JP7635154B2 - 糖修飾タンパク質 - Google Patents
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Description
本発明は、糖修飾タンパク質に関する。より詳細には、タンパク質中の特定の位置のリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質に関する。また、本発明はコク味付与剤に関する。本発明はさらに、飲食品にコク味を付与する方法等に関する。
近年の消費者の嗜好の多様化にともなって、様々な香味特徴をもつビールテイストアルコール飲料やノンアルコールビールテイスト飲料等の開発が望まれている。
例えば、特許文献１にはビール様飲料のコク感等を増強するために、アルコール成分、甘味系成分、アルデヒド系成分などをビール様飲料用風味改善剤とすることなどが開示されている。
本発明は、飲食品にコク味を付与するために有用な物質を提供することを目的とする。また、本発明は、飲食品にコク味を付与する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、飲食品にコク味を付与することができる物質について検討した結果、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、当該アミノ酸配列の１６０番目のリジン及び／又は１８９番目のリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質等が、コク味と相関がある物質であることを見出した。また、本発明者らは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、当該アミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされているタンパク質も、コク味と相関がある物質であることを見出した。
すなわち、これに限定されるものではないが、本発明は、以下の糖修飾タンパク質、コク味付与剤、飲食品にコク味を付与する方法等に関する。
〔１〕リジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であって、下記（ａ１）～（ａ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質。
（ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１６０番目及び／又は１８９番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ３）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置及び／又は１８９番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
〔２〕上記（ａ１）～（ａ３）に記載のタンパク質が、大麦由来のタンパク質である上記〔１〕に記載の糖修飾タンパク質。
〔３〕リジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であって、下記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質。
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１１７番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ３）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
〔４〕上記（ｂ１）～（ｂ３）に記載のタンパク質が、大麦由来のタンパク質である上記〔３〕に記載の糖修飾タンパク質。
〔５〕下記糖修飾タンパク質（Ａ）及び／又は下記糖修飾タンパク質（Ｂ）を含む、コク味付与剤。
糖修飾タンパク質（Ａ）：リジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であって、下記（ａ１）～（ａ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質
（ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１６０番目及び／又は１８９番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ３）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置及び／又は１８９番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
糖修飾タンパク質（Ｂ）：リジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であって、下記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１１７番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ３）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
〔６〕ビールテイストアルコール飲料又はノンアルコールビールテイスト飲料にコク味を付与するために使用される上記〔５〕に記載のコク味付与剤。
〔７〕飲食品にコク味を付与するための、上記糖修飾タンパク質（Ａ）及び／又は上記糖修飾タンパク質（Ｂ）の使用。
〔８〕飲食品がビールテイストアルコール飲料又はノンアルコールビールテイスト飲料である上記〔７〕に記載の使用。
〔９〕上記糖修飾タンパク質（Ａ）及び／又は上記糖修飾タンパク質（Ｂ）を飲食品に添加する、飲食品にコク味を付与する方法。
〔１０〕飲食品がビールテイストアルコール飲料又はノンアルコールビールテイスト飲料である上記〔９〕に記載の方法。
〔１〕リジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であって、下記（ａ１）～（ａ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質。
（ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１６０番目及び／又は１８９番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ３）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置及び／又は１８９番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
〔２〕上記（ａ１）～（ａ３）に記載のタンパク質が、大麦由来のタンパク質である上記〔１〕に記載の糖修飾タンパク質。
〔３〕リジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であって、下記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質。
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１１７番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ３）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
〔４〕上記（ｂ１）～（ｂ３）に記載のタンパク質が、大麦由来のタンパク質である上記〔３〕に記載の糖修飾タンパク質。
〔５〕下記糖修飾タンパク質（Ａ）及び／又は下記糖修飾タンパク質（Ｂ）を含む、コク味付与剤。
糖修飾タンパク質（Ａ）：リジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であって、下記（ａ１）～（ａ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質
（ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１６０番目及び／又は１８９番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ３）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置及び／又は１８９番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
糖修飾タンパク質（Ｂ）：リジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であって、下記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１１７番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ３）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
〔６〕ビールテイストアルコール飲料又はノンアルコールビールテイスト飲料にコク味を付与するために使用される上記〔５〕に記載のコク味付与剤。
〔７〕飲食品にコク味を付与するための、上記糖修飾タンパク質（Ａ）及び／又は上記糖修飾タンパク質（Ｂ）の使用。
〔８〕飲食品がビールテイストアルコール飲料又はノンアルコールビールテイスト飲料である上記〔７〕に記載の使用。
〔９〕上記糖修飾タンパク質（Ａ）及び／又は上記糖修飾タンパク質（Ｂ）を飲食品に添加する、飲食品にコク味を付与する方法。
〔１０〕飲食品がビールテイストアルコール飲料又はノンアルコールビールテイスト飲料である上記〔９〕に記載の方法。
本発明によれば、飲食品にコク味を付与するために有用な糖修飾タンパク質を提供することができる。また、本発明によれば、飲食品にコク味を付与する方法を提供することができる。
本発明の第一の態様は、リジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であって、下記（ａ１）～（ａ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質である。
（ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１６０番目及び／又は１８９番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ３）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置及び／又は１８９番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
上記糖修飾タンパク質を、本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質ともいう。
本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質は、そのアミノ酸配列の、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置及び／又は１８９番目に相当する位置のアミノ酸がリジンである。本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質である。
（ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１６０番目及び／又は１８９番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ３）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置及び／又は１８９番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
上記糖修飾タンパク質を、本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質ともいう。
本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質は、そのアミノ酸配列の、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置及び／又は１８９番目に相当する位置のアミノ酸がリジンである。本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質である。
本明細書中、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置とは、比較対象のタンパク質（ポリペプチド）のアミノ酸配列（一次構造）について、配列番号１のアミノ酸配列（基準のアミノ酸配列）とアミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントを行った場合に、配列番号１のアミノ酸配列中の１６０番目（１６０位）に相当する位置を意味する。従って、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるアミノ酸は、配列番号１では１６０番目のリジンであるが、配列番号１に示すアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列のポリペプチドにおいては、１６０番目とはならない場合がある。配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目以外のアミノ酸、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１８９番目のリジンに相当する位置にあるリジンについても、同様である。後記する配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目のリジンに相当する位置にあるリジンについても同様である。本明細書中、アミノ酸の番号は、Ｎ末端からのアミノ酸の番号である。本明細書中、アミノ酸配列における配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目のリジンに相当する位置を、「配列番号１の１６０番目に相当する位置」ともいう。同様に、アミノ酸配列における配列番号１に示されるアミノ酸配列の１８９番目のリジンに相当する位置を、「配列番号１の１８９番目に相当する位置」ともいう。
配列番号１の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置のリジンを、上記（ａ１）、（ａ２）又は（ａ３）の任意のタンパク質（ポリペプチド）において特定することは、容易である。
配列番号１の１６０番目に相当する位置のリジン及び／又は１８９番目に相当する位置のリジンの特定は、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＮＣＢＩのＰｒｏｔｅｉｎ Ｂｌａｓｔのような既知の配列比較プログラムを用いて行うことができる。ＣｌｕｓｔａｌＷは、通常、デフォルトパラメーターを用いることができる。ＣｌｕｓｔａｌＷは、日本ＤＮＡデータバンク（Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ：ＤＤＢＪ）、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ）等のウェブサイトから利用することができる。比較を行いたい２つのポリペプチドのアミノ酸配列を入力してプログラムを実行することによって、アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントを行うことができる。ここで、配列番号１のアミノ酸配列を、２つのポリペプチドの１つとして入力することによって、任意のポリペプチドの特定位置の残基が、配列番号１のポリペプチドにおいてどの位置に相当するかを容易に特定することができる。
