JP7621656B2 - 樹状細胞分化誘導培地、及び樹状細胞集団の製造方法 - Google Patents
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Description
特許法第３０条第２項適用 令和１（２０１９）年１０月２５日 ウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｈｉｎｇｉ．ｊｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ｋｏｂｅｔｓｕ／ｉｇａｋｕｂｕ／２０１９＿ｉｇａｋｕｂｕ．ｈｔｍｌ ｈｔｔｐｓ：／／ｓｈｉｎｇｉ．ｊｓｔ．ｇｏ．ｊｐ／ｋｏｂｅｔｓｕ／ｉｇａｋｕｂｕ／２０１９＿ｉｇａｋｕｂｕ／ｔｅｃｈ＿ｐｒｏｐｅｒｔｙ．ｈｔｍｌ＃ｐｂＢｌｏｃｋ１０１８９７）を通じて発表
本発明は、樹状細胞分化誘導培地に関する。本発明は、樹状細胞分化誘導培地を用いた樹状細胞集団の製造方法に関する。さらに、本発明は、樹状細胞分化誘導培地中で骨髄細胞試料又は末梢血試料を培養して樹状細胞集団を得る工程、および上記工程で得られた樹状細胞集団を樹状細胞ワクチンに調製する工程を含む、樹状細胞ワクチンの製造方法に関する。本発明は、ＣＤ１１ｃ陽性であり且つＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陽性である細胞（ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉ細胞）を細胞集団中３０％以上の割合で含む樹状細胞集団であって、上記ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉ細胞においてＣ／ＥＢＰα、ＰＰＡＲγおよびＴＧＦ‐β関連遺伝子群のうち少なくとも１つの遺伝子の発現が増加している、樹状細胞集団に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月１２日出願の日本特願特願２０１９－２０４４５４の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月１２日出願の日本特願特願２０１９－２０４４５４の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ；ＤＣ）は、抗原未感作ナイーブＴ細胞を生体内で活性化できる専門的抗原提示細胞である。ＤＣは、微生物感染や環境からの刺激に対応してＴ細胞の活性化／不活性化、胸腺ネガティブセレクションや制御性Ｔ細胞などによる免疫寛容、Ｔｈ１／Ｔｈ２の分化免疫応答、細胞性免疫／液性免疫応答など、獲得免疫応答の方向性や応答量を規定し、がん、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー、移植などの病態形成に関与するので、ＤＣ制御による疾患治療が期待されている（非特許文献１）。
ＤＣ制御による疾患治療としては、生体内ＤＣの免疫増強機能や培養樹状細胞を用いたがん免疫療法がある。培養樹状細胞を用いたがん免疫療法の臨床試験では、例えば、がん抗原ペプチド感作ＤＣを直接リンパ節に投与して約２５％の奏効率を認めた例が報告されている（非特許文献２）。しかし、抗腫瘍効果に関しては、ほとんど効果が認められなかった例も報告されている。これは、体外培養ＤＣを用いる場合、ＤＣの最適な培養調製法や使用法がまだ十分に分かっていないことが問題と指摘されている（非特許文献１）。
ＤＣの培養法について、マウス骨髄中のＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ－ＣＤ４－ＣＤ８α－Ｂ２２０－細胞分画を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）で培養したところ、ＤＣ、マクロファージ及び顆粒球が分化してくること、さらにこのＤＣはＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ８α－であることが報告されている（非特許文献３）。マウス骨髄細胞をＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）の存在下で培養すると、マクロファージと共に樹状細胞が分化することも知られている（非特許文献４）。なお、樹状細胞の前駆細胞に関しては、ＤＣ分化に重要なサイトカイン受容体（Ｆｌｔ３）の発現を指標にしてマウス骨髄からＤＣサブセット、すなわち、形質細胞様樹状細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ；ｐＤＣ）と通常型樹状細胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＤＣ；ｃＤＣ）のみに分化する共通ＤＣ前駆細胞（ｃｏｍｍｏｎ ＤＣ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ；ＣＤＰ）が同定されている（非特許文献５、６）。
非特許文献１ 河上裕、樹状細胞制御によるがん免疫療法、実験医学、Vol.26 No.20(増刊) 2008年 205-211頁
非特許文献２ Nestle F, et a1 :Nat Med, 4 : 328-332.l998
非特許文献３ Inaba K et al :JEM, 176: 1693-1732, 1992
非特許文献４ Brasel K et al :Blood, 96: 3029-3039, 2000
非特許文献５ Onai N, et al : Nat Immunol, 8: 1207-1216, 2007
非特許文献６ Onai N, et al : Immunity, 38: 943-957, 2013
非特許文献１から６の全記載は、参照により本明細書に援用される。
非特許文献２ Nestle F, et a1 :Nat Med, 4 : 328-332.l998
非特許文献３ Inaba K et al :JEM, 176: 1693-1732, 1992
非特許文献４ Brasel K et al :Blood, 96: 3029-3039, 2000
非特許文献５ Onai N, et al : Nat Immunol, 8: 1207-1216, 2007
非特許文献６ Onai N, et al : Immunity, 38: 943-957, 2013
非特許文献１から６の全記載は、参照により本明細書に援用される。
体外培養ＤＣを用いた免疫治療方法の開発が期待されているが、十分な細胞数の樹状細胞を安定的に調製することが困難であるという問題があり、とりわけ樹状細胞の分化誘導効率が低いという課題があった。
本発明は、樹状細胞を効率よく分化誘導するための培地、及び上記培地を用いた樹状細胞の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］ 下記ａ）、ｂ）及びｃ）を含む樹状細胞分化誘導培地。
ａ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤
ｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種。
［２］ 上記ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤が（Ｒ）－（＋）－ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩一水和物（Ｙ２７６３２）である、［１］に記載の樹状細胞分化誘導培地。
［３］ 上記ｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種が、Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシプロポキシ］－３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－イオドフェニル）アミノ］－ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ－（２－｛［４－（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ｝－６－（３，５－ジメトキシフェニル）ピリド（２，３－ｄ）ピリミジン－７－ｙｌ）－Ｎ’－（１，１－ジメチルエチル）尿素（ＰＤ１７３０７４）及び２－（２－アミノ－３－メトキシフェニル）－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン（ＰＤ９８０５９）からなる群から選択される少なくとも１種である、［１］又は［２］に記載の樹状細胞分化誘導培地。
［４］ 上記ｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種が、Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシプロポキシ］－３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－イオドフェニル）アミノ］－ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）である、［１］又は［２］に記載の樹状細胞分化誘導培地。
［５］ 上記ｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種が、Ｎ－（２－｛［４－（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ｝－６－（３，５－ジメトキシフェニル）ピリド（２，３－ｄ）ピリミジン－７－ｙｌ）－Ｎ’－（１，１－ジメチルエチル）尿素（ＰＤ１７３０７４）及び２－（２－アミノ－３－メトキシフェニル）－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン（ＰＤ９８０５９）である、［１］又は［２］に記載の樹状細胞分化誘導培地。
［６］ 上記ｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種が、Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシプロポキシ］－３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－イオドフェニル）アミノ］－ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ－（２－｛［４－（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ｝－６－（３，５－ジメトキシフェニル）ピリド（２，３－ｄ）ピリミジン－７－ｙｌ）－Ｎ’－（１，１－ジメチルエチル）尿素（ＰＤ１７３０７４）及び２－（２－アミノ－３－メトキシフェニル）－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン（ＰＤ９８０５９）である、［１］又は［２］に記載の樹状細胞分化誘導培地。
［７］ ［１］から［６］の何れか一に記載の培地中で骨髄細胞試料又は末梢血試料を培養して樹状細胞集団を得る工程を含む、樹状細胞集団の製造方法。
［８］ 上記樹状細胞集団における、ＣＤ１１ｃ陽性であり、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陽性である細胞の割合が３０％以上である、［７］に記載の製造方法。
［９］ ［１］から［６］の何れか一に記載の培地を含む、キット。
［１０］ ［１］から［６］の何れか一に記載の培地中で骨髄細胞試料又は末梢血試料を培養して樹状細胞集団を得る工程、および
上記工程で得られた樹状細胞集団を樹状細胞ワクチンに調製する工程を含む、
樹状細胞ワクチンの製造方法。
［１１］ ＣＤ１１ｃ陽性であり且つＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陽性である細胞（ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉ細胞）を細胞集団中３０％以上の割合で含む樹状細胞集団であって、上記ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉ細胞においてＣ／ＥＢＰα、ＰＰＡＲγおよびＴＧＦ‐β関連遺伝子群のうち少なくとも１つの遺伝子の発現が増加している、樹状細胞集団。
［１２］ ［１１］に記載の樹状細胞集団、および医薬として許容される添加物を含む、医薬組成物。
［１３］ 対象の疾患を治療する方法であって、
［１］から［６］の何れか一に記載の培地中で、上記対象から採取された骨髄細胞試料又は末梢血試料を培養して樹状細胞集団を得る工程、
上記工程で得られた樹状細胞集団を樹状細胞ワクチンに調製する工程、および
樹状細胞ワクチンを上記対象に投与する工程を含む、方法。
［１］ 下記ａ）、ｂ）及びｃ）を含む樹状細胞分化誘導培地。
ａ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤
ｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種。
［２］ 上記ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤が（Ｒ）－（＋）－ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩一水和物（Ｙ２７６３２）である、［１］に記載の樹状細胞分化誘導培地。
［３］ 上記ｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種が、Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシプロポキシ］－３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－イオドフェニル）アミノ］－ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ－（２－｛［４－（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ｝－６－（３，５－ジメトキシフェニル）ピリド（２，３－ｄ）ピリミジン－７－ｙｌ）－Ｎ’－（１，１－ジメチルエチル）尿素（ＰＤ１７３０７４）及び２－（２－アミノ－３－メトキシフェニル）－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン（ＰＤ９８０５９）からなる群から選択される少なくとも１種である、［１］又は［２］に記載の樹状細胞分化誘導培地。
