。図２０Ｂは、拡大画像を示し、矢印は、線維芽細胞の形態と一致する形態を有するＲＦＰ陽性細胞を示す。
均等物
当業者は、単なる日常的な実験を使用して、本明細書に具体的に説明されている特定の実施形態に対する多数の均等物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲内に包含されることが企図される。
参照による組み込み
本明細書で参照される特許及び刊行物はすべて、参照によりその全体が完全に本明細書に取り込まれる。

Claims (19)

  1. 式（ＩＶ）の化合物

    ［式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である］。
  2. ｎが２～１５である、請求項１に記載の化合物。
  3. ｎが２～１２である、請求項１に記載の化合物。
  4. 前記化合物が、

    である、請求項１に記載の化合物。
  5. 前記化合物が、

    である、請求項１に記載の化合物。
  6. 前記化合物が、

    である、請求項１に記載の化合物。
  7. 前記化合物が、

    である、請求項１に記載の化合物。
  8. 前記化合物が、

    である、請求項１に記載の化合物。
  9. 前記化合物が、

    である、請求項１に記載の化合物。
  10. 前記化合物が、

    である、請求項１に記載の化合物。
  11. 前記化合物が、

    である、請求項１に記載の化合物。
  12. 請求項１に記載の化合物と、薬学的に許容される担体または添加剤とを含む、医薬組成物。
  13. 請求項１に記載の化合物を含む脂質凝集体。
  14. 前記脂質凝集体が、１つ以上の追加の脂質またはポリマーを含まない、請求項１３に記載の脂質凝集体。
  15. ＤＮＡまたはＲＮＡ分子から選択される核酸をさらに含む、請求項１３に記載の脂質凝集体。
  16. 細胞に、核酸をトランスフェクトするためのインビトロの方法であって、前記細胞を、前記核酸と式（ＩＶ）の化合物

    ［式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である］との複合体と接触させることを含む、前記方法。
  17. 細胞にトランスフェクトすることにより疾患を治療するための核酸と式（ＩＶ）の化合物との複合体を含む医薬組成物であって、前記式（ＩＶ）の化合物が

    ［式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である］の構造を有する、医薬組成物。
  18. 前記化合物が、

    から選択される、請求項１７に記載の医薬組成物。
  19. 前記化合物が、

    から選択される、請求項１６に記載の方法。
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