例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、配列番号１の１８９番目に相当する位置にあるアミノ酸は、１９０番目のリジンである。
配列番号１の１６０番目に相当する位置のリジン及び／又は１８９番目に相当する位置のリジンの特定は、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＮＣＢＩのＰｒｏｔｅｉｎ Ｂｌａｓｔのような既知の配列比較プログラムを用いて行うことができる。ＣｌｕｓｔａｌＷは、通常、デフォルトパラメーターを用いることができる。ＣｌｕｓｔａｌＷは、日本ＤＮＡデータバンク（Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ：ＤＤＢＪ）、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ）等のウェブサイトから利用することができる。比較を行いたい２つのポリペプチドのアミノ酸配列を入力してプログラムを実行することによって、アミノ酸配列の相同性に基づくアラインメントを行うことができる。ここで、配列番号１のアミノ酸配列を、２つのポリペプチドの１つとして入力することによって、任意のポリペプチドの特定位置の残基が、配列番号１のポリペプチドにおいてどの位置に相当するかを容易に特定することができる。
例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、配列番号１の１８９番目に相当する位置にあるアミノ酸は、１９０番目のリジンである。
本発明において、「リジンの側鎖アミノ基がグリケーションされた」とは、リジンの側鎖アミノ基に糖が結合していることを意味する。
糖は、単糖、二糖、三糖以上のオリゴ糖、多糖のいずれであってもよい。好ましくは、単糖、二糖又は三糖であり、より好ましくは、単糖又は二糖である。
単糖としては、還元糖が挙げられ、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ラムノース、アラビノース、キシロースを含む全ての単糖が挙げられる。単糖は、Ｄ型であることが好ましい。
二糖としては、還元糖が挙げられ、例えば、マルトース、イソマルトース、ラクトース等のマルトース型二糖が挙げられる。
三糖としては、マルトトリオース、イソマルトトリオース、セルトリオース、フコシルラクトース、シアリルラクトース等が挙げられる。
一態様において、上記糖として、ビールに含有される糖が好ましい。一態様において、リジンの側鎖アミノ基に結合している単糖として、例えば、グルコース、アラビノース、キシロース等が好ましい。二糖として、マルトース、イソマルトース等が好ましい。三糖として、マルトトリオース、イソマルトトリオース等が好ましい。
糖は、単糖、二糖、三糖以上のオリゴ糖、多糖のいずれであってもよい。好ましくは、単糖、二糖又は三糖であり、より好ましくは、単糖又は二糖である。
単糖としては、還元糖が挙げられ、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ラムノース、アラビノース、キシロースを含む全ての単糖が挙げられる。単糖は、Ｄ型であることが好ましい。
二糖としては、還元糖が挙げられ、例えば、マルトース、イソマルトース、ラクトース等のマルトース型二糖が挙げられる。
三糖としては、マルトトリオース、イソマルトトリオース、セルトリオース、フコシルラクトース、シアリルラクトース等が挙げられる。
一態様において、上記糖として、ビールに含有される糖が好ましい。一態様において、リジンの側鎖アミノ基に結合している単糖として、例えば、グルコース、アラビノース、キシロース等が好ましい。二糖として、マルトース、イソマルトース等が好ましい。三糖として、マルトトリオース、イソマルトトリオース等が好ましい。
配列番号１に示すアミノ酸配列は、大麦（学名：Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）由来のＳｅｒｐｉｎＺ４（別名：ＢＳＺ４、ＨｏｒｖｕＺ４、Ｍａｊｏｒ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ ａｌｂｕｍｉｎ、Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ４、Ｓｅｒｐｉｎ－Ｚ４、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｚ又はＰｒｏｔｅｉｎ Ｚ４）のアミノ酸配列である。
上記（ａ１）に記載のタンパク質において、配列番号１の１６０番目に相当する位置は、そのアミノ酸配列の１６０番目であり、１８９番目に相当する位置は、そのアミノ酸配列の１８９番目である。
上記（ａ１）に記載のタンパク質において、配列番号１の１６０番目に相当する位置は、そのアミノ酸配列の１６０番目であり、１８９番目に相当する位置は、そのアミノ酸配列の１８９番目である。
本明細書中、タンパク質のアミノ酸配列において、１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたとは、同一配列中の任意かつ１～９のアミノ酸配列中の位置において、１～９のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じていてもよい。
上記（ａ２）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸の数は、好ましくは１～８個、１～７個又は１～６個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、特に好ましくは１～３個、最も好ましくは１又は２個である。
上記（ａ３）のタンパク質において、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸配列の同一性（配列同一性）は、好ましくは９９％以上である。
アミノ酸配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出することができる。
アミノ酸配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出することができる。
一態様において、本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質は、上記（ａ１）に記載のタンパク質（配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質）の、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であることが好ましい。この糖修飾タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、当該アミノ酸配列の１６０番目のリジン及び／又は１８９番目のリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質ということもできる。
一態様において、本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質は、上記（ａ１）～（ａ３）のいずれかに記載のタンパク質（好ましくは（ａ１）のタンパク質）において、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であることが好ましい。
一態様において、本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質は、上記（ａ１）～（ａ３）のいずれかに記載のタンパク質（好ましくは（ａ１）のタンパク質）において、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であることが好ましい。
本発明の糖修飾タンパク質では、上記（ａ１）、（ａ２）及び（ａ３）のタンパク質において、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジン以外のリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされていてもよい。
本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質は、その製造方法や由来に特に限定されない。一態様において、本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質は、穀類由来のタンパク質において、配列番号１のアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされたタンパク質であることが好ましい。穀類としては、大麦、小麦、トウモロコシ、イネ等が挙げられる。中でも、大麦が好ましい。上記（ａ１）～（ａ３）のタンパク質は、大麦由来のタンパク質であることが好ましい。
本発明の第二の態様は、リジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であって、下記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質である。
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１１７番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ３）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
上記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質を、本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質ともいう。
本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質は、そのアミノ酸配列の、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置のアミノ酸がリジンである。本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質である。
本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質において、リジンの側鎖アミノ基に結合している糖及びその好ましい態様は、上記の第一の態様の糖修飾タンパク質と同じである。
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１１７番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ３）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
上記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質を、本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質ともいう。
本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質は、そのアミノ酸配列の、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置のアミノ酸がリジンである。本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質である。
本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質において、リジンの側鎖アミノ基に結合している糖及びその好ましい態様は、上記の第一の態様の糖修飾タンパク質と同じである。
アミノ酸配列における配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目のリジンに相当する位置を、「配列番号２の１１７番目に相当する位置」ともいう。
配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置のリジンを、上記（ｂ１）、（ｂ２）又は（ｂ３）の任意のタンパク質（ポリペプチド）において特定することは、容易である。配列番号２の１１７番目に相当する位置のリジンを、上記（ｂ１）、（ｂ２）又は（ｂ３）のタンパク質（ポリペプチド）において特定する場合、既知の配列比較プログラムを用いて上記の本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質の場合と同じ方法で特定することができる。
配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置のリジンを、上記（ｂ１）、（ｂ２）又は（ｂ３）の任意のタンパク質（ポリペプチド）において特定することは、容易である。配列番号２の１１７番目に相当する位置のリジンを、上記（ｂ１）、（ｂ２）又は（ｂ３）のタンパク質（ポリペプチド）において特定する場合、既知の配列比較プログラムを用いて上記の本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質の場合と同じ方法で特定することができる。
配列番号２に示すアミノ酸配列は、大麦由来のタンパク質ＳｅｒｐｉｎＺ７（別名：ＢＳＺ７、Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ７又はＨｏｒｖｕＺ７）のアミノ酸配列である。
上記（ｂ１）に記載のタンパク質において、配列番号２の１１７番目に相当する位置は、そのアミノ酸配列の１１７番目である。
上記（ｂ１）に記載のタンパク質において、配列番号２の１１７番目に相当する位置は、そのアミノ酸配列の１１７番目である。
上記（ｂ２）に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸の数は、好ましくは１～８個、１～７個又は１～６個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～４個、特に好ましくは１～３個、最も好ましくは１又は２個である。
一態様において、（ｂ２）のタンパク質として、下記（ｂ２１）～（ｂ２４）のいずれかに記載のタンパク質が好ましい。（ｂ２１）～（ｂ２４）に記載のタンパク質は、大麦（学名：Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）由来のＳｅｒｐｉｎＺ７である。
（ｂ２１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１７３番目がアラニンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２９２番目がトレオニンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２３）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、３０３番目がグルタミン酸であるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２４）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、３２５番目がロイシンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２１）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１７３番目がアラニンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、２９２番目がトレオニンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２３）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、３０３番目がグルタミン酸であるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２４）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、３２５番目がロイシンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