［４］ 上記ｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種が、Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシプロポキシ］－３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－イオドフェニル）アミノ］－ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）である、［１］又は［２］に記載の樹状細胞分化誘導培地。
［５］ 上記ｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種が、Ｎ－（２－｛［４－（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ｝－６－（３，５－ジメトキシフェニル）ピリド（２，３－ｄ）ピリミジン－７－ｙｌ）－Ｎ’－（１，１－ジメチルエチル）尿素（ＰＤ１７３０７４）及び２－（２－アミノ－３－メトキシフェニル）－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン（ＰＤ９８０５９）である、［１］又は［２］に記載の樹状細胞分化誘導培地。
［６］ 上記ｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種が、Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシプロポキシ］－３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－イオドフェニル）アミノ］－ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ－（２－｛［４－（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ｝－６－（３，５－ジメトキシフェニル）ピリド（２，３－ｄ）ピリミジン－７－ｙｌ）－Ｎ’－（１，１－ジメチルエチル）尿素（ＰＤ１７３０７４）及び２－（２－アミノ－３－メトキシフェニル）－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン（ＰＤ９８０５９）である、［１］又は［２］に記載の樹状細胞分化誘導培地。
［７］ ［１］から［６］の何れか一に記載の培地中で骨髄細胞試料又は末梢血試料を培養して樹状細胞集団を得る工程を含む、樹状細胞集団の製造方法。
［８］ 上記樹状細胞集団における、ＣＤ１１ｃ陽性であり、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陽性である細胞の割合が３０％以上である、［７］に記載の製造方法。
［９］ ［１］から［６］の何れか一に記載の培地を含む、キット。
［１０］ ［１］から［６］の何れか一に記載の培地中で骨髄細胞試料又は末梢血試料を培養して樹状細胞集団を得る工程、および
上記工程で得られた樹状細胞集団を樹状細胞ワクチンに調製する工程を含む、
樹状細胞ワクチンの製造方法。
［１１］ ＣＤ１１ｃ陽性であり且つＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陽性である細胞（ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉ細胞）を細胞集団中３０％以上の割合で含む樹状細胞集団であって、上記ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉ細胞においてＣ／ＥＢＰα、ＰＰＡＲγおよびＴＧＦ‐β関連遺伝子群のうち少なくとも１つの遺伝子の発現が増加している、樹状細胞集団。
［１２］ ［１１］に記載の樹状細胞集団、および医薬として許容される添加物を含む、医薬組成物。
［１３］ 対象の疾患を治療する方法であって、
［１］から［６］の何れか一に記載の培地中で、上記対象から採取された骨髄細胞試料又は末梢血試料を培養して樹状細胞集団を得る工程、
上記工程で得られた樹状細胞集団を樹状細胞ワクチンに調製する工程、および
樹状細胞ワクチンを上記対象に投与する工程を含む、方法。
以下に記載する本発明の説明は、代表的な実施態様や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施態様に限定されるものではない。なお、本明細書において「～」を用いて表される数値範囲は「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
以下は本明細書で用いる略号である。
ＡＰＣ（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）：抗原提示細胞
ＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ）：分化抗原群
ＤＣ（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）：樹状細胞
ＧＭ－ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）：顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）：主要組織適合遺伝子複合体
ＩＬ－４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４）：インターロイキン４
ＩＬ－１２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２）：インターロイキン１２
ＨＬＡ－ＤＲ（ＨμＭａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ－ＤＲ ｉｓｏｔｙｐｅ）：ヒト白血球型抗原のＤＲアイソタイプ
ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ＭｅｄｉμＭ）：ダルベッコ改変イーグル培地
ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＭｅｄｉμＭ）：イスコフ改変ダルベッコ培地
ＲＰＭＩ－１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉμＭ－１６４０）：ロズウェルパーク記念研究所培地－１６４０
ＰＢＳ （Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｔｓ）：リン酸緩衝生理食塩水
ＡＰＣ（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）：抗原提示細胞
ＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ）：分化抗原群
ＤＣ（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）：樹状細胞
ＧＭ－ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）：顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）：主要組織適合遺伝子複合体
ＩＬ－４（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４）：インターロイキン４
ＩＬ－１２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２）：インターロイキン１２
ＨＬＡ－ＤＲ（ＨμＭａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ－ＤＲ ｉｓｏｔｙｐｅ）：ヒト白血球型抗原のＤＲアイソタイプ
ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ＭｅｄｉμＭ）：ダルベッコ改変イーグル培地
ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＭｅｄｉμＭ）：イスコフ改変ダルベッコ培地
ＲＰＭＩ－１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｍｅｄｉμＭ－１６４０）：ロズウェルパーク記念研究所培地－１６４０
ＰＢＳ （Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｔｓ）：リン酸緩衝生理食塩水
ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）：ジメチルスルホキシド
ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ）：Ｒｈｏ結合コイルドコイル形成キナーゼ
ＦＧＦＲ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）：線維芽細胞増殖因子受容体
ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）：分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ
ＥＲＫ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ）：細胞外シグナル調節キナーゼ
ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ）：Ｒｈｏ結合コイルドコイル形成キナーゼ
ＦＧＦＲ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）：線維芽細胞増殖因子受容体
ＭＡＰＫ（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）：分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ
ＥＲＫ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ）：細胞外シグナル調節キナーゼ
本明細書において、細胞表面マーカーの記載について「／」は「及び、且つ」を意味する。具体的には、「ＣＤ１１ｃ陽性／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陽性／ＣＤ８０陽性／ＣＣＲ７陽性」は「ＣＤ１１ｃ陽性であり、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陽性であり、ＣＤ８０陽性であり、且つＣＣＲ７陽性である」の意味である。
本明細書において、細胞表面マーカーが陽性であることは＋を用いて、陰性であることは－を用いて記載する場合がある。例えば、ＣＤ１１ｃ陽性は、ＣＤ１１ｃ＋と記載し、ＣＤ１１ｃ陰性は、ＣＤ１１ｃ－と記載する場合がある。陽性は、高発現性（ｈｉｇｈ）と低発現性（ｌｏｗ）とを含む。フローサイトメトリー法により得られるチャートに基づき、陽性、陰性、高発現性、低発現性を判断することができる。
目的のマーカーの発現が陽性であるか陰性であるかの判断には、アイソタイプコントロール（Ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）抗体を用いて判断することができる。アイソタイプコントロール抗体で染色した細胞表面マーカーの蛍光強度を１０３に設定し、１０３よりも高度に発現している場合を陽性（＋）と判定し、１０３と同等か低い場合を陰性（－）と判断した。また蛍光強度が１０４以上を高発現（ｈｉｇｈ）と定義した。
本発明において樹状細胞は、樹状突起を有し（図５）、抗原を提示してＴ細胞を活性化する能力を有する細胞である。本発明の一実施態様では、樹状細胞はマウス樹状細胞であり、ＣＤ１１ｃ陽性及び主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）ｃｌａｓｓ ＩＩ陽性である。本発明の一実施態様では、樹状細胞はヒト樹状細胞であり、ＨＬＡ－ＤＲ陽性／ＣＤ１１ｃ陽性である。
ＣＤ１１ｃは、細胞接着分子であり、単球、マクロファージ、顆粒球、ミエロイド系樹状細胞に発現することが知られている。ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ分子は、マクロファージや樹状細胞、Ｂ細胞などの抗原提示細胞に発現することが知られている。
ＨＬＡ－ＤＲは、ヒトＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ抗原であり、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、活性化Ｔ細胞に発現することが知られている。
ＨＬＡ－ＤＲは、ヒトＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ抗原であり、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、活性化Ｔ細胞に発現することが知られている。
（培地）
本発明の樹状細胞分化誘導培地は、下記ａ）、ｂ）及びｃ）を含む。
ａ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤
ｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種。
本発明の樹状細胞分化誘導培地は、下記ａ）、ｂ）及びｃ）を含む。
ａ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤
ｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種。
従来の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を含む培地を用いて、骨髄細胞試料を培養すると、樹状細胞以外のマクロファージ様細胞などを多く含む細胞集団が得られていた。非特許文献３及び４に記載の方法では、樹状細胞の割合を増加させるために、培養中に非付着性細胞の除去が行われているが、培養時間と多くの材料が必要であるという問題があった。
しかしながら、本発明の樹状細胞分化誘導培地を用いて、骨髄細胞試料又は末梢血試料を培養することにより、向上した効率で樹状細胞を分化誘導させることができる。更には、本発明の樹状細胞分化誘導培地を用いて製造した樹状細胞集団は、コントロール培地を用いて製造した樹状細胞集団と比較して、ＬＰＳ刺激によるインターロイキン－１２産生量が高い。