上記（ｂ３）のタンパク質において、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸配列の同一性は、好ましくは９９％以上である。
一態様において、本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質は、上記（ｂ１）に記載のタンパク質（配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質）の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であることが好ましい。この糖修飾タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、当該アミノ酸配列の１１７番目のリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質ということもできる。
（ｂ１）、（ｂ２）及び（ｂ３）のタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジン以外のリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされていてもよい。
本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質は、その製造方法や由来に特に限定されない。一態様において、本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質は、穀類由来のタンパク質において、配列番号２のアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされたタンパク質であることが好ましい。穀類としては、大麦、小麦、トウモロコシ、イネ等が挙げられる。中でも、大麦が好ましい。上記（ｂ１）～（ｂ３）のタンパク質は、大麦由来のタンパク質であることが好ましい。
以下では、本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質及び本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質を、まとめて本発明の糖修飾タンパク質ともいう。
本発明の糖修飾タンパク質の製造方法は特に制限されない。本発明の糖修飾タンパク質は、例えば、穀類又はこれを原料にして醸造したビール等から精製することができる。穀類は、好ましくは大麦であり、より好ましくは大麦麦芽である。一態様において、麦芽は、北米産麦芽を使用することが好ましい。
本発明の糖修飾タンパク質の製造方法は特に制限されない。本発明の糖修飾タンパク質は、例えば、穀類又はこれを原料にして醸造したビール等から精製することができる。穀類は、好ましくは大麦であり、より好ましくは大麦麦芽である。一態様において、麦芽は、北米産麦芽を使用することが好ましい。
ビールから糖修飾タンパク質を得る方法は特に限定されず、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。例えば、実施例に記載の方法で、ビールを陽イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーに供して、４０ｋＤａのタンパク質を含む画分を回収し、当該画分に硫酸アンモニウムを添加して塩析を行い、上澄を回収することにより、糖修飾タンパク質を含む溶液（上澄）を得ることができる。当該溶液を公知の方法で濃縮することにより、本発明の糖修飾タンパク質の精製品を得ることができる。
得られたタンパク質のリジンのアミノ基がグリケーションされていることの確認は、ＮＢＴ（Ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）法により、グリケーションされたリジンを比色定量することにより行うことができる。
得られたタンパク質のリジンのアミノ基がグリケーションされていることの確認は、ＮＢＴ（Ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）法により、グリケーションされたリジンを比色定量することにより行うことができる。
本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質において、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされていることの確認は、精製したタンパク質を公知の方法で断片化し、得られたペプチド断片をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析することによって確認することができる。
本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質において、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされていることの確認は、精製したタンパク質を公知の方法で断片化し、得られたペプチド断片をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析することによって確認することができる。
後記の実施例に示されるように、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質は、優れたコク味付与効果を有した。配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質は、優れたコク味付与効果を有した。
本発明の糖修飾タンパク質は、飲食品にコク味を付与するために有用である。本発明の糖修飾タンパク質を飲食品に含有させると、当該タンパク質の比率が高いほど、よりコク味を付与することができる。
本発明において、「コク味」とは、５基本味、すなわち、甘味、塩味、酸味、苦味及びうま味では表せない感覚であり、味の強さ（飲み応え）、味の広がり、味の厚み、味の経時変化（余韻又は持続性）等によって表される感覚である。本発明においてコク味を付与するとは、例えば、コク味を有しない飲食品に、コク味を付与すること、コク味を有する飲食品のコク味を増強することを含む。コク味の有無や程度は、官能評価によって評価することができる。
本発明の糖修飾タンパク質は、飲食品にコク味を付与するために有用である。本発明の糖修飾タンパク質を飲食品に含有させると、当該タンパク質の比率が高いほど、よりコク味を付与することができる。
本発明において、「コク味」とは、５基本味、すなわち、甘味、塩味、酸味、苦味及びうま味では表せない感覚であり、味の強さ（飲み応え）、味の広がり、味の厚み、味の経時変化（余韻又は持続性）等によって表される感覚である。本発明においてコク味を付与するとは、例えば、コク味を有しない飲食品に、コク味を付与すること、コク味を有する飲食品のコク味を増強することを含む。コク味の有無や程度は、官能評価によって評価することができる。
本発明の糖修飾タンパク質は、飲食品に含有させて使用することができる。本発明の糖修飾タンパク質の飲食品中の含有量は特に限定されず、飲食品の種類や、所望するコク味の程度などに応じて適宜設定することができる。一態様において、本発明の糖修飾タンパク質は、ビールテイストアルコール飲料、ノンアルコールビールテイスト飲料等にコク味を付与するために好適に使用される。ビールテイストアルコール飲料とは、通常の方法で醸造してビールを製造した場合に得られるビール特有の香味を有するアルコール飲料を意味する。ノンアルコールビールテイスト飲料とは、ビール様の風味をもつ炭酸飲料を意味し、アルコールを実質的に含まないノンアルコールタイプのものである。本発明の糖修飾タンパク質は、１種を単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。本発明の糖修飾タンパク質は、精製されたタンパク質であってよい。
本発明の糖修飾タンパク質は、飲食品等にコク味を付与するために使用されるコク味付与剤の有効成分として使用することができる。
本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質（糖修飾タンパク質（Ａ））、及び／又は、本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質（糖修飾タンパク質（Ｂ））を含むコク味付与剤も、本発明に包含される。
本発明のコク味付与剤は、上記（ａ１）～（ａ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質、及び／又は、上記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質を含む。
本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質（糖修飾タンパク質（Ａ））、及び／又は、本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質（糖修飾タンパク質（Ｂ））を含むコク味付与剤も、本発明に包含される。
本発明のコク味付与剤は、上記（ａ１）～（ａ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質、及び／又は、上記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質を含む。
本発明のコク味付与剤は、本発明の糖修飾タンパク質の少なくとも１種を含むものであり、通常、当該糖修飾タンパク質の少なくとも１種を有効成分として含む。一態様において、コク味付与剤は、本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質及び第二の態様の糖修飾タンパク質を含むことが好ましい。コク味付与剤は、本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質又は第二の態様の糖修飾タンパク質を含むものであってよい。本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質は、１種を単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質は、１種を単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質、第二の態様の糖修飾タンパク質、これらの好ましい態様は、上述したものと同じである。
コク味付与剤は、上記（ａ１）に記載のタンパク質の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質（糖修飾タンパク質（ａ１）ともいう）、及び／又は、上記（ｂ１）に記載のタンパク質の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質（糖修飾タンパク質（ｂ１）ともいう）を含むことが好ましく、糖修飾タンパク質（ａ１）及び糖修飾タンパク質（ｂ１）を含むことがより好ましい。
本発明のコク味付与剤は、例えば、飲食品にコク味を付与するために使用することができる。本発明のコク味付与剤は、例えば、ビールテイストアルコール飲料又はノンアルコールビールテイスト飲料にコク味を付与するために好適に使用することができる。ビールテイストアルコール飲料は、好ましくはビールである。本発明のコク味付与剤により飲食品にコク味を付与する場合、コク味付与剤を飲食品に含有させればよい。コク味付与剤を飲食品に含有させる方法は特に限定されず、予め製造に用いる原料に混合しておく方法、飲食品の製造工程において、任意の工程で添加する方法等が挙げられる。
飲食品にコク味を付与するための、本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質（糖修飾タンパク質（Ａ））、及び／又は、本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質（糖修飾タンパク質（Ｂ））の使用も本発明に包含される。
本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質（糖修飾タンパク質（Ａ））、及び／又は、本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質（糖修飾タンパク質（Ｂ））を飲食品に含有させると、当該飲食品にコク味を付与することができる。
第一の態様の糖修飾タンパク質、及び／又は、本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質を飲食品に添加する、飲食品にコク味を付与する方法も本発明に包含される。
上記使用及び方法においては、上記（ａ１）～（ａ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質、及び／又は、上記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質を使用する。
本発明の糖修飾タンパク質を飲食品に添加する方法は特に限定されず、予め製造に用いる原料に混合しておく方法、飲食品の製造工程において、任意の工程で添加する方法等が挙げられる。飲食品にコク味を付与する方法においては、上記コク味付与剤を飲食品に添加することができる。飲食品は、好ましくはビールテイストアルコール飲料又はノンアルコールビールテイスト飲料である。上記使用及び方法においては、本発明の糖修飾タンパク質の少なくとも１種を使用する。本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質は、１種を単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質は、１種を単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
一態様において、上記使用及び方法においては、本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質及び本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質を使用することが好ましい。上記使用及び方法においては、本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質又は本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質を使用してもよい。一態様において、上記使用及び方法においては、上記糖修飾タンパク質（ａ１）及び／又は糖修飾タンパク質（ｂ１）を使用することが好ましく、糖修飾タンパク質（ａ１）及び糖修飾タンパク質（ｂ１）を使用することがより好ましい。
本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質（糖修飾タンパク質（Ａ））、及び／又は、本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質（糖修飾タンパク質（Ｂ））を飲食品に含有させると、当該飲食品にコク味を付与することができる。
第一の態様の糖修飾タンパク質、及び／又は、本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質を飲食品に添加する、飲食品にコク味を付与する方法も本発明に包含される。
上記使用及び方法においては、上記（ａ１）～（ａ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質、及び／又は、上記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質を使用する。
本発明の糖修飾タンパク質を飲食品に添加する方法は特に限定されず、予め製造に用いる原料に混合しておく方法、飲食品の製造工程において、任意の工程で添加する方法等が挙げられる。飲食品にコク味を付与する方法においては、上記コク味付与剤を飲食品に添加することができる。飲食品は、好ましくはビールテイストアルコール飲料又はノンアルコールビールテイスト飲料である。上記使用及び方法においては、本発明の糖修飾タンパク質の少なくとも１種を使用する。本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質は、１種を単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質は、１種を単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
一態様において、上記使用及び方法においては、本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質及び本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質を使用することが好ましい。上記使用及び方法においては、本発明の第一の態様の糖修飾タンパク質又は本発明の第二の態様の糖修飾タンパク質を使用してもよい。一態様において、上記使用及び方法においては、上記糖修飾タンパク質（ａ１）及び／又は糖修飾タンパク質（ｂ１）を使用することが好ましく、糖修飾タンパク質（ａ１）及び糖修飾タンパク質（ｂ１）を使用することがより好ましい。
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。尚、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞
北米産麦芽を適当な粒度に粉砕し仕込み槽に入れた後温水と混ぜ合わせた。麦芽酵素に適した温度で、糖化に充分な時間保持し、麦芽の酵素の働きででんぷん質を糖分に変換させ、糖化液を製造した。その後、糖化液をろ過してホップを加え、煮沸し、熱麦汁を製造し、発酵に備えた。熱麦汁を冷却し、これにビール酵母を加えた。数日の間に酵母の働きにより、麦汁中の糖分をアルコールと炭酸ガスに分解させ若ビールを製造した。若ビールを貯酒タンクに移し、低温で数十日間貯蔵した。この間にビールを熟成させ、ビールの味と香りを調和させた。熟成終了後、ビールをろ過し瓶詰を行った。
北米産麦芽を適当な粒度に粉砕し仕込み槽に入れた後温水と混ぜ合わせた。麦芽酵素に適した温度で、糖化に充分な時間保持し、麦芽の酵素の働きででんぷん質を糖分に変換させ、糖化液を製造した。その後、糖化液をろ過してホップを加え、煮沸し、熱麦汁を製造し、発酵に備えた。熱麦汁を冷却し、これにビール酵母を加えた。数日の間に酵母の働きにより、麦汁中の糖分をアルコールと炭酸ガスに分解させ若ビールを製造した。若ビールを貯酒タンクに移し、低温で数十日間貯蔵した。この間にビールを熟成させ、ビールの味と香りを調和させた。熟成終了後、ビールをろ過し瓶詰を行った。
上記の方法で北米産麦芽から醸造したビール（以下、ビール（Ｉ）ともいう）から下記に従い糖修飾タンパク質の精製を行った。
（１）陽イオン交換樹脂による分画
陽イオン交換樹脂ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ５０ｍＬを空きカラムに入れた。
ビール（Ｉ）を樹脂に吸着させた。その後、吸着させた樹脂をカラムに移し替え、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で洗浄、次いで２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）＋０．５Ｍ－ＮａＣｌで溶出し、画分を集めた。得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価し、４０ｋＤａの糖修飾タンパク質（４０ｋＤａタンパク質）が含まれる画分を集め陽イオン交換樹脂結合画分とした。
陽イオン交換樹脂ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ５０ｍＬを空きカラムに入れた。
ビール（Ｉ）を樹脂に吸着させた。その後、吸着させた樹脂をカラムに移し替え、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で洗浄、次いで２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）＋０．５Ｍ－ＮａＣｌで溶出し、画分を集めた。得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価し、４０ｋＤａの糖修飾タンパク質（４０ｋＤａタンパク質）が含まれる画分を集め陽イオン交換樹脂結合画分とした。
（２）限外濾過（バッファー交換）
水洗浄した限外ろ過ユニット（Ｍｅｒｃｋ社製 Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ ３０Ｋ）に（１）で得られた陽イオン交換樹脂結合画分を添加し、遠心（３５００ｒｐｍ、１０分間、室温）し限外ろ過し濃縮液を得た。
水洗浄した限外ろ過ユニット（Ｍｅｒｃｋ社製 Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ ３０Ｋ）に（１）で得られた陽イオン交換樹脂結合画分を添加し、遠心（３５００ｒｐｍ、１０分間、室温）し限外ろ過し濃縮液を得た。
（３）硫安分画
２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）＋２Ｍ硫酸アンモニウムをビーカーに入れ、これに（２）で得た濃縮液を滴下、攪拌した。次に懸濁液を遠心（２３３０ｇ、１０分間、室温）した。上清を別容器に集めた。集めた溶液は限外ろ過ユニットを用いて濃縮した。濃縮液に２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を加え遠心（２３３０ｇ、１０分間、室温）し、濃縮を行い、４０ｋＤａタンパク質の精製品（Ｂｒａｄｆｏｒｄ定量（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）換算）、２０．４ｍｇ／ｍＬ、２．２１ｍＬ）を得た。得られた４０ｋＤａタンパク質の精製品の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した。
２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）＋２Ｍ硫酸アンモニウムをビーカーに入れ、これに（２）で得た濃縮液を滴下、攪拌した。次に懸濁液を遠心（２３３０ｇ、１０分間、室温）した。上清を別容器に集めた。集めた溶液は限外ろ過ユニットを用いて濃縮した。濃縮液に２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を加え遠心（２３３０ｇ、１０分間、室温）し、濃縮を行い、４０ｋＤａタンパク質の精製品（Ｂｒａｄｆｏｒｄ定量（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）換算）、２０．４ｍｇ／ｍＬ、２．２１ｍＬ）を得た。得られた４０ｋＤａタンパク質の精製品の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した。
４０ｋＤａタンパク質およびその修飾解析
４０ｋＤａタンパク質の解析を下記に従い行った。
（１）ゲル片の調製
精製した４０ｋＤａタンパク質溶液（濃度１ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５））１０μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動しＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）で染色後、４０ｋＤａタンパク質のゲルを切り出した。
４０ｋＤａタンパク質の解析を下記に従い行った。
（１）ゲル片の調製
精製した４０ｋＤａタンパク質溶液（濃度１ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５））１０μＬをＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動しＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）で染色後、４０ｋＤａタンパク質のゲルを切り出した。
（２）タンパク質の酵素消化
切り出したゲル片を細切し、ジチオスレイトールによる還元（５６℃、１時間）、ヨードアセトアミドによるカルバミドメチル化（遮光下，室温，４５分間）を行った。次いで０．０１％ＰｒｏｔｅａｓｅＭａｘ含有１０ｎｇ／μＬキモトリプシン溶液（５ｍＭ塩化カルシウム，５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液）１５μＬ、５ｍＭ塩化カルシウム、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液１５μＬを添加し一晩インキュベートした後、酵素消化液を回収した。回収した溶液を減圧乾固し、０．１％ギ酸溶液に再溶解した。
これをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に使用した。
切り出したゲル片を細切し、ジチオスレイトールによる還元（５６℃、１時間）、ヨードアセトアミドによるカルバミドメチル化（遮光下，室温，４５分間）を行った。次いで０．０１％ＰｒｏｔｅａｓｅＭａｘ含有１０ｎｇ／μＬキモトリプシン溶液（５ｍＭ塩化カルシウム，５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液）１５μＬ、５ｍＭ塩化カルシウム、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液１５μＬを添加し一晩インキュベートした後、酵素消化液を回収した。回収した溶液を減圧乾固し、０．１％ギ酸溶液に再溶解した。
これをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に使用した。
（３）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる測定
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの測定は下記の条件で行った。
使用装置：ダイレクトフローｎａｎｏＬＣシステムＥａｓｙ－ｎＬＣ １０００ＴＭ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
トラップカラム：Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
分析カラム：ＮＡＮＯ ＨＰＬＣ ＣＡＰＩＬＬＡＲＹ ＣＯＬＵＭＮ（日京テクノス（株））
液体クロマトグラフ質量分析計：Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
移動相：Ａ液：０．１％ギ酸／水、Ｂ液：０．１％ギ酸／アセトニトリル
流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ
グラジエント：０－４０％Ｂ／０－３０ｍｉｎ、４０－６０％Ｂ／３０－３５ｍｉｎ、６０－９０％Ｂ／３５－３７ｍｉｎ、９０％Ｂ／３７－４５ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
イオン化モード：ＥＳＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
測定範囲：ＭＳ１（ｍ／ｚ ３５０－１７５０）
Ｄａｔａ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｃａｎモード
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの測定は下記の条件で行った。
使用装置：ダイレクトフローｎａｎｏＬＣシステムＥａｓｙ－ｎＬＣ １０００ＴＭ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
トラップカラム：Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
分析カラム：ＮＡＮＯ ＨＰＬＣ ＣＡＰＩＬＬＡＲＹ ＣＯＬＵＭＮ（日京テクノス（株））
液体クロマトグラフ質量分析計：Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
移動相：Ａ液：０．１％ギ酸／水、Ｂ液：０．１％ギ酸／アセトニトリル
流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ
グラジエント：０－４０％Ｂ／０－３０ｍｉｎ、４０－６０％Ｂ／３０－３５ｍｉｎ、６０－９０％Ｂ／３５－３７ｍｉｎ、９０％Ｂ／３７－４５ｍｉｎ
注入量：１０μＬ
イオン化モード：ＥＳＩ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
測定範囲：ＭＳ１（ｍ／ｚ ３５０－１７５０）
Ｄａｔａ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｃａｎモード
（４）タンパク質および修飾解析
タンパク質同定および修飾検索は下記の条件で行った。
検索ソフト：Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．２．０．３８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）
生物種：大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
検索条件：消化酵素：Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ
修飾（Ｓｔａｔｉｃ）：Ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ （Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）
修飾（Ｄｙｎａｍｉｃ）：Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）， Ｈｅｘ（Ｋ， Ｒ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎ－ｔｅｒｍ）、 Ｈｅｘ（２）（Ｋ， Ｒ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎ－ｔｅｒｍ）、Ｈｅｘ（３）（Ｋ， Ｒ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎ－ｔｅｒｍ）、Ａｃｅｔｙｌ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎ－ｔｅｒｍ）