本発明の樹状細胞分化誘導培地は、ａ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を含む。ＧＭ－ＣＳＦはサイトカインの１種である。ＧＭ－ＣＳＦは、ヒトＧＭ－ＣＳＦ、マウスＧＭ－ＣＳＦ、リコンビナントヒトＧＭ－ＣＳＦ、リコンビナントマウスＧＭ－ＣＳＦ等を用いることができる。本発明の培地中のＧＭ－ＣＳＦの濃度は、ＧＭ－ＣＳＦの種類などに応じて適宜設定することができるが、例えば１～１００ｎｇ／ｍＬの範囲で用いることができ、好ましくは、５～２５ｎｇ／ｍＬの範囲で用いることができる。
本発明の樹状細胞分化誘導培地は、ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤を含む。ＲＯＣＫ阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、Ｙ２７６３２（（Ｒ）－（＋）－ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩一水和物；ＣＡＳ登録番号：３３１７５２－４７－７）、ファスジル又はＨＡ１０７１（５－（１，４－ジアゼパン－１－イルスルホニル）イソキノリン塩酸塩；ＣＡＳ登録番号：１０５６２８－０７－７）、及びＧＳＫ４２９２８６Ａ（Ｎ－（６－フルオロ－１Ｈ－インダゾール－５－イル）－２－メチル－６－オキソ－４－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－１，４，５，６－テトラヒドロピリジン－３－カルボキサミド；ＣＡＳ登録番号：８６４０８２－４７－３）を挙げることができ、Ｙ２７６３２が好ましい。培地におけるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、ＲＯＣＫ阻害剤の種類などに応じて適宜設定することができる。例えば、Ｙ２７６３２の場合には、好ましくは２０μＭ～２００μＭの範囲であり、より好ましくは２０μＭ～１００μＭの範囲である。
本発明の樹状細胞分化誘導培地は、ｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤（ＭＥＫ阻害剤ともいう）からなる群から選択される少なくとも１種を含む。ＦＧＦＲ阻害剤としては、ＰＤ１７３０７４（Ｎ－（２－｛［４－（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ｝－６－（３，５－ジメトキシフェニル）ピリド（２，３－ｄ）ピリミジン－７－ｙｌ）－Ｎ’－（１，１－ジメチルエチル）尿素；ＣＡＳ登録番号：２１９５８０－１１－７）、ＳＵ５４０２（３－（４－メチル－２－（（２－オキソインドリン－３－イリデン）メチル）－１Ｈ－ピロール－３－イル）プロパン酸；ＣＡＳ登録番号：２１５５４３－９２－３）、及びＤａｎｕｓｅｒｔｉｂ（ＰＨＡ－７３９３５８） （（Ｒ）－Ｎ－（５－（２－メトキシ－２－フェニルアセチル）－１，４，５，６－テトラヒドロピロロ［３，４－ｃ］ピラゾール－３－イル）－４－（４－メチルピペラジン－１－イル）ベンズアミド；ＣＡＳ登録番号：８２７３１８－９７－８）を挙げることができ、ＰＤ１７３０７４が好ましい。培地におけるＦＧＦＲ阻害剤の濃度は、ＦＧＦＲ阻害剤の種類などに応じて適宜設定することができる。例えば、ＰＤ１７３０７４の場合には、好ましくは０．０５μＭ～１０μＭの範囲であり、より好ましくは０．０５μＭ～５．０μＭの範囲である。
ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、ＰＤ０３２５９０１（Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシプロポキシ］－３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－ヨードフェニル）アミノ］－ベンズアミド；ＣＡＳ登録番号：３９１２１０－１０－９）、ＰＤ９８０５９（２－（２－アミノ－３－メトキシフェニル）－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン；ＣＡＳ登録番号：１６７８６９－２１－８）、Ｃｏｂｉｍｅｔｉｎｉｂ （ＧＤＣ－０９７３， ＲＧ７４２０）（［３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－ヨードフェニル）アミノ］フェニル］ ［３－ヒドロキシ－３－（２Ｓ）－２－ピペリジニル－１－アゼチジニル］－メタノン；ＣＡＳ登録番号：９３４６６０－９３－２）、ＰＤ１８４３５２（２－（２－クロロ－４－ヨードフェニルアミノ）－Ｎ－シクロプロピルメトキシ－３，４－ジフルオロベンズアミド；ＣＡＳ登録番号：２１２６３１－７９－３）、Ｂｉｎｉｍｅｔｉｎｉｂ （ＭＥＫ１６２， ＡＲＲＹ－１６２， ＡＲＲＹ－４３８１６２）（５－［（４－ブロモ－２－フルオロフェニル）アミノ］－４－フルオロ－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－１－メチル－１Ｈ－ベンズイミダゾール－６－カルボキサミド；ＣＡＳ登録番号：６０６１４３－８９－９）が挙げられ、ＰＤ０３２５９０１及びＰＤ９８０５９が好ましい。培地におけるＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤の濃度は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤の種類などに応じて適宜設定することができる。例えば、ＰＤ０３２５９０１の場合には、好ましくは０．２μＭ～１０μＭの範囲であり、より好ましくは０．２μＭ～５．０μＭの範囲である。例えば、ＰＤ９８０５９の場合には、好ましくは３μＭ～１００μＭの範囲であり、より好ましくは３μＭ～５０μＭの範囲であり、更により好ましくは３μＭ～１０μＭの範囲である。ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤は、２種以上を組み合わせて用いることができ、ＰＤ０３２５９０１とＰＤ９８０５９を組み合わせて用いることができる。
本発明の一実施態様では、ｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種が、Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシプロポキシ］－３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－イオドフェニル）アミノ］－ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ－（２－｛［４－（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ｝－６－（３，５－ジメトキシフェニル）ピリド（２，３－ｄ）ピリミジン－７－ｙｌ）－Ｎ’－（１，１－ジメチルエチル）尿素（ＰＤ１７３０７４）及び２－（２－アミノ－３－メトキシフェニル）－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン（ＰＤ９８０５９）からなる群から選択される少なくとも１種であってもよい。
本発明の一実施態様では、ｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種が、Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシプロポキシ］－３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－イオドフェニル）アミノ］－ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ－（２－｛［４－（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ｝－６－（３，５－ジメトキシフェニル）ピリド（２，３－ｄ）ピリミジン－７－ｙｌ）－Ｎ’－（１，１－ジメチルエチル）尿素（ＰＤ１７３０７４）及び２－（２－アミノ－３－メトキシフェニル）－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン（ＰＤ９８０５９）からなる群から選択される１種、２種又は３種であってもよい。
本発明の一実施態様では、本発明の樹状細胞分化誘導培地は、ａ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤、及びｃ）ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤を含み、ＲＯＣＫ阻害剤がＹ２７６３２であり、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤がＰＤ０３２５９０１であることが好ましい。後記の実施例では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子に加えて、少なくともＹ２７６３２とＰＤ０３２５９０１とを含む培地においてマウス骨髄細胞試料から分化誘導された細胞集団中の樹状細胞の割合が、溶媒コントロールの培地と比較して有意に増加していることが示されている。
本発明の別の実施態様では、本発明の樹状細胞分化誘導培地は、ａ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤、並びにｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤を含み、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤が２種類含まれる。ＲＯＣＫ阻害剤がＹ２７６３２であり、ＦＧＦＲ阻害剤がＰＤ１７３０７４であり、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤がＰＤ０３２５９０１及びＰＤ９８０５９であることが好ましい。
本発明の更に別の実施態様では、本発明の樹状細胞分化誘導培地は、ａ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤、並びにｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤を含む。ＲＯＣＫ阻害剤がＹ２７６３２であり、ＦＧＦＲ阻害剤がＰＤ１７３０７４であり、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤がＰＤ９８０５９であることが好ましい。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子に加えて、少なくともＹ２７６３２とＰＤ１７３０７４とＰＤ９８０５９とを含む培地においてヒト末梢血試料から分化誘導された細胞集団中の樹状細胞では、溶媒コントロールの培地と比較して、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、及びＣＤ８６の発現が増強する。ＣＤ１１ｂは、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８複合体として、ＮＫ細胞、顆粒球、単球／マクロファージに強く発現し、樹状細胞のサブセットには、ＣＤ１１ｂ高発現性のものがある。ＣＤ８６は共刺激分子であり、主にＢ細胞、樹状細胞、マクロファージを含む抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ；ＡＰＣ）上で発現する。
本発明の樹状細胞分化誘導培地、上記ａ）からｃ）を含むほか、基礎培地に、非働化ウシ胎仔血清、２－メルカプトエタノール、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン等）などの添加成分を任意に組み合わせて添加した培地であってもよく、好ましくは上記の添加成分の全てを組み合わせて含む。ＩＬ－４（例えば、ヒトＩＬ－４、マウスＩＬ－４、リコンビナントヒトＩＬ－４、リコンビナントマウスＩＬ－４）を更に添加することができる。上記基礎培地としては、ＲＰＭＩ－１６４０培地のほか、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ培地などを挙げることができる。非働化ウシ胎仔血清の濃度は５～２０ ｖ／ｖ ％の範囲が好ましく、１０ ｖ／ｖ ％がより好ましい。ＩＬ－４の濃度は５～２０ｎｇ／ｍＬの範囲が好ましく、１０ｎｇ／ｍＬがより好ましい。
（製造方法）
本発明の樹状細胞集団の製造方法は、上記樹状細胞分化誘導培地中で骨髄細胞試料又は末梢血試料を培養して培養樹状細胞集団を得る工程を含む。上記樹状細胞分化誘導培地中での骨髄細胞試料又は末梢血試料の培養期間は、特に限定されず、例えば、２～１０日間、又は３～９日間の範囲で設定することができる。培養条件は、例えば、３７℃、５％ＣＯ２条件下を挙げることができる。骨髄細胞試料又は末梢血試料は、哺乳類由来であり、好ましくはマウス又はヒト由来である。
本発明の樹状細胞集団の製造方法は、上記樹状細胞分化誘導培地中で骨髄細胞試料又は末梢血試料を培養して培養樹状細胞集団を得る工程を含む。上記樹状細胞分化誘導培地中での骨髄細胞試料又は末梢血試料の培養期間は、特に限定されず、例えば、２～１０日間、又は３～９日間の範囲で設定することができる。培養条件は、例えば、３７℃、５％ＣＯ２条件下を挙げることができる。骨髄細胞試料又は末梢血試料は、哺乳類由来であり、好ましくはマウス又はヒト由来である。
本発明において樹状細胞集団とは、複数個の細胞、例えば１×１０５ｃｅｌｌｓ以上の細胞で構成された、樹状細胞を含む細胞集団を意味する。本発明の樹状細胞集団の製造方法により製造された樹状細胞集団は、樹状細胞を３０％以上の割合で含むことができる。
骨髄細胞試料は、採取した骨髄細胞試料をＰＢＳ（－）にて洗浄し、赤血球を除いた骨髄細胞試料を用いる。赤血球は、任意の方法で除くことができる。具体的には、後記の実施例に準じて、骨髄細胞をＰＢＳ（－）にて洗浄し、ＲＢＣ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ （Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に懸濁して、室温で５分放置して赤血球を除くことができる。
本発明の樹状細胞集団の製造方法は、骨髄細胞試料を洗浄する工程、及び／又は骨髄細胞試料から赤血球を除去する工程を更に含むことができる。この工程は、樹状細胞分化誘導培地中で骨髄細胞試料又は末梢血試料を培養して樹状細胞集団を得る工程の前に実施することができる。