プリカーサーイオン質量誤差範囲：Ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ、±１０ｐｐｍ
プロダクトイオン質量誤差範囲：±０．０２Ｄａ
最大ミスクリベージ数：５
コンフィデンスレベル（Ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒ）：Ｈｉｇｈ（確からしさ３段階のうち最も確率が高いレベル）
データベース：ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ
タンパク質同定および修飾検索は下記の条件で行った。
検索ソフト：Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．２．０．３８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）
生物種：大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
検索条件：消化酵素：Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ
修飾（Ｓｔａｔｉｃ）：Ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ （Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）
修飾（Ｄｙｎａｍｉｃ）：Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）， Ｈｅｘ（Ｋ， Ｒ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎ－ｔｅｒｍ）、 Ｈｅｘ（２）（Ｋ， Ｒ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎ－ｔｅｒｍ）、Ｈｅｘ（３）（Ｋ， Ｒ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎ－ｔｅｒｍ）、Ａｃｅｔｙｌ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｎ－ｔｅｒｍ）
プリカーサーイオン質量誤差範囲：Ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ、±１０ｐｐｍ
プロダクトイオン質量誤差範囲：±０．０２Ｄａ
最大ミスクリベージ数：５
コンフィデンスレベル（Ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒ）：Ｈｉｇｈ（確からしさ３段階のうち最も確率が高いレベル）
データベース：ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ
その結果、４０ｋＤａの糖修飾タンパク質は、糖修飾された大麦由来Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ４（配列カバー率：７７．２％）及び糖修飾された大麦由来Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ７（配列カバー率：７２．８％）であることがわかった。大麦由来Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ４のアミノ酸配列を配列番号１に、大麦由来Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ７のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる大麦由来Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ４の修飾解析の結果を表１～８に示す。
表１～４に、ビールから精製した大麦由来Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ４のアミノ酸配列（配列番号１に示すアミノ酸配列）の１４２～１７４番目のアミノ酸からなるペプチド断片
（ＥＡＶＧＱＶＮＳＷＶＥＱＶＴＴＧＬＩＫＱＩＬＰＰＧＳＶＤＮＴＴＫＬ（配列番号３））（Ｚ４（１４２－１７４）ペプチドとも記載する）をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した結果を示す。
表１には、ＬＣ－ＭＳによるペプチド断片のプリカーサーイオンのｍ／ｚ値を示す。表２～４に、表１に示すＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるペプチド断片のフラグメントイオンのｍ／ｚ値を示す。
表２は、表１に示すＭＨ＋３５２１．８８５Ｄａのペプチドのフラグメントイオンの分析結果である。ＭＨ＋３５２１．８８５Ｄａのペプチドのフラグメントイオンは、糖修飾がないＺ４（１４２－１７４）ペプチドのフラグメントイオンである。表３は、表１に示すＭＨ＋３６８３．９３５Ｄａのペプチドのフラグメントイオンの分析結果である。表４は、表１に示すＭＨ＋３８４５．９８０Ｄａのペプチドのフラグメントイオンの分析結果である。
表１～４に、ビールから精製した大麦由来Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ４のアミノ酸配列（配列番号１に示すアミノ酸配列）の１４２～１７４番目のアミノ酸からなるペプチド断片
（ＥＡＶＧＱＶＮＳＷＶＥＱＶＴＴＧＬＩＫＱＩＬＰＰＧＳＶＤＮＴＴＫＬ（配列番号３））（Ｚ４（１４２－１７４）ペプチドとも記載する）をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した結果を示す。
表１には、ＬＣ－ＭＳによるペプチド断片のプリカーサーイオンのｍ／ｚ値を示す。表２～４に、表１に示すＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるペプチド断片のフラグメントイオンのｍ／ｚ値を示す。
表２は、表１に示すＭＨ＋３５２１．８８５Ｄａのペプチドのフラグメントイオンの分析結果である。ＭＨ＋３５２１．８８５Ｄａのペプチドのフラグメントイオンは、糖修飾がないＺ４（１４２－１７４）ペプチドのフラグメントイオンである。表３は、表１に示すＭＨ＋３６８３．９３５Ｄａのペプチドのフラグメントイオンの分析結果である。表４は、表１に示すＭＨ＋３８４５．９８０Ｄａのペプチドのフラグメントイオンの分析結果である。
表５～８に、ビールから精製した大麦由来のＳｅｒｐｉｎ Ｚ４のアミノ酸配列の１８２～２００番目のアミノ酸からなるペプチド断片（ＦＫＧＡＷＤＱＫＦＤＥＳＮＴＫＣＤＳＦ（配列番号４））（Ｚ４（１８２－２００）ペプチドとも記載する）をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した結果を示す。表５には、ＬＣ－ＭＳによるペプチド断片のプリカーサーイオンのｍ／ｚ値を示す。表６～８には、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるペプチド断片のフラグメントイオンのｍ／ｚ値を示す。表６は、表５に示すＭＨ＋２３１０．０１２Ｄａのペプチドのフラグメントイオンの分析結果である。ＭＨ＋２３１０．０１２Ｄａのペプチドのフラグメントイオンは、糖修飾がないＺ４（１８２－２００）ペプチドのフラグメントイオンである。表７は、表５に示すＭＨ＋２４７２．０６４Ｄａのペプチドのフラグメントイオンの分析結果である。表８は、表５に示すＭＨ＋２６３４．１１８Ｄａのペプチドのフラグメントイオンの分析結果である。
表２～４及び６～８中、Ｎｏ．は、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸の番号である。太枠で囲った太字が、検出したフラグメントイオンである。表１に示すペプチド中の修飾について、Ｋ１９は、Ｚ４（１４２－１７４）ペプチドにおける１９番目のリジンの修飾が検出されたことを示す。表５に示すペプチド中の修飾について、Ｋ８は、Ｚ４（１８２－２００）ペプチドにおける８番目のリジンの修飾が検出されたことを示す。
表１～８に示す結果から、糖修飾されたＳｅｒｐｉｎ Ｚ４には、１６０番目のリジン（Ｋ１６０）、１８９番目のリジン（Ｋ１８９）の１以上のリジンのアミノ基がヘキソースで修飾された（グリケーション）構造をもつものが含まれることがわかった。Ｚ４（１４２－１７４）ペプチドには、Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ４の１６０番目のリジン（Ｋ１６０）が含まれる。
表２のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋の欄の検出されたＮｏ．１６０～１７３のｍ／ｚ値と、表３のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋の欄のＮｏ．１６０～１７３のｍ／ｚ値とから、ＭＨ＋３６８３．９３５ＤａのペプチドのフラグメントイオンのＮｏ．１６０のリジン（Ｋ１６０）には、ヘキソースに相当する１６２Ｄａが付加していることが分かった。このことから、ＭＨ＋３６８３．９３５Ｄａのペプチドには、Ｋ１６０にヘキソース１個が付加した修飾配列構造を有するペプチドが含まれることが分かった。表２のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋の欄のＮｏ．１６０～１７３のｍ／ｚ値と、表４のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋の欄のＮｏ．１６０～１７３のｍ／ｚ値とから、ＭＨ＋３８４５．９８０ＤａのペプチドのフラグメントイオンのＮｏ．１６０のリジン（Ｋ１６０）には、ジヘキソースに相当する３２４Ｄａが付加していることが分かった。よって、ＭＨ＋３８４５．９８０Ｄａのペプチドのフラグメントイオンには、Ｋ１６０にジヘキソースが付加した修飾配列構造を持つペプチドが含まれることがわかった。
表２のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋の欄の検出されたＮｏ．１６０～１７３のｍ／ｚ値と、表３のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋の欄のＮｏ．１６０～１７３のｍ／ｚ値とから、ＭＨ＋３６８３．９３５ＤａのペプチドのフラグメントイオンのＮｏ．１６０のリジン（Ｋ１６０）には、ヘキソースに相当する１６２Ｄａが付加していることが分かった。このことから、ＭＨ＋３６８３．９３５Ｄａのペプチドには、Ｋ１６０にヘキソース１個が付加した修飾配列構造を有するペプチドが含まれることが分かった。表２のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋の欄のＮｏ．１６０～１７３のｍ／ｚ値と、表４のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋の欄のＮｏ．１６０～１７３のｍ／ｚ値とから、ＭＨ＋３８４５．９８０ＤａのペプチドのフラグメントイオンのＮｏ．１６０のリジン（Ｋ１６０）には、ジヘキソースに相当する３２４Ｄａが付加していることが分かった。よって、ＭＨ＋３８４５．９８０Ｄａのペプチドのフラグメントイオンには、Ｋ１６０にジヘキソースが付加した修飾配列構造を持つペプチドが含まれることがわかった。
表６～８は、Ｚ４（１８２－２００）ペプチドの分析結果である。Ｚ４（１８２－２００）ペプチドには、Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ４の１８９番目のリジン（Ｋ１８９）が含まれる。
表６のｂ＋及びｙ＋の欄のＮｏ．１８９～１９９のｍ／ｚ値と、表７のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋の欄のＮｏ．１８９～１９９のｍ／ｚ値とから、ＭＨ＋２４７２．０６４ＤａのペプチドのフラグメントイオンのＮｏ．１８９のリジン（Ｋ１８９）には、ヘキソースに相当する１６２Ｄａが付加していることが分かった。よって、ＭＨ＋２４７２．０６４Ｄａのペプチドのフラグメントイオンには、Ｋ１８９にヘキソース１個が付加した修飾配列構造を有するペプチドが含まれることが分かった。
表６のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋の欄のＮｏ．１８９～１９９のｍ／ｚ値と、表８のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋の欄のＮｏ．１８９～１９９のｍ／ｚ値とから、ＭＨ＋２６３４．１１８ＤａのペプチドのフラグメントイオンのＮｏ．１８９のリジン（Ｋ１８９）には、ジヘキソースに相当する３２４Ｄａが付加していることが分かった。このことから、ＭＨ＋２６３４．１１８Ｄａのペプチドのフラグメントイオンには、Ｋ１８９にヘキソース２個が付加した修飾配列構造を持つペプチドが含まれることがわかった。配列番号１に示すアミノ酸配列の１６０番目のリジン（Ｋ１６０）、１８９番目のリジン（Ｋ１８９）の１以上のリジンのアミノ基がグリケーションされたＳｅｒｐｉｎ Ｚ４は、これまで報告されていないものである。
糖修飾Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ４のリジンに付加しているヘキソースは、グルコース又はキシロースであると推定された。ジヘキソースは、マルトース又はイソマルトースであると推定された。
表６のｂ＋及びｙ＋の欄のＮｏ．１８９～１９９のｍ／ｚ値と、表７のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋の欄のＮｏ．１８９～１９９のｍ／ｚ値とから、ＭＨ＋２４７２．０６４ＤａのペプチドのフラグメントイオンのＮｏ．１８９のリジン（Ｋ１８９）には、ヘキソースに相当する１６２Ｄａが付加していることが分かった。よって、ＭＨ＋２４７２．０６４Ｄａのペプチドのフラグメントイオンには、Ｋ１８９にヘキソース１個が付加した修飾配列構造を有するペプチドが含まれることが分かった。
表６のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋の欄のＮｏ．１８９～１９９のｍ／ｚ値と、表８のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋の欄のＮｏ．１８９～１９９のｍ／ｚ値とから、ＭＨ＋２６３４．１１８ＤａのペプチドのフラグメントイオンのＮｏ．１８９のリジン（Ｋ１８９）には、ジヘキソースに相当する３２４Ｄａが付加していることが分かった。このことから、ＭＨ＋２６３４．１１８Ｄａのペプチドのフラグメントイオンには、Ｋ１８９にヘキソース２個が付加した修飾配列構造を持つペプチドが含まれることがわかった。配列番号１に示すアミノ酸配列の１６０番目のリジン（Ｋ１６０）、１８９番目のリジン（Ｋ１８９）の１以上のリジンのアミノ基がグリケーションされたＳｅｒｐｉｎ Ｚ４は、これまで報告されていないものである。
糖修飾Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ４のリジンに付加しているヘキソースは、グルコース又はキシロースであると推定された。ジヘキソースは、マルトース又はイソマルトースであると推定された。
＜実施例２＞
異なるビール３種より糖修飾タンパクを精製し、精製糖修飾タンパク質をビールに添加して官能評価を行った。大麦由来Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ４における１６０番目及び／又は１８９番目のリジンのグリケーションと、コク味付与効果との関連性を調べた。