末梢血試料は、赤血球及び多形白血球を除いた単核球分画試料を用いてもよいし、精製したＣＤ１４陽性単球試料を用いてもよい。単核球分画試料及びＣＤ１４陽性単球試料は、任意の方法で得ることができる。例えば、ヒト末梢血サンプルをＰＢＳ（－）に洗浄し、ＰＢＳ（－）に再懸濁し、赤血球と多形白血球を除くため、リンパ球分離溶液（ｎａｋａｒａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を用いた比重遠心分離方法によって単核球分画を得ることができる。ヒト単核球分画からＣＤ１４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓとＡｕｔｏＭＡＣＳｐｒｏ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣＤ１４陽性単球を精製することができる。
本発明の樹状細胞集団の製造方法は、末梢血試料から単核球細胞集団を調製する工程、又は末梢血試料から単球細胞集団を調製する工程を更に含むことができる。この工程は、樹状細胞分化誘導培地中で骨髄細胞試料又は末梢血試料を培養して樹状細胞集団を得る工程の前に実施することができる。
本発明の樹状細胞集団の製造方法において、樹状細胞分化誘導培地中で骨髄細胞試料又は末梢血試料を培養して樹状細胞集団を得る工程が、非付着性細胞を除去することを含まないことができる。後記の実施例で示されているように、非付着性細胞を除去しなくても、高い割合で樹状細胞を含む細胞集団を得ることができるためである。本発明の樹状細胞集団の製造方法は、培養中に非付着性細胞を除去する工程を含むことができる。培養中に非付着性細胞を除去することにより、更に高い割合で樹状細胞を含む細胞集団を得ることができる。例えば、培養開始から３日後に非付着性細胞を除去することができる。
本発明の樹状細胞集団の製造方法を実施して得られる細胞集団に含まれる細胞の数は、好ましくは１×１０６ｃｅｌｌｓ以上であり、より好ましくは５×１０６ｃｅｌｌｓ以上であり、さらに好ましくは１×１０７ｃｅｌｌｓ以上である。また、本発明の樹状細胞集団の製造方法を実施して得た培養後の細胞集団の細胞濃度は、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であり、好ましくは２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であり、より好ましくは５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である。
本発明の樹状細胞集団の製造方法を実施することにより、骨髄細胞試料又は末梢血試料から効率よく樹状細胞を分化誘導することができる。分化誘導効率は、骨髄細胞試料又は末梢血試料を一定期間培養して得られた細胞集団中の樹状細胞の割合を、コントロールと試験群を比較して評価することができる。培養後の細胞集団中の樹状細胞の割合は、後記の実施例１に記載のとおり、６日間培養後、細胞を回収して樹状細胞の特徴的な細胞表面マーカーであるＣＤ１１ｃとＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ（Ｉ－Ａ ／ Ｉ－Ｅ）に対する特異的抗体にて染色し、各分子の発現レベルをフローサイトメーターによって解析し、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ陽性／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陽性）の割合を算出すればよい。あるいは、樹状細胞の特徴的な細胞表面マーカーであるＣＤ１１ｃとＨＬＡ－ＤＲに対する特異的抗体にて染色し、各分子の発現レベルをフローサイトメーターによって解析し、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ陽性／ＨＬＡ－ＤＲ陽性）の割合を算出してもよい。
本発明の樹状細胞集団の製造方法を実施して得られる細胞集団中における、上記方法で解析した樹状細胞の割合は（割合（％）＝樹状細胞の個数／細胞集団中全細胞の個数×１００）は、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、又は５０％以上であることが好ましい。また、樹状細胞の割合は、さらに高くてもよく、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上であってもよい。
従来のＧＭ－ＣＳＦを用いた培養方法では樹状細胞以外の細胞、例えばＣＤ１１ｃｉｎｔ／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩｉｎｔのマクロファージ様細胞やＣＤ１１ｃ－／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ－細胞が分化誘導される。本発明の樹状細胞集団の製造方法を実施すれば、これらマクロファージ様細胞やＣＤ１１ｃ－／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ－細胞の分化・増殖が抑制され、その結果、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ＋）の分化誘導効率が増加すると考えられる。本発明の樹状細胞集団の製造方法を実施すれば、１×１０６ｃｅｌｌｓの骨髄細胞から１×１０６ｃｅｌｌｓの樹状細胞が得られる。培養中に、樹状細胞及び／又はその前駆細胞の細胞増殖が起こっていると考えられる。
本発明の樹状細胞集団の製造方法を実施して得られる細胞集団について、上記方法で解析した樹状細胞の割合は、溶媒コントロールと比較して、１．１～５０倍上昇することが好ましく、１．２～３０倍上昇することがさらに好ましく、１．５～１０倍上昇することが最も好ましい。コントロールとしては、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤の溶媒であるＤＭＳＯを添加した培地を使用した以外は同条件で培養した細胞集団（溶媒コントロール）を用いることができる。
本発明の樹状細胞集団の製造方法を実施して得られる細胞集団は、溶媒コントロールと比較して、ＬＰＳ刺激によるＩＬ－１２産生量が高い。抗原を貪食し活性化された樹状細胞はＩＬ－１２を産生することにより、ナイーブＴ細胞をＴｈ１細胞に分化させる。Ｔｈ１細胞はインターフェロン（ＩＦＮ）－γを産生し、主な機能としてはマクロファージなどの活性化を誘導し、細胞内病原細菌排除（例えば結核菌やリステリア菌など）、抗ウイルス応答や抗腫瘍応答などに関与する。そのため、がん免疫療法に用いる培養樹状細胞は高いＩＬ－１２産生能を有していることが好ましい。
本発明の樹状細胞集団の製造方法を実施して得られる細胞集団中の樹状細胞は、溶媒コントロールの樹状細胞と比較して、ＬＰＳ刺激によるＩＬ－１２産生能が高いといえる。後記の実施例において、本発明の樹状細胞集団の製造方法を実施して得た細胞集団における樹状細胞の含有濃度は約６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬと算出され、同じ細胞集団におけるＬＰＳ刺激により産生されたＩＬ－１２濃度は３８ｐｇ／ｍＬであった。一方で、溶媒コントロールにおける樹状細胞の含有濃度は約３．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬと算出され、同じ細胞集団におけるＬＰＳ刺激により産生されたＩＬ－１２濃度は１～２ｐｇ／ｍＬであった。上記２つの細胞集団における樹状細胞の含有濃度とＩＬ－１２濃度を基に、本発明の樹状細胞集団の製造方法を実施して得た細胞集団中の樹状細胞は、溶媒コントロールの樹状細胞よりも、ＬＰＳ刺激によるＩＬ－１２産生能が向上しているといえる。
ＩＬ－１２産生能は、後記の実施例１に記載のとおり、６日間培養後、細胞を回収して、ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞を精製し、リポポリサッカロイド（ＬＰＳ）で２日間刺激し、刺激後、培養上精を回収し、ＩＬ－１２ｐ４０の濃度をＥＬＩＳＡ ＭＡＸＴＭ Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ Ｍｏｕｓｅ ＩＬ－１２／ＩＬ－２３（ｐ４０）にて測定すればよい。ＩＬ－１２ｐ７０の濃度をビオチン標識抗マウスＩＬ－１２（ｐ７０）抗体を用いてＥＬＩＳＡで測定してもよい。本発明の樹状細胞集団の製造方法を実施して得た培養後の細胞集団について、上記方法で解析した樹状細胞がＬＰＳ刺激により産生するＩＬ－１２ｐ４０の濃度は、３ｎｇ／ｍＬ以上、４ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、１５ｎｇ／ｍＬ以上、又は２０ｎｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、２５ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、又は３５ｎｇ／ｍＬ以上であることがより好ましい。
本発明の樹状細胞集団の製造方法を実施することにより、Ｔ細胞を刺激しＴｈ１細胞への分化を誘導する共刺激分子ＣＤ８０と樹状細胞がＴ細胞へ抗原提示を行うリンパ節への遊走を制御するケモカイン受容体ＣＣＲ７の発現が増強された樹状細胞を含む細胞集団を得ることができる。
本発明の一実施態様は、ＣＤ１１ｃ陽性であり且つＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陽性である細胞（ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉ細胞）を細胞集団中３０％以上の割合で含む樹状細胞集団であって、上記ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉ細胞においてＣ／ＥＢＰα、ＰＰＡＲγおよびＴＧＦ‐β関連遺伝子群の中から少なくとも１つの遺伝子の発現が溶媒コントロールの樹状細胞と比較して増加している、樹状細胞集団に関する。後記する実施例に記載のとおり、本発明の樹状細胞集団の製造方法を実施して得られる細胞集団中の樹状細胞は、溶媒コントロールの樹状細胞と比較して、Ｃ／ＥＢＰα、ＰＰＡＲγおよびＴＧＦ‐β関連遺伝子群のうち少なくとも１つの遺伝子の発現が増加している。Ｃ／ＥＢＰα（ＣＣＡＡＴ－ｅｎｈａｎｃｅｒ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は、特定の血球の分化に関与する転写因子である。Ｃ／ＥＢＰα遺伝子発現は様々な炎症性サイトカインによって活性化される転写因子、ＮＦκＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ κＢ）によってその発現が制御されている。ＰＰＡＲγ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ γ）は核内受容体スーパーファミリーに属するタンパク質であり、転写因子としても機能する。ＰＰＡＲγは主に脂肪組織に分布して脂肪細胞分化などに関与するほか、マクロファージや血管内皮細胞などにも発現が見られる。ＰＰＡＲγ遺伝子発現は樹状細胞分化誘導サイトカインであるＧＭ－ＣＳＦ刺激によって発現が増強する。ＴＧＦ－β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β）ファミリーは、多彩な機能を持つサイトカインで、その生理作用は細胞増殖、細胞死、細胞分化、免疫調節、細胞運動等多岐に及ぶ。ＴＧＦ－βはほとんど全ての細胞から産生される。
一実施態様において、本発明は上記樹状細胞分化誘導培地中で骨髄細胞試料又は末梢血試料を培養して樹状細胞集団を得る工程、および上記工程で得られた樹状細胞集団を樹状細胞ワクチンに調製する工程を含む、樹状細胞ワクチンの製造方法に関する。一実施態様において、樹状細胞ワクチンは、樹状細胞ワクチンを投与される対象（例えば、がん患者）由来の骨髄細胞試料又は末梢血試料から培養された樹状細胞（すなわち、自家細胞）にがん抗原を付加して調製される。別の実施態様において、樹状細胞ワクチンは、樹状細胞ワクチンを投与される対象以外の提供者（同種ドナー）の骨髄細胞試料又は末梢血試料から培養された樹状細胞（すなわち、同種他家細胞）にがん抗原を付加して調製されてもよい。ＨＬＡ不適合によって引き起こされる宿主拒絶反応を回避するために、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子編集システムなどを用いて樹状細胞のＨＬＡ遺伝子を改変することにより、他家細胞からユニバーサルな樹状細胞ワクチンを製造することが可能になると考えられる。
本発明の樹状細胞ワクチンの製造方法では、上述した本発明の樹状細胞集団の製造方法と同じ工程（上記樹状細胞分化誘導培地中で骨髄細胞試料又は末梢血試料を培養して培養樹状細胞集団を得る工程）で、培養樹状細胞集団を得ることができる。上記骨髄細胞試料又は末梢血試料は、上記樹状細胞ワクチンを投与される対象から採取されたものであってもよいし、樹状細胞ワクチンを投与される対象以外の提供者（同種ドナー）から採取されたものであってもよい。上記工程で得られた樹状細胞集団を樹状細胞ワクチンに調製する工程は、樹状細胞集団にがん抗原を付加することを含むことができる。がん抗原を付加する工程は、樹状細胞集団を製造する過程で行ってもよく、樹状細胞集団の製造後に行ってもよい。がん抗原の付加方法としては、樹状細胞に所望の抗原を取り込ませることができる方法であれば特に限定されないが、樹状細胞を所望の抗原とともに培養すること等が挙げられる。好ましい実施態様において、本発明の樹状細胞ワクチンの製造法において、樹状細胞集団は、がん抗原ペプチドを付加したものである。がん抗原としては、例えば、ＭＡＲＴ１（悪性黒色腫）、Ｈｅｒ２（乳がん）、ＰＳＡ（前立腺がん）、ＷＴ１、ＭＵＳ－１等を用いることができるが、これらに限定されない。
（樹状細胞の利用）
本発明は、本発明の樹状細胞集団の製造方法を実施することにより得られた樹状細胞集団を含む、医薬を提供することができる。また、本発明は、本発明の樹状細胞集団の製造方法を実施することにより得られた樹状細胞集団を患者に投与することを含む、治療方法を提供することができる。上記医薬又は治療方法は、がん、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び／又はアレルギーを治療するために用いることができる。
本発明は、本発明の樹状細胞集団の製造方法を実施することにより得られた樹状細胞集団を含む、医薬を提供することができる。また、本発明は、本発明の樹状細胞集団の製造方法を実施することにより得られた樹状細胞集団を患者に投与することを含む、治療方法を提供することができる。上記医薬又は治療方法は、がん、感染症、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び／又はアレルギーを治療するために用いることができる。
本発明の特定の実施態様は、上記樹状細胞分化誘導培地中で、上記対象から採取された骨髄細胞試料又は末梢血試料を培養して樹状細胞集団を得る工程、上記工程で得られた樹状細胞集団を樹状細胞ワクチンに調製する工程、および樹状細胞ワクチンを上記対象に投与する工程を含む、対象の疾患を治療する方法を提供する。本発明の対象の疾患を治療する方法では、上述した本発明の樹状細胞集団の製造方法と同じ工程（上記樹状細胞分化誘導培地中で骨髄細胞試料又は末梢血試料を培養して培養樹状細胞集団を得る工程）で、培養樹状細胞集団を得ることができる。上記骨髄細胞試料又は末梢血試料は、上記樹状細胞ワクチンを投与される対象から採取されたものであってもよいし、樹状細胞ワクチンを投与される対象以外の提供者（同種ドナー）から採取されたものであってもよい。本発明の対象の疾患を治療する方法では、上述した本発明の樹状細胞ワクチンの製造方法の得られた樹状細胞集団を樹状細胞ワクチンに調製する工程と同じ工程で、樹状細胞集団にがん抗原を付加することを含むことができる。投与された樹状細胞はＴ細胞にがん抗原を提示し、抗原を提示されたＴ細胞（ＣＴＬ）は、がん細胞を特異的に攻撃することが期待される。
上記医薬に含まれる樹状細胞集団又は治療方法に用いられる樹状細胞集団は、ＣＤ１１ｃ陽性／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陽性細胞を３０％以上含むことが好ましい。また上記医薬に含まれる樹状細胞集団又は治療方法に用いられる樹状細胞集団は、高いＩＬ－１２産生能を有する樹状細胞の細胞集団であることが好ましく、さらには樹状細胞上の共刺激分子ＣＤ８０と樹状細胞のリンパ節への遊走を制御するケモカイン受容体ＣＣＲ７の発現が増強された樹状細胞を含む細胞集団であることが好ましい。さらに、上記医薬に含まれる樹状細胞集団又は治療方法に用いられる樹状細胞集団は、ＣＤ１１ｃ陽性であり且つＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陽性である細胞（ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉ細胞）を細胞集団中３０％以上の割合で含む樹状細胞集団であって、上記ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉ細胞においてＣ／ＥＢＰα、ＰＰＡＲγおよびＴＧＦ‐β関連遺伝子群のうち少なくとも１つの遺伝子の発現が増加している、樹状細胞集団であることが好ましい。
上記医薬に含まれる樹状細胞集団又は治療方法に用いられる樹状細胞集団は、がん抗原ペプチドをパルス（付加）したものを患者に投与することができる。がん抗原としては、例えば、ＭＡＲＴ１（悪性黒色腫）、Ｈｅｒ２（乳がん）、ＰＳＡ（前立腺がん）、ＷＴ１、ＭＵＳ－１等を用いることができるが、これらに限定されない。
上記医薬に含まれる樹状細胞集団又は治療方法に用いられる樹状細胞集団は、生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などに懸濁して用いることができ、医薬品及び医薬部外品として薬学的に許容される担体を含むことができる。樹状細胞集団は、冷凍保存することができる。上記医薬に含まれる樹状細胞集団又は治療方法に用いられる樹状細胞集団は、例えば、静脈、動脈、皮下、腹腔内等へ投与することができる。
上記医薬に含まれる樹状細胞集団又は治療方法に用いられる樹状細胞集団の細胞濃度は、適宜調整することができ、例えば、１×１０５～１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬとすることができる。上記樹状細胞集団は、患者の自家細胞または同種他家細胞から製造し、治療に用いることができる。
本発明の樹状細胞集団の製造方法を実施することにより得られた樹状細胞集団は、樹状細胞を用いた研究のために用いることができる。
更に、本発明によれば、上記樹状細胞分化誘導培地を含むキットが提供される。キットは、樹状細胞集団を製造するために用いることができる。キットは任意の容器を含んでいてもよく、容器としてはフラスコ、チューブ、シャーレ等を挙げることができる。キットは、細胞培養手順を記載した説明書を更に含むことができる。一実施態様において、キットは、ＲＰＭＩ－１６４０、ＩＭＤＭ、及びＤＭＥＭ等の基礎培地、ａ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤、並びにｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種を含むものであってもよく、当該キットの使用者は、樹状細胞分化誘導培地を用事調製して、樹状細胞集団を製造するために用いることができる。
以下の例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、本明細書において、特に記載しない限り、「％」等は質量基準であり、数値範囲はその端点を含むものとして記載される。
実験材料と使用機器
１）実験動物
実施例１～３の実験には８～１２週齢のマウスを用いた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系（Ｂ６）マウスは日本エスエルシー株式会社より購入した。実験動物は、金沢医科大学動物実験指針に従い、１２時間おきの明暗サイクル、温度、湿度が管理されたＳｐｅｃｉｆｉｃ－ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ（ＳＰＦ）環境下で飼育した。
１）実験動物
実施例１～３の実験には８～１２週齢のマウスを用いた。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系（Ｂ６）マウスは日本エスエルシー株式会社より購入した。実験動物は、金沢医科大学動物実験指針に従い、１２時間おきの明暗サイクル、温度、湿度が管理されたＳｐｅｃｉｆｉｃ－ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ（ＳＰＦ）環境下で飼育した。
２）細胞培養用培地及び試薬
細胞培養用培地及び試薬には、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウシ胎児血清 （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（Ｗａｋｏ）、２－メルカプトエタノール（Ｗａｋｏ）、リコンビナントマウスＧＭ－ＣＳＦ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＲＢＣ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ （Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ｍｏｕｓｅ ＣＤ１１ｃ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、リポポリサッカロイド（ＬＰＳ： ｌｏｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｉｄ） （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＥＬＩＳＡ ＭＡＸＴＭ Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ Ｍｏｕｓｅ ＩＬ－１２／ＩＬ－２３（ｐ４０）、リコンビナントヒトＧＭ－ＣＳＦ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、リコンビナントヒトＩＬ－４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、リンパ球分離溶液（ｎａｋａｒａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を使用した。
細胞培養用培地及び試薬には、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウシ胎児血清 （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（Ｗａｋｏ）、２－メルカプトエタノール（Ｗａｋｏ）、リコンビナントマウスＧＭ－ＣＳＦ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＲＢＣ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ （Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ｍｏｕｓｅ ＣＤ１１ｃ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、リポポリサッカロイド（ＬＰＳ： ｌｏｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｉｄ） （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＥＬＩＳＡ ＭＡＸＴＭ Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ Ｍｏｕｓｅ ＩＬ－１２／ＩＬ－２３（ｐ４０）、リコンビナントヒトＧＭ－ＣＳＦ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、リコンビナントヒトＩＬ－４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、リンパ球分離溶液（ｎａｋａｒａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を使用した。
３）実験用プラスチック器具類
実験用プラスチック器具類は、細胞培養用シャーレ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、細胞培養用９６穴プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、細胞培養用２４穴プレート（Ｉｗａｋｉ）、細胞取り扱い用ピペット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、細胞回収用コニカルチューブ（ニチリョー）、ＦＡＣＳ用５ｍＬラウンドチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、１．５ｍＬチューブ（Ｗａｔｏｓｏｎ）、ピペットマン用チップ（Ｗａｔｏｓｏｎ）、セルストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、パスツールピペット（Ｉｗａｋｉ）を使用した。
実験用プラスチック器具類は、細胞培養用シャーレ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、細胞培養用９６穴プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、細胞培養用２４穴プレート（Ｉｗａｋｉ）、細胞取り扱い用ピペット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、細胞回収用コニカルチューブ（ニチリョー）、ＦＡＣＳ用５ｍＬラウンドチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、１．５ｍＬチューブ（Ｗａｔｏｓｏｎ）、ピペットマン用チップ（Ｗａｔｏｓｏｎ）、セルストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、パスツールピペット（Ｉｗａｋｉ）を使用した。
４）低分子化合物
低分子化合物は、Ｙ２７６３２（富士フィルムＷａｋｏ）、ＰＤ０３２５９０１（富士フィルムＷａｋｏ）、ＰＤ１７３０７４（富士フィルムＷａｋｏ）、ＰＤ９８０５９（富士フィルムＷａｋｏ）を用いた。
低分子化合物は、Ｙ２７６３２（富士フィルムＷａｋｏ）、ＰＤ０３２５９０１（富士フィルムＷａｋｏ）、ＰＤ１７３０７４（富士フィルムＷａｋｏ）、ＰＤ９８０５９（富士フィルムＷａｋｏ）を用いた。
５）フローサイトメトリー用抗体
下記の抗体は全てトミーデジタルバイオロジー株式会社から購入し、本実験に使用した。
下記の抗体は全てトミーデジタルバイオロジー株式会社から購入し、本実験に使用した。
６）フローサイトメトリー関連試薬及び使用機器
ＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｌｏｗ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃｌｅａｎ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｓｈｕｔｄｏｗｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＢＤ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ Ｓｅｔｕｐ ＆ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ｂｅａｄｓ Ｋｉｔ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、解析用ソフトＦＡＣＳ Ｄｉｖａ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、Ｆｌｏｗｊｏ （Ｔｏｍｙ ｄｉｇｉｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ）、ＡｕｔｏＭＡＣＳｐｒｏ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）