異なるビール３種より糖修飾タンパクを精製し、精製糖修飾タンパク質をビールに添加して官能評価を行った。大麦由来Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ４における１６０番目及び／又は１８９番目のリジンのグリケーションと、コク味付与効果との関連性を調べた。
（ビール３種から糖修飾タンパク４０ｋＤａの精製）
実施例１のビール（Ｉ）からのタンパク精製と同様にして、ビール３種（ビールＢ、Ｃ、Ｄ）より４０ｋＤａの糖修飾タンパクを精製し、糖修飾タンパク質を含む溶液を得た。
実施例１のビール（Ｉ）からのタンパク精製と同様にして、ビール３種（ビールＢ、Ｃ、Ｄ）より４０ｋＤａの糖修飾タンパクを精製し、糖修飾タンパク質を含む溶液を得た。
（ビール３種より精製した糖修飾タンパク質溶液のタンパク質濃度と糖修飾タンパク質の分析）
下記の方法により、ビール３種（Ｂ、Ｃ又はＤ）より精製した糖修飾タンパクを含む溶液のタンパク質濃度及びグリケーションしたリジンの濃度を求めた。
下記の方法により、ビール３種（Ｂ、Ｃ又はＤ）より精製した糖修飾タンパクを含む溶液のタンパク質濃度及びグリケーションしたリジンの濃度を求めた。
（グリケーションされたリジンの濃度）
側鎖アミノ基がグリケーションされたリジンの濃度は、Ｆｒｕｃｔｏｓａｍｉｎｅ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ａｂｃａｍ社製品、ａｂ２２８５５８）を用いてＮＢＴ（Ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）法にて比色定量した。
サンプル及びブランクにつき試験数はｎ＝２として、平均値を採用した。
各ビールから精製した糖修飾タンパクを含む溶液中のグリケーションされたリジンのアミノ基の量（ｎｍｏｌ／ｍＬ）を求めた。また、各ビールから精製した糖修飾タンパクを含む溶液中のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（ＢＳＡ換算）で測定した。
糖修飾タンパクを含む溶液中のグリケーションされたリジンのアミノ基の量（ｎｍｏｌ／ｍＬ）を、タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）で除して、精製糖修飾タンパク質の重量あたりのグリケーションされたリジンのアミノ基の濃度（ｎｍｏｌ／ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ）を求めた。
側鎖アミノ基がグリケーションされたリジンの濃度は、Ｆｒｕｃｔｏｓａｍｉｎｅ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ａｂｃａｍ社製品、ａｂ２２８５５８）を用いてＮＢＴ（Ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）法にて比色定量した。
サンプル及びブランクにつき試験数はｎ＝２として、平均値を採用した。
各ビールから精製した糖修飾タンパクを含む溶液中のグリケーションされたリジンのアミノ基の量（ｎｍｏｌ／ｍＬ）を求めた。また、各ビールから精製した糖修飾タンパクを含む溶液中のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（ＢＳＡ換算）で測定した。
糖修飾タンパクを含む溶液中のグリケーションされたリジンのアミノ基の量（ｎｍｏｌ／ｍＬ）を、タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）で除して、精製糖修飾タンパク質の重量あたりのグリケーションされたリジンのアミノ基の濃度（ｎｍｏｌ／ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ）を求めた。
（精製糖修飾タンパク質の分析結果）
ビール３種（Ｂ、Ｃ、Ｄ）より精製した糖修飾タンパクを含む溶液中のグリケーションされたリジンのアミノ基の濃度およびタンパク質濃度（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（ＢＳＡ換算）で測定）の分析結果を表９に示した。なお表９に示すグリケーションされたリジンのアミノ基の濃度は、精製糖修飾タンパク質の重量あたりのグリケーションされたリジンのアミノ基の濃度である。
ビール３種（Ｂ、Ｃ、Ｄ）より精製した糖修飾タンパクを含む溶液中のグリケーションされたリジンのアミノ基の濃度およびタンパク質濃度（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（ＢＳＡ換算）で測定）の分析結果を表９に示した。なお表９に示すグリケーションされたリジンのアミノ基の濃度は、精製糖修飾タンパク質の重量あたりのグリケーションされたリジンのアミノ基の濃度である。
（ビール３種より精製した糖修飾タンパク質のビールへのコクの付与評価）
ビール３種（Ｂ、Ｃ、Ｄ）から精製した糖修飾タンパク質を含む溶液を市販のビールＡに添加して官能評価を行った。この際に、官能評価サンプル中のグリケーションされたリジンの濃度が同じになるように、ビールＢ、Ｃ又はＤから精製した糖修飾タンパク質溶液をビールＡに添加し、サンプルＢ、サンプルＣ及びサンプルＤを得た。サンプルＢは、ビールＢから精製した糖修飾タンパク質溶液を添加したサンプルであり、サンプルＣは、ビールＣから精製した糖修飾タンパク質溶液を添加したサンプルであり、サンプルＤは、ビールＤから精製した糖修飾タンパク質溶液を添加したサンプルである。市販ビールＡの総プリン体濃度は１０．３９ｍｇ／１００ｍＬであった。総プリン体濃度は、日本食品分析センターで分解法にて実施した。
ビール３種（Ｂ、Ｃ、Ｄ）から精製した糖修飾タンパク質を含む溶液を市販のビールＡに添加して官能評価を行った。この際に、官能評価サンプル中のグリケーションされたリジンの濃度が同じになるように、ビールＢ、Ｃ又はＤから精製した糖修飾タンパク質溶液をビールＡに添加し、サンプルＢ、サンプルＣ及びサンプルＤを得た。サンプルＢは、ビールＢから精製した糖修飾タンパク質溶液を添加したサンプルであり、サンプルＣは、ビールＣから精製した糖修飾タンパク質溶液を添加したサンプルであり、サンプルＤは、ビールＤから精製した糖修飾タンパク質溶液を添加したサンプルである。市販ビールＡの総プリン体濃度は１０．３９ｍｇ／１００ｍＬであった。総プリン体濃度は、日本食品分析センターで分解法にて実施した。
（官能評価）
市販のビールＡ（コントロール（添加なし））並びにサンプルＢ、Ｃ及びＤの官能評価を行った。官能評価は、糖修飾タンパク質の添加をしていない市販ビールＡのコク味を基準点の１．５点とし、専門パネル４名により０．１点刻みでスコア化した。そのスコア値を平均化した。
コク味は以下の基準とした。
０点：全く感じられない
１点：やや感じられる
２点：明確に感じる
３点：非常に強く感じる
市販のビールＡ（コントロール（添加なし））並びにサンプルＢ、Ｃ及びＤの官能評価を行った。官能評価は、糖修飾タンパク質の添加をしていない市販ビールＡのコク味を基準点の１．５点とし、専門パネル４名により０．１点刻みでスコア化した。そのスコア値を平均化した。
コク味は以下の基準とした。
０点：全く感じられない
１点：やや感じられる
２点：明確に感じる
３点：非常に強く感じる
スコアの平均点を表１０に示す。表１０のコントロール（添加なし）は、糖修飾タンパク質を添加していないビールＡである。その結果、表１０に示すようにコク味の強度は、サンプルＣが一番強く、次いでサンプルＤ、サンプルＢであった。
（ビール３種より精製した糖修飾タンパク質の側鎖アミノ基に糖が結合している１６０番目および１８９番目のリジンの量の解析）
ビール３種（Ｂ、Ｃ、Ｄ）より精製した糖修飾タンパク質の修飾解析を実施例１と同様の方法で行った。Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ４（配列番号１）のアミノ酸配列の１４２～１７４番目のアミノ酸からなり、糖修飾がされていないペプチド断片（ＥＡＶＧＱＶＮＳＷＶＥＱＶＴＴＧＬＩＫＱＩＬＰＰＧＳＶＤＮＴＴＫＬ（配列番号３）、未修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチド）のＬＣ－ＭＳイオンの面積値および側鎖アミノ基に糖が付加している１６０番目のリジン（Ｋ１６０）を含む当該ペプチド断片（糖修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチド）のＬＣ－ＭＳイオン面積値を算出した。さらにこれらの面積値をもとに、ビール３種から精製した糖修飾タンパクについて、（糖修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチドのイオン面積値合算）／（未修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチドのイオン面積値）を求め、未修飾のＺ４（１４２－１７４）ペプチドに対する、Ｋ１６０の側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチドの割合の比較を行った（図１）。（未修飾体、修飾体のペプチドによってＬＣ－ＭＳのイオン化効率が同じでない可能性も考慮し、ビール３種の各サンプルを横並びで面積比を比較した。）
ビール３種（Ｂ、Ｃ、Ｄ）より精製した糖修飾タンパク質の修飾解析を実施例１と同様の方法で行った。Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ４（配列番号１）のアミノ酸配列の１４２～１７４番目のアミノ酸からなり、糖修飾がされていないペプチド断片（ＥＡＶＧＱＶＮＳＷＶＥＱＶＴＴＧＬＩＫＱＩＬＰＰＧＳＶＤＮＴＴＫＬ（配列番号３）、未修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチド）のＬＣ－ＭＳイオンの面積値および側鎖アミノ基に糖が付加している１６０番目のリジン（Ｋ１６０）を含む当該ペプチド断片（糖修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチド）のＬＣ－ＭＳイオン面積値を算出した。さらにこれらの面積値をもとに、ビール３種から精製した糖修飾タンパクについて、（糖修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチドのイオン面積値合算）／（未修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチドのイオン面積値）を求め、未修飾のＺ４（１４２－１７４）ペプチドに対する、Ｋ１６０の側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチドの割合の比較を行った（図１）。（未修飾体、修飾体のペプチドによってＬＣ－ＭＳのイオン化効率が同じでない可能性も考慮し、ビール３種の各サンプルを横並びで面積比を比較した。）
図１は、異なるビール３種（Ｂ、Ｃ、Ｄ）より精製した糖修飾タンパク質中の、Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ４（配列番号１）のアミノ酸配列の１４２～１７４番目のアミノ酸からなり、糖修飾がされていないペプチド断片（未修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチド）のＬＣ－ＭＳイオンの面積値（未修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチドのイオン面積値）に対する、当該ペプチド中のＫ１６０に１個のヘキソース又は２個のヘキソース（ジヘキソース）が結合している糖修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチドのＬＣ－ＭＳイオンの合計面積値の比（（糖修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチドのイオン面積値合算）／（未修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチドのイオン面積値））を示すグラフである。図１の縦軸の面積比は、上記の面積値の比（糖修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチドのイオン面積値合算）／（未修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチドのイオン面積値）である。
「糖修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチドのイオン面積値合算」は、１６０番目のリジンの側鎖に単糖（Ｈｅｘ）が結合しているＺ４（１４２－１７４）ペプチドのイオン面積及び１６０番目のリジンの側鎖に二糖（ｄｉＨｅｘ）が結合しているＺ４（１４２－１７４）ペプチドのイオン面積の合計である。「未修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチドのイオン面積値」は、１６０番目のリジンの側鎖に糖が結合していない（Ｋ１６０の側鎖が未修飾）Ｚ４（１４２－１７４）ペプチドのイオン面積である。
さらにＳｅｒｐｉｎ Ｚ４（配列番号１）のアミノ酸配列の１８２～２００番目のアミノ酸からなり、糖修飾がされていないペプチド断片（ＦＫＧＡＷＤＱＫＦＤＥＳＮＴＫｃ（Ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ＤＳＦ、未修飾Ｚ４（１８２－２００）ペプチド）のＬＣ－ＭＳイオンおよび側鎖アミノ基に糖が付加している１８９番目のリジン（Ｋ１８９）を含む当該ペプチド断片（糖修飾Ｚ４（１８２－２００）ペプチド）のＬＣ－ＭＳイオン面積値を算出した。さらにこられの面積値をもとに、ビール３種から精製した糖修飾タンパクについて、（糖修飾Ｚ４（１８２－２００）ペプチドのイオン面積値合算）／（未修飾Ｚ４（１８２－２００）ペプチドのイオン面積値）を求め、未修飾のＺ４（１８２－２００）ペプチドに対するＫ１８９の側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾Ｚ４（１８２－２００）ペプチドの割合の比較を行った（図２）。（未修飾体、修飾体のペプチドによってＬＣ－ＭＳのイオン化効率が同じでない可能性も考慮し、ビール３種の各サンプルを横並びで面積比を比較した。）
図２は、異なるビール３種（Ｂ、Ｃ、Ｄ）より精製した糖修飾タンパク質中の、Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ４（配列番号１）のアミノ酸配列の１８２－２００番目のアミノ酸からなり、糖修飾がされていないペプチド断片（未修飾Ｚ４（１８２－２００）ペプチド）のＬＣ－ＭＳイオンの面積値（未修飾Ｚ４（１８２－２００）ペプチドのイオン面積値）に対する、当該ペプチド中の１８９番目のリジン（Ｋ１８９）に１又は２個のヘキソースが結合している糖修飾Ｚ４（１８２－２００）ペプチドのＬＣ－ＭＳイオンの合計面積値の比（（糖修飾Ｚ４（１８２－２００）ペプチドのイオン面積値合算）／（未修飾Ｚ４（１８２－２００）ペプチドのイオン面積値））を示すグラフである。図２の縦軸の面積比は、上記の面積値の比（糖修飾Ｚ４（１８２－２００）ペプチドのイオン面積値合算）／（未修飾Ｚ４（１８２－２００）ペプチドのイオン面積値）である。
「糖修飾Ｚ４（１８２－２００）ペプチドのイオン面積値合算」は、１８９番目のリジンの側鎖に単糖（Ｈｅｘ）が結合しているＺ４（１８２－２００）ペプチドのイオン面積及び当該リジンの側鎖に二糖（ｄｉＨｅｘ）が結合しているＺ４（１８２－２００）ペプチドのイオン面積の合計である。「未修飾Ｚ４（１８２－２００）ペプチドのイオン面積値」は、１８９番目のリジンの側鎖に糖が結合していない（Ｋ１８９の側鎖が未修飾）であるＺ４（１８２－２００）ペプチドのイオン面積である。