ＢＤ ＦＡＣＳ Ｆｌｏｗ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃｌｅａｎ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｓｈｕｔｄｏｗｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＢＤ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ Ｓｅｔｕｐ ＆ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ｂｅａｄｓ Ｋｉｔ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、解析用ソフトＦＡＣＳ Ｄｉｖａ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、Ｆｌｏｗｊｏ （Ｔｏｍｙ ｄｉｇｉｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ）、ＡｕｔｏＭＡＣＳｐｒｏ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）
＜実施例１＞
本実施例では、マウス骨髄細胞試料から樹状細胞を分化誘導した。
実験方法
１）低分子化合物溶液の準備
表２の４種類の低分子化合物は、Ｈ２ＯあるいはＤＭＳＯで表２に記載の濃度に溶解した。各低分子化合物溶液を、培養培地の総量１に対して１／１０量添加した。以下、４種の低分子化合物をまとめて「ＹＰＰＰ」という。
本実施例では、マウス骨髄細胞試料から樹状細胞を分化誘導した。
実験方法
１）低分子化合物溶液の準備
表２の４種類の低分子化合物は、Ｈ２ＯあるいはＤＭＳＯで表２に記載の濃度に溶解した。各低分子化合物溶液を、培養培地の総量１に対して１／１０量添加した。以下、４種の低分子化合物をまとめて「ＹＰＰＰ」という。
２）マウス樹状細胞の誘導
安楽死させたマウスから大腿骨と脛骨を単離し、ＰＢＳ（－）と２２Ｇの針を使ってフラッシングを行い骨髄細胞を単離した。骨髄細胞をＰＢＳ（－）にて洗浄し、ＲＢＣ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に懸濁して、室温で５分放置し赤血球を除いた。その後ＰＢＳ（－）にて洗浄し、マウス骨髄細胞を得た。マウス骨髄細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、１０ ｖ／ｖ ％非働化ウシ胎仔血清、抗生物質（１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）、５０μＭ ２－メルカプトエタノール及び２５ｎｇ／ｍＬリコンビナントマウスＧＭ－ＣＳＦを含有したＲＰＭＩ－１６４０培地に、ＤＭＳＯあるいは上記のＹＰＰＰ溶液を添加して３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。３日後に半分量の培地交換を行い、培養開始から６日後の細胞集団を実験に供した。培養開始から６日後のＹＰＰＰ溶液を添加した細胞集団の細胞濃度は、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、一方ＤＭＳＯを添加した細胞集団の細胞濃度は２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。
安楽死させたマウスから大腿骨と脛骨を単離し、ＰＢＳ（－）と２２Ｇの針を使ってフラッシングを行い骨髄細胞を単離した。骨髄細胞をＰＢＳ（－）にて洗浄し、ＲＢＣ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に懸濁して、室温で５分放置し赤血球を除いた。その後ＰＢＳ（－）にて洗浄し、マウス骨髄細胞を得た。マウス骨髄細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、１０ ｖ／ｖ ％非働化ウシ胎仔血清、抗生物質（１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）、５０μＭ ２－メルカプトエタノール及び２５ｎｇ／ｍＬリコンビナントマウスＧＭ－ＣＳＦを含有したＲＰＭＩ－１６４０培地に、ＤＭＳＯあるいは上記のＹＰＰＰ溶液を添加して３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。３日後に半分量の培地交換を行い、培養開始から６日後の細胞集団を実験に供した。培養開始から６日後のＹＰＰＰ溶液を添加した細胞集団の細胞濃度は、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、一方ＤＭＳＯを添加した細胞集団の細胞濃度は２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。
３）フローサイトメトリー解析
細胞浮遊液（１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００ｍＬ、１％ＦＣＳ－ＰＢＳ（－）に懸濁した細胞懸濁液）に抗マウスＣＤ１６／３２抗体を添加し、室温１５分間静置し非特異的な抗体結合を防ぐ。その後、各蛍光標識抗マウス抗体を加えて４℃、４５分間静置による染色操作を行った。染色後、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）による解析を行った。細胞表現抗原の発現レベルについては、アイソタイプコントロール抗体で染色した樹状細胞表面マーカーの蛍光強度を１０３に設定し、１０３よりも高度に発現している場合を陽性（＋）と判定し、１０３と同程度あるいはそれ以下を陰性（－）と判断した。また蛍光強度が１０４以上を高発現（ｈｉｇｈまたはｈｉ）と定義した。蛍光強度が１０３から１０４未満を（ｉｎｔ）とした。
細胞浮遊液（１×１０５ｃｅｌｌｓ／１００ｍＬ、１％ＦＣＳ－ＰＢＳ（－）に懸濁した細胞懸濁液）に抗マウスＣＤ１６／３２抗体を添加し、室温１５分間静置し非特異的な抗体結合を防ぐ。その後、各蛍光標識抗マウス抗体を加えて４℃、４５分間静置による染色操作を行った。染色後、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）による解析を行った。細胞表現抗原の発現レベルについては、アイソタイプコントロール抗体で染色した樹状細胞表面マーカーの蛍光強度を１０３に設定し、１０３よりも高度に発現している場合を陽性（＋）と判定し、１０３と同程度あるいはそれ以下を陰性（－）と判断した。また蛍光強度が１０４以上を高発現（ｈｉｇｈまたはｈｉ）と定義した。蛍光強度が１０３から１０４未満を（ｉｎｔ）とした。
４）インターロイキン１２（ＩＬ－１２）産生解析
上記の通り、マウス骨髄細胞に、ＤＭＳＯあるいはＹＰＰＰ溶液を添加して６日間培養した細胞集団からＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）とＡｕｔｏＭＡＣＳｐｒｏ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞を精製した。精製したＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞を１０ ｖ／ｖ ％非働化ウシ胎仔血清、抗生物質（１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）、５０μＭ ２－メルカプトエタノールを含有したＲＰＭＩ－１６４０培地に懸濁し、リポポリサッカロイド（ＬＰＳ、１μｇ／ｍｌ）で２日間刺激した。刺激後、培養上精を回収し、ＩＬ－１２ｐ４０の濃度をＥＬＩＳＡ ＭＡＸＴＭ Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ Ｍｏｕｓｅ ＩＬ－１２／ＩＬ－２３（ｐ４０）にて測定した。
上記の通り、マウス骨髄細胞に、ＤＭＳＯあるいはＹＰＰＰ溶液を添加して６日間培養した細胞集団からＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）とＡｕｔｏＭＡＣＳｐｒｏ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞を精製した。精製したＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞を１０ ｖ／ｖ ％非働化ウシ胎仔血清、抗生物質（１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）、５０μＭ ２－メルカプトエタノールを含有したＲＰＭＩ－１６４０培地に懸濁し、リポポリサッカロイド（ＬＰＳ、１μｇ／ｍｌ）で２日間刺激した。刺激後、培養上精を回収し、ＩＬ－１２ｐ４０の濃度をＥＬＩＳＡ ＭＡＸＴＭ Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ Ｍｏｕｓｅ ＩＬ－１２／ＩＬ－２３（ｐ４０）にて測定した。
５）統計学的処理
統計学的処理にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用い、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１を統計学的有意な差と判定した。
統計学的処理にはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用い、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１を統計学的有意な差と判定した。
結果
フローサイトメトリー解析の結果を図１Ａに示す。マウス骨髄細胞をＧＭ－ＣＳＦとＤＭＳＯ（溶媒コントロール）、あるいは低分子化合物ＹＰＰＰの存在下で６日間培養した後、細胞を回収して樹状細胞の特徴的な細胞表面マーカーであるＣＤ１１ｃとＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ（Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ）に対する特異的抗体にて染色し、各分子の発現レベルをフローサイトメーターによって解析した。溶媒コントロールにて培養した場合、１７．５±７．３％の樹状細胞（ＣＤ１１ｃ陽性／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陽性、ＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ＋）が誘導されたのに対し、低分子化合物を加えた場合、６１．２±８．４％の樹状細胞が誘導された。この結果、図１Ｂに示すとおり、低分子化合物ＹＰＰＰを加えると樹状細胞への分化効率が３倍以上増強された。
フローサイトメトリー解析の結果を図１Ａに示す。マウス骨髄細胞をＧＭ－ＣＳＦとＤＭＳＯ（溶媒コントロール）、あるいは低分子化合物ＹＰＰＰの存在下で６日間培養した後、細胞を回収して樹状細胞の特徴的な細胞表面マーカーであるＣＤ１１ｃとＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ（Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ）に対する特異的抗体にて染色し、各分子の発現レベルをフローサイトメーターによって解析した。溶媒コントロールにて培養した場合、１７．５±７．３％の樹状細胞（ＣＤ１１ｃ陽性／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陽性、ＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ＋）が誘導されたのに対し、低分子化合物を加えた場合、６１．２±８．４％の樹状細胞が誘導された。この結果、図１Ｂに示すとおり、低分子化合物ＹＰＰＰを加えると樹状細胞への分化効率が３倍以上増強された。
ＤＭＳＯ（溶媒コントロール）、あるいは低分子化合物ＹＰＰＰ存在下で分化誘導された樹状細胞上の共刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６）と同細胞のリンパ節への遊走を制御するケモカイン受容体（ＣＣＲ７）の発現を各分子に対する特異的抗体にて染色し、各分子の発現レベルをフローサイトメーターによって解析した。図１Ｃに示すとおり、溶媒コントロールと比較して低分子化合物存在下で分化誘導された樹状細胞ではＣＤ８０とＣＣＲ７の発現レベルが増加していた。ＹＰＰＰで誘導された樹状細胞はＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ＋／ＣＤ８０＋／ＣＣＲ７＋（ＣＤ１１ｃ陽性／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陽性／ＣＤ８０陽性／ＣＣＲ７陽性）であることがわかった。
ＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞の、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）産生解析の結果を図２Ｂに示す。ＹＰＰＰ溶液を添加して６日間培養して分化誘導したＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞は、培養コントロースと比較して、ＬＰＳ刺激によるインターロイキン－１２産生量が高いことが示された（ＤＭＳＯ：１～２ｐｇ／ｍＬ、ＹＰＰＰ：３８ｐｇ／ｍＬ）。
考察
ＧＭ－ＣＳＦを用いた培養方法では樹状細胞以外の細胞、例えばＣＤ１１ｃｉｎｔ／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩｉｎｔのマクロファージ様細胞やＣＤ１１ｃ－／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ－細胞が分化誘導される（図１Ａ、ＤＭＳＯ）。低分子化合物ＹＰＰＰを加えることで、これらマクロファージ様細胞やＣＤ１１ｃ－／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ－細胞の分化・増殖が抑制され（図１Ａ）、その結果、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ＋）の分化誘導効率が増加した。低分子化合物ＹＰＰＰを添加して分化誘導した樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ＋）は、ＩＬ－１２産生能を保持しており、低分子化合物ＹＰＰＰの添加による品質の低下は観察されなかった。