その結果、側鎖アミノ基に糖が結合している１６０番目のリジン（Ｋ１６０）を含むペプチド断片（糖修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチド）について未修飾ペプチド断片（未修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチド）に対する修飾されているペプチド断片（糖修飾Ｚ４（１４２－１７４）ペプチド）の比は、ビールＣが一番多く、次いでビールＤ、ビールＢであった。１８９番目のリジン（Ｋ１８９）を含むペプチド断片についても、未修飾ペプチド断片（未修飾Ｚ４（１８２－２００）ペプチド）に対する修飾しているペプチド断片（糖修飾Ｚ４（１８２－２００）ペプチド）の比は、ビールＣが一番多く、次いでビールＤ、ビールＢであった。これらの結果は、官能評価でサンプルＣが、最もコク味が高かったことと一致した。１６０番目のリジン及び１８９番目のリジンの側鎖アミノ基に糖が結合した糖修飾タンパク質の含有量とコクに関連性があることがわかった。
図１及び図２に示す通り、配列番号１のアミノ酸配列のタンパク質の１６０番目及び／又は１８９番目のリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされた糖修飾タンパク質の比率が高いと、よりコクが向上することが明らかとなった。当該１６０番目及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンのアミノ基がグリケーションされているタンパク質は、優れたコク味付与効果を有することが明らかとなった。
＜実施例３＞
糖修飾Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ７の詳細な修飾解析には、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるターゲットモニタリングを実施した。
実施例１と同じ方法で、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のためのサンプルを調製した。Ｄａｔａ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｃａｎモードをターゲットイオンモニタリングに変更した以外は、実施例１と同様の方法でＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定を行った。ターゲットイオンはｍ／ｚ５２４．７８８、ｍ／ｚ６０５．８１４、ｍ／ｚ６８６．８４０、ｍ／ｚ７６７．８６８を用いた。
糖修飾Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ７の詳細な修飾解析には、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるターゲットモニタリングを実施した。
実施例１と同じ方法で、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のためのサンプルを調製した。Ｄａｔａ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｃａｎモードをターゲットイオンモニタリングに変更した以外は、実施例１と同様の方法でＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定を行った。ターゲットイオンはｍ／ｚ５２４．７８８、ｍ／ｚ６０５．８１４、ｍ／ｚ６８６．８４０、ｍ／ｚ７６７．８６８を用いた。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる大麦由来Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ７の修飾解析の結果を表１１～１５に示す。表１１～１５は、ビールから精製した大麦由来Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ７のアミノ酸配列（配列番号２に示すアミノ酸配列）の１１５～１２３番目のアミノ酸からなるペプチド断片（ＳＬＫＰＳＦＱＥＬ（配列番号５））（Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドとも記載する）をＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した結果である。
表１１には、ＬＣ－ＭＳによるペプチド断片のプリカーサーイオンのｍ／ｚ値を示す。表１２～１５に、表１１に示すＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるペプチド断片のフラグメントイオンのｍ／ｚ値を示す。
表１２は、表１１に示すＭＨ＋１０４８．５６６Ｄａのペプチドのフラグメントイオンの分析結果である。ＭＨ＋１０４８．５６６Ｄａのペプチドのフラグメントイオンは、糖修飾がないＺ７（１１５－１２３）ペプチドのフラグメントイオンである。表１３は、表１１に示すＭＨ＋１２１０．６１９Ｄａのペプチドのフラグメントイオンの分析結果である。表１４は、表１１に示すＭＨ＋１３７２．６７０Ｄａのペプチドのフラグメントイオンの分析結果である。表１５は、表１１に示すＭＨ＋１５３４．７２９Ｄａのペプチドのフラグメントイオンの分析結果である。
表１１には、ＬＣ－ＭＳによるペプチド断片のプリカーサーイオンのｍ／ｚ値を示す。表１２～１５に、表１１に示すＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるペプチド断片のフラグメントイオンのｍ／ｚ値を示す。
表１２は、表１１に示すＭＨ＋１０４８．５６６Ｄａのペプチドのフラグメントイオンの分析結果である。ＭＨ＋１０４８．５６６Ｄａのペプチドのフラグメントイオンは、糖修飾がないＺ７（１１５－１２３）ペプチドのフラグメントイオンである。表１３は、表１１に示すＭＨ＋１２１０．６１９Ｄａのペプチドのフラグメントイオンの分析結果である。表１４は、表１１に示すＭＨ＋１３７２．６７０Ｄａのペプチドのフラグメントイオンの分析結果である。表１５は、表１１に示すＭＨ＋１５３４．７２９Ｄａのペプチドのフラグメントイオンの分析結果である。
表１２～１４中、Ｎｏ．は、配列番号２に示すアミノ酸配列におけるアミノ酸の番号である。太枠で囲った太字が、検出したフラグメントイオンである。表１１に示すペプチド中の修飾について、Ｋ３は、Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドにおける３番目のリジンの修飾が検出されたことを示す。
表１１～１５に示す結果から、糖修飾されたＳｅｒｐｉｎ Ｚ７には、１１７番目のリジン（Ｋ１１７）のアミノ基がヘキソースで修飾された（グリケーション）構造をもつものが含まれることがわかった。Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドには、Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ７の１１７番目のリジン（Ｋ１１７）が含まれる。
表１２及び表１３のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋欄の検出されたｍ／ｚ値から、ＭＨ＋１２１０．６１９ＤａのペプチドのフラグメントイオンのＮｏ．１１７のリジン（Ｋ１１７）には、ヘキソースに相当する１６２Ｄａが付加していることが分かった。このことから、ＭＨ＋１２１０．６１９Ｄａのペプチドのフラグメントイオンには、Ｋ１１７にヘキソース１個が付加した修飾配列構造を有するペプチドが含まれることが分かった。表１２及び表１３のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋欄の検出されたｍ／ｚ値から、ＭＨ＋１３７２．６７０ＤａのペプチドのフラグメントイオンのＮｏ．１１７のリジン（Ｋ１１７）には、ジヘキソースに相当する３２４Ｄａが付加していることが分かった。よって、ＭＨ＋１３７２．６７０Ｄａのペプチドのフラグメントイオンには、Ｋ１１７にジヘキソースが付加した修飾配列構造を持つペプチドが含まれることがわかった。表１２及び表１３のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋欄の検出されたｍ／ｚ値から、ＭＨ＋１５３４．７２９ＤａのペプチドのフラグメントイオンのＮｏ．１１７のリジン（Ｋ１１７）には、トリヘキソースに相当する４８６Ｄａが付加していることが分かった。よって、ＭＨ＋１５３４．７２９Ｄａのペプチドのフラグメントイオンには、Ｋ１１７にトリヘキソースが付加した修飾配列構造を持つペプチドが含まれることがわかった。
配列番号２に示すアミノ酸配列の１１７番目のリジン（Ｋ１１７）のアミノ基がグリケーションされたＳｅｒｐｉｎ Ｚ７は、これまで報告されていないものである。
糖修飾Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ７のリジンに付加しているヘキソースは、グルコース又はキシロースであると推定された。ジヘキソースは、マルトース又はイソマルトースであると推定された。トリヘキソースは、マルトトリオース又はイソマルトトリオースであると推定された。
表１２及び表１３のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋欄の検出されたｍ／ｚ値から、ＭＨ＋１２１０．６１９ＤａのペプチドのフラグメントイオンのＮｏ．１１７のリジン（Ｋ１１７）には、ヘキソースに相当する１６２Ｄａが付加していることが分かった。このことから、ＭＨ＋１２１０．６１９Ｄａのペプチドのフラグメントイオンには、Ｋ１１７にヘキソース１個が付加した修飾配列構造を有するペプチドが含まれることが分かった。表１２及び表１３のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋欄の検出されたｍ／ｚ値から、ＭＨ＋１３７２．６７０ＤａのペプチドのフラグメントイオンのＮｏ．１１７のリジン（Ｋ１１７）には、ジヘキソースに相当する３２４Ｄａが付加していることが分かった。よって、ＭＨ＋１３７２．６７０Ｄａのペプチドのフラグメントイオンには、Ｋ１１７にジヘキソースが付加した修飾配列構造を持つペプチドが含まれることがわかった。表１２及び表１３のｂ＋、ｂ２＋及びｙ＋欄の検出されたｍ／ｚ値から、ＭＨ＋１５３４．７２９ＤａのペプチドのフラグメントイオンのＮｏ．１１７のリジン（Ｋ１１７）には、トリヘキソースに相当する４８６Ｄａが付加していることが分かった。よって、ＭＨ＋１５３４．７２９Ｄａのペプチドのフラグメントイオンには、Ｋ１１７にトリヘキソースが付加した修飾配列構造を持つペプチドが含まれることがわかった。
配列番号２に示すアミノ酸配列の１１７番目のリジン（Ｋ１１７）のアミノ基がグリケーションされたＳｅｒｐｉｎ Ｚ７は、これまで報告されていないものである。
糖修飾Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ７のリジンに付加しているヘキソースは、グルコース又はキシロースであると推定された。ジヘキソースは、マルトース又はイソマルトースであると推定された。トリヘキソースは、マルトトリオース又はイソマルトトリオースであると推定された。
＜実施例４＞
（ビール３種から糖修飾タンパク４０ｋＤａの精製）
実施例１のビール（Ｉ）からのタンパク精製と同様にして、ビール３種（ビールＥ、Ｆ、Ｇ）より４０ｋＤａの糖修飾タンパクを精製し、糖修飾タンパク質を含む溶液を得た。
（ビール３種から糖修飾タンパク４０ｋＤａの精製）
実施例１のビール（Ｉ）からのタンパク精製と同様にして、ビール３種（ビールＥ、Ｆ、Ｇ）より４０ｋＤａの糖修飾タンパクを精製し、糖修飾タンパク質を含む溶液を得た。
（ビール３種より精製した糖修飾タンパク質溶液のタンパク質濃度と糖修飾タンパク質の分析）
実施例２と同じ方法で、ビール３種（Ｅ、Ｆ又はＧ）より精製した糖修飾タンパクを含む溶液のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）及び精製糖修飾タンパク質の重量あたりのグリケーションされたリジンのアミノ基の濃度（ｎｍｏｌ／ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ）を求めた。
実施例２と同じ方法で、ビール３種（Ｅ、Ｆ又はＧ）より精製した糖修飾タンパクを含む溶液のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）及び精製糖修飾タンパク質の重量あたりのグリケーションされたリジンのアミノ基の濃度（ｎｍｏｌ／ｍｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ）を求めた。
（精製糖修飾タンパク質の分析結果）
ビール３種（Ｅ、Ｆ又はＧ）より精製した糖修飾タンパクを含む溶液中のグリケーションされたリジンのアミノ基の濃度およびタンパク質濃度（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（ＢＳＡ換算）で測定）の分析結果を表１６に示した。なお表１６に示すグリケーションされたリジンのアミノ基の濃度は、精製糖修飾タンパク質の重量あたりのグリケーションされたリジンのアミノ基の濃度である。
ビール３種（Ｅ、Ｆ又はＧ）より精製した糖修飾タンパクを含む溶液中のグリケーションされたリジンのアミノ基の濃度およびタンパク質濃度（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（ＢＳＡ換算）で測定）の分析結果を表１６に示した。なお表１６に示すグリケーションされたリジンのアミノ基の濃度は、精製糖修飾タンパク質の重量あたりのグリケーションされたリジンのアミノ基の濃度である。
（ビール３種より精製した糖修飾タンパク質のビールへのコクの付与評価）
ビール３種（Ｅ、Ｆ又はＧ）から精製した糖修飾タンパク質を含む溶液を市販のビールＡに添加して官能評価を行った。この際に、官能評価サンプル中のグリケーションされたリジンの濃度が同じになるように、ビールＥ、Ｆ又はＧから精製した糖修飾タンパク質溶液をビールＡに添加し、サンプルＥ、サンプルＦ及びサンプルＧを得た。サンプルＥは、ビールＥから精製した糖修飾タンパク質溶液を添加したサンプルであり、サンプルＦは、ビールＦから精製した糖修飾タンパク質溶液を添加したサンプルであり、サンプルＧは、ビールＧから精製した糖修飾タンパク質溶液を添加したサンプルである。
ビール３種（Ｅ、Ｆ又はＧ）から精製した糖修飾タンパク質を含む溶液を市販のビールＡに添加して官能評価を行った。この際に、官能評価サンプル中のグリケーションされたリジンの濃度が同じになるように、ビールＥ、Ｆ又はＧから精製した糖修飾タンパク質溶液をビールＡに添加し、サンプルＥ、サンプルＦ及びサンプルＧを得た。サンプルＥは、ビールＥから精製した糖修飾タンパク質溶液を添加したサンプルであり、サンプルＦは、ビールＦから精製した糖修飾タンパク質溶液を添加したサンプルであり、サンプルＧは、ビールＧから精製した糖修飾タンパク質溶液を添加したサンプルである。
（官能評価）
０．０５点刻みでスコア付けをした以外は、実施例２の官能評価と同じ方法で、専門パネル４名により、市販のビールＡ（コントロール（添加なし））並びにサンプルＥ、Ｆ及びＧの官能評価を行い、コク味を評価した。
スコアの平均点を表１７に示す。表１７のコントロール（添加なし）は、糖修飾タンパク質を添加していないビールＡである。その結果、表１７に示すようにコク味の強度は、サンプルＦが一番強く、次いでサンプルＧ、サンプルＥであった。
０．０５点刻みでスコア付けをした以外は、実施例２の官能評価と同じ方法で、専門パネル４名により、市販のビールＡ（コントロール（添加なし））並びにサンプルＥ、Ｆ及びＧの官能評価を行い、コク味を評価した。
スコアの平均点を表１７に示す。表１７のコントロール（添加なし）は、糖修飾タンパク質を添加していないビールＡである。その結果、表１７に示すようにコク味の強度は、サンプルＦが一番強く、次いでサンプルＧ、サンプルＥであった。