ＧＭ－ＣＳＦを用いた培養方法では樹状細胞以外の細胞、例えばＣＤ１１ｃｉｎｔ／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩｉｎｔのマクロファージ様細胞やＣＤ１１ｃ－／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ－細胞が分化誘導される（図１Ａ、ＤＭＳＯ）。低分子化合物ＹＰＰＰを加えることで、これらマクロファージ様細胞やＣＤ１１ｃ－／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ－細胞の分化・増殖が抑制され（図１Ａ）、その結果、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ＋）の分化誘導効率が増加した。低分子化合物ＹＰＰＰを添加して分化誘導した樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ＋）は、ＩＬ－１２産生能を保持しており、低分子化合物ＹＰＰＰの添加による品質の低下は観察されなかった。
培養開始から６日後のＹＰＰＰ溶液を添加した細胞集団について、細胞濃度は１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、フローサイトメトリー解析による樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ＋）の割合は６１．２±８．４％であるので、樹状細胞の含有濃度は約６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬと算出される。一方、培養開始から６日後のＤＭＳＯを添加した細胞集団について、細胞濃度は２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、フローサイトメトリー解析による樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ＋）の割合は１７．５±７．３％であるので、樹状細胞の含有濃度は約３．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬと算出される。これらの細胞集団におけるＬＰＳ刺激によるＩＬ－１２産生試験で、ＩＬ－１２濃度は、ＹＰＰＰ：３８ｐｇ／ｍＬ、及びＤＭＳＯ：１～２ｐｇ／ｍＬであった。よって、培養開始から６日後のＹＰＰＰ溶液を添加した細胞集団については、培養開始から６日後のＤＭＳＯを添加した細胞集団に比較して、樹状細胞の細胞あたりのＩＬ－１２産生能が向上しているといえる。
＜実施例２＞
本実施例では、低分子化合物ＹＰＰＰの最適濃度の検討を行った。表２に記載の低分子化合物の濃度に対して、１／３倍及び１／９倍濃度（表３）の各ＹＰＰＰ溶液を用意し、実施例１と同様の手順にて、１／３倍及び１／９倍濃度のＹＰＰＰを添加した培養培地を調製した。この培地を用いて、実施例１と同様の手順にて、マウス骨髄細胞を培養して、マウス樹状細胞の誘導を実施し、得られた細胞集団をフローサイトメトリー解析に供した。
本実施例では、低分子化合物ＹＰＰＰの最適濃度の検討を行った。表２に記載の低分子化合物の濃度に対して、１／３倍及び１／９倍濃度（表３）の各ＹＰＰＰ溶液を用意し、実施例１と同様の手順にて、１／３倍及び１／９倍濃度のＹＰＰＰを添加した培養培地を調製した。この培地を用いて、実施例１と同様の手順にて、マウス骨髄細胞を培養して、マウス樹状細胞の誘導を実施し、得られた細胞集団をフローサイトメトリー解析に供した。
結果
結果を図３Ａ及びＢに示す。一方、ｘ１／３濃度及びｘ１／９濃度ＹＰＰＰ添加条件下で培養した細胞集団では、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ＋）の割合は、それぞれ１２．６＋／－７．１％及び１４．５＋／－４．６％であった。よって、ＹＰＰＰ添加濃度は、ｘ１／３濃度及びｘ１／９濃度よりも、ｘ１濃度（実施例１の表１の終濃度）がよい分化誘導効率をもたらすことが分かった。
結果を図３Ａ及びＢに示す。一方、ｘ１／３濃度及びｘ１／９濃度ＹＰＰＰ添加条件下で培養した細胞集団では、樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ＋）の割合は、それぞれ１２．６＋／－７．１％及び１４．５＋／－４．６％であった。よって、ＹＰＰＰ添加濃度は、ｘ１／３濃度及びｘ１／９濃度よりも、ｘ１濃度（実施例１の表１の終濃度）がよい分化誘導効率をもたらすことが分かった。
＜実施例３＞
本実施例では、４種の低分子化合物の異なる組み合わせについて検討を行った。各低分子化合物溶液の濃度は表１のとおり調整した。４種の低分子化合物から選択される少なくとも１種を添加した培養培地と４種全てを添加しない培養培地（溶媒コントロール）を１６通りの組合せで用意した。これらの培地を用いて、実施例１と同様の手順にて、マウス骨髄細胞を培養して、マウス樹状細胞の誘導を実施し、得られた細胞集団をフローサイトメトリー解析に供した。
本実施例では、４種の低分子化合物の異なる組み合わせについて検討を行った。各低分子化合物溶液の濃度は表１のとおり調整した。４種の低分子化合物から選択される少なくとも１種を添加した培養培地と４種全てを添加しない培養培地（溶媒コントロール）を１６通りの組合せで用意した。これらの培地を用いて、実施例１と同様の手順にて、マウス骨髄細胞を培養して、マウス樹状細胞の誘導を実施し、得られた細胞集団をフローサイトメトリー解析に供した。
図４は、４種類低分子化合物添加の組合せが異なる１６の培地で誘導された樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ＋細胞）の割合（％）を示す。溶媒コントロールと比較して有意差があったのは化合物（Ｙ２７６３２とＰＤ０３２５９０１）を加えた場合であった。
＜実施例４＞
本実施例では、ヒト末梢血単球から樹状細胞を分化誘導する。
実験方法
１）ヒト末梢血単球細胞集団の調製方法
ヒト末梢血サンプルをＰＢＳ（－）に洗浄し、ＰＢＳ（－）に再懸濁する。赤血球と多形白血球を除くため、リンパ球分離溶液（ｎａｋａｒａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を用いた比重遠心分離方法によって単核球分画を得る。ヒト単核球分画からＣＤ１４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓとＡｕｔｏＭＡＣＳｐｒｏ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣＤ１４陽性単球を精製した。同細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、１０ ｖ／ｖ ％非働化ウシ胎仔血清、抗生物質（１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）、５０μＭ ２－メルカプトエタノール及び２０ｎｇ／ｍＬリコンビナントヒトＧＭ－ＣＳＦと１０ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－４を含有したＲＰＭＩ－１６４０培地に、ＤＭＳＯあるいは実施例１の表１に記載の低分子化合物ＹＰＰＰ溶液を培養培地の総量１に対して１／１０量添加して３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養する。３日後に半分量の培地交換を行い、培養開始から６日後の細胞を続く実験に供する。
本実施例では、ヒト末梢血単球から樹状細胞を分化誘導する。
実験方法
１）ヒト末梢血単球細胞集団の調製方法
ヒト末梢血サンプルをＰＢＳ（－）に洗浄し、ＰＢＳ（－）に再懸濁する。赤血球と多形白血球を除くため、リンパ球分離溶液（ｎａｋａｒａｉ ｔｅｓｑｕｅ）を用いた比重遠心分離方法によって単核球分画を得る。ヒト単核球分画からＣＤ１４ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓとＡｕｔｏＭＡＣＳｐｒｏ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＣＤ１４陽性単球を精製した。同細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、１０ ｖ／ｖ ％非働化ウシ胎仔血清、抗生物質（１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）、５０μＭ ２－メルカプトエタノール及び２０ｎｇ／ｍＬリコンビナントヒトＧＭ－ＣＳＦと１０ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ－４を含有したＲＰＭＩ－１６４０培地に、ＤＭＳＯあるいは実施例１の表１に記載の低分子化合物ＹＰＰＰ溶液を培養培地の総量１に対して１／１０量添加して３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養する。３日後に半分量の培地交換を行い、培養開始から６日後の細胞を続く実験に供する。
＜実施例５＞
本実施例では、樹状細胞ワクチン（ＤＣＶ）の抗腫瘍活性を分析する。
１）マウス、腫瘍細胞および試薬
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）を日本ＳＬＣ（静岡、日本）から購入した。これらのマウスは、環境管理された特定病原体フリー施設である金沢医科大学の動物ユニットで、施設が定めた実験動物のガイドラインに従って、飼育された。いずれの試験も金沢医科大学の動物試験委員会の承認を得た。Ｅ．Ｇ７腫瘍細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ｍａｎａｓｓａｓ社、ＶＡ）から購入し、供給者の推奨に従って維持した。Ｅ．Ｇ７腫瘍細胞は、ＥＬ－４細胞にＯＶＡ発現遺伝子を導入した細胞であり、モデル抗原として卵白アルブミン（ＯＶＡ）を発現する。卵白アルブミン（ＯＶＡ）２５７－２６４ペプチド「ＳＩＩＮＦＥＫＬ」はＡｎａｓｐｅｃ社（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から購入した。
本実施例では、樹状細胞ワクチン（ＤＣＶ）の抗腫瘍活性を分析する。
１）マウス、腫瘍細胞および試薬
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）を日本ＳＬＣ（静岡、日本）から購入した。これらのマウスは、環境管理された特定病原体フリー施設である金沢医科大学の動物ユニットで、施設が定めた実験動物のガイドラインに従って、飼育された。いずれの試験も金沢医科大学の動物試験委員会の承認を得た。Ｅ．Ｇ７腫瘍細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ｍａｎａｓｓａｓ社、ＶＡ）から購入し、供給者の推奨に従って維持した。Ｅ．Ｇ７腫瘍細胞は、ＥＬ－４細胞にＯＶＡ発現遺伝子を導入した細胞であり、モデル抗原として卵白アルブミン（ＯＶＡ）を発現する。卵白アルブミン（ＯＶＡ）２５７－２６４ペプチド「ＳＩＩＮＦＥＫＬ」はＡｎａｓｐｅｃ社（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から購入した。
２）低分子カクテルの調製
最初に、４つの低分子阻害剤（ＹＰＰＰ）をストック溶液に再構成した。具体的には、１０ｍＭ Ｙ２７６３２を滅菌ＰＢＳ中で調製し、４０ｍＭ ＰＤ０３２５９０１、１０ｍＭ ＰＤ１７３０７４および１０ｍＭ ＰＤ９８０５９をそれぞれジメチルスルホキシド中で調製した。ストック溶液は使用までマイナス２０℃で保存した。低分子カクテルは、ストック溶液の対応する量を培地に添加して調製した（表４）。
最初に、４つの低分子阻害剤（ＹＰＰＰ）をストック溶液に再構成した。具体的には、１０ｍＭ Ｙ２７６３２を滅菌ＰＢＳ中で調製し、４０ｍＭ ＰＤ０３２５９０１、１０ｍＭ ＰＤ１７３０７４および１０ｍＭ ＰＤ９８０５９をそれぞれジメチルスルホキシド中で調製した。ストック溶液は使用までマイナス２０℃で保存した。低分子カクテルは、ストック溶液の対応する量を培地に添加して調製した（表４）。
３）マウス骨髄由来樹状細胞の作製
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）から骨髄（ＢＭ）細胞を調製した。ＢＭ細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、５×１０－５Ｍ ２‐メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンおよび２５ｎｇ／ｍＬ 顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ； Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で補充したＲＰＭＩ‐１６４０培地にＤＭＳＯあるいは上記のＹＰＰＰ溶液を添加して、３７℃、５％ＣＯ２存在下６日間培養した。６日目に、抗ＣＤ１１ｃマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＭＡＣＳシステムを用いてＣＤ１１ｃ＋細胞を単離した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）から骨髄（ＢＭ）細胞を調製した。ＢＭ細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、５×１０－５Ｍ ２‐メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンおよび２５ｎｇ／ｍＬ 顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ； Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で補充したＲＰＭＩ‐１６４０培地にＤＭＳＯあるいは上記のＹＰＰＰ溶液を添加して、３７℃、５％ＣＯ２存在下６日間培養した。６日目に、抗ＣＤ１１ｃマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＭＡＣＳシステムを用いてＣＤ１１ｃ＋細胞を単離した。
４）Ｅ．Ｇ７腫瘍モデルにおける樹状細胞ワクチン（ＤＣＶ）の抗腫瘍活性
Ｅ．Ｇ７腫瘍を６～８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（０日齢）の背側腹部に２×１０５ｃｅｌｌｓの腫瘍細胞（ＤＭＥＭ中、５０μＬ）を皮内注射することにより移植した。ＤＣＶ治療のために、腫瘍移植７、１０および１３日後に、１．２５×１０５ｃｅｌｌｓの同系ＢＭＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋細胞、５０μＬ ＤＭＥＭ／０．１％ウシ血清アルブミン中）を腫瘍内に注射した。腫瘍サイズを毎週測定した。マウスは瀕死状態になったとき、または腫瘍が直径２０ｍｍを超えたときに安楽死させた。
Ｅ．Ｇ７腫瘍を６～８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（０日齢）の背側腹部に２×１０５ｃｅｌｌｓの腫瘍細胞（ＤＭＥＭ中、５０μＬ）を皮内注射することにより移植した。ＤＣＶ治療のために、腫瘍移植７、１０および１３日後に、１．２５×１０５ｃｅｌｌｓの同系ＢＭＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋細胞、５０μＬ ＤＭＥＭ／０．１％ウシ血清アルブミン中）を腫瘍内に注射した。腫瘍サイズを毎週測定した。マウスは瀕死状態になったとき、または腫瘍が直径２０ｍｍを超えたときに安楽死させた。
結果
ＹＰＰＰ－ＤＣの優れた抗腫瘍活性
ＤＭＳＯ－ＤＣおよびＹＰＰＰ－ＤＣのｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性を検討するため、確立されたＥＧ．７腫瘍に対するこれらＤＣの治療効果を評価した（図６Ａ）。マウスに２×１０５ｃｅｌｌｓのＥ．Ｇ７腫瘍細胞を注射し（Ｄａｙ０）、腫瘍移植７、１０および１３日後、マウスにＧＭ－ＣＳＦおよびＤＭＳＯ／ＹＰＰＰで培養した１．２５×１０５ｃｅｌｌｓのＣＤ１１ｃ＋細胞由来ＢＭ細胞をワクチン接種した。図１Ｂに示すように、ＤＭＳＯ－ＣＤ１１ｃ＋細胞（ＤＭＳＯ－ＤＣ）は腫瘍増殖を完全に抑制できなかったが、ＹＰＰＰ－ＣＤ１１ｃ＋細胞（ＹＰＰＰ－ＤＣ）は、腫瘍を根絶することはないものの、有意に減少させた。
ＹＰＰＰ－ＤＣの優れた抗腫瘍活性
ＤＭＳＯ－ＤＣおよびＹＰＰＰ－ＤＣのｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性を検討するため、確立されたＥＧ．７腫瘍に対するこれらＤＣの治療効果を評価した（図６Ａ）。マウスに２×１０５ｃｅｌｌｓのＥ．Ｇ７腫瘍細胞を注射し（Ｄａｙ０）、腫瘍移植７、１０および１３日後、マウスにＧＭ－ＣＳＦおよびＤＭＳＯ／ＹＰＰＰで培養した１．２５×１０５ｃｅｌｌｓのＣＤ１１ｃ＋細胞由来ＢＭ細胞をワクチン接種した。図１Ｂに示すように、ＤＭＳＯ－ＣＤ１１ｃ＋細胞（ＤＭＳＯ－ＤＣ）は腫瘍増殖を完全に抑制できなかったが、ＹＰＰＰ－ＣＤ１１ｃ＋細胞（ＹＰＰＰ－ＤＣ）は、腫瘍を根絶することはないものの、有意に減少させた。
＜実施例６＞
本実施例では、ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉ細胞およびＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｉｎｔ細胞の遺伝子発現プロファイルを行った。
１）細胞の調製
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）から骨髄（ＢＭ）細胞を調製した。ＢＭ細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、５×１０－５Ｍ ２‐メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンおよび２５ｎｇ／ｍＬ 顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で補充したＲＰＭＩ‐１６４０培地にＤＭＳＯあるいは実施例５表４のＹＰＰＰ溶液を添加して、３７℃、５％ＣＯ２存在下６日間培養した。３日目および６日目に、ＣＤ１１ｃ＋Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅｈｉ細胞およびＣＤ１１ｃ＋Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅｉｎｔ細胞を、セルソーターＳＨ８００（ソニーバイオテクノロジー、東京、日本）を用いて単離した。
本実施例では、ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉ細胞およびＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｉｎｔ細胞の遺伝子発現プロファイルを行った。
１）細胞の調製
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）から骨髄（ＢＭ）細胞を調製した。ＢＭ細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、５×１０－５Ｍ ２‐メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンおよび２５ｎｇ／ｍＬ 顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で補充したＲＰＭＩ‐１６４０培地にＤＭＳＯあるいは実施例５表４のＹＰＰＰ溶液を添加して、３７℃、５％ＣＯ２存在下６日間培養した。３日目および６日目に、ＣＤ１１ｃ＋Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅｈｉ細胞およびＣＤ１１ｃ＋Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅｉｎｔ細胞を、セルソーターＳＨ８００（ソニーバイオテクノロジー、東京、日本）を用いて単離した。
２）遺伝子発現解析
Ａｌｌ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、Ｎｅｄｅｒｌａｎｄ）で全ＲＮＡを精製した。ＢＭＤＣのためのＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐ ｋｉｔ （Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で調製した。配列決定はＮｅｘ５００／５５０（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて行った。
Ａｌｌ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、Ｎｅｄｅｒｌａｎｄ）で全ＲＮＡを精製した。ＢＭＤＣのためのＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐ ｋｉｔ （Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で調製した。配列決定はＮｅｘ５００／５５０（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて行った。
３）統計解析
統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いてＡＮＯＶＡにより行った。一元配置分散分析と二元配置分散分析を、それぞれ１変数と２変数による実験に用いた。ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。
統計解析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いてＡＮＯＶＡにより行った。一元配置分散分析と二元配置分散分析を、それぞれ１変数と２変数による実験に用いた。ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。
結果
ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉ細胞およびＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｉｎｔ細胞の遺伝子発現プロファイル。
ＹＰＰＰによるｉｎ ｖｉｔｒｏ樹状細胞の遺伝子発現を比較するために、０、３、６日間、ＤＭＳＯまたはＹＰＰＰ条件下で分化したＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉ細胞およびＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｉｎｔ細胞のＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）分析を行った（図７Ａ）。その結果、３日目または６日目のＤＭＳＯ－ＣＤ１１ｃ＋細胞とＹＰＰＰ－ＣＤ１１ｃ＋細胞との間には約５６００の差次的発現（ＤＥ）遺伝子が認められた（図７Ｂ、８、９）。差次的に発現した遺伝子に基づく主成分分析（ＰＣＡ）は、位置と遺伝子型の両方に基づいて、ＹＰＰＰ有りまたは無しで培養したＢＭＤＣを明確に分離した（図７Ｃ）。ＭＡプロットは、いくつかのＣ／ＥＢＰα、ＰＰＡＲγおよびＴＧＦ‐β関連遺伝子が、ＤＭＳＯ‐ＣＤ１１ｃ＋細胞と比較してＹＰＰＰ‐ＣＤ１１ｃ＋細胞で増加することを示した（図１０）。
ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉ細胞およびＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｉｎｔ細胞の遺伝子発現プロファイル。
ＹＰＰＰによるｉｎ ｖｉｔｒｏ樹状細胞の遺伝子発現を比較するために、０、３、６日間、ＤＭＳＯまたはＹＰＰＰ条件下で分化したＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｈｉ細胞およびＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩｉｎｔ細胞のＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）分析を行った（図７Ａ）。その結果、３日目または６日目のＤＭＳＯ－ＣＤ１１ｃ＋細胞とＹＰＰＰ－ＣＤ１１ｃ＋細胞との間には約５６００の差次的発現（ＤＥ）遺伝子が認められた（図７Ｂ、８、９）。差次的に発現した遺伝子に基づく主成分分析（ＰＣＡ）は、位置と遺伝子型の両方に基づいて、ＹＰＰＰ有りまたは無しで培養したＢＭＤＣを明確に分離した（図７Ｃ）。ＭＡプロットは、いくつかのＣ／ＥＢＰα、ＰＰＡＲγおよびＴＧＦ‐β関連遺伝子が、ＤＭＳＯ‐ＣＤ１１ｃ＋細胞と比較してＹＰＰＰ‐ＣＤ１１ｃ＋細胞で増加することを示した（図１０）。
Claims (8)
- ａ）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、
ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤、及び
ｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種を含み、
ｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種が、Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシプロポキシ］－３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－イオドフェニル）アミノ］－ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）である、
樹状細胞分化誘導培地。 - 前記ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤が（Ｒ）－（＋）－ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩一水和物（Ｙ２７６３２）である、請求項１に記載の樹状細胞分化誘導培地。
- Ｎ－（２－｛［４－（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ｝－６－（３，５－ジメトキシフェニル）ピリド（２，３－ｄ）ピリミジン－７－ｙｌ）－Ｎ’－（１，１－ジメチルエチル）尿素（ＰＤ１７３０７４）又は２－（２－アミノ－３－メトキシフェニル）－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン（ＰＤ９８０５９）をさらに含む、請求項１又は２に記載の樹状細胞分化誘導培地。
- 前記ｃ）ＦＧＦＲ阻害剤及びＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種が、Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシプロポキシ］－３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－イオドフェニル）アミノ］－ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ－（２－｛［４－（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ｝－６－（３，５－ジメトキシフェニル）ピリド（２，３－ｄ）ピリミジン－７－ｙｌ）－Ｎ’－（１，１－ジメチルエチル）尿素（ＰＤ１７３０７４）及び２－（２－アミノ－３－メトキシフェニル）－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン（ＰＤ９８０５９）である、請求項１又は２に記載の樹状細胞分化誘導培地。
- 請求項１から４の何れか一項に記載の培地中で骨髄細胞試料又は末梢血試料を培養して樹状細胞集団を得る工程を含む、樹状細胞集団の製造方法。
- 前記樹状細胞集団における、ＣＤ１１ｃ陽性であり、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ陽性である細胞の割合が３０％以上である、請求項５に記載の製造方法。
- 請求項１から４の何れか一項に記載の培地を含む、キット。
- 請求項１から４の何れか一項に記載の培地中で骨髄細胞試料又は末梢血試料を培養して樹状細胞集団を得る工程、及び
前記工程で得られた樹状細胞集団を樹状細胞ワクチンに調製する工程を含む、
樹状細胞ワクチンの製造方法。
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| CN116515752B (zh) * | 2023-03-16 | 2023-10-24 | 沃森克里克（北京）生物科技有限公司 | 3,5-二羟基-4’-甲氧基芪-3-O-β-D-葡萄糖苷用于促进DC细胞体外增殖的用途 |
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-
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