（側鎖アミノ基に糖が結合しているリジンの量の解析）
ビール３種（Ｅ、Ｆ、Ｇ）より精製した糖修飾タンパク質の修飾解析を実施例１と同様の方法で行った。Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ７（配列番号２）のアミノ酸配列の１１５～１２３番目のアミノ酸からなり、糖修飾がされていないペプチド断片（ＳＬＫＰＳＦＱＥＬ（配列番号５）、未修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチド）のＬＣ－ＭＳイオンの面積値および側鎖アミノ基に糖が付加している１１７番目のリジン（Ｋ１１７）を含む当該ペプチド断片（糖修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチド）のＬＣ－ＭＳイオン面積値を算出した。さらにこられの面積値をもとに、ビール３種から精製した糖修飾タンパクについて、未修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積値に対する、糖修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積値合算の比（糖修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積値合算）／（未修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積値）を求め、未修飾のＺ７（１１５－１２３）ペプチドに対する、Ｋ１１７の側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドの割合の比較を行った。（未修飾体、修飾体のペプチドによってＬＣ－ＭＳのイオン化効率が同じでない可能性も考慮し、ビール３種の各サンプルを横並びで面積比を比較した。）
表１８に、上記の未修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積値に対する、糖修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積値合算の比（糖修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのＬＣ－ＭＳイオンの合計面積値の比）を示す。
「糖修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積値合算」は、１１７番目のリジンの側鎖に単糖（Ｈｅｘ）が結合しているＺ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積、当該リジンの側鎖に二糖（ｄｉＨｅｘ）が結合しているＺ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積及び当該リジンの側鎖に三糖（ｔｒｉＨｅｘ）が結合しているＺ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積の合計である。「未修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積値」は、１１７番目のリジンの側鎖に糖が結合していない（Ｋ１１７の側鎖が未修飾）Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積である。
ビール３種（Ｅ、Ｆ、Ｇ）より精製した糖修飾タンパク質の修飾解析を実施例１と同様の方法で行った。Ｓｅｒｐｉｎ Ｚ７（配列番号２）のアミノ酸配列の１１５～１２３番目のアミノ酸からなり、糖修飾がされていないペプチド断片（ＳＬＫＰＳＦＱＥＬ（配列番号５）、未修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチド）のＬＣ－ＭＳイオンの面積値および側鎖アミノ基に糖が付加している１１７番目のリジン（Ｋ１１７）を含む当該ペプチド断片（糖修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチド）のＬＣ－ＭＳイオン面積値を算出した。さらにこられの面積値をもとに、ビール３種から精製した糖修飾タンパクについて、未修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積値に対する、糖修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積値合算の比（糖修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積値合算）／（未修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積値）を求め、未修飾のＺ７（１１５－１２３）ペプチドに対する、Ｋ１１７の側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドの割合の比較を行った。（未修飾体、修飾体のペプチドによってＬＣ－ＭＳのイオン化効率が同じでない可能性も考慮し、ビール３種の各サンプルを横並びで面積比を比較した。）
表１８に、上記の未修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積値に対する、糖修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積値合算の比（糖修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのＬＣ－ＭＳイオンの合計面積値の比）を示す。
「糖修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積値合算」は、１１７番目のリジンの側鎖に単糖（Ｈｅｘ）が結合しているＺ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積、当該リジンの側鎖に二糖（ｄｉＨｅｘ）が結合しているＺ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積及び当該リジンの側鎖に三糖（ｔｒｉＨｅｘ）が結合しているＺ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積の合計である。「未修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積値」は、１１７番目のリジンの側鎖に糖が結合していない（Ｋ１１７の側鎖が未修飾）Ｚ７（１１５－１２３）ペプチドのイオン面積である。
未修飾ペプチド断片（未修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチド）に対する糖修飾されているペプチド断片（糖修飾Ｚ７（１１５－１２３）ペプチド）の比は、ビールＦが一番多く、次いでビールＧ、ビールＥであった。この結果は、官能評価でサンプルＦが、最もコク味が高かったことと一致した。ビールＥ、Ｆ又はＧから精製した糖修飾タンパク質溶液のいずれにも、配列番号１のアミノ酸配列のタンパク質の１６０番目及び／又は１８９番目のリジンの側鎖アミノ基がグリケーションされた糖修飾タンパク質も含まれていた。
本発明の糖修飾タンパク質を用いると、飲食品にコク味を付与することができる。
Claims (10)
- リジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であって、下記（ａ１）～（ａ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基に、グルコース、マルトース又はイソマルトースが結合している糖修飾タンパク質。
（ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１６０番目及び／又は１８９番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ３）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置及び／又は１８９番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質 - 前記（ａ１）～（ａ３）に記載のタンパク質が、大麦由来のタンパク質である請求項１に記載の糖修飾タンパク質。
- リジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であって、下記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基に、グルコース、マルトース、イソマルトース、マルトトリオース又はイソマルトトリオースが結合している糖修飾タンパク質。
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１１７番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ３）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質 - 前記（ｂ１）～（ｂ３）に記載のタンパク質が、大麦由来のタンパク質である請求項３に記載の糖修飾タンパク質。
- 下記糖修飾タンパク質（Ａ）及び／又は下記糖修飾タンパク質（Ｂ）を含む、コク味付与剤。
糖修飾タンパク質（Ａ）：リジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であって、下記（ａ１）～（ａ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基に、グルコース、マルトース又はイソマルトースが結合している糖修飾タンパク質
（ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１６０番目及び／又は１８９番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ３）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置及び／又は１８９番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
糖修飾タンパク質（Ｂ）：リジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であって、下記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基に、グルコース、マルトース、イソマルトース、マルトトリオース又はイソマルトトリオースが結合している糖修飾タンパク質
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１１７番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ３）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質 - ビールテイストアルコール飲料又はノンアルコールビールテイスト飲料にコク味を付与するために使用される、請求項５に記載のコク味付与剤。
- 飲食品にコク味を付与するための、下記糖修飾タンパク質（Ａ）及び／又は下記糖修飾タンパク質（Ｂ）の使用。
糖修飾タンパク質（Ａ）：リジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であって、下記（ａ１）～（ａ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基に、グルコース、マルトース又はイソマルトースが結合している糖修飾タンパク質
（ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１６０番目及び／又は１８９番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ３）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置及び／又は１８９番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
糖修飾タンパク質（Ｂ）：リジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であって、下記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基に、グルコース、マルトース、イソマルトース、マルトトリオース又はイソマルトトリオースが結合している糖修飾タンパク質
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１１７番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ３）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質 - 飲食品がビールテイストアルコール飲料又はノンアルコールビールテイスト飲料である請求項７に記載の使用。
- 下記糖修飾タンパク質（Ａ）及び／又は下記糖修飾タンパク質（Ｂ）を飲食品に添加する、飲食品にコク味を付与する方法。
糖修飾タンパク質（Ａ）：リジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であって、下記（ａ１）～（ａ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置にあるリジン及び／又は１８９番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基に、グルコース、マルトース又はイソマルトースが結合している糖修飾タンパク質
（ａ１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１６０番目及び／又は１８９番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ａ３）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１６０番目に相当する位置及び／又は１８９番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質
糖修飾タンパク質（Ｂ）：リジンの側鎖アミノ基がグリケーションされている糖修飾タンパク質であって、下記（ｂ１）～（ｂ３）のいずれかに記載のタンパク質の配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるリジンの側鎖アミノ基に、グルコース、マルトース、イソマルトース、マルトトリオース又はイソマルトトリオースが結合している糖修飾タンパク質
（ｂ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１１７番目のリジン以外の領域中に１～９個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ３）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して９８％以上の同一性を有し、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１１７番目に相当する位置にあるアミノ酸がリジンであるアミノ酸配列からなるタンパク質 - 飲食品がビールテイストアルコール飲料又はノンアルコールビールテイスト飲料である請求項９に記載の方法。
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